LT3970B - Preparation exibiting enzymatic delignification activity, a method for producting the same and application thereof - Google Patents

Preparation exibiting enzymatic delignification activity, a method for producting the same and application thereof Download PDF

Info

Publication number
LT3970B
LT3970B LTIP1245A LTIP1245A LT3970B LT 3970 B LT3970 B LT 3970B LT IP1245 A LTIP1245 A LT IP1245A LT IP1245 A LTIP1245 A LT IP1245A LT 3970 B LT3970 B LT 3970B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
ncimb
preparation
xylanase
wood pulp
strains
Prior art date
Application number
LTIP1245A
Other languages
English (en)
Inventor
Eugene Rosenberg
Yuval Shoham
Original Assignee
Korsnaes Ab
Univ Ramot
Technion Res & Dev Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korsnaes Ab, Univ Ramot, Technion Res & Dev Foundation filed Critical Korsnaes Ab
Publication of LTIP1245A publication Critical patent/LTIP1245A/xx
Publication of LT3970B publication Critical patent/LT3970B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Earth Drilling (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Heat Treatment Of Sheet Steel (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Chemical And Physical Treatments For Wood And The Like (AREA)

Description

Išradimas skirtas preparatui, pasižyminčiam fermentiniu aktyvumu, sugebančiam delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Dar šis išradimas skirtas minėto preparato gamybos būdui, aerobiškai fermentuojant pasirinktą Bacillus stearothermophilus kamieną. Be to, šis išradimas skirtas dviems išskirtiems Bacillus stearothermophilus kamienams ir jų mutantams bei variantams. Išradimas taip pat skirtas išradimo preparato panaudojimams, būtent, procesui, apimančiam medienos masės apdorojimą preparatu pagal šį išradimą, medienos bei susmulkintos celiuliozės, apdorotai preparatu pagal šj išradimą, taip pat popieriui, lentoms ir dulkėms, pagamintoms iš medienos masės, apdorotos preparatu pagal šj išradimą.
Medienos ir popieriaus pramonėje yra dedamos didelės pastangos, kad būtų sumažintas chemikalų panaudojimas delignifikacijos ir balinimo procesuose, kadangi tokie chemikalai, ir ypač chloro junginiai, ištekėję iš balinimo įrenginių, padidina aplinkos užteršimą.
Vienas kelias sumažinti chemikalų panaudojimą masės sudaryme ir balinime yra susijęs su ligniną suskaldančių mikroorganizmų panaudojimu. Taip pat buvo pasiūlyti ligniną skaldantys ir ligniną modifikuojantys fermentai. Lignino suskaldymo išsami apžvalga buvo publikuota „Critical Revievvs in Biotechnology, vol. 6, Issue 1, 1987, pp. 160, Ed. Stevvart, G.G.“ ir „Russell, I., CRC Press, Ine. Boca Raton, Florida“.
Kitas kelias buvo susijęs su lignino išskyrimu, panaudojant hemiceliuliazes hemiceliuliozės jungčių nutraukimui. Apžvalginis straipsnis apie hemiceliuliazes - „Their Occurence, Purification, Properties and Mode of Activity by Dekker, R.F.H. and Richars, G.N.“ buvo publikuotas žurnale Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, vol. 32, 1976, pp. 277-352.
Tarp hemiceliuliazių panaudojimo biominkštinimui ir biobalinimui didžiausio dėmesio susilaukė ksilanazės. FR 2 557 894-A1 atskleidžia popieriaus masės apdorojimą fermentiniu tirpalu, kuris nepasižymi jokiu celiuliaziniu aktyvumu ir kuriame yra ksilanazės. Šis apdorojimas atliekamas 20-60°C, ypač 40°C temperatūroje, ir 6 pavyzdys parodo, kad pH turėtų būti 5. Tačiau popieriaus ir medienos pramonėje būtų geriau apdoroti medienos masę aukštesnėje temperatūroje ir esant didesniam pH dėl ekonominių priežasčių ir patogumo, kadangi kai kurie įprasti balinimo procesai atliekami temperatūroje, viršijančioje 65°C, esant pH didesniam už 9.
Kiek mums žinoma, niekas nepaskelbė apie medienos masės apdorojimą preparatu, pasižyminčiu fermentiniu aktyvumu ir sugebėjimu delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Šis išradimas pateikia preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu ir sugebantį delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
Šiame aprašyme ir pridėtoje apibrėžtyje posakis „medienos masė“ turi būti interpretuojamas plačiai, ir tuo būdu juo norima apimti visas lignoceliuliozinių medžiagų rūšis.
Vienas šio išradimo aspektų yra skirtas preparatui, pasižyminčiam fermentiniu aktyvumu, kuris gaunamas aerobinės fermentacijos būdu tinkamoje terpėje iš Bacillus stearothermophiius kamieno, parinkto iš deponuotų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 kamienų ir jų mutantų bei variantų, sugebančių praktiškai taip pat gaminti minėtą preparatą kaip ir minėti NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 kamienai, ir kuris sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
Viename iš šio išradimo aspekto įgyvendinimų preparatas yra gaunamas aerobine fermentacija tinkamoje terpėje, kurioje yra gliukozės kaip anglies šaltinio, iš Bacillus stearothermophiius kamieno NCIMB 40222 mutantinio kamieno. Kitame šio išradimo įgyvendinime šio išradimo preparatas susideda iš fermento, sudaryto iš aminorūgščių sekos
-Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-lle-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-Asnarba jos homologo, visam fermentui pasižymint fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje. Šia prasme minėtos aminorūgščių sekos homologas yra homologinė seka, turinti keletą aminorūgščių pakaitalų, pratęsimų ar išbraukimų, dėl kurių viso fermento aktyvumas medienos terpėje neišnyksta. Be to, minėtos aminorūgščių sekos homologas yra bet kuri seka, kuri yra pakankamai homologišką nukleotidų lygyje, kad būtų atpažinta bet kokia DNR ar RNR praba, gauta iš minėtos sekos. Dar viename šio išradimo aspekto įgyvendinime preparatas yra nuskaidrintas kultūros buljonas. Dar kitame šio išradimo aspekto įgyvendinime preparatas yra dalinai išgryninta kultūros buljono frakcija, pasižyminti fermentiniu aktyvumu medienos terpėje. Dalinai išgryninta frakcija gaunama amonio sulfato nusodinimu. Tolesniame šio išradimo aspekto įgyvendinime preparatas yra labai gryna nuskaidrinto kultūros buljono frakcija, kuri gaunama, panaudojant katijonitą, kur minėta frakcija yra ksilanazės pasižyminčios fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje, pavidalo. Viename konkrečiame įgyvendinime ksilanazė turi apytikslę molekulinę masę tarp 41000 ir 42000 Daltonų, nustatytą SDS PAGE ir gelio filtracijos būdu, ir tokią apytikslę sudėtį, nustatytą kaip aminorūgščių liekanos/ molekulei aminorūgščių analizės būdu: Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; lle 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.
