JPS58158194A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法１こよるし一フェニルアラニ／（以下、
単にフェニルアラニンという。）の製造法１こ関する。

従来、発酵法？こよるフェニルアラニンの製造法として
は、ブレビバクテリウム属、又はミクロフッカス属細菌
のチロシン要求菌を使用する方法（特公昭３７−６３４
５）、生育ｔこチロシンヲ要求しかつ５−メ°チルトリ
プトファンｔこ耐性を有する変異株を使用する方法（特
公昭５ｌ−２１０７９）、フェニルアラニンアナログに
耐性を有する変異株を使用する方法（特公昭５ｌ−２８
７１２）、更にはデコイエン感受性変異株を使用する方
法（特公昭５６−６４７９３）等が知られている。

本発明者等は更ｔこ効率良くフェニルアラニンを発酵生
産する方法を開発することを目的として研究を重ねた結
果、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属の
フェニルアラニン生産菌ｔこグルタミンアナログ耐性を
有する変異株の中により多量のフェニルアラニンを生成
、蓄積する菌株が存在することを見い出した。

本発明はこの知見ｔこ基づいて完成されたものである。

従来、グルタミンアナログ耐性とフェニルアラニンの生
成、蓄積の関係１こついては何も報告がなく、本発明の
如く、グルタミンアナログ耐性を付学せしめることをこ
よりフェニルアラニンの蓄積量が増加するという知見は
全く新規である。

本発明において使用される変異株はブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属に属しグルタミンアナログ
耐性を有し、かつ従来知られているフェニルアラニン生
産の為ｒこ必要な性質、例えばＬ−チロシン要求性、フ
ェニルアラニンアナログ耐性、Ｌ−チロシン要求性でか
つトリプトファンもしくはフェニルアラニンアナログ耐
性、即ちフェニルアラニン生産能を有するものである。

本発明の方法において用いられる微生物は、具体的ｔこ
は次のような変異株が挙げられる。

Ｔｙｒ　　　　：　Ｌ−チロシン要求性５−ＭＴ　　　
：５−メチルトリプトファン耐性ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ’　：
　Ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性 Ａｚａ−５ｅｒｒ：アザセリン耐性 ＤＯＮｒ：６−ジアゾー５−オキソ−し−ノルロイシン
耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム属又はコ
リネバクテリウム属のフェニルアラニン生産菌を親株と
して、これ？乙通常の変異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ
線照射あるいはＮ−メチル−Ｎ１−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＧと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理
を施し、変異処理した菌体な親株が生育できないような
量のグルタミンアナログを含有する寒天平板培地で培養
し、該平板培地上Ｖこ生育するコロニーを分離すること
ｔこよって得られる。

上記ブレビバクテリウム１又はコリネバクテリウム属の
フェニルアラニン生産菌は公知のものを使用すれば良い
が、具体例としては次のような変異株が使用される。

親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属の微生物持ｔこグルタミン酸生産性細菌
として知られている微生物を使用し、グルタミンアナロ
グ耐性及びフェニルアラニン生産性を付学することケ乙
よって誘導することができる。このような親株の例とし
ては、ブレビバクテリウム・デバリカタムＡＴＣＣＩ４
０２０、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡ
ＴＣＣ＋３８６９　　、ブレビバクテリウム・ロゼラム
ＡＴＣＣ１４０６６、フリネバクテリウムｅアセトアシ
ドフイラムＡＴＣＣ１３８７０，コリネバクテリウム・
アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２等が使用され
る。

本発明でいうグルタミンアナログとは、ブレビバクテリ
ウム属及びコリネバクテリウム属の微生物の生育を阻害
し、その生育阻害がグルタミンの添加１こよって部分的
１こ又は完全に解除されるような薬剤である。

グルタミンアナログとしては次のものが挙げられる。

アザセリン、６−ジアシー５−オキソ−し−ノルロイシ
ン（以下、ＤＯ′Ｎと略す）、デュアゾマイシンＡ、Ｂ
、アラゾペプチン、メチオニンスルフォキサイド、Ｓ−
カルバミルシスティン、ｏ−カルバミルセリン、０−カ
ルバジルセリン、３−アミノ−３−カルボキシプロペン
−スルフォンアミド、Ｎ−ベンジルグルタミン、γ−グ
ルタミルヒドラジン。

次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び薬剤ｔこ
対する耐性度を以下の実験例にて示す。

実験例１ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１
３８６９より誘導したし一チロシン要求性ノフェニルア
ラニン生産菌ＡＪ３４３５　　ＦＥＲＭ−Ｐ］９１２　
　をイーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した
菌体を集めて１１５０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
懸濁した（１０８〜１０′１個／　ｍｌの菌体を含む）
。この懸濁液１こＮＧ（濃度は２００μｑ／ｍｅ　）　
、室温（こ３０分間保持した。このようをこしてＮＧ変
異処理した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、ア
ザセリン１０００μ？／Ｍｌ　含ｔｒ　最小寒天平板培
地（第１表）ｔこ塗布し、３１．５　Ｃで４〜ｌＯ日間
培養した。

