KR20040033143A

KR20040033143A - 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈, 및 이를이용한 아라비노스 생산방법

Info

Publication number: KR20040033143A
Application number: KR1020020062055A
Authority: KR
Inventors: 한남수; 정 호 김; 윤향식; 윤지효
Original assignee: 한남수; (주)에이피테크놀로지
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2004-04-21

Abstract

본 발명은 초호열성 균주인 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)가 생산 하는 효소, 및 이를 이용한 아라비노스 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 써모토가 마리티마가 생산하는 아라비노푸라노시데이즈 효소 및 이를 이용한 아라비노자일란으로부터 아라비노스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈는 높은 작용 온도에서 기질과 선택적으로 반응하므로 생성물의 순도가 높고 기질과의 친화도와 반응속도가 높아 아라비노스의 생산속도가 높다는 장점이 있어, 여러 기질로부터 효율적으로 아라비노스를 생산할 수 있어 유용하다.

Description

써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈, 및 이를 이용한 아라비노스 생산방법{ARABINOFURANOSIDASE FROM THERMOTOGA MARITIMA AND PRODUCTION METHOD FOR ARABINOSE WITH THE SAME}

본 발명은 아라비노푸라노시데이즈 및 이를 이용한 아라비노스 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 초호열성 균주인 써모토가 마리티마로부터 아라비노푸라노시데이즈를 클로닝한 후 재조합 대장균으로부터 생산하고, 이를 각종 곡물 외피 등 헤미셀룰로스 함유 생물자원에 처리하여 고수율의 아라비노스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아라비노스(L-arabinose)는 자일로스와 함께 자연계의 식물체에 주로 존재하는 대표적인 5탄당으로 동물의 장에서는 거의 대사되지 않는 당이다. L-아라비노스가 장에서 수크레이즈(sucrase)를 비경쟁적으로 강하게 저해함으로써 설탕 섭취후 나타나는 혈당의 현저한 상승과 인슐린 상승을 억제하는 것으로 보고되고 있다(Seri K, Sanai K, Matsuo N, Kawakubo K, Xue C and Inoue S, Metabolism, 45, 1368-1374 (1996) ). 또한, L-아라비노스를 수크로스와 함께 섭취 시 지질발생효소(lipogenic enzyme)의 활성을 억제하고 간의 트리아실글리세롤의 함량을 감소시켜 체지방의 증가를 예방하는 효과가 있다 (Shigemitsu O, Tomoe K, Tomomi S, Susumu H, Nobuko I, L-아라비노스 feeding prevents increases due to dietary sucrose in lipogenic enzymes and triacylglycerol levels in rats, The Journal of Nutrition, 131,796-799 (2001)). 또한 L-아라비노스의 감미도(sweetness)가 수크로스의 약 50% 정도이며 맛의 질은 수크로스에 가까우므로 수크로스를 주원료로 하는 과자, 케익, 빵, 아이스크림 등의 식품에 폭넓게 이용하여 과혈당 관련질환의 예방 및 치료제로서 뿐만 아니라 체지방 축적억제효과의 첨가물로 개발될 수 있다.

또한 임상실험결과, 아라비노스는 당뇨병 치료제로 이용되는 아카보스(acarbose)와 미글리톨(miglitol)과 같은 알파-글루코시데이즈의 저해제 등의 화학물질이나 인공감미료와 같은 대체 물질들이 갖고 있는 위장장애 및 기타 부작용이 적다(Madar Z. The effect of acarbose and miglitol (BAY-M-1099) on post- prandial glucose levels following ingestion of various sources of starch by nondiabetic and streptozotocin-induced diabetic rats. J Nutr. 1989;119:2023-9).

L-아라비노스는 식물 세포벽의 일반적 구성성분으로 식물계에 널리 분포되어 있다. 옥수수, 밀, 호밀, 쌀과 같은 곡식의 헤미셀룰로스, 사탕무와 사과 과육의펙틴질, 식물 검(gum)질의 주요 구성성분으로 아라비노자일란(arabinoxylan), 아라비난(arabinan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan)의 형태로 존재한다(Pigman W, The Carbohydrates. Chemistry, Bio chemistry, Physiology, Pigman W ed, Academic Press, NewYork, 79 (1957)). 농업 부산물인 쌀겨, 밀기울, 옥수수 외피에는 셀룰로오스, 헤미셀룰로스 및 리그닌이 약 36, 25, 20% 정도로 각각 구성되어 있으며, 헤미셀룰로스 분획 중 25∼30% 가량이 아라비노스로 구성되어 있다(Ayano Y, Vitaminol, J. Nutr. Sci, 45, 209-219 (1992)).

