RU2054480C1 - Штаммы бактерий bacillus stearothermophilus - продуценты ксиланазы, способ получения ксиланазы и ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий bacillus stearothermophilus, обладающая активностью делигнификации - Google Patents

Штаммы бактерий bacillus stearothermophilus - продуценты ксиланазы, способ получения ксиланазы и ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий bacillus stearothermophilus, обладающая активностью делигнификации Download PDF

Info

Publication number
RU2054480C1
RU2054480C1 SU905053263A SU5053263A RU2054480C1 RU 2054480 C1 RU2054480 C1 RU 2054480C1 SU 905053263 A SU905053263 A SU 905053263A SU 5053263 A SU5053263 A SU 5053263A RU 2054480 C1 RU2054480 C1 RU 2054480C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
xylanase
ncimb
bacillus stearothermophilus
activity
ala
Prior art date
Application number
SU905053263A
Other languages
English (en)
Inventor
Юджин Розенберг
Юваль Шохэм
Original Assignee
Корснас АБ
Рамот-Юниверсити Осорити фо Эпплайд Рисеч энд Индастриал Дивелопмент Лтд.
Текнион Рисеч энд Дивелопмент Фаундэйшн Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Корснас АБ, Рамот-Юниверсити Осорити фо Эпплайд Рисеч энд Индастриал Дивелопмент Лтд., Текнион Рисеч энд Дивелопмент Фаундэйшн Лтд. filed Critical Корснас АБ
Application granted granted Critical
Publication of RU2054480C1 publication Critical patent/RU2054480C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Abstract

Использование: биотехнология, целлюлозно-бумажная промышленность в процессах делигнификации и отбеливания древесной массы. Сущность изобретения: предложены штаммы бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 и NCIMB 40222 - продуценты ксиланазы, отобранные из вод после обработки на целлюлозно-бумажной фабрике Korsnas, Gavle Швеция. Способ получения ксиланазы предусматривает культивирование одного из вышеотмеченных штаммов - продуцентов на питетельной среде, содержащей необходимые для биосинтеза источники питания, в аэробных условиях, отделение из культуральной жидкости центрифугированием и осаждением сульфатом аммония из осветленного бульона с последующим ресуспендированием в жидкой среде частично очищенной фракции ксиланазы с активностью 15 - 20 Ед/мл или 35 - 40 Ед/мл соответственно и получение высокоочищенной ксиланазы с активностью 15 Ед/мл и 45 Ед/мл из осветленного культурального бульона с одновременной очисткой и концентрированием на катионообменнике SE-52 или СМ-52. Выделенная ксиланаза, обладающая активностью делигнификации, термостабильна по крайней мере при 65oС и рН 9, имеет мол.м. между 41000 и 42000 Да, частичную и N-концевую аминокислотную последовательность. 4 с. и 3 з. п. ф-лы, 25 табл.

Description

Изобретение относится к микроорганизмам-продуцентам ферментов и способам получения ферментов, а точнее к новым штаммам бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 и NCIMB 40222 продуцентам ксиланазы, способу получения ксиланазы и ксиланазе, выделенной из этих штаммов. Изобретение находит применение в процессах делигнификации и отбеливания в целлюлозно-бумажной промышленности.
В целлюлозно-бумажной промышленности главные усилия направлены на снижение использования химикатов в процессах делигнификации и отбеливания, так как такие химикаты, а особенно хлорорганические соединения, поступающие в стоках предприятий отбеливания, повышают загрязнение окружающей среды.
Один подход для снижения использования химикатов при варке целлюлозы и отбеливании состоит в применении микроорганизмов, способных разрушать лигнин. Предлагалось также применение ферментов, разрушающих или модифицирующих лигнин. Исчерпывающий обзор по биодеградации лигнина был опубликован в Critical Reviews TM in Biotechnology, vol. 6, Issue 1, 1987, pp. 1-60, Ed. Stewart, G.G. and Russel, I. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.
Другой подход заключается в удалении лигнина с помощью гемицеллюлаз, чтобы разорвать гемицеллюлозные связи. Обзорная очистка, статья по гемицеллюлазам их распространение, очистка, свойства и механизм действия даны Dekker, R.F.H. и Richards, G.N. и опубликованы в Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, vol. 1976, pp. 277-352.
