SU379101A1 - Способ получения протеолитических ферментов - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к ферментной промышленности .

Известен способ получени  протеолитичеСКИ1Х ферментов путем выращивани  микроорга1низмов рода Bacillus Hai питательной среде, содержащей -источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочном значении рН среды и аэрации с лоследующИМ выделением ферментов из культур а льной жид-кости.

Предлагаемый способ позвол ет получить ферменты, обладающие оптимальной протеолитической активностью по отнощению к гемоглобину в присутствни мочевины при зна,чании рН не менее 10.

Дл  этого -рН среды устанавливают на значении 8,5-10,5, а в качестве микроортанизмов используют один из щтаммов, наход щихс  на хранении в Национальной Колле-кции Про,мышленных бактерий. Исследовательской станции Торри, Абердин, Шотланди , под №№ 10144, 10148, 10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304, 10306-10313, 10315- 10327, 10282, 10287, 10291, 10293, 10302, 10314, или их мутанты.

Способ за-ключаетс  в следующем.

ПроиЗВод т «ульти-вирование бактерий рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей при аэрации и рН среды 7,5--10.

2

В качестве источника углерода используют карбогидраты, такие как сахароза, глюкоза, крахмал, мука из зерен хлебных злаков, рис, сорго и др. Концентраци  карбогидратов составл ет 25-1%, наиболее оптимальна  8-10% (процент вычисл етс  .по декстрозе). Присутствие в питательной среде карбогидратов способствует образованию кислотных комп01нентов, в результате чего рН среды при

культивировании снижаетс . Так Как рН среды неО|бходимо поддерживать в пределах 7- 12, необходимо его измер ть. Дл  поддержа )и  среды в указанных пределах можно определенное количество -карбогидратов -вводить вместе с буферным веществом. Карбонаты и особенно сесквикарбонаты, используемые в концентрации 0,2 М в среде, способны поддерживать рН среды 10.5 и 9,3 соответственно .

Могут примен тьс  и другие буферные смеси , например фосфатные. Карбогидраты можно вводить небольши.ми порци ми в течение всего .процесса. Можно использовать автоматическое регулирование рН добавлением

различных подщелачивающих веществ.

Источники азота могут быть использованы неорганической и/или органической природы |Подход щими неорганическими источниками азота  вл ютс  нитраты и соли ам.мони ,

а органическими - соева  мука, мука сем н

хлопка, арахисова  . казепвд -кукурузный и дрожжевой экстракты,, мочевина, альбумин. Культивирование осуществл ют при 25- 55°С (предпочтительно при 30-40°С).

Максимальна  активность протеолитических ферментов достигаетс  после культивировани  в течеиие 1-5 суток.

Культивдарован-ие бактерий осуществл етс  как глубинным методом при аэрации, так и повер.х.ностным.

При поверхностном культивирований используетс  среда, содержаща  10 г пшеничных отрубей. 2 г Na3PO412H2O и - 10 мл воды. Перед инокул цией рН среды устававливагот на значении около 10 с помощью 2 мл NaOH. Даниым методом культивируют щтамм С 300 и С 303. Активность получеииых ферментов около 20 ед. Ansona на 1 кг пшеничных отрубей.

Активность фер-ментов определ етс  с помощью гемоглобивдового .метода Ansona (Anson gournal of yeneral Physiology, 22, 79-89, 1939).

Одна единица Ansona означает количество протеолитического фермента, расщепл ющего гемоглобин при рН 10,1 и темлературе 25°С в течение 10 мин с такой первоначальной скоростью , при которой в 1 мин образуетс  такое количество продуктов расщеплени , которое не может осаждатьс  трихлоруксусной кислотой, чтобы эти продукты расщеплени  дали тот же цвет с фенольным реагентом, какой дает однн миллиэквивалент тирозинЛ:.

Дл  культивировани  видов и штаммов используют две среды:

Среда BPFA со следующим составом, г/л водопроводной ВОДЫ::

Картофельна  мука50

Сахароза50

Ячменна  мука50

Соева  мука20

Казеинат натри 10 .,-12H2O9

Pleuronic0,1

Среда BSX со следующим составом г1л водопроводной воды:

Ячменна  мука100

Соева  мука30

Pleuronic0,1

Обе эти среды довод тс  до требуемого значени  рН добавлением сесквикарбовата или соды в стерильных услови х. Присутствующий крахмал нейтрализуетс  а-ан«лазой .