L-아라비노스의 생산에 관한 연구로는, 약산(oxalic acid)으로 처리하여 80-150?? 온도에서 반응시켜 아라비노스를 얻는 방법(Hisaku Susumu, Production of L-arabionse by acid hydrolysis〔일본 특개평11-313700; Shibanuma, K. Takamine, K., Maseda, S. Osaki, S., Abe, J., Hizukuri-S. Partial acid hydrolysis of corn fiber for the production of L-arabinose(1999), Journal of applied glycoscience. 46(3) 249-256)와, 곡류외피로부터 수용성 당류를 제조하는 방법으로 핵외피를 pH 1.0-3.0으로 산 처리한 후 120-150 ℃의 온도에서 습식가열처리하여 단당 및 수용성 다당, 올리고당을 제조하는 방법(일본 특개평11-113600)이 있다.

그러나, 이들 대부분 100??이상의 고온, 강산처리에 의해 아라비노스와 자일로스가 동시에 생성되어 분리 정제에 어려움이 있고 내산성과 고압에 견딜 수 있는 특별한 용기와 과도한 분해에 의해 인체에 유해한 산물이 생성될 수 있다는 단점이 있다.

L-아라비노스를 생산하는 효소적인 방법으로는, 바실러스(Bacillus)가 생산하는 조효소액을 이용한 방법(특개평 9-299093)과, 여러 가지 균주가 생산하는 다양한 효소를 이용하여 볏짚과 같은 천연물에 특별한 전처리 없이 직접 작용시켜서 아라비노스를 얻는 방법(특개 2001-286294) 등이 있으나, 다양한 효소 전처리 조건을 고려하여야 한다는 단점이 있다. 또한, 아라비노푸라노시데이즈에 관한 연구도 진행되고 있으나 최적온도가 55 ℃이하로 낮고, 최적 pH 또한 중성(6.0-7.0) 부근으로(일본 특개 2000-106872, 일본 특개 2000-217580), 아라비노자일란에 직접 처리시 생산성이 매우 낮다는 단점이 있다.

그러므로 효소적인 방법으로 아라비노스를 생산하기 위해서는 효소의 반응온도가 높아서 기질에 대한 친화도와 생산속도를 증가시킬 필요가 있다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 최적온도, 기질 특이성 및 반응속도가 높아 원하는 당만을 고효율로 생산가능하고, 분리 및 정제가 용이한, 초호열성 균주인 써모토가 마리티마에서 발현되는 아라비노스를 유리시키는 효소를 암호화하는 아라비노푸라노시데이즈 효소 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아라비노푸라노시데이즈 효소를 코딩하는 유전자 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 대장균을 배양하여 파괴한 후 간단한 열처리로 손쉽게 효소를 정제할 수 있어 효소 정제 단가를 낮출 수 있는, 상기 아라비노푸라노시데이즈 효소를 코딩하는 유전자(TmAra)를 분리하고, 이 유전자를 발현벡터에 재조합한 후 대장균에서 대량발현하여 고온성 아라비노푸라노시데이즈 효소 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고온성 아라비노푸라노시데이즈 효소를 이용하여 각종 아라비노스 함유 기질로부터 아라비노스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 재조합 아라비노푸라노시데이즈 효소의 생산방법 및 정제공정이다

도 2는 재조합 아라비노푸라노시데이즈의 생산을 위한 발현벡터(pRBTmAra)의 제조과정을 나타내는 모식도이다.

도 3은 실시예 1에 따른 재조합 아라비노푸라노시데이즈(pRBTmAra)효소 유전자를 대장균에서 대량 발현시킨 후 정제된 효소 단백질의 SDS-PAGE 사진이다.

도 4는 실시예 1에 따른 재조합 아라비노푸라노시데이즈의 작용 온도를 나타내는 그래프이다.

도 5는 실시예 1에 따른 재조합 아라비노푸라노시데이즈의 작용 pH를 나타내는 그래프이다.

