CH666049A5 - Enzyme bacteriolytique et son procede de preparation. - Google Patents
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Description
DESCRIPTION
L'invention se rapporte à un procédé pour la préparation d'un nouvel enzyme bactériolytique utilisant une bactérie du genre Polysphondylium (moisissure cellulaire des boues) et à l'enzyme ainsi préparé.
Les méthodes connues de rupture des parois cellulaires peuvent être divisées en trois principales catégories, à savoir: 1) les méthodes physiques, 2) les méthodes chimiques, et 3) les méthodes enzymati-ques. Les méthodes physiques et chimiques posent des problèmes inévitables quant aux dispositifs de traitement et, de plus, les produits ont tendance à être modifiés par un traitement excessif. Les méthodes ou les procédés enzymatiques ont en conséquence attiré davantage l'attention du public au cours de ces dernières années.
Les enzymes pour la dissolution des corps de germes utilisés dans ce but sont généralement désignés sous le nom d'enzymes bactétioly-tiques, l'enzyme le plus courant étant le lysozyme, préparé à partir de l'albumen. Toutefois, le spectre bactériolytique du lysozyme de l'albumen couvre certaines bactéries Gram positives, et le lysozyme de l'albumen présente l'inconvénient de ne pas agir sur des bactéries générales de l'acide lactique, dont les types sont représentés par des bactéries du genre Lactobacillus et Streptococcus.
La publication de brevet japonais N° 8597/1982 décrit une méthode dans laquelle une composition enzymatique (contenant de la cellulase, de la laminarinase, de la xylanase, de la pectinase, de l'amylase, de la protéase, etc.) produite par un micro-organisme du genre Illupec, Coryollus ou Coprynus des basidiomycètes est amenée à réagir sur une membrane cellulaire (membrane Chlorella) de manière à provoquer la rupture de la membrane. Toutefois, cette publication appartenant à la technique antérieure ne se réfère à aucun micro-organisme du genre Polysphondylium.
La croissance d'un micro-organisme du genre Polysphondylium (moisissures cellulaires des boues) dans un milieu nutritif simple, a fait l'objet d'un rapport dans «Science», vol. 139, page 338 (1963).
Toutefois, aucun enzyme n'a été extrait du milieu de culture après mise en culture.
Après avoir recherché activement un nouvel enzyme ayant un spectre bactériolytique plus large que celui du lysozyme, on a réussi à séparer une moisissure cellulaire des boues, plus spécifiquement un nouveau micro-organisme (nouvelle espèce de germe) de Polysphondylium, présentant une fonction bactériolytique rapide sur les bactéries de l'acide lactique qui n'ont pas été attaquées par le lysozyme de l'albumen. La présente invention est réalisée sur la base de la découverte précitée.
L'enzyme susmentionné est préparé à partir d'une source extraordinaire, à savoir par la mise en culture d'une moisissure cellulaire des boues, comme précédemment décrit. En outre, une caractéristique avantageuse est que le spectre bactériolytique de cet enzyme est plus large que celui du lysozyme de l'albumen connu. L'enzyme est un nouvel enzyme bactériolytique qui est actif dans une zone de faible valeur d'acidité, où les enzymes bactériolytiques convention-nellement connus, préparés par exemple à partir de l'Achromobacter lunatus et du Bacillus subtilis, ne sont pas actifs.
Le dessin annexé illustre l'invention. Sur ce dessin:
— la figure 1 est un graphique illustrant la courbe de pH optimum de l'enzyme préparé selon l'invention;
— la figure 2 est un graphique illustrant la stabilité de l'enzyme préparé selon l'invention;
— la figure 3 est un graphique illustrant la température optimale pour l'enzyme préparé selon l'invention;
— la figure 4 est un graphique illustrant la stabilité thermique de l'enzyme préparé selon l'invention;
— la figure 5 est un graphique illustrant la capacité de solubilisation de l'enzyme préparé selon l'invention.
