JP2713720B2 - 酸性ウレアーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酒類の品質改良剤などとして有用な酸性ウレ
アーゼの製造法に関する。

従来の技術 ウレアーゼ（EC 3.5.1.5）は尿素を分解して、アン
モニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素であり、
植物、動物、微生物など広く天然界に分布、存在するこ
とが知られている。それらのうち、酸性下で最大活性を
示すウレアーゼ（酸性ウレアーゼ）については、ラクト
バチルス・ファーメンタムが産生することが知られてい
る［アプライド・アンド・エンバイロオンメンタル・マ
イクロバイオロジー（Applied and Environmental Micr
obiology）,Mar.1979,P.379−382］。

発明が解決しようとする課題 酸性ウレアーゼは、酒類の品質改良剤として有用な酵
素であるが［特願昭62−258855号（先の出願の番号：特
願昭61−244893号）；酒類の品質改良法、この目的のた
めにはできるだけ酵素力価の高いものを開発することが
望まれている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、より安価に酸性ウレアーゼを製造する
目的で、その製造方法につき、鋭意研究を進めた結果、
酸性ウレアーゼを産生する能力のある微生物菌株を培養
するに際し、培地にマンガンとニッケルとを共存させる
ことによって、飛躍的に酸性ウレアーゼの活性が増大す
ることを見出し、さらに研究を重ねた結果、本発明を完
成するに至った。

すなわち、本発明は酸性ウレアーゼを産生する能力を
有する微生物を培養し、培養物中に酸性ウレアーゼを蓄
積させるに際し、培地中にマンガンとニッケルとを共存
させることを特徴とする酸性ウレアーゼの製造法であ
る。

本発明でいう酸性ウレアーゼは、尿素１モルと水１モ
ルから、アンモニア２モルと炭酸ガス１モルを生成し、
その活性の至適pH域が２乃至5.5にあるものをいい、酵
素のその他の一般的性質をあらわすpH安定性、基質特異
性、阻害剤の種類、Km値、分子量などについては、とく
に制限はない。

本発明に用いることのできる微生物菌株は、酸性ウレ
アーゼを産生する能力を有する微生物菌株であれば、特
にその属種には左右されずに用いることができ、本微生
物としてはいわゆる「乳酸菌」と呼ばれる種類の細菌が
あげられる。具体的にはストレプトコッカス属、ペディ
オコッカス属、ロイコノストック属、ラクトバチルス
属、ビフィドバクテリウム属の細菌があげられる。その
代表例として、ストレプトコッカス・フエシウム（Stre
ptococcus faecium），ストレプトコッカス・ミチス
（Streptococcus mitis），ストレプトコッカス・ボビ
ス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・ミ
ティオール（Streptococcus mitior）、ラクトバチル
ス・カゼイ・バル・カゼイ（Lactobacillus casei va
r.casei），ラクトバチルス・フアーメンタム（Lactoba
cillus fermentum）、ビフィドバクテリウム・インフ
ァンティス（Bifidobacterium infantis），ビフィド
バクテリウム・スイス（Bifidobacterium suis）、ビ
フィドバクテリウム・ケリナム（Bifidobacterium cho
erinum）などが例示される。

さらに具体的な菌株としては、Lactobacillus ferme
ntum JCM 5867（IFO 14511,FERM P−8990）、Lactobaci
llus fermentum JCM 5868（IFO 14512,FERM P−899
1）、Lactobacillus fermentum JCM 5869（IFO 14513,
FERM P−8992）、Streptococcus mitior PG−154（IFO
14633,FERM P−9460）、Streptococcus bovis PG−1
86（IFO 14634,FERM P−9461）あるいはBifidobacteri
um choerinum PG−196（IFO 14635,FERM P−9462）な
どがあげられる。本発明の製造法は、これら具体的な菌
株に限定されるものではなく、新たに乳製品、土壌、酸
敗食品、動物の臓器や排泄物などから分離したものであ
っても、酸性ウレアーゼを産生する能力を有するもので
あれば、差し支えない。また、さらにこれらの菌株に紫
外線照射や変異剤処理を施して、人為的に変異を誘起さ
せた株や、当該酸性ウレアーゼ活性の発現に必要な遺伝
子断片をこれらの菌株から取り出して、それらを組みい
れた他の微生物菌株であっても、用いることができる。