Kitas šio išradimo aspektas yra skirtas preparato, pasižyminčio fermentiniu aktyvumu, gamybos būdui, kur Bacillus stearothermophilus kamienas, parinktas iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 ir jų mutantų bei variantų, iš esmės sugebančių gaminti minėtą preparatą, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, yra nukreipiamas aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, minėtam preparatui sugebant delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Atskirame šio išradimo įgyvendinime mutantinis Bacillus stearothermophiius NCIMB 40222 kamienas yra nukreipiamas aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, kurioje yra gliukozės kaip anglies šaltinio. Kitame šio išradimo aspekto įgyvendinime fermentacijos buljonas yra nuskaidrinamas paprastai centrifugavimo būdu. Dar viename įgyvendinime nuskaidrintas fermentacijos buljonas yra nukreipiamas amonio sulfato nusodinimui ir paprastai resuspensijai skystoje terpėje, kad būtų gauta dalinai išgryninta minėto nuskaidrinto kultūros buljono frakcija, pasižyminti fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9. Tolesniame būdo pagal šį išradimą įgyvendinime nuskaidrintas fermentacijos buljonas yra gryninamas ir koncentruojamas, panaudojant katijonitą, kad būtų gauta labai gryna ksilanazės pavidalo frakcija, pasižyminti fermentiniu aktyvumu medienos masės terpėje mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
Dar vienas šio išradimo aspektas yra skirtas išskirtiems Bacillus stearothermophiius kamienams NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 ir jų mutantams bei variantams, minėtiems mutantams bei variantams sugebant praktiškai taip pat gaminti preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, minėtam preparatui pasižymint sugebėjimu delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
Dar vienas išradimo aspektas yra skirtas procesui, apimančiam medienos masės apdorojimą, kur medienos masė yra apdorojama preparatu pagal šį išradimą bent vienoje stadijoje. Viename iš šio išradimo aspekto įgyvendinimų medienos masė, kuri turi būti apdorojama, yra sulfato masė. Kitame įgyvendinime sulfato masė, kuri turi būti apdorojama, yra dalinai delignifikuota sulfato masė. Dar viename šio išradimo aspekto įgyvendinime dalinai delignifikuota sulfato masė, kuri turi būti apdorojama, yra deguoniu delignifikuota sulfato masė. Procesas, apimantis medienos masės apdorojimą, yra tinkamai atliekamas mažiausiai 65°C temperatūroje, kai pH yra mažiausiai 9.
Papildomas šio išradimo aspektas yra skirtas produktams, gautiems iš medienos masės, kuri bent vienoje stadijoje buvo apdorota preparatu pagal šį išradimą. Tuo būdu, šis išradimo aspektas apima medienos masę ir susmulkintą celiuliozę, kurios bent vienoje stadijoje buvo apdorotos preparatu pagal šį išradimą, ir popierių, lentas bei dulkes, kurie buvo pagaminti iš medienos masės, bent vienoje stadijoje apdorotos preparatu pagal šį išradimą.
Tolesnis šio išradimo aspektas yra skirtas DNR arba RNR prabai, kuri atpažįsta nukleotidų seką, koduojančią aminorūgšeių seką -Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-lle-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-AsnBe to, vienas išradimo aspektas yra skirtas antikūnui, kuris prisijungia prie aminorūgšeių sekos
-Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-lle-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-Asn-.
Pastarieji du išradimo aspektai yra naudingi fermentų, sugebančių delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje ir esant pH mažiausiai 9, suradimui.
Termostabilių fermentų, gaminančių organizmus, išskyrimas
Organizmų šaltinis buvo vandens ir purvo pavyzdžiai, paimti iš vandens valymo baseinų Korsnas medienos ir popieriaus fabrike (Gavle, Švedija). Praturtinimo terpėje (XM) buvo 0.01% mielių ekstrakto, 0.04% triptono ir 0,2% ksilano, esant pH 7.0. Toje pačioje terpėje, esant pH 8.1 ir 9.6, buvo papildomai Na2CO3. Vandens ir purvo pavyzdžiai buvo įdėti į XM terpę ir aerobiškai kultivuoti 65°C temperatūroje. Kultūrų pavyzdžiai buvo perkeliami į šviežią terpę kas 2-3 dienos. Po 4 perkėlimų, kultūrų pavyzdžiai buvo praskiesti ir paskirstyti ant XM agaro lėkštelių (XM turi 2% agaro).
Po trijų nepriklausomų praturtinimo procedūrų, buvo išskirta 30 kamienų, kurie galėjo augti ant MX agaro lėkštelių 65°C temperatūroje. Nė vienas kamienas nebuvo išskirtas iš XM terpės, esant pH 9.6. 10 iš 30 išskirtų kamienų aplink koloniją gamino ryškias zonas, leidžiančias manyti, kad jie gamina neląstelinę ksilanazę. Du iš šios dešimties išskirtų kamienų (kamienai T2 ir T6) buvo atrinkti deponavimui.
Mikroorganizmų deponavimas
Du kamienai, pavadinti Bacillus sp T-2 \x Bacillus sp. T-čbuvo deponuoti pagal Budapešto sutartį National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd (NCIMB), Aberdeen, 1989 m. lapkričio 3 d. kamienams T-2 ir T-6 buvo priskirti registracijos numeriai, atitinkamai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222.
Kamienų T-2 ir T-6 identifikacija
Kamienai T2 ir T6 yra aerobinės, gramteigiamos, sporas sudarančios lazdelės, galinčios augti 65°C temperatūroje. Šie kamienai NCIMB laikomi skirtingais Bacillus stearothermophiius kamienais, remiantis tokiais bandymo rezultatais:
Bacillus- antros stadijos tyrimai
Izoliato Nr. T2 (NCIMB 40221) T6 (NCIMB 40222)
Tyrimo temp. °C 60°C 60°C
Sporos forma a E E
Sporinė ryškiai išsiplėtusi - -
Sporos padėties dominantė b T T
Anaerobinis augimas c - -
Augimas 5% NaCl - -
Augimas 7% NaCl - -
Augimas 10% NaCl - -
Augimas pH 5.7 buljone - -
Rūgštis iš gliukozėsd + -
Dujos iš gliukozėsd - -
VP(acetoinas) - -
Kiaušinio trynio agaro nepermatomumas Neauga Neauga
Kazeino suskaldymas + +
Izoliato Nr. T2 (NCIMB 40221) T6 (NCIMB 40222)
Želatinos suskaldymas + (+)
Eskulinas + -
Krakmolo hidrozė +R +R
NO3' iki NO2' - -
Liekamasis N - -
Citratas, Koser’io - -
Dekstrozės azidas - -
pH VP buljone 5.5 6.3
Lakmuso pienas koaguliacija
rūgštinimas - -
Katalazė + +
Oksidazė + +
Augimo temperatūros °C 25°C
37°C - -
65°C + +
70°C - -
a E, elipsinė arba cilindrinė; S, sferinė arba beveik sferinė;
b C, centrinė; T-terminalinė arba subterminalinė; CT, nuo centrinės iki terminalinės; c Gliukozės agare;
d Peptono vandens cukrus, Andrade’so indikatorius, R- ribotas.
Kamienų T2 ir T6 riebiųjų rūgščių sudėtis
Termofiliniai ksilanazės teigiami izoliatai T2 ir T6 buvo nusiųsti į Microbial ID, INC. Newark, DE, JAV - riebiųjų rūgščių sudėties nustatymui. Buvo gauti tokie rezultatai:
Ksilanazės teigiamų termofilų riebiųjų rūgščių sudėtis (%)
Izoliatas: T2 T6
Riebioji rūgštis
9:0 0.73 0.64
12:0 0.46
14:0 ižo
14:0 0.85 1.92
15:0 ižo 44.41 46.2
15: anteizo 2.59 2.35
15:0 0.53
16: ižo 6.25 4.15
16:1 4.24 5.53
16:0 5.29 6.14
17:1 ižo H 2.41 2.6
17:0 ižo 26.07 22.58
17:0 anteizo 7.15 5.82
18:0 1.09
Kamienų T2 ir T6 augimo charakteristikos ir koncentruotų nevalytų supernatantų paruošimas iš sukultūrintų kamienų
Augimo terpė: ΧΜΡ terpė, kurioje yra g/l:
bevitamininės kazamino rūgštys, 4; mielių ekstraktas, 0.2; MgSO4, 0.01; (NH4)2SO4, 2; K2HPO4, 0.46; KH2PO4, 0.1; ksilozė, 5; MOPS (3-[Nmorfolino] propano sulforūgštis), 10.4; ir kitų elementų pėdsakai. Terpės pH buvo 7.0.
Ksilanazės aktyvumas:
Ksilanazės aktyvumas buvo nustatytas, inkubuojant šviežią ksilano tirpalą su neląsteliniu supernatantiniu skysčiu ir tiriant padidėjimą redukciniame cukruje ferocianido metodu (Spiro, R.G. 1966, Methods of Enzymology 8:
7-9). Bandymo buferis buvo 50 mM Tris. Cl, pH 7.0 ir 0.5% ksilano (avižos speltos, Sigma). Ksilanazės aktyvumo vienetai yra ųmol redukcinio cukraus, generuojamo per minutę 65°C temperatūroje.