도 6는 실시예 1에 따른 재조합 아라비노푸라노시데이즈 효소 단백질을 이용하여 아라비노자일란에서 생산반응을 실시하고 얇은 막 크로마토그래피 방법에 의해 아라비노스 생산을 확인한 결과이다.

도 7은 아라비노자일란(oat spelts xylan)에 함유된 총 아라비노스에 대한 효소반응에 의해 생산된 아라비노스의 함량비(%)를 나타낸 것이다.

도 8은 실시예 5에 따른 재조합 자일라네이즈(pRBTmXyl)효소 유전자를 대장균에서 대량발현 시킨 후 정제된 효소 단백질의 SDS-PAGE 사진이다.

도 9는 실시예 5에 따른 재조합 자일라네이즈의 작용 온도를 나타내는 그래프이다.

도 10은 실시예 5에 따른 재조합 자일라네이즈의 작용 pH를 나타내는 그래프이다.

도 11은 실시예 5에 따른 재조합 자일라네이즈 효소 단백질을 이용하여 아라비노자일란에서 생산반응을 실시하고 얇은 막 크로마토그래피 방법에 의해 아라비노스와 자일로올리고사카라이드 생산을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

상기 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은 써모토가 마리티마가 생산하며, 60 ~ 120 ℃의 작용온도 및 pH 4 ~ 9 범위의 작용 pH를 가지며, 아라비노자일란을 특이적으로 분해하여 아라비노스를 생산하는 α-L-아라비노푸라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 효소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 써모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 염기서열을 가지는, 써모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 써모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소를 이용하여, 아라비노스를 구성당으로 함유한 기질로부터 아라비노스를 제조하는 공정을 포함하는 아라비노스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)의 아라비노푸라노시데이즈(Arabinofuranosidase) 효소는 최적온도, 기질 특이성 및 반응속도가 높아 원하는 당만을 고효율로 생산가능하고, 분리 및 정제가 용이하며, 상기 아라비노푸라노시데이즈 효소를 코딩하는 유전자(TmAra)를 분리하고, 이 유전자를 발현벡터에 재조합한 후 대장균에서 대량발현하여 고온성 아라비노푸라노시데이즈 효소 단백질을 생산하는 방법은 재조합 대장균을 배양하여 파괴한 후 간단한 열처리로 손쉽게 효소를 정제할 수 있어 효소 정제 단가를 낮출 수 있으며, 상기 고온성 아라비노푸라노시데이즈 효소를 이용하여 각종 아라비노스를 구성당으로 함유하는 기질로부터 아라비노스를 생산할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 써모토가 마리티마의 알파-L-아라비노푸라노시데이즈(alpha-L-arabinofuranosidase) 효소 및 이를 코딩하는 염기서열에 관한 것이다.

상기 알파-L-아라비노푸라노시데이즈 효소는 아라비노자일란으로부터 아라비노스를 유리시키는 효소로서, 아라비노자일란의 아라비노실(arabinosyl) 잔기를 공격하여 아라비노스를 생산하는 효소이다.

본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈는 서열번호 2에 나타난 아미노산 서열을 갖는 것이며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 상기 아라비노푸라노시데이즈를 코딩하는 유전자의 예로는 써모토가 마리티마의 Gene bank accession No. AE001710 (protein_id: AAD35369)을 들 수 있으며, 이 효소의 유전자 영역은 이는 써모토가 마리티마의 게놈 서열중 염기서열 5273에서 6727에 해당하는 영역으로서 서열목록중 서열번호 1에 나타냈으며, 이의 아미노산서열을 서열번호 2에 나타냈다.

본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈의 분자량 측정은 겔여과 크로마토그래피법으로 평가한 결과 약 240 KD이고, SDS-PAGE에 의한 효소의 분자량은 약 60KD이다. 따라서, 효소 한 개 분자당 같은 크기의 서브유니트 4개로 구성되어 있음을 알 수 있다. 상기 아라비노푸라노시데이즈의 작용온도는 60 ~ 120 ℃ 범위이고, 작용 pH는 4 ~ 9 범위이다. 상기 효소의 최적 온도는 pH 6.0에서 10분 반응시의 아라비노푸라노시데이즈의 효소 활성은 최적온도는 105 ℃ 부근이다(도 4). 최적 pH는 105 ℃에서 아라비노푸라노시데이즈의 최적 pH는 5.5 부근이다(도 5). 또한, 아라비노푸라노시데이즈의 비활성은 320U/mg(90 ℃, pH6.0 인산 완충액, 기질은p-니트로페닐--L-아라비노푸라노시드를 사용)이며, 최적조건에서 비활성은 400U/mg 단백질(pH 5.5, 105 ℃)이다.