なお、上記のIFO番号は、財団法人発酵研究所におけ
る受託番号を、またFERM Ｐ番号は通商産業省工業技術
院微生物工業研究所（FRI）における受託番号を示す。

上記のFERM Ｐ番号で示されるFRIへの各寄託株は、
ブタペスト条約に基づく国際寄託に切替えられて、次の
各FERM BP番号で同研究所に保管されている。

上記のラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5867、
ラクトバチルス・フアーメンタムJCM 5868およびラク
トバチルス・フアーメンタムJCM 5869は財団法人発酵
研究所の「リサーチ・コミュニィケーション（RESEARCH
COMMUNICATION）No.13,第94頁,1987」にも記載されて
いる公知菌株である。これらラクトバチルス属菌の菌学
的性質を以下に示す。

一方、ビフィドバクテリウム・ケリナムPG−196、ス
トレプトコッカス・ミティオールPG−154およびストレ
プトコッカス・ボビスPG−186はそれぞれ以下の菌学的
性質を示す。

上表中、NDは実験を実施していないことを示し、Ly
s、Asp、Ala、Glu、Orn、Ser、ｍ−DAPはそれぞれリジ
ン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、オルニ
チン、セリン、メソジアミノピメリン酸を表わす。上記
の菌学的諸性質をもとに、バージェイズ・マニュアル・
オブ・システマティック・バクテリオロジィ・ボリュー
ム２（1986）によって、その分類学的位置を調べるとPG
−196株はアラビノース、セロビオース、リボース、ザ
イロースからの酸の生成が陽性である点が異なるものの
Bifidobacterium choerinumとするのが適切であり、PG
−154株はα−ヘモリシスが陰性である点が異なるもの
のStoreptococcus mitiorとするのが適切であり、PG−
186株はエスクリンの加水分解が陰性である点が異なる
ものの、Storeptococcus bovisとするのが適切であ
る。

次に、本製造法において、培地中に添加されるマンガ
ンおよびニッケルは、培地中でそれぞれマンガンイオン
およびニッケルイオンを生ぜしめるものであれば、いか
なる形態の化合物でも用いられる。このためには、マン
ガンおよびニッケルの各水溶性塩が有利に使用できる。
たとえば、マンガンの水溶性塩としては、硫酸塩、塩酸
塩、硝酸塩、ホウ酸塩あるいは炭酸塩などの無機酸塩
や、酢酸塩、酪酸塩あるいは安息香酸塩などの有機酸塩
があげられる。また、ニッケルの水溶性塩としては、硫
酸塩、塩酸塩、硝酸塩あるいは炭酸塩などの無機酸塩
や、ギ酸、酢酸塩あるいは乳酸塩などの有機酸塩があげ
られる。

マンガンの培地中への添加量は、一般にMnとして0.00
01〜0.15重量％、好ましくは0.0005〜0.05重量％、さら
に好ましくは0.001〜0.015重量％である。一方、ニッケ
ルの培地中への添加量は、一般にNiとして0.00004〜0.0
15重量％、好ましくは0.00004〜0.005重量％、さらに好
ましくは0.0001〜0.0015重量％である。

本発明において、酸性ウレアーゼ産生菌株を培養して
酸性ウレアーゼを生成させるには、通常の静置培養、振
盪培養、通気撹拌培養あるいは固体培養などにより、連
続的あるいは間欠的に行なうことができるが、とりわけ
静置培養が望ましい。ここで用いる培地は、使用される
微生物の生育しうる通常の組成のものに前記のようなマ
ンガン化合物およびニッケル化合物を添加したものが使
用される。すなわち、炭素源には炭水化物，油脂，脂肪
酸，有機酸あるいはアルコール類などのなかから資化し
うるものを適宜選択し、単独または混合して使用され
る。また窒素源としては、例えば、ペプトン，大豆粉，
綿実粉，コーンスチープリカー，酵母エキス，肉エキ
ス，麦芽エキス，ホエーなどの有機窒素源のほか、硫
安，塩安，硝安，燐安等の無機窒素源が必要に応じて、
適宜混合してまたは単独で用いられる。培地には炭素
源、窒素源のほか、マンガンおよびニッケルに加えてそ
の他の生育に必要なミネラル、アミノ酸あるいはビタミ
ンなどを必要に応じて添加するのがよい。

ミネラルとしては、マグネシウム，ナトリウム，カリ
ウム，鉄，カルシウム，亜鉛，銅，モリブデン，ホウ
素，コバルト，スズあるいはストロンチュウムなどがあ
げられる。

