HU214909B

HU214909B - Eljárás L-triptofán előállítására

Info

Publication number: HU214909B
Application number: HU912820A
Authority: HU
Inventors: Kazuhiro Furukawa; Kuniki Kino; Yoshiyuki Kuratsu; Yasuhiro Tomiyoshi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1998-07-28
Also published as: DE69110580T2; JPH04112795A; MX9100859A; DE69110580D1; US5275940A; JP3023615B2; EP0473094A2; HU912820D0; EP0473094A3; CA2049863C; EP0473094B1; HUT61600A; CA2049863A1

Abstract

A találmány tárgya eljárás L-triptőfán előállítására a Cőrynebacteriűmnemzetséghez tartőzó, egy aminő-kinőlin-származékra vagy egyfenőtiazin-származékra rezisztens és L-triptőfán termelésé e képesmikrőőrganizműs tenyésztésével. A főkőzőtt L-triptőfántermelőképességű és megfelelő rezisztenciával rendelkező törzs(ek)etszőkásős műtációs technikákkal állítják elő, majd a megfelelővegyületet tartalmazó táptalajőn szelektálják A szelektált törzseketaddig tenyésztik, amíg az L-triptőfán felhalmőzódik a tenyészetben,majd űtána kinyerik az L-triptőfánt a tenyészetből. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás L-triptofán előállítására a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, egy aminokinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens és L-triptofán termelésére képes mikroorganizmus tenyésztésével. Az L-triptofán gyógyszerhatóanyagként vagy tápanyagként és állati takarmányok adalékaként használt aminosav.

Ez ideig ismertek különböző eljárások L-triptofán előállítására glutaminsav-termelő Coryneform baktériumok tenyésztésével. Ilyen eljárás például egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, növekedéséhez L-tirozint és L-fenilalanint igénylő és a tirozin-analógok és fenilalanin-analógok legalább egyikére rezisztens mikroorganizmust alkalmazó eljárás (19037/76 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés); egy triptofán-analógra, például 5-metiltriptofánra rezisztens mikroorganizmust alkalmazó eljárás (18828/73, 38795/76 és 39517/78 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés); egy hisztidin auxotrófot alkalmazó eljárás (4505/72 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés); egy, a Brevibacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmusnak csökkent vagy hiányzik a piruvátkináz aktivitása (253391/87 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés); egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmusnak csökkent vagy hiányzik a foszfo-enolpiruvátkarboxiláz aktivitása (317397/89 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés) stb.

Ipari alkalmazás céljára állandó igény jelentkezik egy L-triptofán gazdaságos előállítására szolgáló eljárás kifejlesztésére.

Találmányunk szerint az L-triptofánt magas kitermeléssel és alacsony költséggel úgy állítjuk elő, hogy egy Corynebacterium nemzetséghez tartozó, egy amino-kinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens és L-triptofán termelésére képes mikroorganizmust valamilyen táptalajban addig tenyésztünk, amíg az L-triptofán felhalmozódik a tenyészetben, és utána kinyeijük onnan az L-triptofánt.

Az amino-kinolin-származék egy olyan vegyületet jelent, amely amino-kinolin vázzal rendelkezik. Ilyen például egy 4-amino-kinolin-származék, így klorokin, amodiakin stb., egy 8-amino-kinolin-származék, így primakin, pentakin stb. Ezeknek a vegyületeknek a sói, például foszfátjai, hidrokloridjai stb. is használhatók. Ezek a vegyületek mind maláriaellenes hatású anyagokként ismertek.

A fenotiazin-származék egy olyan vegyületet jelent, amely fenotiazin vázzal rendelkezik. Ilyen például a fenotíazin, egy dimetil-amino oldalláncot hordozó fenotiazin-származék, így promazin, klór-promazin, prometazin stb. Ezen vegyületek sói, például hidrokloridjai is használhatók. Ezek a vegyületek mind antipszichotikus hatású anyagokként ismertek.

A találmányunk szerinti eljárásban mikroorganizmusként bármely olyan mikroorganizmus használható, amennyiben az a Corynebacterium nemzetséghez tartozik, amelyek Coryneform glutaminsavtermelő baktériumokként ismertek, és amely mikroorganizmus képes

L-triptofánt termelni és rezisztens egy amino-kinolinszármazékra vagy egy fenotiazin-származékra.