On a séparé plusieurs espèces de micro-organismes, à partir de sols provenant de divers emplacements, puis on a procédé à une étude des produits, afin de contrôler s'ils renfermaient un enzyme bactériolytique. A la suite de cette recherche, on est parvenu à séparer de nouvelles bactéries produisant l'enzyme ayant les caractéristiques précitées.
Les espèces de micro-organismes ainsi séparées sont désignées sous les noms de Polysphondylium pallidum LE-1 (déposé au Fermentation Research Institute, Agencey of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade andlndustry, 1-3, Higashi 1-chôme, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japon, Bikoken FERM BP-633), et Polysphondylium violaceum LE-1 (déposé au Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Bikoken FERM BP-632). Elles ont été identifiées comme étant des moisissures cellulaires des boues du genre Polysphondylium, suivant la méthode décrite par Lindsay S. Olive dans «The Mycetozoans» (1975).
Les caractéristiques microbiologiques des moisissures sont les suivantes:
1) sporocarpes présentant un tube à tige plus large, rempli d'un réseau de cellules vides, caractéristique des Dicryosteliaceae;
2) sporocarpes à grandes spores terminales et à verticilles réguliers de spores plus étroites et à tiges, le long de la tige principale, caractéristiques du Polysphondylium-,
3.i) sporocarpes à grandes spores terminales et à verticilles réguliers de spores plus étroites à tiges, le long de la tige principale, de coloration pourpre rougeâtre, caractéristiques du Polysphondylium violaceum;
3.ii) sporocarpes à grandes spores teminales et à verticilles réguliers de spores plus étroites à tiges, le long de la tige principale, de coloration blanche, caractéristiques du Polysphondylium pallidum.
Le procédé de l'invention consiste à inoculer et à cultiver une bactérie appartenant au genre Polysphondylium, et à produire un enzyme bactériolytique dans un milieu de culture.
Tout milieu solide ou liquide peut être utilisé dans ce but. Il est généralement commode d'utiliser un milieu de culture liquide et d'effectuer la culture en atmosphère aérobie, par exemple de procéder à
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une culture avec secouage, ou à une culture avec aération et agitation.
Un milieu courant de culture peut être utilisé comme composition pour la culture. Des saccharides, tels que glucose et lactose, peuvent être utilisés comme source de carbone, et des composés azotés organiques et inorganiques, tels que peptone, extraits d'enzyme, corps séchés de bactéries, lait écrémé, sels et nitrates d'ammonium, peuvent être utilisés comme source d'azote. Des phosphates ou des sulfates d'éléments métalliques, tels que potassium et magnésium, peuvent être utilisés comme sel inorganique.
Les conditions de culture peuvent être choisies ou ajustées de façon que la quantité maximale de l'enzyme bactériolytique soit accumulée. On a trouvé qu'un résultat satisfaisant pouvait être obtenu en réglant le pH du milieu de culture à une valeur comprise entre 4,0 et 8,0, de préférence entre 5,5 et 7,0, et en effectuant la culture à une température comprise entre 15 et 40° C, de préférence entre 20 et 30° C, pendant 2 à 4 jours.
L'enzyme bactériolytique désiré se trouve ainsi accumulé dans la solution de culture et le corps de la bactérie cultivée.
Dans l'invention, l'enzyme désiré peut être extrait par les moyens habituels de séparation et de purification. Des produits enzymati-ques ayant un degré voulu de pureté peuvent être préparés.
Plus spécifiquement, l'enzyme peut être séparé de la manière suivante.
Le corps de la bactérie cultivée est tout d'abord séparé de la solution de culture par centrifugation ou filtration. Le corps séparé de la bactérie est broyé par ultrasons ou autres moyens, et le résidu des cellules est séparé par centrifugation, de manière à obtenir une solution surnageante. Cette dernière peut être utilisée directement sans autre traitement. En variante, la solution surnageante peut être traitée de façon similaire à la solution de culture afin d'obtenir le produit désiré, comme cela sera décrit ultérieurement en détail.