Экспери.менты провод тс  в 500 мл встр хиваемых колбах, кажда  из колб содержит 100 мл питательной среды BPFA и BSX соответственно , которые стерилизуютс  в автоклаве в, течение 90 мин при 120°С. После обработки в автокл:аве 31начен.ие рН доводитс  до 9,3-10,5 с помощью сесквикарбоната натри . Дл  «аждой бактерии используетс  четыре колбы, и пробы из культуральных

сред дл  определени  активности фермента, выраженного в единицах Anson, берутс  после культивировани  через 3, 4, 5 и 6 дней соответственно. Колбы при культивировании

по..мещаютс  на вращающийс  стол с 240 об/мин.

В табл. 1 привод тс  максимальные выходы энзимов и Значени  рН.

Питательные средства BPFA и BSX используютс  также дл : культивировани  в емкост х в глубинных услов и х при искусствеННой аэраЦии.

В табл. 2 приведены данные культивировани  при 34°С на пилотной установке в 550 л

емкост х.

При других культивировани х на пилотной установке используютс  другие щтаммы с варьируемыми составами питательной среды. В остальных цистернах культивируетс  щтамм

С 303 в четырех вариантах с различными услови ми .

Композиции культуральных сред, услови  культивации и полученные результаты даютс  в табл1. 3.

Протеолитические ферменты выдел ют из культуральной среды путем удалени  клеток бактерий центрифугиров.анйем и осаждени  ферментов из фу.гата добавлением - Na2sO4 или этанола. Образовавщийс  осадок отдел ют фильтрованием на кизельгуре и полученн-ый осадок сущат.

Примеры выделе ш  ферментов приведены в табл. 4.

Исходные материалы., упом нутые в табл.4,

получают культивированием в 550 л цистернах из нержавеющей: стали при искусственной аэрации, рН питательных сред устанавливаетс  перво.начально с помощью 2М раствора Ма.2СОз.

Испытание нротеолитических ферментов, показывает, что между ними есть существенные различи , относ щиес  К р ду их свойств. |По нротеолитической активности ферменты мотут быть разделены на три .группы или типа . Протеолитическа  активность измер етс  при рН 12 и выражаетс  в прогдентах максимальной активности: Тип 1 100-80 Тип 2 80-50

Тип 3 50-0

Известно на пр актике, что ионы кальци  стабилизируют актив.ность больщинства нротеолитических ферментов. Новые ферменты, продуцируемые бактери ми, перечисленными

в табл. 1 и разделенные иа виды и разновидности , испытывают в отнощении стабилизирующего действи  .кальци  в концентрации 0,01М и при рН 10,5 или 111. Стабилизади  выражаетс  в. процентах остаточной

активности после выдержки в течение 30 мин при 50°С.

Результаты испытани  типов ферментов и стабилизирующего эффекта ионов «альци  привод тс  в табл. 5, в которо.й плюс озвачает , что остаточиа  протеолитическа  активТ а б л и ц а 1

Таблица 3

С 339

Услови  проведени 

опыта

250 кг культуральной жидкости , содержащей 25 ед. Anson на 1 кг . количество ,иниц 3000 06JMUH (30 мин) Центрифугирование 35С, 85 л;г/Ка25О4, отс Осаждение вание 1 час 2,25 КЗ кизельгуровый Фильтраци  фильтр-пресс Сушильна  камера ( 4000 г содержание 0,4 Порошок фермента Anson на 1 г 1600 ед. Anson 25 96

Таблица 4

С 351

С 347

Исходный материал

600 мл культуральной жидкости , содержащей 32 ед. Anson на 1 кг 3000 06JMUH (30 мин) Сушильна  камера (40С) 4000 об1мин (30 мин) tOC 1200 мл CjHjOH t35C, 85 кг NaaSO4, отстаивание 1 час Никакой (центрифугирование) 30 мин при 4000 о61мин; Фильтр-пресс промывка 600 мл CaHjOH при ОС, центрифугирование 4000 об1мин 10 мин Вакуум PjOs 1300 г, содержание 0,8 ед. 9,7 г, содержание 1,3 ед. Anson на 1 г Anson на 1 г 1020 ед. Anson 9 6 12,6 ед. Anson 65%.