Az amino-kinolin-származékra vagy fenotiazinszármazékra rezisztenciával rendelkező, L-triptofánt termelő mikroorganizmus az amino-kinolin-származékra vagy fenotiazin-származékra való rezisztenciának egy ismert L-triptofánt termelő mikroorganizmusba való bevitelével nyerhető. Ugyanígy, az L-triptofánt termelő, egy amino-kinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens mikroorganizmus az L-triptofán termelést fokozó mutációnak, például auxotrófiának, analóg rezisztenciának stb. egy vad törzsből származó és amino-kinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens mutánsba való bevitelével is nyerhető. Az L-triptofánt termelő mutáns növekedéséhez L-tirozint vagy L-fenilalanint igénylő törzsként szelektálható [Journal of Agricultural Chemical Association, 50(1), R79 (1976)].

Az amino-kinolin-származékra vagy fenotiazinszármazékra rezisztenciával rendelkező mutáns a találmányunk szerinti eljárásban szokásos mutációs technikák, például UV-besugárzás és N-metil-N’-nitro-Nnitrozo-guanidinnel (továbbiakban rövidítve NTG), salétromsavval stb. végzett kémiai kezelés alkalmazásával nyerhető, és az ilyen rezisztens mutánst olyan törzsként szelektáljuk, amely képes nőni egy amino-kinolinszármazékot vagy egy fenotiazin-származékot olyan koncentrációban tartalmazó agarlemezen, amelyen a megfelelő vad törzs növekedésre képtelen.

Egy amino-kinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens, L-triptofánt termelő mikroorganizmusra példaként a primakin-rezisztens Corynebacterium glutamicum H-7853, a klorokin-rezisztens Corynebacterium glutamicum H-7854 és a promazin-rezisztens Corynebacterium glutamicum H-8014 említhető. Ezeket a törzseket a Budapesti Egyezménynek megfelelően 1990. augusztus 10. óta letétben tartjuk a Japán Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség Fermentációs Kutató Intézeténél (Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan) a FERM BP-3055, FERM BP-3056 és FERM BP-3057 letéti számokon.

Találmányunk szerint az L-triptofán előállítását úgy végezzük, hogy a fenti mikroorganizmusokat szokásos módon tenyésztjük. Táptalajként bármely szintetikus vagy természetes táptalaj használható, amennyiben megfelelő szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen vegyületeket és a használt törzs által igényelt nyomnyi mennyiségű egyéb tápanyagokat tartalmaz.

Szénforrásként szénhidrátok, például glükóz, glicerin, fruktóz, szacharóz, maltóz, mannóz, keményítő, keményítő-hidrolizátum, melasz, polialkoholok stb. és különböző szerves savak, például pirosszőlősav, fumársav, tej sav, ecetsav stb. használhatók. Az alkalmazandó mikroorganizmus asszimiláló-képességétől függően szénhidrogének, alkoholok stb. is használhatók. Különösen előnyös a melasz használata.

HU 214 909 Β

Nitrogénforrásként ammónia, különböző szervetlen és szerves ammóniumsók, például ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónium-karbonát, ammóniumacetát stb., karbamid és egyéb nitrogéntartalmú vegyültek, nitrogéntartalmú szerves anyagok, például pepton, NZ-aminok, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, kazeinhidrolizátum, halliszt vagy lebontott terméke stb. használhatók.

Szervetlen vegyületekként kálium-dihidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, ammónium-szulfát, ammónium-klorid, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(II)-szulfát, mangán(II)- szulfát, kalcium-karbonát stb. használható.

A tenyésztést aerob körülmények között, például rázatott tenyészetben vagy levegőztetett merített tenyészetben stb. végezzük. A tenyészet hőmérsékletét előnyösen 20 °C és 40 °C közötti tartományban tartjuk. A táptalaj pH-ját a tenyésztés alatt előnyösen semleges körül tartjuk. A tenyésztés általában 1-5 napon belül befejeződik.

A tenyésztés befejezése után a kiválásokat, például sejteket stb. eltávolítjuk a tenyészetből, és az Ltriptofánt a felülúszóból ismert technikákkal, például kristályosító töményítéssel, aktív szenes kezeléssel vagy ioncserélő gyantás kezeléssel stb. nyerhetjük ki.

