JPS6012997A - 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

発酵法によるl−トリプトフアンの製造法

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JPS6012997A
JPS6012997A JP12197383A JP12197383A JPS6012997A JP S6012997 A JPS6012997 A JP S6012997A JP 12197383 A JP12197383 A JP 12197383A JP 12197383 A JP12197383 A JP 12197383A JP S6012997 A JPS6012997 A JP S6012997A
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杉本 信幸
Katsuaki Sato
勝明 佐藤
Yasushi Morinaga
康 森永
Takashi Tanaka
崇 田中
Takao Kida
隆夫 木田
Hiroshiro Shibai
柴井 博四郎
Hitoshi Ei
仁 江井
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法によるL−)リプトフ7ン(以下、ト
リプトファンと記す)の製造法に関する。
従来トリプトファンの製造法としては、トリプトファン
の前駆物質であるアントラニル酸、インドールあるいは
3−インドールピルビン酸よりトリプトファンを製造す
る方法が知られている。
これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物質を使用
しないで、糖類等を炭素源とし、ブレビバクテリウム属
に属し5−メチルトリプトファンなどのトリプトファン
アナログに耐性を有する変異株又は5−メチルトリプト
ファンなどのトリプトファンアナジグに耐性を有し、か
つフエー・レアラニン又は、およびチーシン要求性を示
す変異株(以下、トリプトファン生産能を有する微生物
と略す。)を使用して直接発酵法によりトリプトファン
を生産する方法(特公昭48−18828 )が開発さ
れている。
本発明者らは、さらに効率よくトリプトファンを発酵生
産する方法を開発することを目的として研究を重ねた結
果、ブレビバクテリウム属及びブリネバクテリウム属な
どのプリネフォルムバクテリアに属し、NlN−ビス−
(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホスホノメチ
ル)グリシンに耐性を有しトリプトファン生産能を有す
る微生物が、従来のトリプトファン生産能を有する微生
物より更に多量のトリプトファンを生成、蓄積すること
を見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成された
ものである。即ち本発明は、ブレビバクテリウム屈及び
コリネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリア
に属し、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN、N
−ビス−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を有し、か
つL−トリプトファン生産能を有する微生物を液体培地
中で好気的に培養し、培地中にL−)!jブトファンを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵
法による1、−)9ブト77ンの製造法に関する。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でバーデース・マニアル・オプーデター
ミネイティブバクテリオpジー第8版599頁(197
4)に記載されている。
本発明の方法でυ1用される変異株はブレビバクテリウ
ム夙及びコリネバクテリウム属などのコリネフォルムバ
クテリアに屈し、N、N−ビス−(ホスホ/メチル)グ
リシンまたはN−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を
有し、かつ、L−トリプトファンを生産する能力を有す
る微生物であり、例えば次のような変異株が使用される
グルタミl A (IMF、 BPMGr)5−M’F
 : 5−メチルトリプトファン耐性5−FT’ : 
5−フルオートリプトファン耐性BPMGr : N、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ4J性PMGr 
: N−(ホスホノメチル)グリシン耐性IMr : 
インドールマイシン耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリアに
、属するトリプトファン生産能を有する微生物を親株と
して、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線、X線
照射あるいはN−メチル−N1−二tl−N−ニトロソ
グアニジン(NGと略す)、亜硝酸等の化学薬剤処理を
施し、変異処理した菌体な親株が生育できないような量
のN、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホ
スホノメチル)グリシンを含有する寒天平板培地で培養
し、平板培地上に生育するコロニーを分離することに゛
よって得らhる。
上記ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属な
どのコリネフォルムバクテリアに属するトリプトファン
生産能を有する微生物は公知のものを使用すればよいが
、具体例としては次のような変異株が使用される。
ブレビバ/テ’)つA −AJ 12042 FERM
−P 7/上!ラクトフエルメンタA (5−MTr、
 5−FTr)コリネバクテリウム−AJ11492 
FIRM−P 5294グルタミクム (IMF) 親株としCはこの他フリネフォルムバクテリアに属する
微生物、特にグルタミン酸生産性細菌として知らjtて
いる微生物を用いることができる。
このような親株にN、N−ビス−(ホスホノメチル)グ
リシン耐性および、またはN−(ホスホ/メチル)グリ
シン耐性およびトリプトファン生産性を付与することに
よって目的とするトリプトファン生産菌を誘導すること
ができる。
この場合、N、N−ビス−(ホスホノメチル)グリシン
耐性および、又はN−(ホスホノメチル)グリシン耐性
をあらかじめ付与した後に従来からドリフトファン生産
性を付与する性質として知らンアナログに対する耐性又
は5−メチルトリプトファンなどのトリプトファンアナ
ジグに対する耐性、およびフェニルアラニン又は、及び
チロシン要求性を付与することもできるし、逆にあらか
じめ従来から知られているトリプトファン生産能を付与
する性質を伺与した後にN、N−ビス−(ホスホノメチ
ル)グリシン耐性および、又はN−(ホスホノメチル)
グリシン耐性をイツ与しても良い。このような親株の例
としては、ブレビバクテリウム・デパリカタムATCC
14020,ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼラム
ATCC14066、ブレビバクテリウム自フラバムA
TCC14067、コリネバクテリウム・7セトアシド
フイラムATCC11870、フリネバクテリウムeア
セトグルタミクムATCC15806、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムATCC13032等がある。
