JPS59143596A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法Info
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- JPS59143596A JPS59143596A JP1683183A JP1683183A JPS59143596A JP S59143596 A JPS59143596 A JP S59143596A JP 1683183 A JP1683183 A JP 1683183A JP 1683183 A JP1683183 A JP 1683183A JP S59143596 A JPS59143596 A JP S59143596A
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- Japan
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- phenylalanine
- produce
- strain
- bacillus subtilis
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるし一フェニルアラニン（以下、単
ンこフェニルアラニンという。）の製造法に関する。
ンこフェニルアラニンという。）の製造法に関する。
従来、発酵法によるフェニルアラニンの製造法としては
、ブレビバクテリウム属、又ハミクロコンカス属細菌の
チロシン要求菌を使用する方法（特公昭３７−６３４５
）、生育にチロシンを要求しかつ５−メチルトリプトフ
ァンに耐性を有する変異株を使用する方法（特公昭５ｌ
−２１０７９）、フェニルアラニンアナログに耐性を有
する方法（特公昭５ｌ−２８７１２）、更にはデフイニ
ン感受性変異株を使用する方法（特公昭５６−６４７９
３ ）等が知られている。
、ブレビバクテリウム属、又ハミクロコンカス属細菌の
チロシン要求菌を使用する方法（特公昭３７−６３４５
）、生育にチロシンを要求しかつ５−メチルトリプトフ
ァンに耐性を有する変異株を使用する方法（特公昭５ｌ
−２１０７９）、フェニルアラニンアナログに耐性を有
する方法（特公昭５ｌ−２８７１２）、更にはデフイニ
ン感受性変異株を使用する方法（特公昭５６−６４７９
３ ）等が知られている。
一方、バチルス属についてはＬ−チロシン要求性変異株
を使用する方法（特公昭３７−６３４５号）、あるいは
トリプトファン要求性、Ｐ−フルオロフェニルアラニン
耐性及びβ−２−チェニルアラニン耐性の変異株を使用
する方法（特開昭４８−６７４８８ ）等が知られてい
るが、そのＬ−フェニルアラニン生［性（４ｏ、２〜０
．４ ｙ／ｄｉ程度であり、上記ブレビバクテリウム属
又はコリネバクテリウム属のフェニルアラニン生産菌に
比べて著しく劣っている。この為、フェニルアラニンの
工業的生産を目的とした菌株の育種は殆んど検討がなさ
れず、実際にＬ−フェニルアラニン生産性の高いものは
知られていない。
を使用する方法（特公昭３７−６３４５号）、あるいは
トリプトファン要求性、Ｐ−フルオロフェニルアラニン
耐性及びβ−２−チェニルアラニン耐性の変異株を使用
する方法（特開昭４８−６７４８８ ）等が知られてい
るが、そのＬ−フェニルアラニン生［性（４ｏ、２〜０
．４ ｙ／ｄｉ程度であり、上記ブレビバクテリウム属
又はコリネバクテリウム属のフェニルアラニン生産菌に
比べて著しく劣っている。この為、フェニルアラニンの
工業的生産を目的とした菌株の育種は殆んど検討がなさ
れず、実際にＬ−フェニルアラニン生産性の高いものは
知られていない。
又本発明者等は、バチルス属の微生物が発酵分野に於て
、核酸発酵菌として実際に使用されており、潜在的に優
れた発酵生産性を有する微生物であると考え、フェニル
アラニンの工業生産を目的としたフェニルアラニン生産
菌の育種を行った。その結果、バチルス属のフェニルア
ラニン生産菌にＮ。
、核酸発酵菌として実際に使用されており、潜在的に優
れた発酵生産性を有する微生物であると考え、フェニル
アラニンの工業生産を目的としたフェニルアラニン生産
菌の育種を行った。その結果、バチルス属のフェニルア
ラニン生産菌にＮ。
Ｎ−ビスホスホノメチルグリノン（以下ＢＰＭＧと略す
）又はＮ−ホスホ／メチルグリジン（以下ＰＭＧと略す
）に耐性を付与した変異株の中により多月二のフェニル
アラニンを生成、蓄積する菌株が存在することを見い出
した。
）又はＮ−ホスホ／メチルグリジン（以下ＰＭＧと略す
）に耐性を付与した変異株の中により多月二のフェニル
アラニンを生成、蓄積する菌株が存在することを見い出
した。
本発明はこの知見ｔこ基づいて完成されたものである。
本発明において使用される変異株は、ＢＰＭＧ又はＰＭ
Ｇに耐性を有し、従来知られているフェニルアラニン生
産の為に有効な性質、例えばＬ−チロンン要求性、Ｌ−
４リプトフアン要求性、フェニルアラニンアナログ耐性
、チロシンアナログ耐性、トリプトファンアナログ耐性
等を併せ持つフェニルアラニン生産菌でアル。