Среди гемицеллюлаз ксиланазы являются теми ферментами, которые привлекли наибольшее внимание в плане их использования для варки и отбеливания целлюлозы с помощью биологических методов. FR 2557 894-A1 описывает обработку бумажной массы с помощью ферментного раствора, который лишен какой-либо целлюлазной активности и который содержит ксиланазу. Обработка эффективна при 20-60оС, особенно при 40оС, а в примере 6 показано, что рН должно быть 5. Однако в целлюлозно-бумажной промышленности по экономическим причинам и удобствам желательно проводить обработку древесной массы при более высоких температурах и более высоких значениях рН, поскольку некоторые отработанные процессы отбеливания осуществляют при температурах свыше 65оС и при рН, превышающих 9.
Известен способ получения ксиланазы (заявка Японии N 1309684 (А), рег. N заявки 64-104155, опублик. 14.12.89 или Patent Abstracts of Japan, v. 014, 106 (c-694) 27.02.90), который включает культивирование продуцирующих бактерий Bacillus sp FERM P-7221 в питательной среде, содержащей необходимые для биосинтеза источники питания, в аэробных условиях, извлечение из прозрачной среды фермента добавлением сульфата аммония, выпавший в осадок фермент обезвоживают и высушивают, полученный сырой порошок растворяют в 0,05 М HCl буфере с рН 7,2, отделяют осадок и последовательно очищают ксиланазу сначала на DEAE-целлюлозе и сефадексе G-100. Ксиланаза VII типа, продуцируемая штаммом Bacillus sp. NV-2 (FERM P-7221), имеет мол.м. 50000 Да или 42000 Да, рН оптимум 6-7,0; рН стабильность 4,5-10,0 (при 45оС в течение 60 мин), температурный оптимум 60-70оС при рН 6,0-7,0; фермент стабилен при 60оС в течение 10 мин.
Указанный фермент применяют для получения ксилоолигосахаридов из растительного сырья и для расщепления одревесневших (лигнофицирующих) материалов.
Однако фермент, продуцируемый указанным штаммом, обладает недостаточно высокой активностью делигнификации и термостабильностью.
В основу изобретения положена задача создания новых штаммов-продуцентов ксиланазы, продуцирующих ксиланазу с повышенной активностью и термостабильностью, а также разработка способа получения ксиланазы.
Задача решена тем, что заявляются новый штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 и новый штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222 продуценты ксиланазы.
Фермент ксиланаза, продуцируемый указанными штаммами, обладает повышенной активностью делигнификации и термостабильностью по сравнению с ксиланазой, продуцируемой известным штаммом бактерий Bacillus sp FERM P-7221.
Задача также решается тем, что в способе получения ксиланазы путем культивирования бактерий-продуцентов ксиланазы на питательной среде, содержащей источники питания, необходимые для биосинтеза, в аэробных условиях, с последующим отделением из полученной культуральной жидкости клеточной массы и выделением из оставшегося осветленного культурального бульона целевого продукта, согласно изобретению в качестве бактерий-продуцентов ксиланазы используют штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 или штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222. Отделение из культуральной жидкости клеточной массы предпочтительно проводят центрифугированием.
Для получения частично очищенной фракции целевого продукта выделение его целесообразно проводить путем осаждения сульфатом аммония осветленного культурального бульона с последующим ресуспендированием в жидкой среде.
Для получения высокоочищенной фракции целевого продукта выделение его проводят путем пропускания через катионообменник осветленного культурального бульона с одновременной очисткой и концентрированием.
Согласно изобретению ксиланаза, выделенная из заявляемых штаммов B. stearothermophilus NCIMB 40221 или B. stearothermophilus NCIMB 40222, обладает активностью делигнификации и имеет
мол.м. между 41000 и 42000 Да (при определении методами ПААГ на DDC-натрия и гель-фильтрацией);
изоэлектрическую точку 9,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования);
рН оптимум около 7,0 при рН 9,0 активность около 50% от таковой при рН 7,0;
термостабильность: активность падает после 65оС и рН 9,0 в течение 15 мин, при 65оС и рН 7,0 активен в течение более 10 ч;
частичная N-концевая аминокислотная последовательность: Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro- Gln-Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro- Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-.
Выделение организмов, вырабатывающих термостабильный фермент, осуществляли следующим образом.
Источниками организмов являлись вода и образцы ила (тины, грязи), отобранные из вод после обработки на целлюлозно-бумажной фабрике Korsnas, Gavle, Швеция. Обогащенная среда (ХМ) содержала 0,01% дрожжевой экстракт, 0,04% триптона и 0,2% ксилана при рН 7,0. Такая же среда, но с рН 8,1 и 9,6 содержала еще Na2CO3. Образцы воды и ила добавляли к среде ХМ и культивировали аэробно при 65оС. Образцы культур переносили на свежие среды каждые 2-3 дня. После четырех переносов образцы из культур разбавляли и наносили на агаровые пластины с ХМ (ХМ, содержащая 2% агара).