분리한 유전자로부터 번역되어 얻어지는 아라비노푸라노시데이즈를 이용하여 아라비노스를 생산할 수 있는지를 확인하기 위하여 대장균에서 발현시키고, 발현된 재조합 효소 단백질을 순수 분리한 후 아라비노스 생산능력을 검정하였다. 아라비노푸라노시데이즈 유전자 부분을 분리하고 대장균에서의 발현 벡터인 pRSET 플라스미드에 삽입시켜 효소 단백질의 발현을 유도하고 발현된 재조합 효소 단백질은 Ni²⁺-니트릴로트리아세트산-아가로스(nitrilotriacetic acid-agarose) 흡착겔 크로마토그래피(Qiagen)를 이용하여 순수분리하고, SDS-PAGE를 이용하여 재조합 효소 단백질이 발현됨을 확인할 수 있다. 분리된 재조합 효소 단백질의 아라비노스 생산능을 검정하기 위하여 효소의 효소활성을 측정할 수 있는 기질인p-니트로페닐아라비노푸라노시드(p-nitrophenylarabinofuranoside)와 아라비노자일란에 작용시켜 봄으로서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 자일라네이즈(xylanase)는 서열번호 4에 나타난 아미노산 서열을 갖는 것이며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 상기 자일라네이즈를 코딩하는 유전자의 예로는 써모토가 마리티마의 Gene bank accession No. Z46264 (protein_id: CAA86406)을 들 수 있다.

본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈의 분자량 측정은 효소의 분자량은 SDS-PAGE 결과 약 120,000 Da이었다. 상기 자일라네이즈의 작용 온도는 60 ~ 120 ℃ 이고, 최적 온도는 pH 6.0, 10분 반응시의 재조합 자일라네이즈의 효소 활성은 최적온도가 90 ℃ 부근이었다(도 9). 또한 상기 자일라네이즈의 작용 pH는 3 ~ 9 범위이고, 최적 pH는 90 ℃에서 재조합 자일라네이즈의 최적 pH는 6.0 부근이었다(도 10).

본 발명은 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈 효소의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 효소 생산방법은 초호열성 균주인 써모토가 마리티마의 게놈 DNA로부터 분리한 아라비노푸라노시데이즈 유전자를 분리하는 단계, 대장균에서의 TmAra 유전자의 발현 및 순수 분리하는 단계, 효소 단백질을 이용하여 아라비노스를 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 구체적 일례를 들어 아라비노푸라노시데이즈를 생산하는 과정 및 발현벡터 제조를 도면을 들어 설명한다. 도 1의 효소 생산과정 및 도 2의 발현벡터제조 개략도를 보면, 도 2에 기재된 대로 아라비노푸라노시데이즈 유전자를 포함하는 대장균 발현 벡터를 제조하고, 이 벡터로 대장균을 형질전환시키고, 상기 형질전환체를 배양하여 셀을 파쇄하고, 분리 및 정제과정을 거쳐서 아라비노푸라노시데이즈를 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈 생산과정의 자세한 구체적인 예는 하기 실시예에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 상기 아라비노푸라노시데이즈를 이용하여 여러 가지 기질로부터 아라비노스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 아리비노푸라노시데이즈 효소는 정제된 효소 또는 효소 배양액을 사용할 수 있으며, 상기 효소 배양액의 예로는 아라비노푸라노시데이즈 효소를 재조합 대장균에서 발현시킨 후 열처리나 Ni²⁺-NTA-아가로스 흡착 겔 크로마토그래피등의 정제 과정을 거치지 않은 효소액일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 아라비노스 생산방법에 사용하는 아라비노푸라노시데이즈에 추가하여 자일라네이즈를 사용하면 아라비노푸라노시데이즈 또는 자일라네이즈를 단독으로 사용하는 경우보다 아라비노스 생산수율을 더욱 높일 수 있다. 본 발명에서 통상의 알려진 자일라네이즈를 사용할 수 있으나, 써모토가 마리티마의 자일라네이즈를 사용하는 것이 반응온도 등의 반응조건 설정면에서 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 바람직한 일례에서, 상기 아라비노푸라노시데이즈를 이용하여 여러 가지 기질로부터 아라비노스를 생산하는 공정의 반응조건은 반응온도가 60-120℃, 바람직하게는 75 내지 110 ℃ 범위, 반응 pH가 4-9 범위일 수 있다. 상기 반응조건을 벗어날 경우에 효소 활성이 매우 낮아 아라비노스 생산에 시간과 비용이 많이 소요된다.

