JPS6012997A - 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−トリプトフアンの製造法Info
- Publication number
- JPS6012997A JPS6012997A JP12197383A JP12197383A JPS6012997A JP S6012997 A JPS6012997 A JP S6012997A JP 12197383 A JP12197383 A JP 12197383A JP 12197383 A JP12197383 A JP 12197383A JP S6012997 A JPS6012997 A JP S6012997A
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- Japan
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- tryptophan
- glycine
- phosphonomethyl
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、発酵法によるL−)リプトフ7ン(以下、ト
リプトファンと記す)の製造法に関する。
リプトファンと記す)の製造法に関する。
従来トリプトファンの製造法としては、トリプトファン
の前駆物質であるアントラニル酸、インドールあるいは
3−インドールピルビン酸よりトリプトファンを製造す
る方法が知られている。
の前駆物質であるアントラニル酸、インドールあるいは
3−インドールピルビン酸よりトリプトファンを製造す
る方法が知られている。
これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物質を使用
しないで、糖類等を炭素源とし、ブレビバクテリウム属
に属し5−メチルトリプトファンなどのトリプトファン
アナログに耐性を有する変異株又は5−メチルトリプト
ファンなどのトリプトファンアナジグに耐性を有し、か
つフエー・レアラニン又は、およびチーシン要求性を示
す変異株(以下、トリプトファン生産能を有する微生物
と略す。)を使用して直接発酵法によりトリプトファン
を生産する方法(特公昭48−18828 )が開発さ
れている。
しないで、糖類等を炭素源とし、ブレビバクテリウム属
に属し5−メチルトリプトファンなどのトリプトファン
アナログに耐性を有する変異株又は5−メチルトリプト
ファンなどのトリプトファンアナジグに耐性を有し、か
つフエー・レアラニン又は、およびチーシン要求性を示
す変異株(以下、トリプトファン生産能を有する微生物
と略す。)を使用して直接発酵法によりトリプトファン
を生産する方法(特公昭48−18828 )が開発さ
れている。
本発明者らは、さらに効率よくトリプトファンを発酵生
産する方法を開発することを目的として研究を重ねた結
果、ブレビバクテリウム属及びブリネバクテリウム属な
どのプリネフォルムバクテリアに属し、NlN−ビス−
(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホスホノメチ
ル)グリシンに耐性を有しトリプトファン生産能を有す
る微生物が、従来のトリプトファン生産能を有する微生
物より更に多量のトリプトファンを生成、蓄積すること
を見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成された
ものである。即ち本発明は、ブレビバクテリウム屈及び
コリネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリア
に属し、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN、N
−ビス−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を有し、か
つL−トリプトファン生産能を有する微生物を液体培地
中で好気的に培養し、培地中にL−)!jブトファンを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵
法による1、−)9ブト77ンの製造法に関する。
産する方法を開発することを目的として研究を重ねた結
果、ブレビバクテリウム属及びブリネバクテリウム属な
どのプリネフォルムバクテリアに属し、NlN−ビス−
(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホスホノメチ
ル)グリシンに耐性を有しトリプトファン生産能を有す
る微生物が、従来のトリプトファン生産能を有する微生
物より更に多量のトリプトファンを生成、蓄積すること
を見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成された
ものである。即ち本発明は、ブレビバクテリウム屈及び
コリネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリア
に属し、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN、N
−ビス−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を有し、か
つL−トリプトファン生産能を有する微生物を液体培地
中で好気的に培養し、培地中にL−)!jブトファンを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵
法による1、−)9ブト77ンの製造法に関する。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でバーデース・マニアル・オプーデター
ミネイティブバクテリオpジー第8版599頁(197
4)に記載されている。
あり、非抗酸性でバーデース・マニアル・オプーデター
ミネイティブバクテリオpジー第8版599頁(197
4)に記載されている。
本発明の方法でυ1用される変異株はブレビバクテリウ
ム夙及びコリネバクテリウム属などのコリネフォルムバ
クテリアに屈し、N、N−ビス−(ホスホ/メチル)グ
リシンまたはN−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を
有し、かつ、L−トリプトファンを生産する能力を有す
る微生物であり、例えば次のような変異株が使用される
。
ム夙及びコリネバクテリウム属などのコリネフォルムバ
クテリアに屈し、N、N−ビス−(ホスホ/メチル)グ
