JPH0480675B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、細胞性粘菌ポリスホンドリウム属
（Polyshondylium）に属する微生物を用いて細菌
菌体溶菌酵素を製造する方法に関する。 （従来の技術） 細菌菌体溶菌酵素は、溶菌酵素とも呼ばれ、卵
白から得られたリゾチームがよく知られている。
しかしながら、卵白リゾチームの溶菌スペクトル
は、グラム陽性細菌の一部に限られ、ラストバチ
ルス属、ストレプトコツカス属などに代表される
乳酸菌には一般に作用しない。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、卵白リゾチームよりも溶菌スペ
クトルの広い酵素を得ることを目的として種々研
究した結果、土壌より得られた細胞性粘菌、さら
に詳しくはポリスホンドリウム属に属する新規な
微生物（新菌株）を分離することができ、かつそ
れが産生する酵素は、卵白リゾチームの働かなか
つた乳酸菌に対しても速やかに溶菌作用を示すこ
とを見出し、本発明を完成した。 本発明の酵素は、前記の如く細胞性粘菌の培養
により製造されるもので、起源的にめずらしいも
のである。また、従来公知の卵白リゾチームと相
異し、溶菌スペクトルが広いという特徴を有して
いる。さらに公知の溶菌酵素、例えば、アクロモ
バクター・ルナタースやバチルス・ズブチルスな
どの菌株から得られた溶菌酵素の作用しないよう
な低酸性域でさえ、作用するという従来その例を
見ない特徴を有する新規な溶菌酵素である。 （問題点を解決するための手段） 本発明者等は、各地の土壌より数多くの微生物
菌株を分離し、その溶菌酵素生産の有無を検索
し、その結果、前述の特徴を有する酵素を産生す
る新規な菌株を分離することに成功した。 ここに分離された微生物菌株はポリスホンドリ
ウム・パリデインLE−１（工業技術院微生物工業
技術研究所 寄託微工研条寄 第633号）、ポリス
ホンドリウム・バイオラセウムLE−１（同寄託微
工研条寄 第632号）と名づけ、オリーブ著
「ジ・ミセトゾーンズ」（1975年）によつて、細胞
性粘菌ポリスルホンドリウム属に属する菌株であ
ると同定した。 本菌株の菌学的性質は次の通りである。 (1) 子実体の柄は太く、液胞性の細胞からなる―
――タマホコリカビ科（Dicryosteliaceae） (2) 子実体は規則的に輪生枝を形成する―――ム
ラサキカビモドキ属（Polysphondylium） (3‐) 子実体は規則的に輪生枝を形成し、赤紫
色を帯びる―――ムラサキカビモドキ属（P.
violaceum） (3‐) 子実体は規則的に輪生枝を形成し、白色
である―――シロカビモドキ（P.pallidum） 本発明の方法は、ポシスホンドリウム属に属す
る溶菌性酵素の生産菌を、培地に接種、培養する
ことによつて実施される。 培地としては、固体状のものでも液体状のもの
でもよい。通常は液体培地を使用し、振盪培養ま
たは通気撹拌培養など、好気的条件下で実施する
のが有利である。 培地組成としては、通常用いられているものが
用いられる。すなわち、炭素源としてはグルコー
ス、ラクトースなどの糖類、窒素源としてはペプ
トン、酵母エキス、乾燥菌体、脱脂粉乳、アンモ
ニウム塩類、硝酸塩類などの有機、無機の窒素含
有化合物が用いられる。また無機塩としてはカリ
ウム、マグネシウムなどの金属をリン酸塩、硫酸
塩などの形で用いてもよい。 培養条件は、目的とする溶菌酵素の蓄積量が最
大となるように適宜選択又は調整される。本発明
者等の研究によれば、培地のPHは4.0〜8.0、好ま
しくは5.5〜7.0、培養温度は15〜40℃好ましくは
20〜30℃で、培養時間は２〜４日の条件を、大体
満足すればよいことが判明した。 かくて、所望の溶菌酵素は培養液や菌体中に充
分蓄積される。 本発明に於いて、所望の酵素を取得するには、
この種の技術分野における通常の分離、精製手段
を、採用し得る。また必要により任意純度のもの
を得ることができる。 具体的には例えば次のように行う。 即ち、まず遠心分離または濾過などの方法によ
つて、菌体と培養液とを分離する。分離した菌体
の方は、超音波などを用いて菌体を破砕した後、
さらに遠心分離により細胞残渣を除去し、上澄液
を得る。この上澄液はそのまゝ使用しうる。前記
上澄液は、また、後記する。培養液と同様な処理
を行ない、目的物をうることができる。 一方、培養液の方は、そのままの状態で硫酸ア
ンモニウムのような塩を添加して塩析したり、あ
るいはアルコール類、アセトンのような親水性有
機溶媒を添加して目的物を分画、沈澱させる。 さらに、イオン交換体に吸着、脱着させる方法
あるいはセフアクリル（フアルマシア社製）やト
