JPH0218838B2 - - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は発酵法によるＬ―ヒスチジンの製造法
に関する。 発酵法によるＬ―ヒスチジンの製造法として
は、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属の２―チアゾールアラニン（ヒスチジンアナ
ログ）耐性変異株を用いる方法（米国特許第
3716453号）、２―チアゾールアラニン及びサルフ
ア剤に耐性を有するＬ―ヒスチジン生産菌を用い
る方法（特公昭51―23594号公報）、更に２―チア
ゾールアラニン耐性の他にＬ―アルギニン、Ｌ―
メチオニン、Ｌ―フエニルアラニン、Ｌ―プロリ
ン等のＬ―アミノ酸又はキサチン、グアニン等を
要求する変異株を使用する方法（特公昭51―
23593、51―24594号公報）等が知られている。 本発明者等はより高収率でＬ―ヒスチジンを生
産する微生物を育種することを目的として種々研
究した結果、ブレビバクテリウム属のＬ―ヒスチ
ジン生産菌にサイアミンアンタゴニスト耐性を付
与した変異株がより高い収率でＬ―ヒスチジンを
生産することを見い出した。本発明はこの発見に
基づいて完成されたものである。 本発明に於て用いられる微生物は、ブレビバク
テリウム属に属し、サイアミンアンタゴニストに
耐性を有し、更にＬ―ヒスチジン生産に必要な性
質、例えばヒスチジンアナログ耐性等を有する変
異株であり、代表的なものとして次のような変異
株が挙げられる。 ブレビバクテリウム・フラバム AJ11845
FERM―P6478（2TA※、トリアゾールカルボキ
サミド耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11846
FERM―P6479（2TA、トリアゾールカルボキサ
ミド、コバラミン耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11847
FERM―P6480（2TA、ピリサイアミン耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11848
FERM―P6481（2TA、オキシサイアミン耐性） （※ 2TA：２―チアゾールアラニン） 本発明でいうサイアミンアンタゴニストとは、
ブレビバクテリウム属微生物の生育を阻害し、そ
の生育阻害がサイアミン（塩酸塩）の添加によつ
て部分的に又は完全に解除されるような化学薬剤
をいい、例えば、ピリサイアミン、オキシサイア
ミン、トリアゾールカルボキサミド等が挙げられ
る。 これらサイアミンアンタゴニスト耐性のＬ―ヒ
スチジン生産菌に、Ｌ―ヒスチジン生産性を高め
るのに有効な公知の性質、例えばＬ―メチオニ
ン、Ｌ―トリプトフアン、Ｌ―フエニルアラニン
等の要求性、サルフア剤、５―メチルトリプトフ
アン耐性等を付与したＬ―ヒスチジン生産能の高
い菌株を使用することが望ましく本発明をより一
層効果的に実施することができる。 本発明で使用する変異株は、ブレビバクテリウ
ム属に属したヒスチジンアナログ耐性のＬ―ヒス
チジン生産菌を親株とし、これに通常の変異処
理、例えば紫外線照射あるいはＮ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジン（以下、
NGと略す）、亜硝酸等で変異処理し、次いで変
異処理した菌体を親株が生育できない量のサイア
ミンアンタゴニストを含有する寒天平板培地で培
養し、該平板培地上に生育するコロニーをサイア
ミンアンタゴニスト耐性株として分離し、Ｌ―ヒ
スチジン生産能の高いものを選択することによつ
て採取される。 上記親株としてはヒスチジンアナログ耐性を有
するＬ―ヒスチジン生産菌の他に、Ｌ―ヒスチジ
ン生産に有用な公知の性質を有するＬ―ヒスチジ
ン生産菌、例えば、Ｌ―スレオニン、又はグアニ
ン要求性（特公昭51―24594号）、サルフア剤耐
性、コバラミン耐性（特開昭50―70591号公報）
のＬ―ヒスチジン生産菌等が使用され、具体的に
は次のようなものが挙げられる。 ブレビバクテリウム・フラバム AJ3225
ATCC21406（2TA耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ3579 FERM
―P2170（Ｌ―スレオニン要求性、2TA耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ3620 FERM
―P2316（2TA、スルフアダイアジン、コバラミ
ン耐性） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3227ATCC21407 （2TA耐性） 再に本発明のＬ―ヒスチジン生産菌は次に示す
ような、いわゆるコリネフオームのＬ―グルタミ
ン酸生産菌を親株とし、これにヒスチジンアナロ
グ耐性及びサイアミンアンタゴニスト耐性を順次
又は任意の順に付与することによつて誘導するこ