После трех независимых процессов обогащения были выделены 30 штаммов, которые были способны расти на пластинах с агаром и ХМ при 65оС. Не было выделено изолятов со среды ХМ при рН 9,6. Из 30 изолятов 10 образовывали четкие зоны вокруг колонии, что предполагает их способность продуцировать внеклеточную ксиланазу. Два из этих 10 изолятов (штаммы Т2 и Т6) были выбраны для депонирования.
Депонирование микроорганизмов.
Два штамма, а именно Bacillus sp T-2 и Bacillus sp T-6, были депонированы согласно Будапештскому Соглашению в Национальной Коллекции Промышленных и Морских Бактерий, Ltd (NCIMB), Абердин, 8 ноября, 1989 г. Каталожные номера для штаммов Т-2 и Т-6 NCIMB 40221 и NCIMB 40222 соответственно.
Идентификация штаммов Т2 и Т6.
Штаммы Т2 и Т6 являются аэробами, грамположительные, спорообразующие палочки, способные расти при 65оС. Эти штаммы отнесены к различным штаммам Bacillus stearothermophilus, согласно NCIMB на основе следующих данных, приведенных в табл. 1.
Составы жирных кислот штаммов Т2 и Т6, обладающих активностью ксиланазы, были посланы в Microbial ID, INC. Newark, DE, USA для определения состава жирных кислот. Результаты представлены в следующей табл. 2.
Характеристики роста штаммов Т2 и Т6 и получение концентрированных неочищенных надосадков из культивируемых штаммов.
Ростовая среда: среда ХМР, содержащая, г/л: казаминокислоты без витаминов 4; дрожжевой экстракт 0,2; MgSO4 0,01; (NH4)2SO4 2; K2HPO4 0,46; KH2PO4 0,1; ксилоза 5; MOPS (3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота) 10,4; микроэлементы, рН среды 7,0.
Активность ксиланазы:
Активность ксиланазы определяли, инкубируя свежий раствор ксилана с внеклеточной надосадочной жидкостью и определяя прирост содержания восстанавливающихся сахаров с применением феррицианидного метода (Spiro, R.G. 1966, Methods in Enzymology 8:7-9). Буфер для определения: 50 мМ трис-HCl, pH 7,0 и 0,5% ксилана (лущеный овес, Сигма). Единицы активности ксиланазы определяли как количество микромолей восстанавливающихся сахаров, образующихся за 1 мин при 65оС.
Мутность клеток в среде. Мутность клеток в среде дана в единицах Klett'a. IKU 0,004 г сухого веса клеток/л. Как только культура достигает максимальной плотности, она приобретает тенденцию к лизису, на что указывает резкое снижение мутности культуры.
Штаммы Т2 и Т6 выращивали на среде ХМР в течение 24 ч в ферментере New Brunswick Microferm объемом 7,5 л. Рост проводили в рабочем объеме 4 л, при 60оС, при перемешивании 600 об. в 1 мин и при скорости аэрации 7 л в 1 мин. Образование пены контролировали автоматически, добавляя силиконовый противовспениватель (5% Fluka), а рабочий объем поддерживали добавлением стерильной воды. Мутность исходного посевного материала составляла 10 KU (0,04 г сухого веса клеток/л). В течение первых 8 ч ферментации мутность клеток возрастала с 540 до 700 KU для штаммов Т6 и Т2 соответственно. В течение 24 ч мутность снижалась.
Культуральную жидкость охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали (при 8000 g, 10 мин, 20оС) для отделения клеток. Бесклеточный надосадок содержал 1,0-1,4 и 2,0-2,4 ед. активности ксиланазы на 1 мл для штаммов Т2 и Т6 соответственно и примерно 0,02 мг белка в 1 мл для обоих штаммов. Белок концентрировали, добавляя к надосадку кристаллический сульфат аммония до 80% от насыщения при 4оС с последующим центрифугированием (15 мин при 9000 g) после 12 ч при 4оС. Осадок растворяли в общем объеме 100 мл 10 мМ фосфатного буфера с рН 7,0 и диализовали трижды против 5 л того же буфера при 4оС. Диализованный раствор (120 мл) содержал 7 мг/мл белка и 15-20 и 35-40 ед. ксиланазы для штаммов Т2 и Т6 соответственно (табл. 3 и 4).
Следует отметить, что активность ксиланазы штаммов Т2 и Т6 не снижалась к концу ферментации.
Были проведены испытания активности ксиланазы, выделенной из указанных штаммов Т2 и Т6.