ヨパール（東洋曹達工業製）などを用いたゲル濾
過法などを、単独または適宜組み合わせることに
よりその精製度を高めることができる。 本発明の酵素の作用は、PHが約２〜７という広
い範囲で認められる。特に、PHが３〜６の酸性側
で、高い活性を有する（第１図；なおPHの調整は
マクルベイン氏緩衝液（イオン強度0.06）によつ
て行つた。）。 また、PH安定性についてもPHが約２〜８におい
て、比較的安定である〔第２図；なおPH安定性
は、本発明の実施の結果得られる酵素を、 PH２〜４（○で表示）は、グリシン−塩酸緩衝
液（0.01M）、 PH４〜６（●で表示）は、酢酸緩衝液
（0.01M）、 PH６〜８（△で表示）は、リン酸緩衝液
（0.01M）、 PH８〜10（▲で表示）は、アンモニウム緩衝液
（0.01M）、 に加え、30℃16時間保つた後、残存酵素活性を測
定したものである。〕。 酵素反応の至適温度は約45〜55℃付近である
（第３図）。 さらに熱安定性については、60℃、15分間の加
熱も充分安定である〔第４図；なお熱安定性は、
酵素をPH4.0（酵素緩衝液0.01M）、PH7.0（リン酸緩
衝液0.01M）に加え、各温度で15分加熱し、残存
活性を測定した。〕。 なお、酵素の溶解作用の測定（算定）は、次の
方法で行つた； 基質としては、（別段の言及のない限り）ミク
ロコツカス・リゾダイクチカス（Microccus
Lysodeikticus）の乾燥菌体（シグマ社製）を用
いた。この基質をマクルベイン氏緩衝液（PH3.5、
イオン強度0.06）に加え、570ｍμの光学密度
（Optical Density以下、O.D.と略称）が0.7にな
るように調整した懸濁液3.0ミリリツトルに対し、
酵素液0.1ミリリツトルを加え、37℃に保温し、
その時の上記波長における濁度減少度をもつて溶
菌活性とした。また、O.D.570ｍμを毎分0.001だ
け減少させる酵素量を溶菌活性の１単位と定義し
た。尚、対照液としては酵素液の代りに水を加え
たものを用いた。 本発明に係わる新規溶菌酵素は、イオン交換ク
ロマトグラフイーにかけると、ミクロコツカス・
リゾダイクチカスに対して溶解作用を示す活性成
分が少なくとも３種類認められ、数種類の酵素の
混合物であることがわかる。従つて、酵素の採
取、精製に当たつては、完全に各酵素を精製、単
離してもよいし、目的によつては３種類以上の酵
素の混つた任意純度の部分精製品として採取し、
これを使用してもよい。溶解作用の進行と共にモ
ルガン・エルソンに呈色するヘキソサミンが可溶
科される（第５図）。 なお、第５図は次の処方による； まず0.01Mの酢酸緩衝液に溶解した本発明の酵
素液7.5mlを、B.Megateriumのペプチドグリカン
15mgに加え、37℃にて反応させた。濁度の減少は
O.D.570nｍの変化で表わした。Ｎ−アセチルア
ミノ糖の測定はGhysenらの手法〔Elizabeth F.
Neufeld外一名著；Methods in Enzymology
“Complex Carbohydrates”vol.V、691〜692、
1966〕に従い行つた。 （本発明の効果） 本発明により得られる溶菌酵素は、卵白リゾチ
ームに比べはるかに広い溶菌スペクトルを示す。
すなわち乳酸菌を含むほとんどのグラム陽性菌に
対し溶菌作用を有する。殊に、公知の各種溶菌酵
素が比較的作用しないような低酸性域でも、作用
するという点において大きな特徴がある。 本発明の酵素は、たとえば医学、薬学の領域に
おける抗菌物質として用いられる。また食品製造
の分野においては、副作用の少ない天然防腐剤と
して用いることができる。更に近年バイオテクノ
ロジー分野で、話題になつている細胞融合技術に
用いうるなど、広範な応用が期待される。 実施例 １ ペプトン0.5％酵母エキス0.05％、グルコース
0.5％、リン酸−カリウム0.225％、リン酸二カリ
ウム0.067％、硫酸マグネシウム（７水加物）
0.05％を含む液体培地15リツトルを50リツトル容
培養タンクに入れ、121℃に於いて、15分間滅菌
し、クレブジエラ・エロゲネス菌を接種し、35
℃、150回転／分、20リツトル／分の通気条件で
48時間培養を行つた。菌の生育に伴つて生ずる泡
は消泡剤を添加して防止した培養終了後、培養液
を121℃に於いて、５分間滅菌し、２日間の振盪
フラスコ培養により得たポリスホンドリウム・パ
リデインLE−１のアメーバをこの滅菌培養液に
加えた。ついで25℃、150回転／分、20リツト
ル／分の通気条件下で72時間培養を行つた。この
培養の終了後、遠心分離により得たアメーバ細胞
（湿重量97ｇ）を脱イオン水で洗浄し、次に細胞
量の1/2重量の水を加え、冷却しながら20KHz、