次に本発明で使用する変異株の変異誘導法および薬剤に
対する耐性度を以下の実験例にて示す。
実験例1 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC1
3869より誘導した5−メチルトリプトファン耐性、
5−フルオロトリプトファン耐性のトリプトファン生産
菌AJ12042FERM−P7メ)−! をイースト
ブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体な集めて
”/M!J(資) ン酸緩衝液(pH7,0)に懸渇しく108〜109個
/−の菌体な含む)、これにNGを加え(NG濃度は2
00μf / me )、室温で30分間保易した。こ
のようにしてNG処理した菌体な同リン酸緩衝液で充分
洗浄した後、N、N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ
ンを含む第1表に示す最小寒天平板培地に塗布し、31
.5℃で4〜10日間培養した。
第1表 最小培地の組成(pH7,0)成分 含分。
グルコース 209/L 硫酸アンモニウム 51 尿 素 21 KH,PO411 Mg504−7H,011 Fe 、Mn イオン 2ppm ビオチン 5opt7t サイアミン塩酸塩 200 I DL−メチオニン 20 o mg/ tL−チロシン
 100 # 塞大平板上に生育したフロニーのうち大きなものをN、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシン耐性株として採
取した。このようにして得られた耐性株の内には親株よ
りトリプトファン生産能の優れたものが多く見い出され
た。この内生産能の最も高い菌株AJ12043を選ん
だ。同様の変異操作によりAJ12042を親株として
N−(ホスホノメチル)グリシン耐性株ha 1204
4を誘導した。
マタ全く同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミク
ムAJ11492を親株としてN、N−ビス−(ホスホ
ノメチル)グリシン耐性株AJ/:L01−2− を誘
導した。
次にこのようにして得た変異株のN、N−ビス−(ホス
ホノメチル)グリシン耐性度、およびN−(ホスホノメ
チル)グリシン耐性度の結果を第2表に示す。
第2表 薬剤耐性度 メチル)グリシン グリシン 0 500 1(10021)F)0 50 100 
21Xl 30G12043 100 98 80 5
8 90 80 65 4012044 100 89
 78 54 95 85 72 5511492 1
00 0 0 0 0 0 0 01ユct上 100
 88 45 20 80 4(18020実験方法は
、各変異株の菌体な第1表の最小培地で良く洗浄した後
、小型試験管に入れた第2表に示す所定量の薬剤を含む
最小培地(4−)に一定量接種し、31.5℃で24時
間振盪培養を行い、培養液の560nm に於る吸光度
を測定して生育度をめた。第2表にはその相対生育値を
示した。
本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、ソ
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素
源としては使用する変異株の利用可能なものであれば良
く、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース
、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、そ
の他、エタノール、プロパツール等のアルコール類、酢
酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によってはノルマ
ルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使
用される。
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
ン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育に、アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使
用する場合には要求される栄養素を補添することが必要
である。
培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培
地のpHな5ないし9、温度を20℃ないし40℃に制
御しつつ1日ないし4日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりトリプトファンが蓄量培養液中に蓄私され
る。培養液からトリプトファンを採取する方法は公知の
方法に従って行えば良く、培養液から菌体な分離除去し
た後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用い
る方法等により採取される。
以下、実施例にて説明する。
実施例1 下記第3表に示すトリプトファン生産用培地を追加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末109を補添した。
第3表 トリプトファン生産用培地(p H7,(+ 
)成分 濃度 成分 濃度 グ/l/:Ill −7,13,0f/de MnMn
SO44H1,囲11/&J硫酸アンモニウム 1.O
#L−チロシン 4o #IGf、PO413# DL
−/チオニア40 1Mg5O4−7H,OO,04#
 大豆蛋白分m液 3.0 ml/diビオチン5.o
llt/dl ニアv −ル液 1.2 t/dl。
サイアミン塩酸塩 20 1 酢酸 u31FeSO4
−7H,0111119/if/コノ培地に第4表に示
すトリプトファン生産菌を1白金耳接種し、30℃で7
2時間振盪培養した。培養液中のトリプトファン生成量
を測定し、その結果を第4表に示した。
第4表 トリプトファンのN Iff Ji菌 株 蓄
積量Ctldl) AJ12042 (FERM−P 7tユi) 0.2
0AJ12043 (FERM−P 7/工4) 0.
40AJI2044 (FERM−P /’/上ン )
 0.38AJ11492 (FERM−P 5294
) 0.018AJ /−)−otb (FERM−P
 7/iJ’ ) 0.035−RFtl −

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. ブレビバクテリウム属及びフリネバクテリウム属に属し
    、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN、N−ビス
    −(ホスホノメチル)グリシンに耐性を有し、かつL−
    トリプトファン生産能を有する微生物を液体培地中で好
    気的に培養し、培地中にL−)リプトファンを生成蓄積
    せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法による
    L−)リプトファンの製造法。
JP12197383A 1983-07-05 1983-07-05 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 Granted JPS6012997A (ja)

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