본 발명에서 이용 가능한 기질은 아라비노스를 구성당으로 포함하는 기질로서, 예컨대 쌀겨, 밀기울, 옥수수 외피 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈를 이용하여 아라비노스를 구성당으로 함유하는 기질로부터 아라비노스를 생산하는 방법은 본 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법대로 수행할 수 있다. 즉, 상기 기질에 알칼리 처리 등 전처리를 수행하여 아라비노자일란을 얻은 후에 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈를 처리하여 아라비노스를 생산하는 것이 바람직하다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

[실시예]

실시예 1: 아라비노푸라노시데이즈 생산

써모토가 마리티마 게놈 유전자로부터 아라비노푸라노시데이즈 유전자를 분리하기 위하여 프라이머를 제작하여 게놈 DNA의 아라비노푸라노시데이즈 유전자 부분을 증폭시키는 PCR을 실시하였다. 상기 써모토가 마리티마의 아라비노푸라노시데이즈의 유전자 서열을 서열번호 1에 나타나 있고, 상기 프라이머 서열을 서열번호 5 및 6에 기재하였다.

TmAra-NCCAATTAGATCTATGTCCTACAGGATAGTG (서열번호 5)

TmAra-CGGGGAAAGATCTTTACTCCAAYYCTACCTC (서열번호 6)

PCR 산물 용액을 페놀-클로로포름으로 정제한 후 제한효소 (BglⅡ)처리하고 아가로스 전기영동 후 유전자를 분리하여 발현 벡터인 pRSET 벡터에 삽입하였다(도 2).

상기 발현 벡터인 pRSET 플라즈미드에 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드(pRBTmAra)로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시키고, 37 ℃에서 12시간 배양하였다.

상기 배양된 형질전환체 배지에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 최종농도 0.7 mM이 되도록 첨가하고 4시간 더 배양하여 재조합효소 단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 재조합 효소 단백질은 Ni²⁺-NTA-아가로스 흡착 겔 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리하였다. 도 3은 발현된 재조합 효소 단백질을 SDS-PAGE 전기영동하여 확인한 결과를 나타내며 각 레인은 다음과 같다:

레인 M: 단백질 분자량 마커,

레인 1: 재조합 아라비노푸라노시데이즈,

레인 2: TmAra 유전자를 포함하는 pRBTmAra의 플라즈미드을 유도발현시킨 전체 효소단백질,

레인 3: TmAra 유전자를 포함하는 pRBTmAra의 플라즈미드을 유도발현시킨 수용성 효소단백질,

레인 4-10: 발현된 효소단백질을 순수 분리한 결과.

도 3에서 보는 바와 같이 재조합 효소 단백질은 다량 발현되었으며 발현된효소 대부분이 수용성인 상태로 존재하며 Ni²⁺-NTA-아가로스 흡착 겔 크로마토그래피로 순수하게 분리가 가능하였으며, 이후 실시예에서 상기 분리된 효소를 사용하였다. 또한, 재조합 효소가 매우 높은 열안정성을 나타내므로 80 ℃에서 20분간 열처리함으로써 효소를 정제할 수 있었다.

실시예 2: 재조합 아라비노푸라노시데이즈의 특성

2-1: 분자량 측정

실시예 1에서 최종 정제된 효소 단백질에 대해서, α-L-아라비노푸라노시데이즈의 분자량은 겔여과 크로마토그래피법으로 평가하였으며 그 결과, 분자량은 240,000Da이다. SDS-PAGE에 의한 효소의 분자량은 약 60,000Da이다(도 3). 그러므로 효소 한 개 분자당 같은 크기의 서브유니트 4개로 구성되어 있음을 알 수 있었다.