アミノ酸としては、アルギニン，シトルリン，オルニ
チン，アスバラギン，アスバラギン酸，グルタミン，グ
ルタミン酸，バリン，ロイシン，イソロイシン，アラニ
ン，セリン，スレオニン，リジン，シスチン，システイ
ン，メチオニン，フェニルアラニン，ヒスチジン，プロ
リン，チロシンあるいはトリプトファンなどがあげられ
る。

また、ビタミンとしては、アスコルビン酸，ピリドキ
シン，パントテン酸カルシウム，チアミン，ナイアシ
ン，リボフラビン，パラアミノ安息香酸，ビオチン，葉
酸，ビタミンB₁₂,ニコチン酸，ニコチンアミド，アデニ
ン，グアニン，キサンチン，ウラシルあるいはオロチン
酸などがあげられる。

以上の培地成分の外、さらに酸性ウレアーゼの生成を
誘導するために尿素，チオ尿素などを添加することもあ
る。培養中のpHおよび泡の管理の目的で苛性アルカリ
液、炭酸ナトリウム液、カルシウム塩類を適宜補添した
り、消泡剤の添加も有効である。また、窒素ガスや炭酸
ガスを通気して、雰囲気を嫌気的な状態に保ってもよ
い。

培養の温度は、用いる微生物の生育に適した温度を選
択すればよく、通常20℃乃至50℃、好ましくは25℃乃至
45℃で培養するのが有利である。また培養の時間は、用
いる微生物の生育および酸性ウレアーゼの生成に十分な
時間続行されるが、通常５乃至120時間を要する。マン
ガンおよびニッケルを培地に添加する時期は、滅菌前の
培地に予め添加しておいてもよいし、培養中、酸性ウレ
アーゼ活性が最大に達するまでの適宜の時間内に添加し
てもよい。この最大活性にいたるまでの時間は、微生物
の種類や培養方法によって異なるが一般に約40時間まで
である。マンガンおよびニッケルは、従来の培養法で培
養を終了させた後の培養液に添加しても酸性ウレアーゼ
の活性増大の効果は認められない。

このようにして培養後、酸性ウレアーゼは通常、微生
物菌体に含有されているので、培養液から遠心分離、沈
降分離、凝集分離、多孔性膜やセラミック膜などによる
ろ過などの通常の菌体分離の方法によって集菌し、生菌
体のまま、もしくは熱殺菌、薬剤殺菌などの殺菌処理を
施したのち、凍結乾燥、噴霧乾燥、アセトン乾燥などの
手段を用いて乾燥菌体にして、その利用に供される。さ
らには菌体を凍結融解処理、磨砕処理、超音波処理、浸
透圧処理、細胞壁膜の溶解処理、界面活性剤処理などの
方法を単独もしくは組合わせて行なうことによって、該
酵素を可溶化し、プロタミン処理、塩析、有機溶媒処
理、等電点沈澱、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルろ過，アフィニティークロマトグラフィー、
晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組合わせること
によって、比活性の向上した粗酵素乃至精製酵素を得る
こともできる。

かくして得られる本酸性ウレアーゼは特願昭62−2588
55号記載の方法に準じて酒類中の尿素を分解させ品質改
良をはかるために有利に用いられる。

実施例 以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に
説明するが、これらはいずれも本発明の内容を例示する
ものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

なお、培養物の酸性ウレアーゼ活性は、適宜希釈した
培養液を尿素を含む0.2Mクエン酸バッファー（pH4.0）
と等量混合し、37℃で30分間反応させて生成したアンモ
ニアを、ニトロプルシッド法で比色定量する方法で測定
し、単位時間（分）当りに１マイクロモルのアンモニア
を生成する酵素量を１ユニット（IU）として表示した。

実施例１ グルコース0.5％，ポリペプトン1.0％，酵母エキス1.
0％，肉エキス0.5％，食塩0.5％，炭酸カルシウム1.0
％，寒天1.5％からなる培地中に穿刺、生育したLactoba
cillus fermentum JCM5867（IFO14511,FERM BP−145
4）を、グルコース２％，ポリペプトン１％，肉エキス
１％，酵母エキス0.5％，食塩0.5％，無水酢酸ナトリウ
ム0.2％、pH7.0（30％苛性アルカリにて中和）からなる
滅菌シード培地50mlを含む200ml容三角フラスコに接種
して、37℃で24時間、静置培養した。次にシードと同じ
組成の培地に、硫酸マンガン（約４水塩）および硫酸ニ
ッケル（６水塩）を表１に示す組合せで添加したものを
それぞれ調製し、滅菌した。それぞれの滅菌培地100ml
を含む200ml容三角フラスコに、上記シード培養物5mlを
移植し、32℃で２日間静置培養した。この培養物の酸性
ウレアーゼ活性を定量したところ、表１に示す結果が得
られた。表１から明らかなように、硫酸マンガンと硫酸
ニッケルの濃度の適切な組合せを選択することにより、
飛躍的に酸性ウレアーゼ活性を増大させることができ
た。