A következőkben a találmányt részletesen szemléltetjük az alábbi példákkal.

1. példa

A találmány szerinti mutáns törzs előállítása.

Kiindulási törzsként az L-triptofán termelésére képes Corynebacterium glutamicum BPS-13 törzset (FERM BP-1777, 317395/89 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés) használjuk. A sejteket 30 °C-on 16 óra hosszat tenyésztjük teljes (1 liter vízben 20 g húsléport és 50 g élesztőkivonatot tartalmazó, 7,2 pH-ra beállított) táptalajban, utána a sejteket összegyűjtjük, és 7,2 pH-jú 0,05 mólos foszfátpufferral mossuk. A sejteket utána a pufferban szuszpendálva körülbelül 10⁹ sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk. A szuszpenzióhoz 500 pg/ml végkoncentrációig NTG-t adunk, majd az elegyet hagyjuk 30 °C-on 20 percig állni, hogy létrejöjjön a mutáció. Utána a sejteket mossuk a pufferral, és szélesztjük egy 0,2 mM primakin-foszfátot tartalmazó és az 1 .táblázatban megadott összetételű agarlemezen.

1. táblázat

Minimál táptalaj összetétele

glükóz	10 g/1
ammónium-dihidrogén-foszfát	lg/1
kálium-klorid	10 g/1
magnézium-szulfát—víz (1/7)	0,2 mg/1
vas(II)-szulfát-víz (1/7)	0,2 g/1
mangán(II)-szulfát-víz (1/4—1/6)	0,2 mg/1
cink(II)-szulfát-víz (1/7)	0,9 mg/1

réz(II)-szulfát-víz (1/5)	0,4 mg/1
dinátrium-tetraborát-víz (1/10)	0,09 mg/1
ammónium-molibdenát [(NH₄)₆Mo₇O₂₄x4 H₂O]	0,04 mg/1
biotin	50 pg/l
p-amino-benzoesav	2,5 mg/1
tiamin-hidroklorid	1 mg/1
L-tirozin	50 mg/1
L-fenilalanin	50 mg/1
agar	16 g/1
	(pH 7,2)

°C-on 5-10 napig tartó tenyésztés után az agarlemezen kinőtt nagy telepeket leszedjük, és Ltriptofán-termelési vizsgálatnak vetjük alá. Szelektálunk egy mutánst, amelynek L-triptofánt termelő képessége jobb, mint a Corynebacterium glutamicum BPS-13-é.

A szelektált törzset, amely primakinre rezisztens, Corynebacterium glutamicum Η-7853-nak nevezzük. A primakin-rezisztens mutáns előállítására előbb leírt eljárást megismételjük, azzal az eltéréssel, hogy 0,2 mM primakin-foszfát helyett 0,3 mM klorokin-foszfátot vagy 0,3 mM promazin-hidrokloridot tartalmazó táptalajt használunk. így a klorokin-rezisztens Corynebacterium glutamicum H-7854 mutánst, illetve a promazin-rezisztens Corynebacterium glutamicum H-8014 mutánst kapjuk.

Az így kapott mutánsokat és az eredeti törzset (BPS-13) összehasonlítjuk egymással rezisztens tulajdonságaik szempontjából. Az eredményeket a 2., 3. és 4. táblázatokban mutatjuk be. Az egyes törzseket 30 °C-on 24 óra hosszat tenyésztjük az előbb leírt összetételű teljes táptalajban. A sejtek fiziológiás nátrium-klorid-oldatban való szuszpendálásával körülbelül 10⁴ sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk. A szuszpenzió 0,1 ml-ét szélesztjük az 1. táblázatban megadott összetételű agarlemezeken, amelyek a 2., 3. és 4. táblázatban feltüntetett mennyiségű primakin-foszfátot, klorokin-foszfátot, illetve promazin-hidrokloridot tartalmaznak. A rezisztenciát 30 °C-on 7 napig végzett tenyésztés után határozzuk meg a növekedési fokozat megállapításával.