Terpės ląstelių drumstumas:
Terpės ląstelės drumstumas pateiktas Klett vienetais. IKV=0.004 g sausos ląstelės masės (SLM)/litre. Jei kultūra pasiekia savo maksimalų tankį, ji yra linkusi lizuotis, ką parodė ryškus kultūros drumstumo sumažėjimas.
Kamienai T2 ir T6 buvo auginami ΧΜΡ terpėje 24 valandas New Brunsvvick Microferm 7.5 litrų fermentatoriuje. Auginimas buvo atliekamas 4 litrų darbo tūryje 60°C temperatūroje, esant maišymo greičiui 600 aps/min. ir vėdinimo greičiui 7 l/min. Putojimas buvo reguliuojamas automatiškai, pridedant silicio priemonės prieš putojimą (5%, Fluka), o darbinis tūris buvo išlaikomas, pridedant sterilaus vandens. Pradinis pasėlių drumstumas buvo 10 KV (0.04g SLM/I). Per pirmąsias 8 fermentacijos valandas ląstelių drumstumas kamienams T2 ir T6 išaugo atitinkamai iki 540 ir 700 KV. Po 24 valandų drumstumas išnyko.
Kultūros skystis buvo atšaldytas iki kambario temperatūros ir centrifuguotas (8000 g, 10 min., 20°C), kad būtų pašalintos ląstelės. Beląsteliniame supernatante buvo 1.0-1.4 ir 2.0-2.4 ksilanazės vienetų ml atitinkamai kamienams T2 ir T6 bei apie 0.02 mg baltymo abiems kamienams. Baltymas buvo sukoncentruotas, pridedant prie supernatanto kieto amonio sulfato iki 80% prisotinimo 4°C temperatūroje ir centrifuguojant (9000 g, 15 min.) mišinį 12 valandų 4°C temperatūroje. Nuosėdos buvo ištirpintos bendrame 100 ml 10mM fosfato buferio su pH 7.0 tūryje ir triskart dializuotos prieš 5 litrus to paties buferio 4°C temperatūroje.Dializuotame tirpale (120 ml) buvo maždaug 7 mg/ml baltymo ir 15-20 bei 35-40 ksilanazės vienetų atitinkamai kamienams T2 ir T6.
Kamieno T6 augimas
Laikas (vai.) KV Ksilanazė (V/ml)
0 10 nd
2 25 nd
4 140 nd
6 400 1.48
8 540 1.88
11 540 1.78
14 528 2.26
24.5 280 2.42
Kamieno T2 augimas
Laikas (vai.) KV Ksilanazė (V/ml)
0 10 nd
2 30 nd
4 160 0.75
6 430 0.58
8 700 0.98
11 600 1.05
24 250 1.23
Reikėtų pastebėti, kad kamienų T2 ir T6 ksilanazės aktyvumas fermentacijos pabaigoje nesumažėjo.
Fermentas, pasižymintis fermentiniu aktvumu pagal šj išradimą
Beląsteliniai supernatantai nuo T2 ir T6 kamienų augimo ΧΜΡ terpėje turi mažiausiai vieną ksilanazę, kadangi buvo parodyta, kad jie pasižymi ksilanazės aktyvumu. Minėti supernatantai (taip pat vadinami nevalytais fermentiniais preparatais) ir dalinai išgrynintos frakcijos buvo panaudotos, apdorojant nebalintą ir deguoniu pusiau išbalintą minkštos medienos sulfato masę.
Nebalintos ir deguoniu pusiau išbalintos masės pavyzdžiai
Masės pavyzdžiai buvo minkštos medienos sulfato masės pavyzdžiai, paimti iš Korsnas fabriko.
Nebalintos medienos pavyzdys buvo pavyzdys, paimtas po šarminio apdorojimo Kamyr autoklave, laboratoriškai persijotas ir perpalutas, ir šis pavyzdys buvo per naktį džiovinamas 50°C temperatūroje. Pusiau sausas pavyzdys buvo panaudotas eksperimentuose ir buvo pažymėtas K8. Ši medžiaga buvo džiovinama 105°C temperatūroje iki pastovaus svorio, atiduodanti 6.35% vandens turinio.
Deguoniu pusiau išbalintos masės pavyzdys buvo pavyzdys, apdorotas Korsnas pluošto 3 linijoje, ir buvo paimtas po antro apdorojimo deguonimi, laboratoriškai persijotas ir perplautas. Bendras medienos apdorojimas Korsnas fabrike aprašymas buvo atspausdintas 1989 m. spalio mėn., Paper 26, p. 20 ir Nordisk Cellulose 1989 No. 6, P.8-11. Deguoniu pusiau išbalinta masė buvo pažymėta K11.
Masių K8 ir K11 lignino kiekis
Masių K8 ir K11 lignino kiekis buvo nustatytas pagal „The Svvedish Association of the Pulp and Paper Engineers“, Series CCA5. K8 (nebalintos) lignino kiekis buvo 2.8% ir K11 (deguoniu pusiau išbalintos) lignino kiekis buvo 2.0%. Tokiu būdu deguoniu pusiau išbalintos masės K11 pavyzdys turėjo maždaug 25% mažesnį lignino kiekį negu K8.
Masių K8 ir K11 delignifikavimo eksperimentai, atlikti su nevalytais fermentų preparatais iš Bacillus stearothermophiius kamienų T2 ir T6
Norint nustatyti, kiek lignino padaryta ekstrahuojamu šio išradimo preparatu, buvo panaudotas jautrus spektrofotometrinis bandymas. Buvo matuoti pavyzdžių supernatantinių skysčių absorbcijos dydžiai, prie 350 nm (A35o), ir išmatuoti dydžiai pateikti kaip išskirto lignino %, Eksperimentai ir rezultatai susumuoti 1-5 lentelėse.
Pagal duomenis, pateiktus 1-5 lentelėse, gali būti padaryta išvada, kad nevalyti fermentų preparatai iš Bacillus stearothermophiius kamienų T2 ir T6 sugeba delignifikuoti ir išbalintą, ir pusiau išbalintą medienos masę, esant pH dydžiams mažiausiai 9, ir mažiausiai 65°C temperatūroje. Dar daugiau, gali būti padaryta išvada, kad išskirto lignino % priklauso tiek nuo laiko, tiek nuo koncentracijos.
lentelė
Lignino išskyrimo iš medienos masės K11 kaip nevalytų fermentinių preparatų iš B.stearothermophilus kamienų T2 ir T6a funkcija
Fermentas, Išskirto lignino kiekis, %b (m9/m|) Bendras Grynas
0 8
T2 (0.6) 14
T2 (0.8) 17
T2 (1.2) 20
Fermentas, (mg/ml) Išskirto lignino kiekis, %b
Bendras Grynas
T2 (1.9) 22 14
T6 (0.25) 16 . 8
T6 (0.5) 18 10
T6 (1.1) 19 11
a Fermentiniai preparatai buvo amonio sulfato nuosėdos, ištirpintos 10 mM Fosfato buferyje, pH 9.0 iki galutinės baltymo koncentracijos kaip nustatyta. Kontrolė buvo 10mM fosfato buferis, pH 9.0. Masė K11 buvo 150 mg 3-juose ml.
b Inkubacija vyko 18 vai. 65°C temperatūroje, esant pH 9.0. Išskirto lignino kiekis % paremtas A350 ir patikslintas absorbcijai nevalyto fermento preparato atitinkamoje koncentracijoje.
lentelė
Lignino išskyrimo iš masės K11 nevalytu fermentiniu preparatu iš B. stearothermophiius kamienų T2 ir T6a kinetika
Laikas, (vai.) Fermentas“3 Išskirto lignino kiekis, %
Bendras Grynas
2 T2 17 12
4 T2 23 18
Laikas, (vai.) Fermentas0 Išskirto lignino kiekis, %
Bendras Grynas
18 T2 29 21
2 T6 12 5
4 T6 15 8
6 T6 17 9
18 T6 18 10
a Eksperimentas buvo atliekamas, kaip aprašyta 1 lentelėje, 65°C temperatūroje ir esant pH 9.0.
b Nevalyto fermento T2 ir T6 koncentracijos buvo atitinkamai 2.8 ir 1.5 mg baltymo/ml.
lentelė
Lignino išskyrimas nevalytu fermentiniu preparatu iš
B.stearothermophilus kamienų T2 ir T6a kaip temperatūros funkcija
Temperatūra Fermentas13 Išskirto lignino kiekis %
Bendras Grynas
53 T2 16 6
65 T2 19 9
75 T2 20 5
Temperatūra Fermentas13 Išskirto lignino kiekis %
Bendras Grynas
53 T6 15 5
65 T6 18 8
75 T6 20 5
a Eksperimentas buvo atliekamas, kaip aprašyta 1 lentelėje, 65°C
temperatūroje, esant pH 9.0.
b Nevalytų fermentų T2 ir T6 koncentracija buvo atitinkamai 1.7 ir 0.7 mg
baltymo/ml.