Ｇに耐性を有し、従来知られているフェニルアラニン生
産の為に有効な性質、例えばＬ−チロンン要求性、Ｌ−
４リプトフアン要求性、フェニルアラニンアナログ耐性
、チロシンアナログ耐性、トリプトファンアナログ耐性
等を併せ持つフェニルアラニン生産菌でアル。
本発明において用いられる微生物は、具体的には例えば
次のような並異株が挙げられる。
次のような並異株が挙げられる。
バチルス・ズブチリス ＡＪ １２０００ＦＥＲＭ −
Ｐ ６８９５ （、Ｔｙｒ 、 ＢＰＭＧｒ）バチル
ス・ズブチリス ＡＪ １２００１ＦＥＲＭ−Ｐ ６８
９６ （Ｔｙｒ 、ＰＭＧｒ）バチルス・ズブチリス
ＡＪ １２００２ＦＥＲＭ−Ｐ ６８９７ （Ｔｙｒ
、Ｐ−Ｆ−Ｐｈｅｒ、ＰＭＧｒ）バチルス拳ズフ゛チリ
ス ＡＪ １２００３ＦＥＲＭ −Ｐ ６ Ｂ ９ Ｂ
（ｍ−Ｆ−Ｐｈｅｒ、 ＰＭＧ” ）本発明の変異
株はバチルス属の野生株又は公知１７） ７ ：ｘ−＝
／ｌ／アラニン生産菌を親株として、これに通常の変
異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ１−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンン（ＮＧを略
す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌
体を親株が生育できないような量のＢＰＭＧ又はＰＭＧ
を含有する寒天平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによって得られる。
Ｐ ６８９５ （、Ｔｙｒ 、 ＢＰＭＧｒ）バチル
ス・ズブチリス ＡＪ １２００１ＦＥＲＭ−Ｐ ６８
９６ （Ｔｙｒ 、ＰＭＧｒ）バチルス・ズブチリス
ＡＪ １２００２ＦＥＲＭ−Ｐ ６８９７ （Ｔｙｒ
、Ｐ−Ｆ−Ｐｈｅｒ、ＰＭＧｒ）バチルス拳ズフ゛チリ
ス ＡＪ １２００３ＦＥＲＭ −Ｐ ６ Ｂ ９ Ｂ
（ｍ−Ｆ−Ｐｈｅｒ、 ＰＭＧ” ）本発明の変異
株はバチルス属の野生株又は公知１７） ７ ：ｘ−＝
／ｌ／アラニン生産菌を親株として、これに通常の変
異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ１−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンン（ＮＧを略
す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌
体を親株が生育できないような量のＢＰＭＧ又はＰＭＧ
を含有する寒天平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによって得られる。
次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及びＢＰＭＧ
又はＰＭＧに対する耐性度を以下の実験例にて示す。
又はＰＭＧに対する耐性度を以下の実験例にて示す。
実験例１
バチルス・ズブチリスＡＪ１１７０８より誘導したチロ
ノン要求性のフェニルアラニン生産菌ＡＪ１１９６６を
イーストブイヨン寒天斜面培地て培養し、生育した菌体
な集めて１１５０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁
しく１０８〜１０９個／ ｍｌの菌体を含む）、これに
ＮＧを加え（ＮＧ濃度は２００７１ Ｓ’ ／ ｍｅ
）、室温で３０分間保持した。このようにしてＮＧ処理
した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、ＢＰＭ０
５００μ２／ｍｅを含む第１表に示す最小寒天平板培地
に塗布し、３１５℃で４〜１０日間培養した。
ノン要求性のフェニルアラニン生産菌ＡＪ１１９６６を
イーストブイヨン寒天斜面培地て培養し、生育した菌体
な集めて１１５０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁
しく１０８〜１０９個／ ｍｌの菌体を含む）、これに
ＮＧを加え（ＮＧ濃度は２００７１ Ｓ’ ／ ｍｅ
）、室温で３０分間保持した。このようにしてＮＧ処理
した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、ＢＰＭ０
５００μ２／ｍｅを含む第１表に示す最小寒天平板培地
に塗布し、３１５℃で４〜１０日間培養した。
第１表 最小培地の組成（ｐＨ７，ｏ）グルコース
２０ｆ／を硫酸アンモニウム
５ 〃尿 素
２ 〃ＫＨ２ＰＯ４１ｒｒ ＭｇＳＯ４−７Ｈ，０１〃 Ｆ ｅ ”、Ｍｎ十＋イオン ２ｐｐ
ｍビオチン ５０μｆ／ｌサイアミ
ン塩酸塩 ２００ ／’Ｌ−チロ／ン※
１００ ／’寒天平板上に生育したコロニー
のうち、大きなものをＢ Ｐ ＭＧ耐性株として採取し
た。このようにして得られた耐性株の内には親株より７
エニルアラニン生産能の優れたものが多く見出された。
２０ｆ／を硫酸アンモニウム
５ 〃尿 素
２ 〃ＫＨ２ＰＯ４１ｒｒ ＭｇＳＯ４−７Ｈ，０１〃 Ｆ ｅ ”、Ｍｎ十＋イオン ２ｐｐ
ｍビオチン ５０μｆ／ｌサイアミ