Бесклеточные надосадки при росте штаммов Т2 и Т6 на среде ХМР содержат по крайней мере одну ксиланазу, поскольку было установлено наличие в них ксиланазной активности. Указанные надосадки (также называемые как неочищенные ферментные препараты) и частично очищенные фракции применялись для обработки неотбеленных и кислородных полуотбеленных сульфатных пульп из мягкой древесины.
Неотбеленные и кислородные полуотбеленные образцы пульпы.
Образцами пульпы являлись образцы сульфатных пульп из мягкой древесины, отобранные с фабрики в Korsnas.
Неотбеленные образцы пульпы представляли собой образец, взятый после щелочного гидролиза в гидролизаторе Kamyr, которые были подвергнуты скринингу и отмывке в лабораторных условиях, и указанный образец сушили в течение ночи при 50оС. Полусухой образец использовали в опытах и его обозначали как К8. Этот материал сушили при 105оС до постоянного веса с содержанием воды 6,35%
Образец кислородной полуотбеленной пульпы представлял собой образец, который был обработан на волоконной линии-3 в Korsnas, и он был отобран после второй обработки кислородом, скринирован и отмыт в лабораторных условиях. Общее описание обработки растительных масс в Korsnas было опубликовано в документе 26, сентябрь 1989 г. с. 20 и Norbisk Cellulosa 1989, No.6, c. 8-11.
Кислородная полуотбеленная пульпа обозначена как K11.
Cодержание лигнина в пульпах К8 и К11.
Содержание лигнина в пульпах К8 и К11 определяли по методике "The Swedish Association of Pulp and Paper Engineers. Series CCAS". Содержание лигнина в К8 (неотбеленная) было 2,8% а в К11 (кислородная полуотбеленная) 2,0% Таким образом, образец кислородной полуотбеленной К11 содержал примерно 25% от уровня восстановленного лигнина по сравнению с его содержанием в К8.
Опыты, проведенные с неочищенными ферментными препаратами из Bacillus stearothermophilus, штаммы Т2 и Т6, по делигнификации пульп К8 и К11.
Для оценки степени экстрагируемости лигнина с помощью ферментных препаратов изобретения был применен чувствительный метод спектрофотометрии. Величины поглощения при 350 нм (А350) рассчитывали в образцах надосадков, и вычисленные значения представляли в виде высвобождаемого лигнина.
Эксперименты и результаты суммированы в табл. 5-9.
На основании данных табл. 5-9 можно заключить, что неочищенные ферментные препараты из штаммов Т2 и Т6 Bacillus stearothermophilus способны осуществлять делигнификацию как неотбеленных, так и полуотбеленных образцов пульп при значениях рН по крайней мере 9 и при температурах по крайней мере 65оС. Более того, можно заключить, что высвобождаемого лигнина зависит от времени и концентрации.
Получение высокоочищенной фракции при росте штамма Т6.
Высокоочищенная фракция (в форме ксиланазы) из осветленного культурального бульона при росте штамма Т6 получена при использовании катионообменника в одну стадию концентрирования и очистки. Таким образом, ксиланаза из Т6 была очищена и сконцентрирована непосредственно из бесклеточного надосадка путем адсорбции на катионообменнике СМ-52 (Ватман). Однако на среде ХМР выход составил лишь 21% вероятно из-за высокой ионной силы среды. Когда среду диализовали против буфера с низкой ионной силой или когда MOPS удаляли из среды, выход составлял примерно 50% Для определения минимального количества СМ-52, необходимого для эффективной адсорбции из осветленной культуральной среды, были испытаны разные количества СМ-52 для очистки ксиланазы из Т-6.
Результаты даны в табл. 10.
Как видно из табл. 10, при 5% адсорбента выход составляет 50% Другим коммерчески доступным катионнообменником является SE-52 (Ватман) (отрицательно заряженные группы соединены с целлюлозой через сульфоксиэтильные группы). Известно, что SE-52 обладает более высокой адсорбцией, чем СМ-52. Поскольку стадия очистки является также и стадией концентрирования, ее преимуществом является минимальное использование адсорбента. Поэтому попробовали использовать SE-52 для адсорбции ксиланазы. Результаты даны в табл. 11.
Как видно из табл. 11, только 2% SE-52 требуются для достижения 48% выхода ксиланазы Т6.
Характеристика ксиланазы из Т-6.