実施例２ 実施例１と同様にLactobacillus fermentum JCM586
8（IFO 14512,FERM BP−1445）およびLactobacillus
fermentum JCM5869（IFO 14513,FERM BP−1446）を、
表２に示す硫酸マンガンと硫酸ニッケルの組合せ培地で
培養し、表２の結果を得た。

実施例３ 実施例１と同様に、Lactobacillus fermentum JCM5
867（IFO 14511,FERM BP−1454）を、表３に示すマン
ガン化合物0.005％とニッケル化合物0.001％を添加した
培地で培養し、表３に示す結果を得た。

実施例４ 実施例１と同様に生育したLactobacillus fermentum
JCM5867（IFO 14511,FERM BP−1454）のシード培養物
5mlをマンガン化合物およびニッケル化合物を無添加の
滅菌メイン培地（グルコース２％，ポリペプトン１％，
肉エキス１％，酵母エキス0.5％，食塩0.5％，無水酢酸
ナトリウム0.2％,pH7.0（30％苛性アルカリにて中
和））100mlを含む200ml容三角フラスコに移植して、37
℃で静置培養を開始したこの培養途中（０時間目,12時
間目,24時間目,36時間目）および培養終了後に硫酸マン
ガン（約４水塩）0.01％，硫酸ニッケル（６水塩0.001
％を同時に添加して酸性ウレアーゼ活性を比較したとこ
ろ、表４に示す結果が得られた。

実施例５ 実施例１と同様に生育したLactobacillus fermentum
JCM 5867（IFO 14511,FERM BP−1454）のシード培養
物を、グルコース２％，ポリペプトン１％，エールリッ
ヒ肉エキス１％，酵母エキス0.5％，食塩0.5％，無水酢
酸ナトリウム0.2％，硫酸マンガン（約４水塩）0.01
％，硫酸ニッケル（６水塩）0.001％,pH7.0（30％苛性
アルカリにて中和）からなる、滅菌メイン培地１を含
む３容三角フラスコに移植して、34℃で24時間静置培
養をおこなったところ、4.6U/mlの酸性ウレアーゼ活性
を示す培養液が1.03えられた。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、0.05M燐酸緩
衝液（pH7.2）で２回洗浄後、400mlの0.05M燐酸緩衝液
（pH7.2）,0.02MのEDTAおよび0.01Mのジチオスレイトー
ルを含む液に懸濁し、径0.1乃至0.2mmのガラスビーズ30
0mlを加えて菌体破砕機で4500rpm、20分間、菌体を破砕
した。これを遠心分離し、その上清液を硫安分画して、
40％から80％飽和の画分の沈殿物を集め、50mlの0.05M
燐酸緩衝液に溶解したのち、一晩透析し、凍結乾燥する
ことによって216mgの粗酵素粉末を得た。このものの酸
性ウレアーゼ活性を測定したところ、17.6U/mgであり、
精製収率は80.3％であった。

なお、本粗酵素粉末の一般的性質は以下のようであっ
た。

至適pH範囲 pH2〜4.5 至適温度 60℃〜70℃ pH安定性 37℃,2時間処理でpH2〜10で安定 温度安定性 pH4,2時間処理で60℃迄、安定 実施例６ 市販GAM半流動培地（日水製薬）に生育した、Strepto
coccus mitior PG−154（IFO 14633、FERM BP−144
8）をグルコース３％，ポリペプトン1.5％，肉エキス１
％、酵母エキス0.8％、食塩0.5％、無水酢酸ナトリウム
0.2％、pH7.0（30％苛性アルカリにて中和）からなる滅
菌シード培地50mlを含む200ml容三角フラスコに接種し
て、34℃で24時間、静置培養した。このシード培養物5m
lを表５に示す硫酸マンガンと硫酸ニッケル以外は、シ
ード培地と同じ組成からなる滅菌培地100mlを含む200ml
容三角フラスコに移植し、32℃で２日間静置培養した。
この培養物の酸性ウレアーゼ活性を定量したところ、表
５に示す結果を得た。