2-2: 작용 온도

75 mM 인산완충액(pH 6.0)에 기질의 농도가 2.5 mM이 되도록(p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside)한 후, 정제된 재조합 효소 56pmole을 첨가하여 다양한 온도에서 10분간 반응시켰다. 0.6M 탄산나트륨 1 mL을 가하여 반응을 정지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 상대적인 활성은 최적 온도의 효소 활성을 100으로 하여 상대적인 활성으로 나타냈으며, 실험결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈의작용 온도는 60 ~ 120 ℃범위이고, 최적 온도는 pH 6.0에서 10분 반응시의 아라비노푸라노시데이즈의 효소 활성은 최적온도는 105 ℃ 부근이었다.

2-3: 작용 pH

상기 2-2의 작용온도측정 방법과 실질적으로 동일한 조건으로 실험하였으며, 다만 최적온도인 105 ℃에서 완충액의 pH만 달리하여 효소 활성을 측정하였다. 상기 실험결과를 도 5에 나타냈다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 아라비노푸라노시데이즈의 작용 pH는 pH 4-9 범위이고, 최적 온도는 105 ℃에서 아라비노푸라노시데이즈의 최적 pH는 5.5 부근이었다.

2-4: 효소의 활성

아라비노푸라노시데이즈의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 75 mM 인산완충액(pH 6.0)에 기질의 농도가 2.5 mM이 되도록(p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside)한 후, 효소액 1uL을 첨가하여 90 ℃에서 10분간 반응시켰다. 0.6M 탄산나트륨 1 mL을 가하여 반응을 정지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성의 표시는 상기조건에 있어서 1분간 1μmol의 p-니트로페놀을 유리시키는 효소량을 1 유니트(U)로 표시하였다.

실시예 1에서 정제한 pRBTmAra의 비활성을 90 ℃, pH6.0 인산완충액, 기질은p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드를 사용한 조건에서 측정한 결과 비활성(specific activity)은 320U/mg이며. 최적조건에서 측정된 비활성은 400U/mg 단백질(pH 5.5, 105 ℃)이었다.

실시예 3: 재조합 아라비노푸라노시데이즈의 속도론적 고찰

본 발명의 핵심이 되는 효소의 기질에 대한 친화도를 알아볼 수 있는 Km값과 생산속도를 평가할 수 있는 Vmax값을 기질을 달리하여 조사하였다.

3-1: p-니트로페닐-α-아라비노푸라노시드

pRBTmAra의 효소적인 특성을 알아보기 위해 속도 인자를 구하였다. Vmax와 Km(p-nitrophenol-α-L-arabinofuranoside에 대한)은 기질 농도를 달리하여 105 ℃, pH 5.5에서 5 분간 반응시킨 후 O.D 측정값으로부터 계산하였는데(효소농도: 56pmoles), 데이터는 3번 반복하여 평균값을 이용하였다. 이들 값은 Lineweaver-Burk plots을 이용하여 구하였다. 그 결과 본 발명의 효소는 105 ℃의 고온에서 반응하는 특성으로 Km=0.992 mM이고, Vmax=61,408umol min-1 mg-1으로 기존의 보고에 비해 높은 기질 친화도와 매우 빠른 반응속도가 나타났다. Km 값은 작을수록 기질에 대한 친화도가 높다는 것을 나타내며, Vmax 값은 클수록 효소 활성이 높음을 나타내므로 본 발명에서 이용한 효소는 고온에서 높은 기질친화도와 매우 빠른 반응속도를 보였다. 또한 본 발명의 아라비노푸라노시데이즈의 Km값과 Vmax 값은 기존의 보고에 비해 매우 낮은 값과 높은 값으로 이 효소의 최적온도가 높고 효소 활성이 높다는 것을 알 수 있었다(Eom, S.-J. Cho, S-.G., and Chio, Y.-J., Purification and characterization of the α-L-arabinofuranosidase fromEscherichia colicells harboring the recombinant plasmid pKMG11.Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.23(4), 446-453(1995). Lee, S.F. and Forsberg, C.W. Purification and characterization of an α-L-arabinofuranosidase fromClostridium acetobutylicum ATCC 824. Can.J. Microbiol.33: 1011-1016(1987) Kaji, A., Sato, M., and Tsutsui. An α-L-arabinofuranosidase produced by wild-type Streptomyces sp. no. 17-1.Agric. Biol. Chem.45: 925-931.(1981) Kaji, A., and Tagawa. Purification, cystallisation and amino acid composition of α-L-arabinofuranosidase fromAspergillus niger. Biochem. Biophys. Acta207: 456-464).