4 lentelė
Lignino išskyrimas iš masės K11 kaip pHa funkcija
PH Fermentas13 Išskirto lignino Bendras kiekis % Grynas
7 T2 14 6.4
8 T2 14 6.1
9 T2 17 7.7
10 T2 18 8.3
7 T6 13 4
8 T6 15 6
9 T6 19 9
10 T6 18 7
10.5 T6 18 6
a Eksperimentas buvo atliekamas, kaip aprašyta 1 lentelėje, 65°C temperatūrojel 8 valandų.
b Nevalytų fermentinių preparatų T2 ir T6 koncentracijos buvo atitinkamai
1.7 ir 15 mg baltymo/ml.
lentelė
Lignino išskyrimas iš masės K8a
Fermentinis preparatas Koncentracija, (mg/ml) Išskirto lignino kiekis, %
Bendras Grynas
T2 0.8 16 5
T2 1.2 17 6
T2 1.6 20 9
T6 0.3 14 3
T6 0.6 15 4
T6 1.1 17 6
a Eksperimentas buvo atliekamas, kaip aprašyta 1 lentelėje, 65°C
temperatūroje, esant pH 9.0 18 valandų, naudojant K8 vietoj K11.
Labai išgrynintos frakcijos iš kamieno T6 kultūros preparatas
Nuskaidrinto buljono iš kamieno T6 kultūros labai išgryninta frakcija (ksilanazės pavidalo) yra gaunama, panaudojant katijonitą vienoje koncentracijos ir gryninimo stadijoje. Tokiu būdu, ksilanazė T6 buvo gryninama ir koncentruojama tiesiog iš beląstėlinio supernatanto adsorbcija j katijonitą CM-52 (VVhatman). Tačiau su ΧΜΡ terpe regeneravimo išeiga buvo tik 21%, matyt, dėl didelės terpės joninio pajėgumo. Kada terpė buvo dializuotą prieš mažo joninio pajėgumo buferį arba MOPS buvo išleista iš terpės, regeneravimo išeiga buvo maždaug 50%. Minimalaus CM-52 kiekio, reikalingo efektyviai adsorbcijai iš nuskaidrintos kultūros nustatymui buvo tiriami įvairūs CM-52 kiekiai ksilanazės T-6 gryninimui. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.
lentelė
Ksilanazės T-6 adsorbcija su įvairiais CM-52 kiekiais
CM-52/bul- jonas, (g/g) Frakcija Tūris, (ml) Ksilanazė, (V/ml) Bendri vienetai Išeiga, (%)
Supernatantas 100 0.78 78.0 100.0
0.1 Ekstraktas 40 1.04 41.6 55.3
Neadsorbuotas 100 0.055 5.5 7.0
0.05 Ekstraktas 30 1.3 39.9 50.0
Neadsorbuotas 100 0.077 7.7 9.8
0.02 Ekstraktas 15 1.94 29.1 37.3
CM-52/bul- jonas, (g/g) Frakcija Turis, (ml) Ksilanazė, (V/ml) Bendri vienetai Išeiga, (%)
Neadsorbuotas 100 0.16 16.0 20.5
0.01 Ekstraktas 14 2.05 28.7 36.8
Neadsorbuotas 100 0.24 24.0 30.8
Kaip parodyta 6 lentelėje, esant 5% adsorbento, išeiga yra 50%. Kitas komerciškai prieinamas katijonitas yra SE-52 (Whatman) (neigiamos grupės yra sulfoksietilo, prijungto prie celiuliozės). Žinoma, kad SE-52 yra didesnės adsorbcinės talpos negu CM-52. Kadangi gryninimo stadija yra kartu ir koncentravimo stadija, yra naudinga panaudoti kiek įmanoma mažiau adsorbento. Todėl mes ksilanazės adsorbcijai išbandėme SE-52. Rezultatai pateikti 7 lentelėje.
lentelė
Ksilanazės T-6 adsorbcija su įvairiais kiekiais SE-52
CE-52/bul- jonas, (g/g) Frakcija Tūris, (ml) Ksilanazė, (V/ml) Bendri vienetai Išeiga, (%)
Supernatantas 100 1.41 141.0 100
0.05 Ekstraktas 30 2.4 72.0 51.1
0.02 Ekstraktas 21 3.2 67.8 48.0
0.01 Ekstraktas 20 2.9 58.0 41.1
Kaip parodyta 7 lentelėje, tik 2% SE-52 buvo sunaudoti ksilanazės T-6
48% regeneravimui.
Ksilanazės T-6 charakterizavimas
Ksilanazės T-6 molekulinė masė nustatyta SDS PAGE ir gelio filtracijos būdas, gauti dydžiai svyruoja tarp 41000 ir 42000 Daltonų. Faktas, kad abu metodai davė panašią MM (molekulinę masę), parodo, kad fermentas sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės (elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu (SDS PAGE) atskiria baltymo subvienetus). Fermento pi (pH, kur bendras baltymo krūvis yra lygus nuliui) buvo 9.0, nustatytas aukšto voltažo izoelektrinio fokusavimo būdu. Palyginti aukštas fermento pi paaiškina teigiamą fermento krūvį, esant neutraliam pH. Fermento optimalus pH buvo apie 7.0; esant pH 9.0, fermentas turėjo maždaug 50% jo pH 7.0 aktyvumo. Ksilanazės T-6 aktyvumo temperatūros profilis pateiktas 8 lentelėje.
lentelė
Ksilanazės T-6 aktyvumas, esant skirtingoms temperatūroms*
Temperatūra, °C Santykinis aktyvumas, (%)
45 20
55 51
60 70
65 81
70 92
75 100
80 73
85 40
* Reakcijos laikas: 5 minutės
Ksilanazės T6 termostabilumas, esant 65°C temperatūrai ir pH 9, parodytas 9 lentelėje lentelė
Ksilanazės T-6 termostabilumas, esant 65°C ir pH 9
Laikas, vai. Santykinis aktyvumas, (%)
0 100
0.25 82
0.5 78
1 75
2 72
4 63
Be to, galima paminėti, kad esant 65°C ir pH 7, per 10 vai. nebuvo aptikta aktyvumo sumažėjimo.