ность в отсутствии иОНов кальци   вл етс  ниже 80% соответствующей активности контрол  (в присутствии ионов 1калыци ), а минус озиачает, что остаточна  протеолитическа  активность в отсутствии иоиов кальци   вл етс  выше 80% соответствующей активности (Контрол  в присутствии ионов кальци .

Протеол;итическа  активность ферментов, продуцируемых штаммами, перечисленными в табл 5, испытываетс  «е только нр« рН 12, но также лри более низких его значени х.

Новые ферменты подвергают следующим испытани м:

а) Стабильность против триполифосфата

(ТРР).

Таблица 5 Определ етс  стабильность ферментов в растворе, содержащем 0,2% триполифосфата. Ста:билыность выражаетс  в процентах остаточ«ой активности спуст  50 мин, при 50°С .при рН 10. Кон-цектраци  фермента 0,1 ед, Anson-на 1 л (по методу Ansona). Результаты привод тс  в табл. 6. Соответствующие растворы с 0,01 М СаСЬ показывают остаточную активность во всех случа х 80-100%. b)Стабильность против пербората. Определ етс  а1ктив1ность раствора, содержащего фермент и перборат натри  в кодичестве 0,1%. Стабильность выражаетс  в процентах остаточной а ктивности спуст  30 мин при и рН 10. Концентраци , фермента и методика а нализа такие же, как в испытании а. c)Стабильность против поверхностно-активных веществ. Стабильность растворов, содержащих фермент и различные ловерхностно-активиые вещества , определ етс  лр« использовании трех типичных поверхностно-активных веществ в концентраци х, соответствующих концентраци м , примеп емым в моющем растворе: Мыло0,25 г/л ДВ5 - алкил-арилсульфон1ат ( 50%-ный).2,5 г/л TAS - сульфат жириого спирта ( 25%-ный)5,0 г/л Концентраци  фермента 0,1 ед Anson.ц.а 1 л

Таблица 6 Испытани  провод тс  30 мин. при 50°С и лри рН 10; метод ан ализа - нитро-казеиновый (Е. V. Pechrnainn, Biochemische Zeitschrift, Bd. 321, 248-260/1950). Цифры в табл. 6 расщифровываютс  следующим образом: цифра над строкой показывает процент остаточной активности, когда анализ выполн етс  сразу после добавлени  поверхностноактиБиого вещества, то есть даниа  цифра дает показатель первоначальной степени инактивации; цифра под строкой показывает разницу между данной первоначальной остаточной активностью и процентом остаточной активности спуст  30 мин. d)Оптимальна  температура. Температура дана в градусах Цельси , лри которой была найдена .максимальна  активность при рН 10. (Методом авализа -был метод Anson). e)Тип фермента. Найдено, что все ферментные препараты ингибируютс  моментально с полностью фен .илм.етилсульфонилфтор-идом. Это означает, что все ферменты в активном центре имеют серин. f)рН- устойчивость. Стабильность при различных значени х рН определ етс  :в отнощении п ти ферментных препаратов лри следующих услови х: выдерживание- 24 час .при 25°С; значени  рН - 5-7-8-10-12; .колцентраци  фермента 0,2 ед, Anson иа 1 л.

13

14

Таблиц а 7 Номер, под которым бактери  находитс  в

Продолжение национальной коллекции промышленных бактерий.

iB табл. 6 лаказан интервал рН, в котором была найдена остаточна  активвость пор лка 80-100%.

Испытание ферментных пренаратов, полученных с помощью штаммов С 303 и С 347, по отношению сульфиту натри  показывает, что ферменты не чувствительны к данному восстанавливающему агенту, из чего следует, что S-S мостИКи .не существенны дл  третичной структуры ферментов.

Из табл. 6 видно, что р д фер.ментнмх лрепаратов .показывает удивительные свойства стабильности.

Ферментные препараты или композиции, согласно изобретению, состо т .из твердой или жидкой смеси протеолитических ферментов и других компонентов, количество и состав которых завис т от цели и технической или научной области, в К-оторой .намереваютс  использовать их.