とができる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC14066 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 以下の実験例にて、本発明の変異株の具体的誘
導方法の１例とサイアミンアンタゴニストに対す
る耐性度を示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・フラバム
AJ3225ATCC21406をイースト・ブイヨン基天ス
ラント培地で培養し、生育した菌体を集めて
0.02Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、これに
200μg／mlのNGを加え室温に30分間保持した。
このようにNG変異処理した菌体を同緩衝液で洗
滌した後、トリアゾールカルボキサミドを
1000μg／ml含む最少寒天プレート上（第１表）
に塗布、31.5℃で４日間培養した。
に関する。 発酵法によるＬ―ヒスチジンの製造法として
は、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属の２―チアゾールアラニン（ヒスチジンアナ
ログ）耐性変異株を用いる方法（米国特許第
3716453号）、２―チアゾールアラニン及びサルフ
ア剤に耐性を有するＬ―ヒスチジン生産菌を用い
る方法（特公昭51―23594号公報）、更に２―チア
ゾールアラニン耐性の他にＬ―アルギニン、Ｌ―
メチオニン、Ｌ―フエニルアラニン、Ｌ―プロリ
ン等のＬ―アミノ酸又はキサチン、グアニン等を
要求する変異株を使用する方法（特公昭51―
23593、51―24594号公報）等が知られている。 本発明者等はより高収率でＬ―ヒスチジンを生
産する微生物を育種することを目的として種々研
究した結果、ブレビバクテリウム属のＬ―ヒスチ
ジン生産菌にサイアミンアンタゴニスト耐性を付
与した変異株がより高い収率でＬ―ヒスチジンを
生産することを見い出した。本発明はこの発見に
基づいて完成されたものである。 本発明に於て用いられる微生物は、ブレビバク
テリウム属に属し、サイアミンアンタゴニストに
耐性を有し、更にＬ―ヒスチジン生産に必要な性
質、例えばヒスチジンアナログ耐性等を有する変
異株であり、代表的なものとして次のような変異
株が挙げられる。 ブレビバクテリウム・フラバム AJ11845
FERM―P6478（2TA※、トリアゾールカルボキ
サミド耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11846
FERM―P6479（2TA、トリアゾールカルボキサ
ミド、コバラミン耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11847
FERM―P6480（2TA、ピリサイアミン耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ11848
FERM―P6481（2TA、オキシサイアミン耐性） （※ 2TA：２―チアゾールアラニン） 本発明でいうサイアミンアンタゴニストとは、
ブレビバクテリウム属微生物の生育を阻害し、そ
の生育阻害がサイアミン（塩酸塩）の添加によつ
て部分的に又は完全に解除されるような化学薬剤
をいい、例えば、ピリサイアミン、オキシサイア
ミン、トリアゾールカルボキサミド等が挙げられ
る。 これらサイアミンアンタゴニスト耐性のＬ―ヒ
スチジン生産菌に、Ｌ―ヒスチジン生産性を高め
るのに有効な公知の性質、例えばＬ―メチオニ
ン、Ｌ―トリプトフアン、Ｌ―フエニルアラニン
等の要求性、サルフア剤、５―メチルトリプトフ
アン耐性等を付与したＬ―ヒスチジン生産能の高
い菌株を使用することが望ましく本発明をより一
層効果的に実施することができる。 本発明で使用する変異株は、ブレビバクテリウ
ム属に属したヒスチジンアナログ耐性のＬ―ヒス
チジン生産菌を親株とし、これに通常の変異処
理、例えば紫外線照射あるいはＮ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジン（以下、
NGと略す）、亜硝酸等で変異処理し、次いで変
異処理した菌体を親株が生育できない量のサイア
ミンアンタゴニストを含有する寒天平板培地で培
養し、該平板培地上に生育するコロニーをサイア
ミンアンタゴニスト耐性株として分離し、Ｌ―ヒ
スチジン生産能の高いものを選択することによつ
て採取される。 上記親株としてはヒスチジンアナログ耐性を有
するＬ―ヒスチジン生産菌の他に、Ｌ―ヒスチジ
ン生産に有用な公知の性質を有するＬ―ヒスチジ
ン生産菌、例えば、Ｌ―スレオニン、又はグアニ
ン要求性（特公昭51―24594号）、サルフア剤耐
性、コバラミン耐性（特開昭50―70591号公報）
のＬ―ヒスチジン生産菌等が使用され、具体的に
は次のようなものが挙げられる。 ブレビバクテリウム・フラバム AJ3225
ATCC21406（2TA耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ3579 FERM