Ksilanazės struktūrinių mutantų iš kamieno T-6 gavimas
Norėdami gauti mutantus, mes pasinaudojome tuo faktu, kad daugeliu atvejų ksilanazė ir ksilozidazė yra pavaldžios tai pačiai reguliacinei kontrolei (tas pats represorius). Kamienai, kurie gamino ksilozidazę, gali būti lengvai aptikti ant agaro lėkštelių su chromogeniniu p-nitrofenilo β-Dksilopiranozido (ΟΝΡΧ) substratu. Tik struktūriniai mutantai ksilozidazei gamins ant agaro lėkštelių geltoną spalvą, kai nėra ksilozės. Norint gauti ksilozidazės struktūrinius mutantus, ląstelės buvo mutagenizuotos MNNC (1-metil-3-nitro-1-nitrozoguanidinu) ir tuomet patalpintos ant agaro lėkštelių su ΟΝΡΧ be ksilozės. Maždaug viena iš penkių šimtų ląstelių gamino kolonijas, kurios ant agaro lėkštelių davė geltoną spalvą. Tokiu būdu buvo išskirti trisdešimt ksilozidazės struktūrinių mutantų ir visi jie buvo ir ksilanazės struktūriniai mutantai. Dviejų iš jų (M-7 ir M-28), augančių esant ksilozei ar gliukozei, augimas ir ksilanazės gaminimas yra pateikti 10 ir 11 lentelėse. Abiejose terpėse (ΧΜΡ ir GMP) mutantų ir T-6 augimo greičiai buvo panašūs. Tačiau mutantai, palyginus su T-6, gamino žymiai daugiau ksilanazės ΧΜΡ terpėje. GMP terpėje (gliukozė yra anglies šaltinis) kamienas T-6 negamino nustatomo ksilanazės kiekio tuo tarpu kai mutantai davė ksilanazės aktyvumo lygį. Kamieno M-7 ksilanazė buvo išgryninta ir pasižymėjo ksilanazei T-6 identiškomis savybėmis.
lentelė
Ksilanazės T-6 struktūrinių mutantų augimas ir ksilanazės gamyba ΧΜΡ terpėje
Kamienas Laikas, (vai.) Drumstumas, (KV) Ksilanazė, (V/ml)
T6 0 10 -
T6 2 40 -
T6 4 150 0.5
T6 6 200 0.8
T6 12 310 2.1
T6 24 290 2.3
T6 30 270 -
M7 0 10 -
Kamienas Laikas, (vai.) Drumstumas, (KV) Ksilanazė, (V/ml)
M7 2 30 -
M7 4 190 0.9
M7 6 270 1.6
M7 12 350 2.1
M7 24 310 2.3
M7 30 310 -
M28 0 20 -
M28 1 20 -
M28 4 40 0.6
M28 6 120 2.0
M28 10 370 5.5
M28 24 320 7.2
lentelė
Ksilanazės T-6 struktūrinių mutantų augimas ir ksilanazės gamyba GMP terpėje
Kamienas Laikas, (vai.) Drumstumas, (KV) Ksilanazė, (V/ml)
T6 0 20 -
T6 2 30 0
T6 4 80 0.1
T6 6 230 0.1
Kamienas Laikas, (vai.) Drumstumas, (KV) Ksilanazė, (V/ml)
T6 8 340 0.1
T6 23 390 0.1
T6 32 370 -
M7 0 20 -
M7 2 70 0.3
M7 4 100 0.6
M7 6 310 1.1
M7 8 340 1.4
M7 23 330 2.2
M7 32 300 -
M28 0 20 -
M28 1 20 -
M28 4 30 0.1
M28 6 100 0.9
M28 8 190 1.7
M28 10 320 3.1
M28 23 330 4.8
Ksilanazės T-6 fragmento seka ir aminorūgščių sudėtis
Iš gana ilgos baltymo N-terminalinės aminorūgščių sekos dalies galima visiškai identifikuoti baltymą. Vieno ksilanazės T-6 fragmento seka buvo dukart nustatyta VVeizman institute Izraelyje Taikomuoju biosistemų dujinės fazės mikrosekvenseriu ABI 475 A. Pirmas baltymo pavyzdys buvo pirmiausiai elektra padengtas ant PVDF membranos (Millipore) ir davė 20 aminorūgščių. Antras baltymo pavyzdys buvo pirmiausiai išgrynintas Superose 12 FPLC kolonėlėje (Pharmacia) ir buvo pakankamas 41 aminorūgšties sekos gavimui.
Gauta tokia seka:
-Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-lle-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-AsnTolesnei fermento charakteristikai aminorūgščių tyrimas buvo atliktas su išgryninta ksilanaze T-6. Šio tyrimo rezultatai pateikti 12 lentelėje.
lentelė
Ksilanazės T-6 aminorūgščių sudėtis
Pk Skilimo Komponentės Koncentra- Liekana/mo-
Nr. laikas pavadinimas cija (nmoliai) lekulei3
1 8.08 Asparagino rūgštis 4.705 58b
2 9.76 Treoninas 0.831 12
3 10.45 Serinas 0.672 10
4 14.05 Glutamino rūgštis 3.639 44c
5 15.52 Prolinas 1.950 24
6 18.80 Glicinas 1.64 20
7 19.84 Alaninas 2.439 30
Pk Skilimo Komponentės Koncentra- Liekana/mo-
Nr. laikas pavadinimas cija (nmoliai) lekulei3
8 20.80 Cistinas 0.061 1
9 21.81 Valinas 2.23 28
10 23.60 Metioninas 0.15 2
11 24.64 Izoleucinas 2.064 26
12 25.39 Leucinas 1.027 14
13 28.75 Tirozinas 1.613 22
14 29.87 Fenilalaninas 1.269 16
15 38.37 Lizinas 3.124 38
16 39.95 Amoniakas 3.691
17 42.63 Histidinas 0.560 6
18 48.05 Argininas 0.904 12
3 42000 Daltonų molekulinės masės pagrindu; patikslinimai buvo atliekami nestabilioms aminorūgštims.
b Asparagino rūgštis yra asparagino rūgšties ir asparagino (Asx) suma. c Glutamino rūgštis yra glutamino rūgšties ir glutamino (Glx) suma.
Eksperimentai, atlikti su fermentu medienos masėje K14
Masės pavyzdys K14 buvo deguoniu pusiau išbalintos minkštos medienos masė iš Korsnas fabriko. Fermentas buvo išgryninta termofilinė ksilanazė T-6.
Buvo tirti įvairūs parametrai, veikiantys masės K14 delignifikacijos laipsnį. Pluošto koncentracijos poveikis yra susumuotas 13 lentelėje.
lentelė
Pluošto koncentracijos poveikis apdorojimui ksilanazė*
Ksilanazė, (V/ml) Pluoštas, (%) Išskirto gryno lignino, (%)
5.1 4.7 4.9
5.1 2.5 6.6
20.4 4.7 9.3
20.4 2.5 11.8
15.0 1.0 15.0
40.8 2.5 13.9
45.0 1.0 16.7
* Sąlygos: pH 9.0, 65°C, 2 vai., K14 masė: kontrolinis pavyzdys be fermento buvo atimamas kiekvienu atveju.
Kaip matyti iš 13 lentelės, mažinant pluošto koncentraciją nuo 4.7 iki 2.5 ir iki 1.0% sauso pluošto svorio, procesas stiprėja. Kadangi fermentinis apdorojimas atliekamas be maišymo, panašu, kad buvo per silpnas kontaktas tarp fermento ir netirpaus substrato. Dėl praktinių priežasčių mes pasirenkame dirbti su 2.5% koncentracijos pluoštu.
pH poveikis pateiktas 14 lentelėje.
lentelė pH poveikis ksilanazės apdorojimui*
PH Buferis Išskirto gryno lignino, (%)
8.5 0.01 M Fosfatas 8.3
9.0 8.4
9.5 6.3
8.5 0.1 M Na2SO4 10.9
9.0 10.2
9.5 8.2
* Sąlygos: 2.5% K14 masė, 15 V/ml ksilanazės, 2 vai., 65°C.
Kaip matyti iš 14 lentelės, fermentas yra efektyviausias, esant pH 8.5-9.0, tiek kalio fosfate, tiek natrio sulfate. Ankstesni eksperimentai parodė mažą aktyvumą žemiau pH 8.0 ir aukščiau pH 9.5.
Na2SO4 koncentracijos poveikis yra pateiktas 15 lentelėje.
lentelė
Na2SO4 koncentracijos poveikis*
Na2SO4 (M) Išskirto gryno lignino, (%)
0 7.2
0.01 8.6
0.05 9.9
0.10 10.8
0.15 11.5
0.20 10.7
*Sąlygos: 2.5% masės K14, 10 V/ml ksilanazė, pH 9.0, 65°C, 2 vai.