La solution de culture est directement soumise à un relargage par addition d'un sel, tel que du sulfate d'ammonium, ou par addition d'un solvant organique hydrophile, tel que l'alcool ou l'acétone, de manière à fractionner et à précipiter le produit désiré.
Le degré de purification peut être encore accru par une méthode dans laquelle le produit est absorbé par une résine échangeuse d'ions puis retiré de celle-ci, ou par une méthode de filtration sur gel, avec utilisation de Sephacryl (marque déposée, produit fabriqué et distribué par Pharmacia Fine Chemicals) ou de Toyopearl (marque déposée, produit fabriqué et distribué par Toyo Soda manufacturing Co., Ltd.). Ces méthodes peuvent être utilisées seules ou en combinaison. L'enzyme de l'invention est actif dans un vaste intervalle de pH compris entre environ 2 et 7. Il présente une activité particulièrement élevée dans une zone d'acidité de pH 3 à 6. (A cet égard, il y a lieu de se référer à la figure 1. Dans cet essai, le pH est ajusté au moyen d'une solution tampon Mcllvaine, ayant une force ionique de 0,06.)
L'enzyme est relativement stable dans une gamme de pH d'environ 2 à 8. (A cet égard, il y a lieu de se référer à la figure 2 illustrant la stabilité de l'enzyme lorsque le pH varie. Le graphique de la figure a été obtenu en traçant la courbe de l'activité de l'enzyme résiduel, après que l'enzyme préparé par le procédé de l'invention a été maintenu aux valeurs indiquées du pH, à 30° C pendant 16 heures.) Les solutions tampons utilisées pour ajuster le pH sont les suivantes: pH2à6 (indiqué par O): solution tampon (0,01M)
glycine/acide chlorhydrique pH 4 à 6 (indiqué par •): solution tampon acide acétique (0,01 M) pH 5 à 8 (indiqué par A): solution tampon acide phosphorique (0,01M) pH 8 à 10 (indiqué par A)-' solution tampon d'ammonium (0,01M) La température optimale pour la réaction enzymatique est d'environ 45 à 55° C. (Voir figure 3.)
L'enzyme présente une stabilité thermique suffisante, du fait qu'il est stable même après avoir été chauffé à 60° C pendant 15 minutes.
(A cet égard, il y a lieu.de se référer à la figure 4 qui illustre les résultats d'un essai confirmant la stabilité thermique. Dans cet essai, l'enzyme a été ajouté, respectivement, à une solution tampon d'acide acétique 0,01M d'un pH de 4,0, et à une solution tampon d'acide 5 phosphorique d'un pH de 7,0, puis chauffé aux températures indiquées, l'activité résiduelle de l'enzyme étant alors mesurée.)
La fonction de dissolution de l'enzyme a été mesurée ou calculée de la manière suivante.
Sauf indication contraire, le substrat utilisé était un corps séché io de bactérie (produit par Sigma Chemical Company) de Micrococcus lysodeikticus. Le substrat a été ajouté à une solution tampon Mcllvaine (pH 3,5, force ionique 0,06), de manière à préparer une suspension. 0,1 ml de la solution d'enzyme est ajouté à 3,0 ml de la suspension ayant une densité optique (ci-après désignée par D.O.) à 15 570 m|i de 0,7, la suspension étant maintenue à 37° C. L'activité bactériolytique a été identifiée par la diminution de l'aspect trouble à la longueur d'onde précitée. La quantité d'enzyme requise pour une diminution de la D.O. à 570 m p. de 0,001 par minute a été définie comme l'unité d'activité bactériolytique. Une suspension renfermant 20 de l'eau, ajoutée à la place de la solution d'enzyme, a été utilisée comme témoin.
L'enzyme bactériolytique résultant fut soumis à une Chromatographie par échange d'ions, ce qui révéla la présence d'au moins trois constituants actifs pour la dissolution du Micrococcus lysodeik-25 ticus. On en déduit que la composition est un mélange d'un petit nombre d'enzymes. Dans l'extraction et la purification de la composition d'enzymes, des enzymes individuels peuvent être purifiés et isolés complètement, ou un mélange partiellement purifié, comprenant trois enzymes ou davantage, peut être extrait pour l'utilisation. 30 Comme on le voit à la figure 5, au fur et à mesure que la dissolution s'effectue, l'hexosamine est solubilisée. L'hexosamine est colorée par la réaction de Morgan-Elson.