Молекулярный вес ксиланазы из Т-6 определяли методами ПААГ на ДДС-натрия и гель-фильтрацией, и были получены величины между 41000 и 42000 Да. Тот факт, что оба метода дали одинаковые значения молекулярного веса ксиланазы, указывает на то, что фермент состоит из одной полипептидной цепи (известно, что при ПААГ в ДДС-натрия происходит разделение белковых субъединиц). Величина pI (pH, когда суммарный заряд белка равен нулю) для фермента равна 9,0, что определили методом высоковольтного изоэлектрофокусирования. Относительно высокое значение pI для фермента объясняет положительный заряд фермента при нейтральном значении рН. Оптимум рН для фермента определен около 7,0; при рН 9,0, его активность составляет около 50% от таковой при рН 7,0. Температурная зависимость ксиланазы из Т-6 дана в табл. 12.
Термоcтабильноcть кcиланазы из Т6 при температуре 65оС и рH 9 предcтавлена в табл. 13.
В дополнение можно отметить, что при 65оС и рН 7 не происходило потери активности фермента в течение более чем 10 ч.
Фрагмент последовательности и аминокислотный состав ксиланазы из Т-6.
Исходя из достаточно протяженной N-концевой последовательности аминокислот белка, можно осуществить полную идентификацию белка. Последовательность одного фрагмента ксиланазы Т-6 определяли дважды в Институте Weizman, Израиль, на Прикладной Биосистеме газофазового микросеквенатора ABI 475A. Первый образец белка подвергали электроблоттингу на мембране PVDF (Millipore), где получили информацию только о 20 аминокислотах. Второй образец белка сначала был очищен на колонке с Superose 12 FPLC (Pharmacia), и этого оказалось достаточным, чтобы получить последовательность 41 аминокислоты. Полученная последовательность оказалась следующей: -Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-Ile-Ser-Ala-Leu-Ans-Ala-Pro-Gln Leu-Asn-Gln-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-Ile-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro- Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-.
Для дальнейшей характеристики фермента был выполнен анализ аминокислот на очищенной ксиланазе Т-6. Результаты этого анализа представлены в табл. 14.
Опыты, выполненные с ферментом на пульпе К14.
Образец пульпы К14 представлял собой кислородную полуотбеленную пульпу мягкой древесины с фабрики Korsnas. Этот фермент представлял собой очищенную термофильную ксиланазу Т6.
Были исследованы различные параметры, влияющие на степень делигнификации пульпы К14.
Влияние концентрации волокна суммировано в табл. 15.
Как видно из табл. 15, при снижении концентрации волокна с 4,7 до 2,5 и до 1,0% сухого веса волокна происходило усиление процесса. Поскольку обработка ферментом проводилась без перемешивания, вероятно, что контакт между ферментом и нерастворимым субстратом был слабым. Из-за практических соображений предпочли проводить опыты при концентрации волокна 2,5%
Влияние рН приведено в табл. 16.
Как видно из табл. 16, фермент наиболее активен при рН 8,5-9,0 как в калия фосфате, так и в натрия сульфате. В более ранних опытах наблюдали более низкие активности при рН ниже 8,0 и рН свыше 9,5.
Влияние концентрации Na2SO4 представлено в табл. 17.
Обработка была эффективной как без Na2SO4, так и до 0,2 М с оптимумом активности при 0,15 М Na2SO4.
Влияние концентрации ксиланазы суммировано в табл. 18.
Как видно из табл. 18, существует зависимость высвобождения лигнина от концентрации фермента вплоть до примерно 15 Ед/мл как в 0,1 М Na2SO4, так и в калий-фосфатном буфере. Лишь незначительное увеличение высвобождения лигнина наблюдалось при более высоких концентрациях фермента или при более длительной (4 ч) инкубации.
Приготовление 10 г и 50 г образцов обработанной К14 для дальнейших испытаний.
10 г образцов пульпы К14 обрабатывали 15 Ед/мл и 45 Ед/мл ксиланазы в течение 2 и 4 ч вместе с соответствующими контролями. Все образцы обрабатывали в дубликатах. Все инкубации проводили при рН 9,0 и 65оС. Данные спектрофотометрического анализа по высвобождению лигнина даны в табл. 19 (в фосфатном буфере) и табл. 20 (в 0,1 М Na2SO4). Чистый выход образующегося лигнина варьировал от 10,3 до 14,9% при концентрации фермента 45 ЕД/мл и при 4 ч инкубации, что лишь незначительно выше, чем при 15 Ед/мл за 2 ч.
Недавно 50 г образцов пульпы были обработаны в дубликате для дополнительных анализов. Чистый выход лигнина с 15 Ед/мл фермента составил 10,8% за 2 ч и 12,6% за 4 ч.
Анализ 10 г образцов, обработанных ксиланазой.