Ферментные препараты илн .композиции- могут со сто ть из .гранул, могут быть в виде суспензии «ли раствора, содержащего стабилизаторы .

.Полученные фермен.ты используют в «ебольщ .их количествах (н-е более 10 вес. %).

Эти ферменты используют в моющих, депилаториых 1КОМПОЗИЦИЯХ, в препаратах дл  гидролиза .протеинов, в установках дл  очистки канализации, в орошающих композици х и в качестве септичвСких .добавок в резер.вуары.

Дл  получени , протеолитических фермевто:В осуществл ют культивирование новых видов Bacillus, в.ыделенны.х из. различных образцов почв, навоза животных и других источников .

Дл  выделени  новых видов бактерий рода Bacillus источники выделени  («апример, почву, навоз) по;мещают в питательные среды , им.еющие значение рН 9-.И, а затем выдел ют бактерии, с.посо.бные расти при указанных рН, и подвергают их исследовани м.

Дл  выделени  используют и методы удо-бр ни  (витаминизировани ), известные в промышленности .

Характеристики в.новь выделенных штаммов привад тс  в табл. 7.

Таксономические исследовани  всех этих членов рода Bacillus осуществл ютс , при использовании методов, описанных Smithom, Gordon u Clark b «Aerobic Spore forming Bacteria, U. S. Department of Agr. монографи  № 16 (1952). Эти методы до н асто щего времени считаютс  наиболее подход щими, но он.и должны, видоизмен тьс  в виду того, что все питательные среды должны ycTa.HiaBливатьс  на более высокой величине рН, чем та, котора  указываетс  Смитом, Gordon u Clark, потому что все виды Bacillus, перечисленные в табл. 7, растут при повыщенных значени х рН.

Бактерии могут раздел тьс  довольно точно .на морфологические группы. Эти .группы отличаютс  друг от друга до та.кой степени.

что в действ.ительности .представл ют отдель№ые виды.

Внутри морфологических групп встречаютс  различи  в биохимических реа.кци х. На основе этих различий группы подраздел ютс  на разновидности, которые представл ютс  одним или более штамма.ми.

Вид I (принадлежащий к морфологической грш.пе I в соответствии с Bergey).

Морфологи . Вегетативные палочки размером 0,5-0,7x1,5-4 мк, образует споры размером 0,5-0,8X0,8-1 мк от центральных до субтерминальных. Встречаютс  споры овальные , цилиндр.ичеокие, тоикостенные.

Разновидность о.

С 300, с 301, с 360, с 372, С 374.

Грампол.ожительные.

Рост .на питательном агаре при рН 7,3 и 9,7 хороший. Максимальна  температура дл  роста 50-55°С.

На ГЛЮ1КОЗНОМ или маннитово.м агаре с нитратом в Качестве единственного источника азота .при рН 9,7 рост скудный ил.и отсу ствует .

Крахмал гидролизует.

Через семь дней зона гидролиза узка .

Разновидность Ь.

С 302, С 334. Грамположительный.

.Рост на питательном агаре при рН 7,3 гораздо медленнее в течение первых двух дней, после это.го почти срав.ним с ростом на питательном агаре при рН 9,7.

Максимальна  температура дл  роста 40- 50°С.

На глюкозном или ма.ннитовом агаре при рН 9,7 с нитрато.м в качестве единственного источ.ника азота рост скудный или отсутствует .

Гидролизует крахмал; 1при это.м образуетс  широка  зона гидролиза.

Разновидность с. С 323, С 339, С 352, С 363.

Грамположительный или грамизменчивый. Рост умеренный до скудного на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура роста 37- 50°С.

На глюкозйом или манниитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота рост скудный. Гидролизует крахмал, 3owa гидролиза щ.ирока . Разновидность d.

С 304, С 311, С 336. Грамположительные палочки. Рост умеренный до скудного на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 37°С.

Скудный рост глюкозном или маанитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота. Крахмал .не гидролизует.

Вид II (п-ринадлежащий к морфологической группе I, согласно Bergey).

С 335, С 341.

Морфологи . Вегетативные палочки размером 0,3-0,4X1,5-2,5 мк.

Споры образует. Размер их 0,3-0,5Х Х0,8-1 мк от центральных до парацентральН .ЫХ, от овальных до цилиндрических, тонкостенные .