ン塩酸塩 ２００ ／’Ｌ−チロ／ン※
１００ ／’寒天平板上に生育したコロニー
のうち、大きなものをＢ Ｐ ＭＧ耐性株として採取し
た。このようにして得られた耐性株の内には親株より７
エニルアラニン生産能の優れたものが多く見出された。
このうち、生産能の最も高い菌株ＡＪ１２０００を選ん
だ。同様の変異操作により、ＡＪ１１９６６にＰＭＧ耐
性を付与してＡＪ１２００１を、ＡＪ１１９７１にＰＭ
Ｇ耐性を付与してＡＪ１２００２をＡＪ３２５７にＰＭ
Ｇ耐性を付与してＡ Ｊ ！２００３を誘導した。
だ。同様の変異操作により、ＡＪ１１９６６にＰＭＧ耐
性を付与してＡＪ１２００１を、ＡＪ１１９７１にＰＭ
Ｇ耐性を付与してＡＪ１２００２をＡＪ３２５７にＰＭ
Ｇ耐性を付与してＡ Ｊ ！２００３を誘導した。
実験例２
第２表に示す濃度のＢＰＭＧ又はＰＭＧを含む最少培地
（第１表）を試験管に４．Ｏｍｅ宛分注し加熱殺菌した
。
（第１表）を試験管に４．Ｏｍｅ宛分注し加熱殺菌した
。
この培地ｅこ上記変異株を一定量接種し３１．５℃振盪
培養した。各培養液を水で２６倍に希釈し、その５６２
ｎｍ に於る吸光度を測定して生育度を求めた。そ
の結果を第２表に示す。
培養した。各培養液を水で２６倍に希釈し、その５６２
ｎｍ に於る吸光度を測定して生育度を求めた。そ
の結果を第２表に示す。
尚、第２表には薬剤無添加時の生育度を１００とする相
対生育値を示した。
対生育値を示した。
第２表 薬剤耐性度
薬 剤 （μ？、／ｍｅ ）
菌株 Ｂ Ｐ ＭＧ Ｐ ＭＧ
ｏ ５００１０００２０００ Ｇ １００２００３０
０ＡＪ１１９６６１０００００１０００００ＡＪ１１９
７１１０００００１０００００ＡＪ３２５７１００００
０１０００００ＡＪ１２０００１００１００４０２０１
００１００７５２０ＡＪ１２００１１００９８３５１０
１００１００８０１０ＡＪ１２００２１００９６３０１
０１００９８５５１０ＡＪ１２００３１００９０２０５
１００９０５５８本発明で使用する培地は炭素源、窒素
源、無機塩類、Ｌ−チロシンその他必要に応じてアミノ
酸、ビタミン、核酸等の有機微量栄養素を含有する通常
の栄養培地が使用される。炭素源としては使用する変異
株の利用可能なものであれば良く、例えハクルコース、
フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉分解
物糖蜜等の糖類が使用され、その他、エタノール、フロ
パノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸
類等が使用される。
０ＡＪ１１９６６１０００００１０００００ＡＪ１１９
７１１０００００１０００００ＡＪ３２５７１００００
０１０００００ＡＪ１２０００１００１００４０２０１
００１００７５２０ＡＪ１２００１１００９８３５１０
１００１００８０１０ＡＪ１２００２１００９６３０１
０１００９８５５１０ＡＪ１２００３１００９０２０５
１００９０５５８本発明で使用する培地は炭素源、窒素
源、無機塩類、Ｌ−チロシンその他必要に応じてアミノ
酸、ビタミン、核酸等の有機微量栄養素を含有する通常
の栄養培地が使用される。炭素源としては使用する変異
株の利用可能なものであれば良く、例えハクルコース、
フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉分解
物糖蜜等の糖類が使用され、その他、エタノール、フロ
パノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸
類等が使用される。
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
す７／酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿
素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源
が使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するベブ
ト／、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用さ
れる。
す７／酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿
素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源
が使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するベブ
ト／、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用さ
れる。
Ｌ−チロノン等のアミノ酸を要求する変異株を使用する
ときは、要求する栄養累等を補添することが必要である
。
ときは、要求する栄養累等を補添することが必要である
。
培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培