Les courbes de la figure 5 ont été obtenues de la manière suivante.
35 A 7,5 ml de la solution d'enzyme dissous dans une solution tampon d'acide acétique 0,01M, on ajoute 15 mg de peptidoglycane de B. megaterium pour une réaction à 37° C. La diminution du trouble est représentée par la variation de la D.O. à 570 m(x. Le sucre N-acétylamino a été analysé quantitativement suivant la 40 méthode de Ghysen et ses collaborateurs (Elizabeth F. Neufeld et al., Methods in Enzymology in «Complex Carbohydrates», vol. VIII, pages 691 et 692 [1966]).
L'enzyme bactériolytique préparé selon l'invention présente un spectre bactériolytique considérablement plus large que celui du ly-45 sozyme de l'albumen. En d'autres termes, il présente la fonction bactériolytique sur presque toutes les bactéries Gram positives, y compris les bactéries de l'acide lactique. Une caractéristique particulièrement remarquable est qu'il est actif dans une gamme de faibles valeurs de l'acidité, à l'intérieur de laquelle les enzymes bactériolyti-jo ques connus ont des activités relativement médiocres.
L'enzyme de l'invention peut être utilisé comme antibiotique dans le domaine médical et pharmaceutique. Il peut être également utilisé comme antiseptique naturel entraînant une légère réaction contraire dans le domaine de la production des produits alimentai-55 res. Il y a lieu de considérer que cet enzyme peut être utilisé dans une vaste gamme d'applications, y compris la fusion cellulaire, domaine qui, au cours de ces dernières années, est devenu d'un vif intérêt eh technologie biologique.
60 Exemple 1
Dans une cuve de culture d'un volume de 501, on introduit 151 d'un milieu de culture liquide contenant 0,5% de peptone, 0,05% d'extrait de levure, 0,5% de glucose, 0,225% de phosphate de potassium, 0,067% d'hydrogénophosphate dipotassique et 0,05% de 65 sulfate de magnésium (heptahydraté); les produits contenus dans la cuve sont stérilisés par chauffage à 121° C pendant 15 minutes.
Après inoculation par le Klebsiella aerogenes, la culture est poursuivie pendant 48 heures à 35° C et à 150 tr/min, avec un taux d'aéra-
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tion de 20 1/min. La formation de bulles résultant de la croissance des germes est empêchée par addition d'un agent antimousse. Une fois la culture terminée, la solution de culture est stérilisée à 121° C pendant 5 heures et une bactérie Polysphondylium pallidum LE-1, qui a été cultivée dans une fiole soumise à une vibration pendant deux jours, est ajoutée à la solution de culture stérilisée, cela étant suivi d'une culture à 25° C et à 150 tr/min, avec un taux d'aération de 20 1/min. Une fois la culture terminée, la solution de culture est centrifugée pour séparer les cellules bactériennes (97 g en poids humide), lesquelles sont rincées à l'eau déionisée et auxquelles on ajoute alors de l'eau en une quantité de 50% en poids des cellules. Le mélange est placé dans un oscillateur à ultrasons, de manière à briser ou à broyer les cellules à 20 kHz pendant 20 minutes. Le reste des cellules est séparé par centrifugation, ce qui permet d'obtenir 110 ml d'une solution surnageante. L'activité enzymatique de la solution surnageante est de 180 unités/ml.
Exemple 2
On ajoute 684 g de sulfate d'ammonium (heptahydraté) à 1000 ml de la solution surnageante cultivée de la même façon que dans l'exemple 1 et dépourvue de cellules amibes; on laisse reposer le mélange à 4° C pendant une nuit, de manière à relarguer le précipité, lequel est rassemblé par centrifugation. Le précipité rassemblé est dialysé avec une quantité d'eau suffisante qui est concentrée pour obtenir 50 ml de liquide de dialyse. L'activité enzymatique du liquide de dialyse ainsi concentré est de 55 unités/ml.