―P2170（Ｌ―スレオニン要求性、2TA耐性） ブレビバクテリウム・フラバム AJ3620 FERM
―P2316（2TA、スルフアダイアジン、コバラミ
ン耐性） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3227ATCC21407 （2TA耐性） 再に本発明のＬ―ヒスチジン生産菌は次に示す
ような、いわゆるコリネフオームのＬ―グルタミ
ン酸生産菌を親株とし、これにヒスチジンアナロ
グ耐性及びサイアミンアンタゴニスト耐性を順次
又は任意の順に付与することによつて誘導するこ
とができる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC14066 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 以下の実験例にて、本発明の変異株の具体的誘
導方法の１例とサイアミンアンタゴニストに対す
る耐性度を示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・フラバム
AJ3225ATCC21406をイースト・ブイヨン基天ス
ラント培地で培養し、生育した菌体を集めて
0.02Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、これに
200μg／mlのNGを加え室温に30分間保持した。
このようにNG変異処理した菌体を同緩衝液で洗
滌した後、トリアゾールカルボキサミドを
1000μg／ml含む最少寒天プレート上（第１表）
に塗布、31.5℃で４日間培養した。
【表】
プレート上に生育したコロニーのうち大きなも
のを定性株として採取した。このようにして得ら
れた耐性株の中には親株よりＬ―ヒスチジン生産
性の高いものが多く見い出された。この内、最も
生産能の高い菌株AJ11845を撰択した。 次に、第１表に示す組成の生育測定用培地に第
２表に示す濃度の各薬剤を添加し、夫々試験管に
3.0ml宛分注し110℃で10分間加熱した。この培地
に、各試験菌を接種し（接種量107個／ml）、31℃
で48時間振盪培養した。培養液を水で26倍に希釈
し、その562nmに於る吸光度を測定して生育度を
求めた。その結果を第２表に示す。第２表には薬
剤無添加時の生育度を100とする相対値を示した。
のを定性株として採取した。このようにして得ら
れた耐性株の中には親株よりＬ―ヒスチジン生産
性の高いものが多く見い出された。この内、最も
生産能の高い菌株AJ11845を撰択した。 次に、第１表に示す組成の生育測定用培地に第
２表に示す濃度の各薬剤を添加し、夫々試験管に
3.0ml宛分注し110℃で10分間加熱した。この培地
に、各試験菌を接種し（接種量107個／ml）、31℃
で48時間振盪培養した。培養液を水で26倍に希釈
し、その562nmに於る吸光度を測定して生育度を
求めた。その結果を第２表に示す。第２表には薬
剤無添加時の生育度を100とする相対値を示した。
【表】
これらの微生物を培養する培地は炭素源、窒素
源、無機イオン及び更に必要に応じ、その他の有
機微量栄養素を含有する通常の培地である。 炭素源としてはグルコース、シユークロース、
澱粉加水分解物などの炭水化物、酢酸等の有機酸
等その他が使用できる。 窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、尿素等が好適である。 培養は好気的条件が望ましく、培養の間培地の
PHを４ないし８に、温度を25ないし37℃に調節し
つつ行えばより好ましい結果が得られる。 かくして、１ないし７日間も培養すれば培地中
に著量のＬ―ヒスチジンが生成蓄積される。 培養液よりＬ―ヒスチジンを採取する方法はオ
イン交換樹脂による方法等通常の方法で採取でき
る。 以下、実施例にて説明する。 実施例 グルコース10ｇ／dl、硫酸アンモニウム4.5
ｇ／dl、KH2PO40.2ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.1
ｇ／dl、FeおよびMnイオン各2ppm、ビオチン
100γ／、サイアミン塩酸塩100γ／、酢酸ア
ンモニウム1.0ｇ／dl、大豆タンパク塩酸加水分
解液70mg／dl（総窒素として）CaCO35ｇ／dlを
含みPH7.0に調節した培地を500ml容フラスコに20
ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺し、別塗加熱
殺菌した炭酸カルシウム1.0ｇを補添した。この
培地に、あらかじめブイヨン寒天スラント上に生
育させた各試験菌を接種し、31℃にて72時間振盪
培養した。 ヒスチジンの定量をKapeiler―Alder反応
〔Biochem.Z.，264，131（1933）〕を用いる比色法
によつて行つた。培養中へのＬ―ヒスチジンの蓄
積量は第３表に示すとおりである。
源、無機イオン及び更に必要に応じ、その他の有
機微量栄養素を含有する通常の培地である。 炭素源としてはグルコース、シユークロース、