Спорангии очень мелкие или отсутствуют, разбухание спорами.

Грамтоложительный.

Почти нет роста на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 37°С.

Нет или скудный рост на глюкозном или маннитовом агаре с нитратом в качестве единственного источника азота.

Крахмал не гидролизует.

Вид III.

Морфологи . Вегетативные палочки размером 0,6-0,7x1,5-3,5 мк с закругленными ко«цами.

Споры эллипсоидальные размером 0,7- 0,9X1 0-1,2 р, ларацентральные до субтерминальных , толстостенные.

Некоторые спорангии отчетливо вздутые.

Палоч1 и в спорулироваиных культурах разбухают и растут очень толстыми, но сохран ют их оригинальный вид. СпорулируюЩие короткие палочки могут иметь глобул рную н-а дайной стадии. Таким образом, нет локального разбухани  на месте, где размещаетс  Спора, хот  некоторые споратагии веретенообразные .

Разновидность а.

С 326, С 324.

(Грамположительный.

Рост отсутствует или только незвач-ительньш на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 50°С.

Рост отсутствует или только скудный «la глюкозном или майнитовом агаре лри рН 9,7 с нитратом в Качестве единственного источника азота.

Крахмал гидролизует, при этом образуетс  широка  зо«а гидролиз.а.

Разновидность Ь.

С 347, С 350.

Грамположительный.

Умеренный рост на .питательном агаре при рН 7,3.

МаК|Си.мал;ьна,  температура дл  роста 50°С.

Недостаточный рост на глюкозном или ман«итовом агаре при рН 9,7 с .нитратом в качестве единственного источника азота.

Крахмал гидролизует, зона гидролиза широ-ка .

Разновидность с.

С 337, С 340.

iГpaмoтpицaтeльный или грамизменчивый.

Умерениы-й ро,ст на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 37 и 50°С.

Недостаточный рост на глюкоз1ном или ман«итовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.

Крахмал гидролизует € образованием широкой зоны гидролиза.. Разновидность d. С 338, С 343, С 346, С 343, С 349. |Грамизменчнвый или грамотрииательный. Рост на питательном агаре при рН 7,3 умеренный .

Максимальна  температура дл  роста 45-50°С .

Рост отсутствует или очень незначительный на глюкозном или м аннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.

Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролиза.

Разновидность е. С 324, С 355.

Грамлоложительный.

Роста нет или только очень незначительный на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 45- 50С.

Умеренный рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота.

Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза. Разновидность /. С 353.

Грам отрицательный.

Умеренный рост на питательном агаре при рН 7,3.

Максимальна  температура дл  роста 50°С. Умеренный ро.ст на глЮКОЗном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве источника азота.

Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза.

Вид Яо IV (принадлежащий К морфологической группе II, согласно Bergey).

Морфологи . Вегетативные палочки размером 0,4-0, мк часто встречаютс - в виде длинных цепочек.

Образует споры овальные, субтерминальные толстостенные, легко окрашенные, размером 0,6-0,8X0,7-0,9 .ик.

Слорангии отчетливо вздутые, булавовидные .

Разновидность а.

С 303, с 354, С 357, С 366, С 367, С 371, С 375, С 378.

Грамотрицательный.

Рост умеренный до хорошего н-а питательном агаре при рН 7,3.

Ма-кси.мальна  температура дл  роста 57°С. Рост умеренный до хорошего на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота .

Крахмал гидролизует с образованием умеренной 3ojibj гидро.лнза.

21

Разновидность b.

С 351, С 356, С 364, С 376, С 377, С 411.

Грамизменчивьш.

В других отнюшели х похож на разновидность а.

Разновидность с:

С 358, С 410.

Грамполюжительный.

iB других отношени х разновидость а.

Вид V (принадлежащий к морфологической группе II, согласно Bergey).