リシンまたはN−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を
有し、かつ、L−トリプトファンを生産する能力を有す
る微生物であり、例えば次のような変異株が使用される
。
グルタミl A (IMF、 BPMGr)5−M’F
: 5−メチルトリプトファン耐性5−FT’ :
5−フルオートリプトファン耐性BPMGr : N、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ4J性PMGr
: N−(ホスホノメチル)グリシン耐性IMr :
インドールマイシン耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリアに
、属するトリプトファン生産能を有する微生物を親株と
して、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線、X線
照射あるいはN−メチル−N1−二tl−N−ニトロソ
グアニジン(NGと略す)、亜硝酸等の化学薬剤処理を
施し、変異処理した菌体な親株が生育できないような量
のN、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホ
スホノメチル)グリシンを含有する寒天平板培地で培養
し、平板培地上に生育するコロニーを分離することに゛
よって得らhる。
: 5−メチルトリプトファン耐性5−FT’ :
5−フルオートリプトファン耐性BPMGr : N、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ4J性PMGr
: N−(ホスホノメチル)グリシン耐性IMr :
インドールマイシン耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属などのコリネフォルムバクテリアに
、属するトリプトファン生産能を有する微生物を親株と
して、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線、X線
照射あるいはN−メチル−N1−二tl−N−ニトロソ
グアニジン(NGと略す)、亜硝酸等の化学薬剤処理を
施し、変異処理した菌体な親株が生育できないような量
のN、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN−(ホ
スホノメチル)グリシンを含有する寒天平板培地で培養
し、平板培地上に生育するコロニーを分離することに゛
よって得らhる。
上記ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属な
どのコリネフォルムバクテリアに属するトリプトファン
生産能を有する微生物は公知のものを使用すればよいが
、具体例としては次のような変異株が使用される。
どのコリネフォルムバクテリアに属するトリプトファン
生産能を有する微生物は公知のものを使用すればよいが
、具体例としては次のような変異株が使用される。
ブレビバ/テ’)つA −AJ 12042 FERM
−P 7/上!ラクトフエルメンタA (5−MTr、
5−FTr)コリネバクテリウム−AJ11492
FIRM−P 5294グルタミクム (IMF) 親株としCはこの他フリネフォルムバクテリアに属する
微生物、特にグルタミン酸生産性細菌として知らjtて
いる微生物を用いることができる。
−P 7/上!ラクトフエルメンタA (5−MTr、
5−FTr)コリネバクテリウム−AJ11492
FIRM−P 5294グルタミクム (IMF) 親株としCはこの他フリネフォルムバクテリアに属する
微生物、特にグルタミン酸生産性細菌として知らjtて
いる微生物を用いることができる。
このような親株にN、N−ビス−(ホスホノメチル)グ
リシン耐性および、またはN−(ホスホ/メチル)グリ
シン耐性およびトリプトファン生産性を付与することに
よって目的とするトリプトファン生産菌を誘導すること
ができる。
リシン耐性および、またはN−(ホスホ/メチル)グリ
シン耐性およびトリプトファン生産性を付与することに
よって目的とするトリプトファン生産菌を誘導すること
ができる。
この場合、N、N−ビス−(ホスホノメチル)グリシン
耐性および、又はN−(ホスホノメチル)グリシン耐性
をあらかじめ付与した後に従来からドリフトファン生産
性を付与する性質として知らンアナログに対する耐性又
は5−メチルトリプトファンなどのトリプトファンアナ
ジグに対する耐性、およびフェニルアラニン又は、及び
チロシン要求性を付与することもできるし、逆にあらか
じめ従来から知られているトリプトファン生産能を付与
する性質を伺与した後にN、N−ビス−(ホスホノメチ
ル)グリシン耐性および、又はN−(ホスホノメチル)
グリシン耐性をイツ与しても良い。このような親株の例
としては、ブレビバクテリウム・デパリカタムATCC
14020,ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼラム
ATCC14066、ブレビバクテリウム自フラバムA
TCC14067、コリネバクテリウム・7セトアシド
フイラムATCC11870、フリネバクテリウムeア
セトグルタミクムATCC15806、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムATCC13032等がある。
耐性および、又はN−(ホスホノメチル)グリシン耐性
をあらかじめ付与した後に従来からドリフトファン生産
性を付与する性質として知らンアナログに対する耐性又
は5−メチルトリプトファンなどのトリプトファンアナ
ジグに対する耐性、およびフェニルアラニン又は、及び
チロシン要求性を付与することもできるし、逆にあらか
じめ従来から知られているトリプトファン生産能を付与
する性質を伺与した後にN、N−ビス−(ホスホノメチ
ル)グリシン耐性および、又はN−(ホスホノメチル)
グリシン耐性をイツ与しても良い。このような親株の例
としては、ブレビバクテリウム・デパリカタムATCC
14020,ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼラム
ATCC14066、ブレビバクテリウム自フラバムA
TCC14067、コリネバクテリウム・7セトアシド
フイラムATCC11870、フリネバクテリウムeア
セトグルタミクムATCC15806、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムATCC13032等がある。
次に本発明で使用する変異株の変異誘導法および薬剤に