Apdorojimas buvo efektyvus nuo to, kai nebuvo pridėta Na2SO4, iki 0.2 M; optimalus aktyvumas prie 0.15 M Na2SO4.
Ksilanazės koncentracijos poveikis susumuotas 16 lentelėje.
lentelė
Lignino išskyrimas kaip ksilanazės koncentracijos funkcija*
Ksilanazė, (V/ml)
Buferis Išskirtas ligninas (Klason’o %)
0.01 M K Fosfatas 0
Ksilanazė, (V/ml) Buferis Išskirtas ligninas (Klason’o %)
10 10
15 12
45 14
0 0.1 M Na2SO4 0
5 12
10 13
15 14
45 16
* Sąlygos: 2,5% sauso pluošto K-14, 2 vai., pH 9, 65°C.
Kaip matyti iš 16 lentelės, lignino išskyrimas priklausė nuo koncentracijos iki maždaug 15 V/ml tiek 0.1 M Na2SO4, tiek kalio fosfato buferyje. Didesnė fermento koncentracija arba ilgesnis inkubacijos periodas (4 vai.) tik nežymiai padidino išskirtą gryną ligniną.
g ir 50 g apdorotos K14 masės pavyzdžių paruošimas tolesniems bandymams g masės K14 pavyzdžių buvo apdoroti 15 V/ml ir 45 V/ml ksilanaze 2 vai. ir 4 vai. kartu su atitinkamais kontroliniais pavyzdžiais. Visi pavyzdžiai turėjo dublikatus. Visos inkubacijos buvo atliekamos, esant pH 9.0 ir 65°C. Lignino išskyrimo spektrometrinė analizė parodyta 17 lentelėje (fosfato buferis) ir 18 lentelėje (0.1 M Na2SO4). Išskirto lignino kiekis svyravo nuo
10.3 iki 14.9 % su 45 V/ml fermentu ir 4 vai. inkubacijos periodais, gaunant nežymiai didesnius dydžius negu prie 15 V/ml ir 2 vai. Neseniai 50 g masės pavyzdžių buvo apdorota, naudojant dublikatus, papildomai analizei. Išskirto gryno lignino buvo 10.8% 13 V/ml fermento 2 vai. ir atitinkamai 12.6% prie 15 V/ml 4 vai.
lentelė g masės K14 apdorojimas ksilanazė fosfato buferyje*
Ksilanazė, (V/ml) Laikas, (vai.) Išskirtas ligninas (%)
Bendras Grynas
0 2 5.3 0
15 2 15.6 10.3
45 2 17.9 12.6
0 4 6.3 0
15 4 17.4 11.1
45 4 20.1 13.8
*Sąlygos: 2.5% masė K14, pH 9.5, 65°C; vidurkis pagal 2 eksperimentus.
lentelė g masės K14 apdorojimas ksilanaze 0.1 M Na2SO4
Ksilanaze, (V/ml) Laikas, (vai.) Išskirtas ligninas, (%)
Bendras Grynas
0 2 5.9 0
15 2 17.6 11.7
45 2 19.8 13.9
0 4 7.0 0
15 4 19.4 12.4
45 4 21.9 14.9
*Sąlygos kaip 17 lentelėje.
Ksilanaze apdorotų 10 g pavyzdžių analizė
Analizės rezultatai yra susumuoti 19-23 lentelėse. Parametrai, pateikti lentelėse, buvo matuoti pagal SCAN bandymų serijas, išskyrus nulinio žingsnio dydžius, kurie buvo matuojami pagal gamintojų (Pulmac Instruments Ltd., Kanada) instrukcijas. 19 lentelėje pateikti duomenys, gauti panaudojant masę, kuri buvo apdorota 2 valandas 65°C temperatūroje, pH 9.0, 0.1 M Na2SO4, be fermento (kontrolinis pvz.) ir su 15 V/ml fermento. Kaip galima matyti, buvo puikus atgaminimas su dublikatų pavyzdžiais, paruoštais kas 2 savaičių intervalai. Didžiausias poveikis buvo pentozano kiekiui, kuris sumažėjo 17.4% Buvo nedideli, bet patikimi Kapa skaičių bei tamprumo indeksų sumažėjimai, ir ryškumo, klampumo bei nulinio žingsnio dydžių padidėjimai.
Aukščiau minėtų savybių dydžiai medienos masei arba lakštams, padarytiems iš masės, nebuvo labai skirtingi, naudojant fermentus 15 V/ml bei 45 V/ml, apdorojant 2 vai. ir 4 vai., ir naudojant 0.01 M kalio fosfatą bei 0.1 M Na2SO4 (20 ir 21 lentelės).
Šių duomenų reikšmingumo analizė, medienos masės ir popieriaus savybės yra pateiktos 22 ir 23 lentelėse kaip procentiniai pasikeitimai, palyginus su atitinkamais kontroliniais pavyzdžiais.
Daromos tokios išvados:
1. Pentozanai yra dalinai išskirti (10.4-22.2%); didesni fermento kiekiai išskiria daugiau pentozanų.
2. Yra mažas, bet reikšmingas klampumo padidėjimas; tai gali būti paaiškinta pentozanų išskyrimu (apie 1% K14 sausos masės). Nepastebima celiuliozės skilimo netgi esant didžiausioms fermento koncentracijoms, 4 vai. 65°C temperatūroje, pH 9.
3. Kapa skaičius mažėjo visose aštuoniose tirtose sąlygose (ribos: 5.59.1%). Kai šie dydžiai toliau nemažėja prie didesnių fermento koncentracijų (tada, kai pentozanai buvo), didesni fermento kiekiai pasirodė išskiriantys pentozanus, kurie nebuvo prijungti prie lignino.
4. Visose aštuoniose tikrintose sąlygose masės lakštai parodė nedidelį ryškumo ir nulinio žingsnio dydžių padidėjimą ir tamprumo indeksų sumažėjimą.
lentelė
Masės K14 apdorojimas ksilanazė*
Parametras Kontr. pvz. Naudotas fermentas Vidutinis pasikeitimas, (%)
Kapa skaič. 17.3, 16.8 16.0, 15.5 -7.6, (±0.1)
Klampumas (dm3/kg) 1066, 1045 1072, 1039 +0.8, (±0.1)
Pentozanas (%) 9.1,9.3 7.7, 7.5 -17.4 (±1.8)
Lakštai (75q/m2)
Ryškumas (% ISO) 32.3, 32.8 33.4, 33.8 +2.9, (±0.1)
Tamprumo indeksas (Nm/g) 20.9, 20.4 19.0, 19.3 -7.2, (±1.8)
Nulinio žingsnis (drėgnas) (Nm/g) 95.2, 97.8 101.5, 104.3 +6.3, (±0.3)
*Sąlygos: 15 V/ml fermentas, pH 9.0, 2 vai., 0.1 M Na2SO4.
lentelė
Masės K14 apdorojimas ksilanazę 0.1 M Na2SO4*
Para- 0/ml 15 V/ml 45 V/ml 0/ml 15 V/ml 45 V/ml
metras 2v. 2v. 2v. 4v. 4v. 4v.
Kapa 17.1 15.8 16.0 17.0 15.4 15.8
Klam- 1055 1066 1072 1061 1075 1075
pumas
Pento- 9.20 7.6 7.3 9.0 7.5 7.0
zanas
Ryšku- 32.6 33.6 34.1 32.6 34.1 34.4
mas
Tampru- 20.7 19.2 20.7 21.2 19.6 19.8
mas
Nulinis 97 103 104 100 104 103
žingsnis *Vidurkis iš dviejų eksperimentų: sąlygos kaip 19 lentelėje.
lentelė
Masės K14 apdorojimas ksilanazė 0.01 fosfato buferyje*
Para- 0/ml 15 V/ml 45 V/ml 0/ml 15 V/ml 45 V/ml
metras 2v. 2v. 2v. 4v. 4v. 4v.