С 365, С 412. Морфологи . Вегетативные палочки, пр мые , встречаютс  слегка изогнутые, размером 0,3-0,4x2-4 мк. Споры размеро,м 0,6-0,7X0,9-1,2 мк, овальные до эллипсоидальных, оарадентральные до терминальных, толстостенные, слегка окрашенные. Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные до ракетковидных. Грамлоложительный. Рост умеренный до хорошего на питательном агаре ири рН 7,3. Максимальна  темлература дл  роста 57°С. Хороший рост на глюкозлом или маннитовом агаре при; рН 9,7 с нитратом в качестве единСтвеННого источ.ника азота. Гидролизует крахмал с образованием зоны гидролиза от умеренной до широкой. Бид VI (принадлежащий к морфологической группе II, согласно Bergey). Морфологи . Вегетативные палочки слегка изогнутые, КО.НЦЫ заостренные, размером 0,25-0,35x2,5-5 мк. Спрры от овальных до эллипсоидных, от субтерминальных до термвн-альвьгх, размером 0,8-1X1,1 -1,3 л/с. Спорангии отчетливо вздутые, булавовидные , встречаютс  формы барабанной палочки . Разновидность а. Грамотрицательный. Рост отсутствует или только очень незначительный на питательном агаре :при рН 7,3. Максимальна  темлература дл  роста 50°С. Рост отсутствует или только очень незначительный на глюкозном или мавнитовом агаре лри рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота. Гидролизует крахмал с образованием широкой зоны гидролиза. Разновидность Ь. С 325, С 413. Грамположительный. Умеренный рост на питательном агаре при рН 7,3. Максимальна  температура роста 50°С. Рост отсутствует или голько очень незначительный на глюкозном или маннитовом агаре лри рН 9,7 с нитратом в «ачестве единственного источника азота..

22

Крахмал гидролизует с образованием широкой зоны гидролиза.

Вид VII.

С 370.

Этот штамм экспериментально классифицирован Как новый вид.

Он;  вл етс  аспорогенным или олигоспорогевным и, следовательно, не может быть ,помеш ,е.Н в какую-нибудь морфологическую группу.

Таблица 8 Вегетативные палочки часто в длинных цепочках , нитевидвые, концы слегка заостренные или закругленные, размером 0,3-0,5x2-5 мк. Грамотрицательный. Рост от умеренного до хорошего на питательном агаре при рН 7,3. Максимальна  температура дл  роста 57°С. Хороший рост на глюкозном или маннитовом агаре при рН 9,7 с нитратом в качестве единственного источника азота. Гидролизует крахмал с образованием умеренной зоны гидролиза. Следующие признаки  вл ютс  общими дл  р да штаммов, принадлежащих к различным разновидност м в видах I-IV. Желатин - гидролизует. Казеин - гидролизует. На агаре с глюкозой рост такой же, как на питательном агаре. На соевом косом агаре рост более обильный и м гче, чем на питательном агаре. Тирозиновый косой агар. Рост такой же, как на питательном агаре. Питательный бульон. Средн   мутность с обильным осадком.

Таблица Пленки нет или образуетс  пленка тонка  и хрупка . Бульон с iNaCl. Хороший рост при 5%-ной концентрации NaCl; растет при 7%. Ацетилметилкарбинола не образует. Восстанавливает нитрат в нитрит. На глюкозном бульоне в анаэробных услови х при рН 7,8 или выше за 14 дней (рН среды доводитс  до 9 перед инокул цией) рост скудный. На основе таксономических исследований изобретателей штаммы рода Bacillus, перечисленные в табл. 1, классифицируютс  следующим образом (см. табл. 8). Все эти виды выращиваютс  также на питательном агаре и соево-бобовом агаре, а некоторые из них на глюкозном и маннитовом питательных агарах с целью наблюдени  формы, виды и цвета колонии. В табл. 9 приведены свойства, вариации которых образуют основу дл  разделени  разновидностей внутри различных морфологических групп.

25 Предмет изобретени 

1. Способ получени  протеолитических ферментов путем выращивани  микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии минеральных солей при щелочном значевии рН среды и аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийс  тем, что, с целью получени  ферментов, обладающих оптимальной протеолитической активностью по отнощению к ге379101

26

моглобину в присутствии мочевины при значении рН не менее 10, рН среды устанавливают на значении 8-10,5. 2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что

дл  выращивани  используют один из штаммов рода Bacillus, наход щихс  на хранении в национальной коллекции Промышленных бактерий. Исследовательской Станции Торри, Абердин (Шотланди ) под №№ 10144, 10148,

10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304, 10306-10313, 10315-10327, 10282, 10287, 10291, 10293, 10302, 10314, или их мутанты.