澱粉加水分解物などの炭水化物、酢酸等の有機酸
等その他が使用できる。 窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、尿素等が好適である。 培養は好気的条件が望ましく、培養の間培地の
PHを４ないし８に、温度を25ないし37℃に調節し
つつ行えばより好ましい結果が得られる。 かくして、１ないし７日間も培養すれば培地中
に著量のＬ―ヒスチジンが生成蓄積される。 培養液よりＬ―ヒスチジンを採取する方法はオ
イン交換樹脂による方法等通常の方法で採取でき
る。 以下、実施例にて説明する。 実施例 グルコース10ｇ／dl、硫酸アンモニウム4.5
ｇ／dl、KH2PO40.2ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.1
ｇ／dl、FeおよびMnイオン各2ppm、ビオチン
100γ／、サイアミン塩酸塩100γ／、酢酸ア
ンモニウム1.0ｇ／dl、大豆タンパク塩酸加水分
解液70mg／dl（総窒素として）CaCO35ｇ／dlを
含みPH7.0に調節した培地を500ml容フラスコに20
ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺し、別塗加熱
殺菌した炭酸カルシウム1.0ｇを補添した。この
培地に、あらかじめブイヨン寒天スラント上に生
育させた各試験菌を接種し、31℃にて72時間振盪
培養した。 ヒスチジンの定量をKapeiler―Alder反応
〔Biochem.Z.，264，131（1933）〕を用いる比色法
によつて行つた。培養中へのＬ―ヒスチジンの蓄
積量は第３表に示すとおりである。
【表】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11846を同様
の方法で培養し、培養液を遠心分離して不溶性物
質を除去し、得られた上清1.0を強酸性陽イオ
ン交換樹脂“ダイヤイオン SK―1B”（NH+ 4）
に通加してＬ―ヒスチジンを吸着させた。樹脂を
水洗後2N―アンモニア水にて溶出し、ついで溶
出液を濃縮しこれよりＬ―ヒスチジンの粗結晶
12.5ｇを得た。
の方法で培養し、培養液を遠心分離して不溶性物
質を除去し、得られた上清1.0を強酸性陽イオ
ン交換樹脂“ダイヤイオン SK―1B”（NH+ 4）
に通加してＬ―ヒスチジンを吸着させた。樹脂を
水洗後2N―アンモニア水にて溶出し、ついで溶
出液を濃縮しこれよりＬ―ヒスチジンの粗結晶
12.5ｇを得た。
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属に属しサイアミンアン
タゴニストに耐性を有し、かつＬ―ヒスチジン生
産能を有する特生物を培養して培養液中にＬ―ヒ
スチジンを生成・著積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ―ヒスチジンの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17166182A JPS5963194A (ja) | 1982-09-30 | 1982-09-30 | 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17166182A JPS5963194A (ja) | 1982-09-30 | 1982-09-30 | 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5963194A JPS5963194A (ja) | 1984-04-10 |
| JPH0218838B2 true JPH0218838B2 (ja) | 1990-04-26 |
Family
ID=15927348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17166182A Granted JPS5963194A (ja) | 1982-09-30 | 1982-09-30 | 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5963194A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1813677B1 (en) | 2004-10-07 | 2019-02-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzymatic process for producing basic amino acids |
-
1982
- 1982-09-30 JP JP17166182A patent/JPS5963194A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5963194A (ja) | 1984-04-10 |
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