対する耐性度を以下の実験例にて示す。
対する耐性度を以下の実験例にて示す。
実験例1
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC1
3869より誘導した5−メチルトリプトファン耐性、
5−フルオロトリプトファン耐性のトリプトファン生産
菌AJ12042FERM−P7メ)−! をイースト
ブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体な集めて
”/M!J(資) ン酸緩衝液(pH7,0)に懸渇しく108〜109個
/−の菌体な含む)、これにNGを加え(NG濃度は2
00μf / me )、室温で30分間保易した。こ
のようにしてNG処理した菌体な同リン酸緩衝液で充分
洗浄した後、N、N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ
ンを含む第1表に示す最小寒天平板培地に塗布し、31
.5℃で4〜10日間培養した。
3869より誘導した5−メチルトリプトファン耐性、
5−フルオロトリプトファン耐性のトリプトファン生産
菌AJ12042FERM−P7メ)−! をイースト
ブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体な集めて
”/M!J(資) ン酸緩衝液(pH7,0)に懸渇しく108〜109個
/−の菌体な含む)、これにNGを加え(NG濃度は2
00μf / me )、室温で30分間保易した。こ
のようにしてNG処理した菌体な同リン酸緩衝液で充分
洗浄した後、N、N−ビス−(ホスホノメチル)グリシ
ンを含む第1表に示す最小寒天平板培地に塗布し、31
.5℃で4〜10日間培養した。
第1表 最小培地の組成(pH7,0)成分 含分。
グルコース 209/L
硫酸アンモニウム 51
尿 素 21
KH,PO411
Mg504−7H,011
Fe 、Mn イオン 2ppm
ビオチン 5opt7t
サイアミン塩酸塩 200 I
DL−メチオニン 20 o mg/ tL−チロシン
100 # 塞大平板上に生育したフロニーのうち大きなものをN、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシン耐性株として採
取した。このようにして得られた耐性株の内には親株よ
りトリプトファン生産能の優れたものが多く見い出され
た。この内生産能の最も高い菌株AJ12043を選ん
だ。同様の変異操作によりAJ12042を親株として
N−(ホスホノメチル)グリシン耐性株ha 1204
4を誘導した。
100 # 塞大平板上に生育したフロニーのうち大きなものをN、
N−ビス−(ホスホノメチル)グリシン耐性株として採
取した。このようにして得られた耐性株の内には親株よ
りトリプトファン生産能の優れたものが多く見い出され
た。この内生産能の最も高い菌株AJ12043を選ん
だ。同様の変異操作によりAJ12042を親株として
N−(ホスホノメチル)グリシン耐性株ha 1204
4を誘導した。
マタ全く同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミク
ムAJ11492を親株としてN、N−ビス−(ホスホ
ノメチル)グリシン耐性株AJ/:L01−2− を誘
導した。
ムAJ11492を親株としてN、N−ビス−(ホスホ
ノメチル)グリシン耐性株AJ/:L01−2− を誘
導した。
次にこのようにして得た変異株のN、N−ビス−(ホス
ホノメチル)グリシン耐性度、およびN−(ホスホノメ
チル)グリシン耐性度の結果を第2表に示す。
ホノメチル)グリシン耐性度、およびN−(ホスホノメ
チル)グリシン耐性度の結果を第2表に示す。
第2表 薬剤耐性度
メチル)グリシン グリシン
0 500 1(10021)F)0 50 100
21Xl 30G12043 100 98 80 5
8 90 80 65 4012044 100 89
78 54 95 85 72 5511492 1
00 0 0 0 0 0 0 01ユct上 100
88 45 20 80 4(18020実験方法は
、各変異株の菌体な第1表の最小培地で良く洗浄した後
、小型試験管に入れた第2表に示す所定量の薬剤を含む
最小培地(4−)に一定量接種し、31.5℃で24時
間振盪培養を行い、培養液の560nm に於る吸光度
を測定して生育度をめた。第2表にはその相対生育値を
示した。
21Xl 30G12043 100 98 80 5
8 90 80 65 4012044 100 89
78 54 95 85 72 5511492 1
00 0 0 0 0 0 0 01ユct上 100
88 45 20 80 4(18020実験方法は
、各変異株の菌体な第1表の最小培地で良く洗浄した後
、小型試験管に入れた第2表に示す所定量の薬剤を含む
最小培地(4−)に一定量接種し、31.5℃で24時
間振盪培養を行い、培養液の560nm に於る吸光度
を測定して生育度をめた。第2表にはその相対生育値を
示した。
本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、ソ
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素
源としては使用する変異株の利用可能なものであれば良
く、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース
、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、そ
の他、エタノール、プロパツール等のアルコール類、酢
酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によってはノルマ
ルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使
用される。
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素
源としては使用する変異株の利用可能なものであれば良
く、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース
、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、そ
の他、エタノール、プロパツール等のアルコール類、酢
酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によってはノルマ
ルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使
用される。
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
ン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育に、アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使
用する場合には要求される栄養素を補添することが必要
である。
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
ン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育に、アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使
用する場合には要求される栄養素を補添することが必要
である。
培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培
地のpHな5ないし9、温度を20℃ないし40℃に制
御しつつ1日ないし4日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりトリプトファンが蓄量培養液中に蓄私され
る。培養液からトリプトファンを採取する方法は公知の
方法に従って行えば良く、培養液から菌体な分離除去し
た後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用い
る方法等により採取される。
地のpHな5ないし9、温度を20℃ないし40℃に制
御しつつ1日ないし4日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりトリプトファンが蓄量培養液中に蓄私され
る。培養液からトリプトファンを採取する方法は公知の
方法に従って行えば良く、培養液から菌体な分離除去し
た後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用い
る方法等により採取される。
以下、実施例にて説明する。
実施例1
下記第3表に示すトリプトファン生産用培地を追加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末109を補添した。
菌した炭酸カルシウム粉末109を補添した。
第3表 トリプトファン生産用培地(p H7,(+
)成分 濃度 成分 濃度 グ/l/:Ill −7,13,0f/de MnMn
SO44H1,囲11/&J硫酸アンモニウム 1.O
#L−チロシン 4o #IGf、PO413# DL
−/チオニア40 1Mg5O4−7H,OO,04#
大豆蛋白分m液 3.0 ml/diビオチン5.o
llt/dl ニアv −ル液 1.2 t/dl。
)成分 濃度 成分 濃度 グ/l/:Ill −7,13,0f/de MnMn
SO44H1,囲11/&J硫酸アンモニウム 1.O
#L−チロシン 4o #IGf、PO413# DL
−/チオニア40 1Mg5O4−7H,OO,04#
大豆蛋白分m液 3.0 ml/diビオチン5.o
llt/dl ニアv −ル液 1.2 t/dl。
サイアミン塩酸塩 20 1 酢酸 u31FeSO4
−7H,0111119/if/コノ培地に第4表に示
すトリプトファン生産菌を1白金耳接種し、30℃で7
2時間振盪培養した。培養液中のトリプトファン生成量
を測定し、その結果を第4表に示した。
−7H,0111119/if/コノ培地に第4表に示
すトリプトファン生産菌を1白金耳接種し、30℃で7
2時間振盪培養した。培養液中のトリプトファン生成量
を測定し、その結果を第4表に示した。
第4表 トリプトファンのN Iff Ji菌 株 蓄
積量Ctldl) AJ12042 (FERM−P 7tユi) 0.2
0AJ12043 (FERM−P 7/工4) 0.
40AJI2044 (FERM−P /’/上ン )
0.38AJ11492 (FERM−P 5294
) 0.018AJ /−)−otb (FERM−P
7/iJ’ ) 0.035−RFtl −
積量Ctldl) AJ12042 (FERM−P 7tユi) 0.2
0AJ12043 (FERM−P 7/工4) 0.
40AJI2044 (FERM−P /’/上ン )
0.38AJ11492 (FERM−P 5294
) 0.018AJ /−)−otb (FERM−P
7/iJ’ ) 0.035−RFtl −
Claims (1)
- ブレビバクテリウム属及びフリネバクテリウム属に属し
、N−(ホスホノメチル)グリシンまたはN、N−ビス
−(ホスホノメチル)グリシンに耐性を有し、かつL−
トリプトファン生産能を有する微生物を液体培地中で好
気的に培養し、培地中にL−)リプトファンを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法による
L−)リプトファンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12197383A JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12197383A JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6012997A true JPS6012997A (ja) | 1985-01-23 |
JPH0314437B2 JPH0314437B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=14824440
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12197383A Granted JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるl−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6012997A (ja) |
-
1983
- 1983-07-05 JP JP12197383A patent/JPS6012997A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0314437B2 (ja) | 1991-02-26 |
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