Результаты анализов суммированы в табл. 21-25. Параметры, данные в таблицах, согласуются с сериями SCAN Test за исключением величин нулевой зажимной длины, которые рассчитывали согласно инструкциям производителей (Pulmac Instruments Ltd, Canada). В табл. 21 представлены данные, полученные с применением пульпы, которая была обработана в течение 2 ч при 65оС и рН 9,0 в 0,1 М Na2SO4 без фермента (контроль) и с 15 ЕД/мл фермента. Как видно, наблюдается высокая степень воспроизводимости в дубликатных образцах, приготовленных с интервалом в две недели. Наиболее значительный эффект наблюдался в отношении содержания пентозана, уровень которого снижался на 17,4% Отмечено также небольшое, но достоверное снижение числа Каппа и показателей растяжения, увеличение яркости, вязкости и величин нулевых зажимных длин.
Значения отмеченных свойств для пульпы или отливок, сделанных из пульпы, не отличались существенно при 15 ЕД/мл и 45 ЕД/мл фермента, при 2 ч и 4 ч обработки и при использовании 0,01 М калий-фосфата и 0,1 М Na2SO4 (табл. 22 и 23).
Для анализа достоверности этих данных величины, характеризующие свойства пульпы и бумаги, представлены в табл. 24 и 25 и выражены в виде процента изменения по сравнению с соответствующими контролями.
Сделаны следующие выводы:
1. Пентозаны частично удаляются (10,4-22,2%); при более высоких концентрациях фермента больше удаляется пентозанов.
2. Имеет место небольшое, но достоверное увеличение вязкости; это можно объяснить удалением пентозанов (примерно 1% от сухого веса К14). Не получено данных о деградации целлюлозы, причем даже при наивысших концентрациях фермента за 4 ч при 65оС, рН 9.
3. Число Каппа снижалось при всех восьми исследованных условиях (интервал: 5,5-9,1%). Поскольку не происходило дальнейшего снижения величин при более высоких концентрациях фермента (это не относится к пентозану), при этом по-видимому удалялся пентозан, не связанный с лигнином.
4. При всех 8 испытанных условиях в самодельных листах наблюдали незначительное увеличение яркости и величин нулевых зажимных длин, а также снижения показателей растяжения.
Теcт на обеcцвечивание.
Пульпу К14 с числом Каппа 18.5 использовали для изучения влияния фермента на обесцвечивание. Пульпу К14 обрабатывали ферментом в концентрации 15 ед./мл ксиланазы, полученной из штамма Т6. После ферментной обработки пульпу обесцвечивали согласно методике, принятой на фабрике Korsnas: двуокись хлора (DO) щелочная экстракция, усиленная кислородом (ЕО) двуокись хлора (DI) двуокись хлора (D2).
Обработка ферментом снижала содержание лигнина в пульпе до числа Каппа 15,9. Пульпа, обработанная таким образом, как и ферментом, то есть при 65оС и рН 9 в 100 мМ Na2SO4-буфере, но без добавки фермента, делигнифицировалась до числа Каппа 17,2. Чистый эффект ферментной обработки заключался в делигнификации по числу Каппа с 17,2 до 15,9, то есть делигнификация составила 8%
Пульпа, обработанная ферментами в системе сульфатного буфера, израсходовано 47 кг двуокиси хлора (активный хлор) на 1 т пульпы, когда обесцвечивание достигало 83% от ISO яркости при применении схемы обесцвечивания DO (EO) D1D2. Соответствующий расход для пульпы, обработанной только буферным раствором, составил 59 кг двуокиси хлора (Cl) на 1 т пульпы, то есть при обработке ферментом расход двуокиси хлора был на 20% меньше.

Claims (7)

1. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 - продуцент ксиланазы.
2. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222 - продуцент ксиланазы.
3. Способ получения ксиланазы путем культивирования бактерий - продуцентов ксиланазы на питательной среде, содержащей источники питания, необходимые для биосинтеза в аэробных условиях, с последующим отделением из полученной культуральной жидкости клеточной массы и выделением из оставшегося осветленного культурального бульона целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве бактерий - продуцентов ксиланазы используют штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 или штамм бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40222.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что отделение из культуральной жидкости клеточной массы проводят центрифугированием.
5. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что выделение целевого продукта проводят путем осаждения сульфатом аммония осветленного культурального бульона с последующим ресуспендированием в жидкой среде.
6. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что выделение целевого продукта проводят путем пропускания через катионообменник осветленного культурального бульона с одновременной очисткой и концентрированием.
7. Ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221 или B. stearothermophilus NCIMB 40222, обладающая активностью делигнификации, имеющая: - мол. м. - между 41000 и 42000 Да (при определении методами ПААГ на ДДС - натрия и гельфильтрацией); - изоэлектрическую точку - 9,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования); - pH оптимум - около 7,0, при pH 9,0 - активность около 50% от таковой при pH 7,0; - термостабильность: активность падает после 65oС и pH 9,0 в течение 15 мин, при 65oС и pH 7,0 - активен в течение более 10 ч; - частичная N-концевая аминокислотная последовательность; - Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala - Lys-Lys-Pro-His-Ile - Ser-Ala - Leu-Asn-Ala-Pro-Gln - Leu-Asn-Gln- Arg-Tyr-Lys-Asn- - Glu-Phe-Thr-Ile-Gly- Ala-Ala-Val-Glu-Pro- Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-.
SU905053263A 1990-01-10 1990-12-28 Штаммы бактерий bacillus stearothermophilus - продуценты ксиланазы, способ получения ксиланазы и ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий bacillus stearothermophilus, обладающая активностью делигнификации RU2054480C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9000070A SE465320B (sv) 1990-01-10 1990-01-10 Preparat som uppvisar enzymatisk delignifieringsaktivitet, saett att framstaella detsamma och tillaempningar daerav
SE9000070-4 1990-01-10
PCT/SE1990/000885 WO1991010724A1 (en) 1990-01-10 1990-12-28 Preparation exhibiting enzymatic delignification activity, a method of producing the same, and applications thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2054480C1 true RU2054480C1 (ru) 1996-02-20

Family

ID=20378196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU905053263A RU2054480C1 (ru) 1990-01-10 1990-12-28 Штаммы бактерий bacillus stearothermophilus - продуценты ксиланазы, способ получения ксиланазы и ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий bacillus stearothermophilus, обладающая активностью делигнификации

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5434071A (ru)
EP (1) EP0585217B1 (ru)
JP (1) JPH05505722A (ru)
KR (1) KR920703793A (ru)
AT (1) ATE150787T1 (ru)
AU (1) AU631485B2 (ru)
BR (1) BR9007975A (ru)
CA (1) CA2073436A1 (ru)
DE (1) DE69030326D1 (ru)
FI (1) FI923016A0 (ru)
IE (1) IE62344B1 (ru)
IL (1) IL96922A0 (ru)
LT (1) LT3970B (ru)
LV (1) LV10489B (ru)
NO (1) NO922727L (ru)
NZ (1) NZ236708A (ru)
PL (1) PL166837B1 (ru)
PT (1) PT96461B (ru)
RU (1) RU2054480C1 (ru)
SE (1) SE465320B (ru)
WO (1) WO1991010724A1 (ru)
ZA (1) ZA91179B (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677161A (en) * 1990-01-10 1997-10-14 Korsnas Aktiebolag Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)
GB9018426D0 (en) * 1990-08-22 1990-10-03 Sandoz Ltd Improvements in or relating to novel compounds
WO1993020192A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Korsnäs Aktiebolag DELIGNIFYING PREPARATION EXHIBITING α-L-ARABINOFURANOSIDASE ACTIVITY, PRODUCTION AND APPLICATION THEREOF
DK105592D0 (da) * 1992-08-26 1992-08-26 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2807612B2 (ja) * 1993-03-12 1998-10-08 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
JPH0787957A (ja) * 1993-07-28 1995-04-04 Nippon Paper Ind Co Ltd 微生物ｓｋｂ−１１５２株及びそれを利用したパルプの漂白方法
CA2156048C (en) * 1993-12-24 2010-11-16 Pieter Van Solingen Alkali-tolerant xylanases
US6506592B1 (en) * 1998-08-18 2003-01-14 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Hyperthermophilic alpha-glucosidase gene and its use
KR20040033143A (ko) * 2002-10-11 2004-04-21 한남수 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈, 및 이를이용한 아라비노스 생산방법
US7960148B2 (en) 2003-07-02 2011-06-14 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2891101A1 (en) 2003-08-11 2005-03-10 Basf Enzymes Llc Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2006031554A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Novozymes North America, Inc. Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm
USRE45660E1 (en) 2006-02-14 2015-09-01 Bp Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2069389T3 (en) 2006-08-04 2015-01-12 Bp Corp North America Inc Glucanases, nucleic acids encoding them, and processes for their preparation and use
BRPI0817811A2 (pt) 2007-10-03 2014-10-14 Verenium Corp Xilanases, ácidos nucleicos que codificam as mesmas e métodos para fabricação e uso das mesmas.