생산균주	Km(mM)	Vmax(umol.min-1.mg protein-1)	비고
Bacillus stearothermophilus	3.0	319.7	Eom et al, 1995
Clostridium acetobutylicum	4.0	36.4	Lee et al, 1987
Aspergillus niger	4.9		Kaji et al. 1970
Streptomycessp. no. 17-1	3.6		Kaji et al. 1981
써머토가 마리티마	0.99	61,408	본 발명

3-2: 아라비노자일란

기질 아라비노자일란(Sigma. co.)에 대한 속도인자는 아라비노자일란을 10% 농도가 되도록 증류수를 넣어 30분 동안 끊인 후, 각각 다른 기질농도에서 기질이 유리되는 속도를 측정하였으며 상기 1)의 방법과 같은 방법을 이용하여 Km과 Vmax를 구하였다. Vmax는 23.75umol min^-1mg^-1이고, Km는 0.1036%이었다.

실시예 4: 아라비노자일란(oat spelts xylan)로부터 아라비노스 생산

실시예 1에 따른 아라비노푸라노시데이즈를 이용하여 아라비노스를 생산하기위해서 Oat spelts xylan(Sigma co.)를 기질로 하였으며, 아라비노자일란에서 유리된 아라비노스의 생산량 측정을 위해 TLC법과 DNS 방법을 사용하였으며 전당 함량은 페놀 황산법을 사용하였다.

100 ℃에서 30분간 끊인 후 수용성 상등액을 사용하고, 아라비노푸라노시데이즈 108 U(반응액의 최종 부피는 1 mL)를 50 mM 인산 완충액(pH6.0) 조건 하에서 90 ℃에서 기질과 30분간 반응시킨 후 얇은 막 크로마토그래피법(TLC법)을 수행하였으며 그 결과를 도 6에 나타냈다. TLC법은 시료액을 1uL 취하여 Merck K5 TLC 플레이트에 점적한 후 아세토니트릴/물 (85/15, v/v)에서 2번 내지 4번 전개하였고, 분리된 당의 성분은 에탄올에 0.5% α-나프톨(w/v)과 5% H₂SO₄을 함유한 시약으로 발색 후 110 ℃에서 5분간 건조하였다. 표준당의 농도는 1 mg/mL로 하였다. 도 6에 의하면 아라비노스만 유리시키는 것을 확인할 수 있었다.

DNS법은 가용화된 아라비노자일란 2.5%를 함유하는 기질에 재조합 아라비노푸라노시데이즈 96U를 첨가하여 반응시킨 것으로(90 ℃, pH6.0) 반응액의 최종 부피는 1 mL로 하였으며 DNS법으로 정량하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다. 기질에 함유된 전체 아라비노스 중 효소 반응에 의해 생산된 아라비노스의 생산비율(%)을 조사한 결과 도 7과 같은 결과를 얻었다.

실시예 5: 재조합 자일라네이즈의 생산 및 특성

5-1: 재조합 자일라네이즈의 생산

자일라네이즈도 상기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 써모토가 마리티마로부터 유전자를 증폭하여 분리한 후 제한효소(BamH1)처리하여 pRSET벡터에 삽입하고(pRBTmXy1), 형질전환하고, 효소 단백질을 생산하였다. 다만, 실시예 1과 달리 서열번호 3에 기재된 자일라네이즈의 코딩 유전자 서열와, 서열번호 7 및 8에 기재된 PCR 증폭 프라이머를 사용하였고, 자일라네이즈는 유전자를 증폭하여 분리한 후 TA 벡터(pGEM-T Easy vector, Promega)을 이용하여 클로닝 한 후 M13/F와 M13/R을 이용하여 PCR로 증폭한 후 제한효소 BamH1으로 처리한 후 pRSET 벡터에 삽입하였다.