Kapa 17.0 15.9 16.0 17.2 16.0 16.2
Klam- 1065 1073 1076 1060 1070 1073
pumas
Pento- 9.10 8.2 7.4 9.0 7.9 7.4
zanas
Ryšku- 31.8 33.2 33.6 32.6 33.2 33.7
mas
Tampru- 21.0 19.2 20.4 20.9 19.4 20.3
mas
Nulinis 101 101 107 99 102 104
žingsnis
*Vidurkis iš dviejų eksperimentų.
lentelė
Masės K14 apdorojimas ksilanazė*
Parametras Pasikeitimas, (%)
15 V/ml 15/ml 45 V/ml . 45 V/ml
Kapa -7.6 -9.1 -5.9 -7.1
Klampumas +0.8 + 1.4 + 1.5 + 1.4
Pentozanas -17.4 -16.5 -20.6 -22.2
Ryškumas +2.9 +4.4 +4.7 +5.3
Tamprumas -7.2 -7.5 -6.8 -6.4
Nulinis žingsnis +6.3 +3.7 +7.1 +3.0
* 0.1 M Na2SO4; duomenys iš 20 lentelės.
lentelė
Masės K14 apdorojimas ksilanazė*
Pasikeitimas, (%)
Parametras 15 V/ml 15/ml 45 V/ml 45 V/ml
Kapa -7.3 -7.0 -6.7 -5.5
Klampumas +0.8 +0.9 + 1.0 + 1.2
Pentozanas -10.4 -12.7 -20.7 -18.4
Parametras Pasikeitimas, (%)
15 V/ml 15/ml 45 V/ml 45 V/ml
Ryškumas +4.3 +2.8 +5.3 +3.2
Tamprumas -8.8 -7.4 -3.3 -2.9
Nulinis žingsnis -0.7 +8.3 +5.8 +5.2
* 0.1 M fosfatas; duomenys iš 21 lentelės.
Balinimo bandymas
Masė K14 su Kapa skaičiumi 18.5 buvo panaudota tirti apdorojimo fermentu poveikį balinimui. Masė K14 buvo apdorota fermentu, kurio koncentracija 15 V/ml ksilanazės, pagamintos iš kamieno T-6. Po fermentinio apdorojimo masė buvo balinama su balinimo seka, naudojama Korsnas fabrike: Chloro dioksidas (DO)- šarminė ekstrakcija, sustiprinta deguoniu (E0)- Chloro dioksidas (D1)- chloro dioksidas (D2).
Fermentinis apdorojimas sumažino lignino masės kiekį iki Kapa skaičiaus
15.9. Masė, apdorota tuo pačiu būdu, kaip fermentu apdorota masė, t.y. 65°C temperatūroje, pH 9, 100 mM Na2SO4 buferyje, bet nepridėjus fermentų, buvo delignifikuojama iki Kapa skaičiaus 17.2. Tikrasis fermentinio apdorojimo poveikis buvo delignifikacija nuo Kapa sk. 17.2 iki
15.9, t.y. 8% delignifikacija.
Masė, apdorota fermentais sulfato buferio sistemoje, sunaudojo 47 kg chloro dioksido (aktyvaus chloro)/masės tonai, kai buvo balinama iki 83% ryškumo su balinimo seka DO (E0) D1D2. Atitinkamas suvartojimas tiktai buferiu apdorotai masei buvo 59 kg chloro dioksido (Cl)/masės tonai, t.y. fermentu apdorota masė sunaudojo 20% mažiau chloro dioksido.

Claims (10)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Preparatas, pasižymintis fermentiniu aktyvumu, besiskiriantis tuo, kad jis gaunamas iš Bacillus stearothermophiius kamieno, parinkto iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantų ir variantų, sugebančių iš esmės taip pat gaminti minėtą preparatą, kaip minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, aerobine fermentacija tinkamoje terpėje ir sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje ir esant pH mažiausiai 9.
  2. 2. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas gaunamas iš mutantinio Bacillus stearothermophiius kamieno NCIMB 40222 aerobine fermentacija tinkamoje terpėje, turinčioje gliukozės kaip anglies šaltinio.
  3. 3. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas susideda iš fermento, apimančio aminorūgščių seką -Lys-Asn-Ala-Asp-Ser-Tyr-Ala-Lys-Lys-Pro-His-lle-Ser-Ala-Leu-Asn-Ala-Pro-GIn-Leu-Asn-GIn-Arg-Tyr-Lys-Asn-Glu-Phe-Thr-lle-Gly-Ala-Ala-Val-Glu-Pro-Tyr-GIn-Leu-GIn-Asnarba jos homologą, visam fermentui parodant aktyvumą medienos masės terpėje.
  4. 4. Preparatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas preparatas yra labai išgryninta kultūros buljono frakcija, gaunama panaudojant katijonitą, minėtai frakcijai esant ksilanazės formoje, parodančiai fermentinį aktyvumą medienos masės terpėje.
  5. 5. Preparatas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ksilanazė turi apytikslę molekulinę masę tarp 41000 ir 42000 Daltonų, nustatytą elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje su natrio dodecilsulfatu (SDS PAGE) bei gelių filtracija, ir tokią apytikslę aminorugščių sudėtį, nustatytą aminorugščių analize kaip aminorūgšties liekanos/ molekulei:
    Asx 58; Thr 12; Ser 10; Glx 44; Pro 24; Gly 20; Ala 30; Cys 1; Vai 28; Met 2; Ile 26; Leu 14; Tyr 22; Phe 16; Lys 38; His 6; Arg 12.
  6. 6. Preparato, pasižyminčio fermentiniu aktyvumu, gavimo būdas, b e siskiriantis tuo, kad BaciUus stearothermophilus kamieną, parinktą iš kamienų NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantų ir variantų, sugebantį iš esmės taip pat gaminti minėtą peparatą, kaip minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, nukreipia aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, minėtam preparatui sugebant delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, esant pH mažiausiai 9.
  7. 7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad Bacillus stearothermophilus kamieno NCIMB 40222 mutantinį kamieną nukreipia aerobinei fermentacijai tinkamoje terpėje, turinčioje gliukozės kaip anglies šaltinio.
  8. 8. Išskirti BaciUus stearothermophilus kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222 bei jų mutantai ir variantai, minėtiems mutantams ir variantams iš esmės taip pat sugebant gaminti preparatą, pasižymintį fermentiniu aktyvumu, kaip ir minėti kamienai NCIMB 40221 ir NCIMB 40222, o minėtas perparatas sugeba delignifikuoti medienos masę mažiausiai 65°C temperatūroje, esant pH mažiausiai 9.
  9. 9. Būdas, susidedantis iš medienos masės apdorojimo, b e s i s k i r i a nt i s tuo, kad medienos masę bent vienoje stadijoje apdoroja preparatu pagal bet kurį iš 1-5 punktų.
  10. 10. Medienos masė, susmulkinta celiuliozė, popierius, lentos bei dulkės, besiskiriantys tuo, kad jie padaryti iš medienos masės, kuri bent vienoje stadijoje apdorota preparatu pagal bet kurį iš 1-5 punktų.