JP6384720B2 (ja) 2014-07-30 2018-09-05 株式会社デンソー 回転角度検出装置

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2557894B1 (fr) * 1984-01-10 1986-12-12 Centre Tech Ind Papier Procede de traitement de pates papetieres par une solution enzymatique favorisant la fibrillation et pates ainsi traitees.
US4692413A (en) * 1985-07-15 1987-09-08 Repligen Corporation Use of rLDM™ 1-6 and other ligninolytic enzymes for the decolorization of E1 effluent
FR2604198B1 (fr) * 1986-09-22 1989-07-07 Du Pin Cellulose Procede de traitement d'une pate papetiere par une solution enzymatique.
FI81395B (fi) * 1988-03-14 1990-06-29 Cultor Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
US5179021A (en) * 1989-02-10 1993-01-12 Gil Inc. (Now Ici Canada Inc.) Pulp bleaching process comprising oxygen delignification and xylanase enzyme treatment
FI90888B (fi) * 1989-02-14 1993-12-31 Enso Gutzeit Oy Menetelmä selluloosamassan valkaisemiseksi
FI86896B (fi) * 1989-05-04 1992-07-15 Enso Gutzeit Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
ZA904441B (en) * 1989-06-22 1991-03-27 Int Paper Co Enzymatic delignification of lignocellulosic material
ATE134231T1 (de) * 1989-08-14 1996-02-15 Genencor Int Europ Verbesserung beim bleichen von pulpe
WO1991002791A1 (en) * 1989-08-14 1991-03-07 Cultor Oy Enzymatic bleaching of pulp
DK420289D0 (da) * 1989-08-25 1989-08-25 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af lignocellulosepulp
NZ235679A (en) * 1989-10-18 1993-01-27 Int Paper Co Bleaching lignocellulosic pulp using (a) treatment with xylanase and (b) one or more chemical bleaching stages
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Опубликованная заявка Японии N 1309684, кл. C 12N 9/24, опублик. 14.12.89. *

Also Published As

Publication number Publication date
LV10489B (en) 1996-04-20
IE62344B1 (en) 1995-01-25
IL96922A0 (en) 1992-03-29
KR920703793A (ko) 1992-12-18
SE9000070L (sv) 1991-07-11
FI923016A (fi) 1992-06-29
SE465320B (sv) 1991-08-26
PT96461B (pt) 1998-06-30
AU7166391A (en) 1991-08-05
NZ236708A (en) 1992-10-28
DE69030326D1 (de) 1997-04-30
ZA91179B (en) 1991-10-30
NO922727D0 (no) 1992-07-10
NO922727L (no) 1992-07-10
LT3970B (en) 1996-05-27
EP0585217A1 (en) 1994-03-09
CA2073436A1 (en) 1991-07-11
BR9007975A (pt) 1992-11-10
ATE150787T1 (de) 1997-04-15
JPH05505722A (ja) 1993-08-26
AU631485B2 (en) 1992-11-26
LTIP1245A (en) 1995-04-25
LV10489A (lv) 1995-02-20
WO1991010724A1 (en) 1991-07-25
SE9000070D0 (sv) 1990-01-10
IE910066A1 (en) 1991-07-17
PL166837B1 (pl) 1995-06-30
FI923016A0 (fi) 1992-06-29
EP0585217B1 (en) 1997-03-26
US5434071A (en) 1995-07-18
PT96461A (pt) 1991-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2054480C1 (ru) Штаммы бактерий bacillus stearothermophilus - продуценты ксиланазы, способ получения ксиланазы и ксиланаза, выделенная из штаммов бактерий bacillus stearothermophilus, обладающая активностью делигнификации
AU649703B2 (en) A method for enzymatically treating pulp with an enzyme system from thermomonospora fusca
JP2807612B2 (ja) 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
AU624279B2 (en) Method for bleaching with reduced organic chlorides
EP0825254A2 (en) Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and xylanase obtainable therefrom
JPH08507221A (ja) アルカリ耐性キシラナーゼ
CA2048322A1 (en) Xylanase for biobleaching
US6200797B1 (en) Bacterial protein with xylanase activity
JPH0787970A (ja) キシラナーゼの製造方法
WO1991018978A1 (en) β-XYLANASE PREPARATION, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF AND ITS USE IN PULP BLEACHING
US5677161A (en) Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
JP3022962B2 (ja) 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
AU695276B2 (en) Bacterial protein with xylanase activity
JP3070290B2 (ja) 耐熱性アルカリキシラナーゼを生産する微生物及びその利用法
Vignesh et al. ISOLATION, SCREENING, CHARACTERISATION AND PARTIAL PURIFICATION OF XYLANASE ENZYME FROM TWO DIFFERENT SOIL SAMPLES