20分間の条件で超音波発振器にかけ細胞を破砕し
た。ついで遠心分離法により細胞残渣を除去し、
上澄液110ミリリツトルを得た。この上澄液の１
ミリリツトル当たりの酵素活性量は180単位であ
つた。 実施例 ２ 実施例１の培養で得たアメーバ細胞を除去した
培養上澄液1000ミリリツトルに対して、684ｇの
割合で硫酸アンモニウム（７水加物）を添加し、
さらに４℃にて一夜静置し、塩析された沈澱物を
遠心分離により集めた。これを充分量の水で透析
した。この濃縮透析内液50ミリリツトルの１ミリ
当たりの酵素活性量は、55単位であつた。 実施例 ３ 実施例１で得た上澄液を酵素源として各種微生
物菌体に対する溶解試験を行つた。第１表に示す
各種細菌をそれぞれ液体培養し、遠心分離により
菌体を採取し、マクルベイン氏緩衝液（PH3.5、
イオン強度0.06）に懸濁させ、先に述べた溶菌活
性測定法に従つて溶菌の有無を判定した。 その結果を第１表に示す。 尚、リゾチームの溶菌活性測定法としては、マ
クルベイン氏緩衝液の代りに、リン酸緩衝液（PH
7.0、イオン強度0.06）を用いること、本発明の
酵素の代りにリゾチーム液（15μｇ／ml濃度）を
用いること以外は、すべて前記した溶菌活性側定
法に従つた。 第１表から明らかなように、本発明に基く酵素
はPH3.5の酸性下において卵白リゾチームよりも
作用範囲が広いことが明らかである。

【表】

【表】 実施例 ４ ペプトン0.5％、酵母エキス0.05％、グルコー
ス0.5％、クレブジエラ・エロゲネス凍結乾燥菌
体1.0％、リン酸−カリウム0.225％、リン酸二カ
リウム0.067％、硫酸マグネシウム（７水加物）
0.05％を含む液体培地を500ミリリツトル容・坂
口フラスコ10本に50ミリリツトルずつ分注し、
121℃に於いて15分間滅菌した。次いでポリスホ
ンドリウム・バリデインLE−１のアメーバを接
種し、22℃で３日間振盪培養を行つた。培養終了
後、遠心分離によりアメーバ細胞破砕液を遠心分
離した上澄液の１ミリリツトル当たりの酵素活性
量を測定したところ、170単位であつた。また、
培養上澄液の実施例と同様に硫酸アンモニウムで
塩析後、透析した透析内液の酵素活性量は、46単
位であつた。 実施例 ５ 大豆レシチン0.08％、脱脂粉乳２％、プロテオ
ースペプトン１％、リン酸−カリウム0.68％を含
む液体培地を500ミリリツトル容・坂口フラスコ
10本に50ミリリツトルずつ分注し、121℃に於い
て15分間滅菌した。次いでポリスホンドリウム・
パリデインLE−１のアメーバを接種し、22℃で
３日間振盪培養を行つた。培養終了後、遠心分離
によりアメーバ細胞と培養液とを分離した。実施
例１と同様の方法で得たアメーバ細胞粉砕液の遠
心分離した上澄液の１ミリリツトル当たりの酵素
活性量は72単位であつた。また、培養上澄液を実
施例２と同様に硫酸アンモニウムで塩析後、透析
した透析内液50ミリリツトルにおける１ミリリツ
トル当たりの酵素活性量は60単位であつた。 実施例 ６ ポリスホンドリウム・バイオラセウムLE−１
のアメーバを実施例４で示した条件で３日間振盪
培養した。培養終了後、遠心分離して集めたアメ
ーバ細胞を実施例１と同様の方法で超音波により
破砕した。さらに、遠心分離して得た上澄液の１
ミリリツトル当たりの酵素活性量は170単位であ
り、しかも各種微生物に対して実施例３と同様の
溶菌作用を示した。また、アメーバ細胞を取り除
いた培養上澄液100ミリリツトルについて実施例
２と同様に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、つ
づいて塩析物を少量の水に溶かし透析して濃縮酵
素液50ミリリツトルを得た。この濃縮酵素液１ミ
リリツトル当たりの酵素活性量は42単位であつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によつて得られる酵素の至適
PHの曲線を示すものでなる。第２図は、本発明に
よつて得られる酵素のPHの安定性を示すものであ
る。第３図は、本発明によつて得られる酵素の至
適温度を示すものである。第４図は、本発明によ
つて得られる酵素の熱安定性を示すものである。
第５図は、本発明によつて得られる酵素の溶解性
を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 微生物の細胞壁を溶解する酵素を生産するポ
   リスホンドリウム属に属する菌株を炭素源、窒素
   源、無機塩類及びその他の栄養物質を含有する培
   地に於いて培養し、培養物から前記性質を有する
   酵素を採取することを特徴とする溶菌酵素の製造
   法。