第１表　最小培地の組成（ｐＨ７，０）グルコース　　
　　　　　　　　　２０　　ｙ／を硫酸アンモニウム　
　　　　　　　　５　　〃尿　　　素　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２　　　／／ＫＨ２ＰＯ４１
／／ ＭｇＳＯ４・７ＨｑＯｌ　ｔｔ Ｆｅ　　、Ｍｕ　　イオン　　　　　　　　各　ｐｐｍ
ビオチン　　　　　　　　　　　　５０　μｍ／１サイ
アミン塩酸塩　　　　　　　２００　　〃ＤＬ−メチオ
ニノ　　　　　　　　ｚｏｏｍｇ／ｌＬ−チロシン　　
　　　　　　　　１００＃平板上に生育したコロニーの
うち大きなものをアザセリン耐性株として採取した。こ
のようにして得られた耐性株の内には親株よりフェニル
アラニン生産能の優れたものが多く見い出された。この
内生産能の最も高い菌株ＡＪＩ　＋８２１を選んだ。

同様の変異誘導操作ｔこより、ＡＪ３４３２、ＡＪ３２
４４を親株として夫々ＡＪ１１８２、ＡＪ！１８２４　
　を得た。

第３表１こ示す濃度のアザセリン又はＤＯＮを含む第２
表の液体培地を試験管にＦ；、Ｏｗｌ宛分注し加熱殺菌
した。これ１こ上記変異株を１白金耳完接種し３ＯＣに
て４８時間振盪培養した。生育度は培養液を水で２６倍
ｔこ希釈し、その５６２　ｎｍに於る吸光度を測定して
求めた。第３表には薬剤無添加時の生育度を１００とす
る相対生育値を示した。

第２表培地組成 グルコース　　　　　　　　　　　２０　　　　Ｆ硫酸
アンモニウム　　　　　　　ＩＯ 尿　　　素　　　　　　　　　　　　　　　　　　３Ｋ
Ｈ，ＰＯ４１，０／／ ＭｇＳＯ４・７１−１，０　　　０．４　／／ＦｅＳＯ
４＠　７Ｈ２００，Ｏｌ　” ＭｎＳＯ４・　４Ｈ，０８，Ｏｍ９ サイアミン塩酸塩　　　　　　　１　’００　　　μ？
ビオチン　　　　　　　　　　　３０ メチオニン　　　　　　　　　　　０．４ｔＬ−チロシ
ン※　　　　　　　　　　０．１　　　・（ＩＡに（２
４４反ひＡＪ　ｌ　］　８２４の砺せｉ’Ｘ　無ｊｉｆ
ｆｓ　ｎ口）第３表　耐　性　度 本発明で使用する培地は炭素源、無機塩類、その他に応
じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微量栄養素を含
有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては使
用する変異株の利用可能なものであれば良く、例えばグ
ルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース
、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その他、エタノ
ール、プルパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸
等のｌｌ［類、更に菌株ｔこよってはノルマルパラフィ
ン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。

窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
ン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育１こアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使
用する場合１こけ要求さｉる栄養素を補添することが必
要である。無機塩類としてはＫ）（、ＰＯ４％Ｍｇ５Ｏ
，、ＭｎＳＯ４、Ｆｅ５０．　　等が適宜添加される。

培養は好気的条件で行う９とが望ましく、培養期間中培
地のｐＨを５ないし９、温度を２０ｔ？ないし４０Ｃ＃
こ制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は通気攪拌培
養することによりフェニルアラニンが著量培養液中に蓄
積される。培養液からフェニルアラニン。を採取する方
法は公知の方法に従って行えば良く、培養液から菌体を
分離除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換
樹脂を用いる方法等により採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 下記第４表１こ示すフェニルアラニン生産用培地を調製
し、５００１１Ｉ／容振盪フラスコｔこ２０−充分注し
、１．２０ｔ：’で１０分間加熱滅菌した。これに別途
加熱殺菌した炭酸カルシウム粉末１．Ｏｆを補添した。

Ｋｌ（、ＰＯ４Ｌ、５ＩＩ　　ＤＬ−メチオニン　　４
Ｑ　　　ｔｔＦｅＳＯ，−７８，０１，０箇＋９７ｄｌ
この培地ｔこ第５表に示すフェニルアラニン生産菌を１
白金耳接種し、３０Ｃで７２時間振盪培養した。培養液
中のフェニルアラニン生成量を測定し、その結果を第５
表會こ示した。

第５表　フェニルアラニンの蓄積量 Ａ　　Ｊ　　Ｉ　　１　８　２　１　　　　　　　　　
　　　　　　１　１．５ＡＪ　　３４３２　　　　　　
　　１７．１Ａ　Ｊ　１１８２２　　　　　　　　１９
．２ＡＪ　　３４３７　　　　　　　　２１．０Ａ　Ｊ
　Ｉ　１８２３　　　　　　　　２４．１ＡＪ　　３２
４４　　　　　　　　　１．５Ａ　Ｊ　１１８２４　　
　　　　　　　７．８特許出願人　味の素株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属１こ属
   し、グルタミンアナログに耐性を有し、かつＬ−フェニ
   ルアラニン生産能を有する微生物を培養して培養液中１
   こし一フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とする発酵法によるし一フェニルアラニ
   ンの製造法。