Exemple 3
La solution surnageante préparée dans l'exemple 1 est utilisée comme source d'enzyme destinée à effectuer des essais de dissolution permettant d'étudier l'activité de dissolution sur divers corps de mi-cro-organismes. Les germes indiqués au tableau 1 furent cultivés dans des liquides, après quoi on rassembla les corps de germes par séparation par centrifugation, et ces derniers furent mis en suspension dans une solution tampon Mcllvaine (pH 3,5, force ionique 0,06). Les activités bactériolytiques sur les germes respectifs furent déterminées suivant la méthode précédemment décrite.
Les résultats sont indiqués au tableau 1.
Dans la détermination des activités bactériolytiques du lysozyme, une solution tampon d'acide phosphorique (pH 7,0, force ionique 0,06) est utilisée à la place de la solution tampon Mcllvaine, et une solution de lisozyme (concentration 15 (ig/mg) est utilisée à la place de la composition d'enzymes de l'invention, le mode opératoire étant par ailleurs le même.
Comme cela ressort du tableau 1, les enzymes de l'invention agissent sur une plus large variété de germes, dans un milieu acide à pH 3,5, que ceux attaqués par le lysozyme de l'albumen.
( Tableau en tête de la colonne suivante)
Exemple 4
En utilisant une série de dix fioles Sakaguchi de 500 ml, on introduit dans chacune d'elles 50 ml d'un milieu de culture liquide contenant 0,5% de peptone, 0,05% d'extrait de levure, 0,5% de glucose, 1,0% d'un corps de bactérie lyophilisé de Klebsiella aerogenes, 0,225% de dihydrogénophosphate de potassium, 0,067% d'hydrogê-nophosphate de dipotassium et 0,05% de sulfate de magnésium (heptahydraté), et l'on stérilise à 121° C pendant 15 minutes. La bactérie Polysphondylium pallidum LE-1 est ensuite inoculée dans chaque fiole, puis on procède à une culture par vibration à 22° C pendant 3 jours. Une fois la culture terminée, les cellules de l'amibe sont brisées, et la solution surnageante est séparée par centrifugation. L'activité enzymatique de la solution surnageante est mesurée, ce qui donne une valeur de 170 unités/ml de solution. La solution surnageante est relarguée avec du sulfate d'ammonium, puis dialy-sée, et l'activité enzymatique de la solution dialysée est mesurée et trouvée égale à 46 unités.
Tableau 1
Lysozyme
Enzyme
Espèce de germe de l'albumen de
(témoin)
l'invention
Lactobacillus arabinosus
—
+ + -1- + +
Lactobacillus bulgaricus
+
+ + + + +
Lactobarillus casei
+
-f- +
Streptococcus faecalis
(+)
+ + +
Streptococcus thermophilus
-
+ + + + +
Streptococcus lactis
-
+ + + + +
Bacillus subtilis
+ + +
+ + +
Bacillus megaterium
+ + + +
+ + + + +
Bacillus licheniformis
+
+ + +
Bacillus polymyxa
-
+ + + + +
Bacillus cereus
—
—
Micrococcus lysodeikticus
+ + + + +
+ + + + +
Staphylococcus epidermidi's
-
—
Arthrococcus simplex
(+)
+ + + + +
Brevibacterium ammoniagenes
-
(+)
Corynebacterium fascians
-
-
Escherichia coli
—
—
Alcaligenes faecalis
-
(+)
Enterobacter aerogenes
-
-
Note — La diminution de la D.O. à 570 m|i (%) est indiquée comme suit:
0 à inférieur à 8: - 8 à inférieur à 10: (+)
10 à inférieur à 20: + 20 à inférieur à 40: + +
30 40 à inférieur à 60 : + + + 60 à inférieur à 80 : + + + + supérieur à 80: + + + + +
Exemple 5
35 En utilisant une série de dix fioles Sakaguchi de 500 ml, on introduit dans chacune d'elles 50 ml d'un milieu de culture liquide contenant 0,08% de lécithine de soja, 2% de lait écrémé, 1 % de protéose peptone et 0,68% de dihydrogénophosphate de potassium, et l'on stérilise à 121° C pendant 15 minutes. La bactérie Polysphondylium 40 pallidum LE-1 est ensuite inoculée dans chaque fiole, puis on procède à une culture par vibration à 22° C pendant 3 jours. Une fois la culture terminée, les cellules de l'amibe sont séparées, par centrifugation, de la solution du milieu de culture. L'activité enzymatique de la solution surnageante séparée des cellules bactériennes 45 brisées est mesurée de la même façon que dans l'exemple 2, et trouvée égale à 72 unités/ml de solution. La solution surnageante du milieu cultivé est relarguée avec du sulfate d'ammonium, puis dialysée, de la même façon que dans l'exemple 2, et l'activité enzymatique de 50 ml de la solution dialysée est mesurée et trouvée égale à so 60 unités/ml.