Az eredmények azt jelzik, hogy a mutánsok növekedését az illető vegyületek olyan koncentrációban nem gátolják, amilyen koncentrációnál az eredeti kiindulási törzs már nem képes növekedni; ez azt mutatja, hogy a mutánsok erős rezisztenciát szereztek az egyes vegyületekre.

2. táblázat

Primakin-foszfát (mM)

Törzs	0	0,1	0,15	0,2
BPS-13	+	-	-	-
H-7853	+	+	+	±

HU 214 909 Β

3. táblázat

Klorokin-foszfát (mM)

Törzs	0	0,1	0,2	0,3
BPS-13	+	+	±	-
H-7854	+	+	+

4. táblázat

Promazin-hidroklorid

Törzs	0	0,1	0,15	0,2
BPS-13	+	-	-	-
H-7854	+	+	+	±

++: megfelelő növekedés +: mérsékelt növekedés ±: gyenge növekedés nincs növekedés

2. példa

L-Triptofán termelési vizsgálat

Az 1. példában kapott Corynebacterium glutamicum H-7853, H-7854 és H-8014 törzseket és az eredeti BPS-13 törzset 20 ml oltótáptalajba inokuláljuk, amely w t/tf.% nátrium-kloridot, 1,5 t/tf.% polipeptont, 1,5 t/tf.% élesztőkivonatot, 0,25 t/tf.% nátrium-kloridot, 0,1 t/tf.% karbamidot, 200 mg/1 Ltirozint és 200 mg/1 L-fenilalanint tartalmaz (pH = 7,2), és egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 30 °C-on 24 óra hosszat tenyésztjük egy körkörös rázógépen 210 ford./percnél rázatva. Ezután a kapott oltótenyészetből 2 ml-t inokulálunk 20 ml alább megadott összetételű fermentációs táptalajba, és egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 72 óra hosszat tenyésztjük az oltótenyészetnél megadottakhoz hasonló módon.

A fermentációs táptalaj összetétele:

t/tf.% glükóz, 0,05 t/tf.% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,05 t/tf.% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,025 t/tf.% magnézium-szulfát-víz (1/7), 0,025 t/tf.% ammóniumszulfát, 30 pg/l biotin, 10 mg/1 mangán(II)-szulfát-víz (1/7), 0,5 t/tf.% kukoricalekvár, 2 t/tf.% kalcium-karbonát (pH = 7,2).

A tenyésztés befejezése után a felhalmozódott Ltriptofánt nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) kvantitatíve meghatározzuk.

Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.

5. táblázat

Törzs	L-triptofán (g/1)
BPS-13	7,2
H-7853	8,7
H-7854	8,2
H-8014	8,6

A H-7853 törzs tenyésztésével kapott L-triptofántartalmú fermentlé 2 literéből centrifügálással eltávolítjuk a sejteket, a kalcium-karbonátot és egyéb szennyezéseket. A kapott felülúszót egy erősen savas Diaion SK-104 (H⁺-ciklus) (a Mitsubishi Kaséi Corporation, Japán terméke) kationcserélő gyantával töltött oszlopon átengedve felkötjük az L-triptofánt. Az oszlopot utána vízzel lemossuk, majd 0,5 M vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot sómentesítjük, és a kapott nyers porszerű kristályos L-triptofánt kevés meleg 50 tf.%-os vizes etanolban oldjuk. Az oldatot aktív szénnel kezelve derítjük. A szűrletből lehűtés után 12,2 g kristályos L-triptofánt kapunk.

Claims

1. Eljárás L-triptofán előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, egy amino-kinolin-származékra vagy egy fenotiazin-származékra rezisztens és L-triptofán termelésére képes mikroorganizmust megfelelő táptalajban tenyésztünk, majd a termelődött L-triptofánt ismert módon kinyeijük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a klorokin és primakin és sóik közül választott, amino-kinolin-származékra rezisztens mikroorganizmust tenyésztünk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promazin és sói közül választott, fenotiazin-származékra rezisztens mikroorganizmust tenyésztünk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmust tenyésztünk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a primakin-rezisztens Corynebacterium glutamicum FERM BP-3055 vagy a klorokin-rezisztens Corynebacterium glutamicum FERM BP-3056 vagy a promazin-rezisztens Corynebacterium glutamicum FERM BP-3057 törzset tenyésztjük.