LTIP1245A 1990-01-10 1993-09-28 Preparation exibiting enzymatic delignification activity, a method for producting the same and application thereof LT3970B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9000070A SE465320B (sv) 1990-01-10 1990-01-10 Preparat som uppvisar enzymatisk delignifieringsaktivitet, saett att framstaella detsamma och tillaempningar daerav

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1245A LTIP1245A (en) 1995-04-25
LT3970B true LT3970B (en) 1996-05-27

Family

ID=20378196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1245A LT3970B (en) 1990-01-10 1993-09-28 Preparation exibiting enzymatic delignification activity, a method for producting the same and application thereof

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5434071A (lt)
EP (1) EP0585217B1 (lt)
JP (1) JPH05505722A (lt)
KR (1) KR920703793A (lt)
AT (1) ATE150787T1 (lt)
AU (1) AU631485B2 (lt)
BR (1) BR9007975A (lt)
CA (1) CA2073436A1 (lt)
DE (1) DE69030326D1 (lt)
FI (1) FI923016A (lt)
IE (1) IE62344B1 (lt)
IL (1) IL96922A0 (lt)
LT (1) LT3970B (lt)
LV (1) LV10489B (lt)
NO (1) NO922727D0 (lt)
NZ (1) NZ236708A (lt)
PL (1) PL166837B1 (lt)
PT (1) PT96461B (lt)
RU (1) RU2054480C1 (lt)
SE (1) SE465320B (lt)
WO (1) WO1991010724A1 (lt)
ZA (1) ZA91179B (lt)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677161A (en) * 1990-01-10 1997-10-14 Korsnas Aktiebolag Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)
GB9018426D0 (en) * 1990-08-22 1990-10-03 Sandoz Ltd Improvements in or relating to novel compounds
WO1993020192A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Korsnäs Aktiebolag DELIGNIFYING PREPARATION EXHIBITING α-L-ARABINOFURANOSIDASE ACTIVITY, PRODUCTION AND APPLICATION THEREOF
DK105592D0 (da) * 1992-08-26 1992-08-26 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2807612B2 (ja) * 1993-03-12 1998-10-08 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
JPH0787957A (ja) * 1993-07-28 1995-04-04 Nippon Paper Ind Co Ltd 微生物ｓｋｂ−１１５２株及びそれを利用したパルプの漂白方法
DK0686193T3 (da) * 1993-12-24 2010-10-25 Dsm Ip Assets Bv Alkalitolerante xylanaser
US6506592B1 (en) * 1998-08-18 2003-01-14 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Hyperthermophilic alpha-glucosidase gene and its use
KR20040033143A (ko) * 2002-10-11 2004-04-21 한남수 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈, 및 이를이용한 아라비노스 생산방법
BRPI0412279A (pt) 2003-07-02 2006-09-19 Diversa Corp glucanases, ácidos nucléicos codificando as mesmas e métodos para preparar e aplicar os mesmos
CA2535526C (en) 2003-08-11 2015-09-29 Diversa Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101040052A (zh) 2004-09-10 2007-09-19 诺维信北美公司 防止、去除、减少或破坏生物膜的方法
EP2548954A1 (en) 2006-02-14 2013-01-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0714876B1 (pt) 2006-08-04 2022-04-19 Verenium Corporation Ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula bacteriana, fúngica ou de levedura transformada, polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante, composição, bem como métodos de produção e de usos dos mesmos
CN101952437B (zh) 2007-10-03 2014-04-09 维莱尼姆公司 木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
JP6384720B2 (ja) 2014-07-30 2018-09-05 株式会社デンソー 回転角度検出装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2557894A1 (fr) 1984-01-10 1985-07-12 Centre Tech Ind Papier Procede de traitement de pates papetieres par une solution enzymatique favorisant la fibrillation et pates ainsi traitees.

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4692413A (en) * 1985-07-15 1987-09-08 Repligen Corporation Use of rLDM™ 1-6 and other ligninolytic enzymes for the decolorization of E1 effluent
FR2604198B1 (fr) * 1986-09-22 1989-07-07 Du Pin Cellulose Procede de traitement d'une pate papetiere par une solution enzymatique.
FI81395B (fi) * 1988-03-14 1990-06-29 Cultor Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
US5179021A (en) * 1989-02-10 1993-01-12 Gil Inc. (Now Ici Canada Inc.) Pulp bleaching process comprising oxygen delignification and xylanase enzyme treatment
FI90888B (fi) * 1989-02-14 1993-12-31 Enso Gutzeit Oy Menetelmä selluloosamassan valkaisemiseksi
FI86896B (fi) * 1989-05-04 1992-07-15 Enso Gutzeit Oy Foerfarande foer blekning av cellulosamassa.
ZA904441B (en) * 1989-06-22 1991-03-27 Int Paper Co Enzymatic delignification of lignocellulosic material
WO1991002791A1 (en) * 1989-08-14 1991-03-07 Cultor Oy Enzymatic bleaching of pulp
PT94984A (pt) * 1989-08-14 1991-04-18 Cultor Oy Processo aperfeicoado para branqueamento de polpa a oxigenio
DK420289D0 (da) * 1989-08-25 1989-08-25 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af lignocellulosepulp
NZ235679A (en) * 1989-10-18 1993-01-27 Int Paper Co Bleaching lignocellulosic pulp using (a) treatment with xylanase and (b) one or more chemical bleaching stages
WO1991018976A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Novo Nordisk A/S HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2557894A1 (fr) 1984-01-10 1985-07-12 Centre Tech Ind Papier Procede de traitement de pates papetieres par une solution enzymatique favorisant la fibrillation et pates ainsi traitees.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEKKER R.F.H AND RICHARS G.N.: "Their Occurence, Purification, Properties and Mode of Activity", ADVANCES IN CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY, 1976, pages 277 - 352
SPIRO R.G.: "Analysis of sugars found in glycoproteins", METHODS IN ENZYMOLOGY, 1966, pages 7 - 9

Also Published As

Publication number Publication date
PL166837B1 (pl) 1995-06-30
IL96922A0 (en) 1992-03-29
BR9007975A (pt) 1992-11-10
FI923016A0 (fi) 1992-06-29
US5434071A (en) 1995-07-18
LV10489A (lv) 1995-02-20
AU7166391A (en) 1991-08-05
IE62344B1 (en) 1995-01-25
NO922727L (no) 1992-07-10
EP0585217B1 (en) 1997-03-26
SE9000070D0 (sv) 1990-01-10
FI923016A (fi) 1992-06-29
LV10489B (en) 1996-04-20
RU2054480C1 (ru) 1996-02-20
DE69030326D1 (de) 1997-04-30
ZA91179B (en) 1991-10-30
PT96461A (pt) 1991-10-15
EP0585217A1 (en) 1994-03-09
JPH05505722A (ja) 1993-08-26
ATE150787T1 (de) 1997-04-15
SE465320B (sv) 1991-08-26
PT96461B (pt) 1998-06-30
AU631485B2 (en) 1992-11-26
WO1991010724A1 (en) 1991-07-25
SE9000070L (sv) 1991-07-11
NO922727D0 (no) 1992-07-10
CA2073436A1 (en) 1991-07-11
KR920703793A (ko) 1992-12-18
LTIP1245A (en) 1995-04-25
NZ236708A (en) 1992-10-28
IE910066A1 (en) 1991-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0825254B1 (en) Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and xylanase obtainable therefrom
LT3970B (en) Preparation exibiting enzymatic delignification activity, a method for producting the same and application thereof
EP0473545B1 (en) Thermostable endoxylanases
JP4285767B2 (ja) 熱安定性キシラナーゼ
JP3865769B2 (ja) アルカリ耐性キシラナーゼ
JPH08224081A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
FI118010B (fi) Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät
US5834301A (en) Method of removing color from kraft wood pulps
US5369024A (en) Xylanase from streptomyces roseiscleroticus NRRL-11019 for removing color from kraft wood pulps
JPH0892284A (ja) キシラナーゼ、それを生産する微生物、ｄｎａ分子、そのキシラナーゼの調製方法及び使用
US6548283B1 (en) Bacterial protein with xylanase activity
EP0546045A1 (en) ENZYMS WITH XYLANOLYTIC ACTIVITY.
CA2142818A1 (en) New xylanases having high activity and stability at alkaline conditions and high temperatures
JP3353893B2 (ja) 好アルカリ性バチルス属ｓｐ．ＡＣ１３株及びそれより獲得できるプロテアーゼ，キシラナーゼ，セルラーゼ
US5677161A (en) Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
EP0580710A1 (en) Novel microorganisms and novel enzymes
JP2002345472A (ja) 新規ヘキセンウロニダーゼ、それをコードする遺伝子、およびそれらの使用
JP4392488B2 (ja) 新規キシラナーゼ、該キシラナーゼを産生するフリゴリバクテリウム属細菌、及び該キシラナーゼの産生方法
WOOD Jeffries et al.[45] Date of Patent: Nov. 10, 1998
JP2001245665A (ja) アルカリ性キシラナーゼ及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 19970928