Exemple 6
La bactérie Polysphondylium violaceum LE-1 est cultivée par vibration pendant 3 jours, dans les mêmes conditions que décrites 55 dans l'exemple 4. Une fois la culture terminée, les cellules bactériennes sont rassemblées par centrifugation et sont broyées aux ultrasons, de la même façon que dans l'exemple 1. L'activité enzymatique de la solution surnageante séparée par centrifugation est de 170 unités/ml et se manifeste sur une variété de micro-organismes in-60 diqués dans l'exemple 3, illustrant ainsi la fonction bactériolytique sur ces micro-organismes. A 100 ml de la solution surnageante du milieu de culture séparée des cellules bactériennes, on ajoute du sulfate d'ammonium pour le relargage, et le précipité est dissous dans une petite quantité d'eau, puis dialysé, ce qui permet d'obtenir 65 50 ml d'une solution d'enzyme concentrée. L'activité enzymatique de la solution ainsi concentrée est de 42 unités/ml.
R
3 feuilles dessins
Claims (8)
1. Procédé de préparation d'un enzyme bactériolytique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à cultiver une bactérie du genre Polysphondylium dans un milieu de culture contenant une source de carbone, une source d'azote, un sel inorganique et d'autres constituants nutritifs, puis à extraire ledit enzyme bactériolytique à partir du produit cultivé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie du genre Polysphondylium est le Polysphondylium pallidum LE-1 FERM BP-633.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie du genre Polysphondylium est le Polysphondylium violaceum LE-1 FERM BP-632.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite source de carbone est le glucose ou le lactose.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite source d'azote est au moins une source choisie dans le groupe comprenant des corps de germes séchés et du lait écrémé.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit sel inorganique est un phosphate ou un sulfate de potassium ou de magnésium.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est effectuée à un pH compris entre 4,0 et 8,0 et à une température comprise entre 15 et 40° C pendant 2 à 4 jours.
8. Enzyme bactériolytique préparé au moyen du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une haute activité dans un intervalle d'acidité correspondant à un pH compris entre 3 et 6, est stable à un pH compris entre 2 et 7, a une activité optimale
à une température comprise entre 45 et 55° C, supporte, tout en demeurant stable, un chauffage à 60e C pendant 15 minutes et présente une activité bactériolytique vis-à-vis du Micrococcus lysodeikticus.
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| SU519470A1 (ru) * | 1973-09-28 | 1976-06-30 | Днепропетровский Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.300-Летия Воссоединения Украины С Россией | Способ получени литических ферментов |
| JPS5332189A (en) * | 1976-09-07 | 1978-03-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Treatment of unicellular agar |
| US4144327A (en) * | 1978-03-20 | 1979-03-13 | G. D. Searle & Co. | Antimicrobial composition comprising lytic enzymes from physarum and an antimycotic agent |
-
1984
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1985
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