実施例７ 市販GAM半流動培地（日水製薬）に生育した、Strepto
coccus bovis PG−186（IFO 14634、FERM BP−144
9）およびBifidobacterium choerinum PG−196（IFO
14635、FERM Ｐ−9462）を、滅菌した市販GAMブイヨ
ン培地（日水製薬）50mlを含む200ml容三角フラスコに
接種して、34℃で24時間、静置培養した。このシード培
養物5mlを同じ市販GAMブイヨン培地に硫酸マンガン（約
４水塩）および硫酸ニッケル（約６水塩）を表２に揚げ
る濃度で添加して滅菌した培地100mlを含む200ml容三角
フラスコに移植し、32℃で３日間静置培養した。この培
養物の酸性ウレアーゼ活性を定量したところ、表６に示
す結果を得た。

実施例８ 市販GAM半流動培地（日水製薬）に生育したStreptoco
ccus mitior PG−154株（IFO14633、FERM BP−144
8）をグルコース２％、ポリペプトン1.0％、肉エキス１
％、酵母エキス0.5％、食塩0.5％、無水酢酸ナトリウム
0.2％、硫酸マンガン（約４水塩）0.005％、、pH7.0（3
0％苛性アルカリにて中和）からなる滅菌シード培地60m
lを含む200ml容三角フラスコに接種して、34℃で24時
間、静置培養した。このシード培養物を同じ組成からな
る滅菌培地1.2を含む２容三角フラスコに移植し、3
4℃24時間静置培養した。この培養物を上記培地にシリ
コンKM−72 0.01％を添加した300の滅菌培地を含む5
00発酵槽に移植して、37℃で16時間静置培養したの
ち、グルコース４％、ポリペプトン1.5％、肉エキス１
％、酵母エキス0.9％、尿素0.1％、食塩1.5％，無水酢
酸ナトリウム0.2％，硫酸マンガン（約４水塩）0.02
％、硫酸ニッケル（６水塩）0.002％、硫酸コバルト
（７水塩）0.001％、硫酸第一スズ0.01％、硫酸ストロ
ンチウム0.001％、シリコンKM−72 0.01％、pH7.2（30
％苛性アルカリにて中和）からなる滅菌培地4500を含
む6000発酵槽に移植して、32℃で46時間静置培養をお
こなった。培養開始後、17時間目、24時間目、40時間目
にpHが4.5に低下したので、80rpmで、ゆるやかに撹拌し
ながら、10％の滅菌炭酸ソーダ水溶液を添加して、pHを
5.0に調整した。滅菌炭酸ソーダ溶液は145要した。培
養終了時の酵素力価を測定したところ、3.6U/mlであっ
た。

この培養液4700を、孔径0.2nm、ろ過面積10m²のセ
ラミックフィルター「マルチメディア」（セラベール社
製）に、33℃で流速170/min、入口圧力4.0Kg/m²G、出
口圧力0.8Kg/m²Gで通液した。5.5時間後、ろ液量が4200
になった時点で入口圧力2.1Kg/m²G、出口圧力0.3Kg/m
²Gで連続定容加水操作に切り換え、さらに10時間運転し
て、ろ液4000を得てから濃縮操作に入り、内部液を15
0にした。この菌体濃縮液に試薬一級エタノール100
を添加し、２時間静置して殺菌したのち約30℃で減圧濃
縮し、160の溜出液を得た時点で100の水を加え、再
び減圧濃縮して127の濃縮液を得た。この液を噴霧乾
燥して3.2Kgの乾燥物を得た。このものの酸性ウレアー
ゼ活性を測定したところ、2.3U/mg乾燥物であり、培養
液からの酵素活性の収率は43.9％であった。

発明の効果 本発明によると、培養液中に蓄積する酸性ウレアーゼ
の活性を、従来の方法に比べて40倍以上に飛躍的に増大
させることができ、該酵素を工業的方法でより安価に提
供できる。本酸性ウレアーゼは酒類中の尿素を分解し品
質改良をはかるために有利に用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１４５０ (56)参考文献 Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｍｅｎｔｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ，37（３） （1979），Ｐ．379− 382 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，13（１） （1976），Ｐ. ９−15，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．，132（10） （1986），Ｐ．2749 −2752，ＰＮＡＳ，80（８） （1983），Ｐ．2253−2257

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酸性ウレアーゼを産生する能力のある微生
   物を培養して、酸性ウレアーゼを生産させるに際し、培
   地中にマンガンとニッケルとを共存させることを特徴と
   する酸性ウレアーゼの製造法。