地のｐＨを５ないし９、温度を２０℃ないし４０℃に制
御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりフェニルアラニンが著量培養液中Ｖこ蓄積
される。培養液からフェニルアラニンを採取する方法は
公知の方法に従って行えば良く、培養液から菌体を分離
除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂
を用いる方法等ｔこより採取される。
地のｐＨを５ないし９、温度を２０℃ないし４０℃に制
御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりフェニルアラニンが著量培養液中Ｖこ蓄積
される。培養液からフェニルアラニンを採取する方法は
公知の方法に従って行えば良く、培養液から菌体を分離
除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂
を用いる方法等ｔこより採取される。
以下、実施例にて説明する。
実施例１
下記第３表ケこ示すフェールアラニン生産用培地を調製
し、５００ ｍｅ容振盪フラスコに２０ ｍｅ宛分注し
、１２０℃て１０分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸力ルンウム粉末１０２を補添した。
し、５００ ｍｅ容振盪フラスコに２０ ｍｅ宛分注し
、１２０℃て１０分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸力ルンウム粉末１０２を補添した。
第３表 フェニルアラニン生産培地の組成酸 分
１．Ｏｔ中の含量グルコース
８０．０ｆＮＨ４Ｃ１１０，ＯＮ ＫＣｌ ２．ＯｒｔＫＨ２Ｐ
０． １．０ ／ｒＭｇＳ０４・
７ Ｈ２Ｏ０，４Ｎ Ｆｅ ”、 Ｍｎ ” 各２ １）Ｔ
）ｍＬ−チロシン０．１５ｍ１７ 大豆蛋白分解液※ ２ｏ ｍｌこの培地に第
４表に示すフェニルアラニン生産菌を１白金耳接種し、
３０℃で７２時間振盪培養した。培養液中のフェニルア
ラニン生成量を測定し、その結果な第４表に示した。尚
、ＡＪ３２５７およびＡＪ１２００３の場合は、フェニ
ルアラニン生産培地よりＬ−チロシンのみを除いた培地
をルし・た。
１．Ｏｔ中の含量グルコース
８０．０ｆＮＨ４Ｃ１１０，ＯＮ ＫＣｌ ２．ＯｒｔＫＨ２Ｐ
０． １．０ ／ｒＭｇＳ０４・
７ Ｈ２Ｏ０，４Ｎ Ｆｅ ”、 Ｍｎ ” 各２ １）Ｔ
）ｍＬ−チロシン０．１５ｍ１７ 大豆蛋白分解液※ ２ｏ ｍｌこの培地に第
４表に示すフェニルアラニン生産菌を１白金耳接種し、
３０℃で７２時間振盪培養した。培養液中のフェニルア
ラニン生成量を測定し、その結果な第４表に示した。尚
、ＡＪ３２５７およびＡＪ１２００３の場合は、フェニ
ルアラニン生産培地よりＬ−チロシンのみを除いた培地
をルし・た。
ｍ４表 フェニルアラニンの蓄積量
Claims (1)
- バチルス属に属しＮ、Ｎ−ビスホスホノメチルグリンン
又はＮ−ホスホノメチルグリシンに耐性を有しＬ−フェ
ニルアラニン生産能を有する微生物を液体培地中で培養
してＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とする発酵法によるＬ−フェニルアラ
ニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1683183A JPS59143596A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1683183A JPS59143596A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59143596A true JPS59143596A (ja) | 1984-08-17 |
Family
ID=11927136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1683183A Pending JPS59143596A (ja) | 1983-02-03 | 1983-02-03 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59143596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010279283A (ja) * | 2009-06-04 | 2010-12-16 | Kao Corp | アルカリプロテアーゼ高生産菌 |
-
1983
- 1983-02-03 JP JP1683183A patent/JPS59143596A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010279283A (ja) * | 2009-06-04 | 2010-12-16 | Kao Corp | アルカリプロテアーゼ高生産菌 |
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