TmXyl-N: CTTCGCGGATCCGATGCAAGTCAGGAAGAGA (서열번호 7)

TmXyl-C: GAAGCGGGATCCTCACTTGATGAGCCTGAG (서열번호 8)

상기 방법의 재조합 아라비노퓨라노시데이즈 효소 단백질 제조방법과 같은 방법으로 자일라네이즈 유전자를 써모토가 마리티마로부터 분리하여 대장균에서 발현시켜 SDS-PAGE로 확인한 결과는 도 8과 같았다.

5-2: 재조합 자일라네이즈의 특성

실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 재조합 자일라네이즈에 대해서 분자량, 작용 온도 및 작용 pH를 구하고, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다.

재조합 자일라네이즈 효소의 분자량은 SDS-PAGE 결과 약 120,000Da이었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 작용 온도는 60 ~ 120 ℃이고, 최적 온도는 pH 6.0, 10분 반응시의 재조합 자일라네이즈의 효소 활성은 최적온도가 90 ℃ 부근이었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 자일라네이즈의 작용 pH는 4 ~ 9 범위이고, 최적 pH는 90℃에서 재조합 자일라네이즈의 최적 pH는 6.0 부근이었다.

5-3: 효소 활성

자일라네이즈의 효소활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 기질의 농도가 0.5%가 되도록(Sigma. co. 아라비노자일란)한 후, 효소액 1uL을 첨가하여 90 ℃에서 10분간 반응시켰다. 반응은 DNS시약을 가하여 정지시킨 다음 증류수 0.9 mL을 가하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준품의 흡광도와 비교하여 생성된 환원당의 농도를 정량하였다. 효소 활성의 표시는 상기조건에 있어서 1분간 1umol의 자일로스에 해당하는 환원당을 유리시키는 효소량을 1 유니트로 표시하였다. 상기 재조합 자일라네이즈의 효소 활성을 DNS법으로 측정하고, 생산 결과를 TLC로 확인한 결과를 도 8에 나타냈다. 반응조건은 기질 2.5%을 포함하는 90 ℃(pH6.0)에서 효소 0.85U를 첨가하여 30분간 반응시킨 것이다. 도 8의 각 레인은 다음과 같다:

레인 1: 분자량 크기 마커,

레인 2: 자일로스,

레인 3: oat spelts xylan에 pRSET벡터만E. coli에서 발현시킨 추출물 처리,

레인 4: oat-spelts xylan(Sigma Co.),

레인 5: oat spelts xylan 기질에 재조합 자일라네이즈 (pRBTmXyl) 처리,

레인 6: birchwood xylan(Sigma. co.)

레인 7: birchwood xylan(Sigma. co.)에 재조합 자일라네이즈(pRBTmXyl)처리.

실시예 6: 쌀겨로부터 아라비노스 생산

우리나라의 주요한 농림업 부산물로부터 아라비노스를 생산하기 위해, 알칼리 추출 방법에 따라 쌀겨로부터 아라비노자일란을 추출한 후 이를 기질로 하여 아라비노스를 생산하였다. 효소 반응조건은 50mM 인산완충용액(pH 6.0)조건하에서 기질이 1% 가 되도록 하여 실시예 1에서 얻은 재조합 아라비노푸라노시데이즈를 28 U 첨가하여 전체 반응부피를 1 mL로 하였으며 실시예 5에 따른 재조합 자일라네이즈는 4 U 첨가하여 전체 반응부피를 1 mL로 하였다. 이를 90 ℃에서 6시간 반응시키고, 얼음물에 넣어 반응을 종결하였다. 그 결과는 DNS법으로 측정하였다.

재조합 아라비노푸라노시데이즈만 처리했을때는 82.4 ug/mL, 재조합 자일라네이즈만 처리했을때는 1,121ug/mL, 두 효소를 동시에 처리했을 때는 1,475ug/mL로 환원당의 생성량이 증가하였다.

본 발명에 따른 α-L-아라비노푸라노시데이즈는 아라비노자일란의 측쇄를 특이적으로 절단하므로 분해 산물에 복잡한 부산물등이 없어 분해 산물의 분리 및 정제가 쉽고, 효소활성 및 효소 반응 최적온도가 높아 아라비노스 생산속도가 높기 때문에 기존의 효소와는 달리 고수율의 아라비노스를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

Claims

써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)가 생산하며, 상기 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은 써모토가 마리티마가 생산하며, 60 ~ 120 ℃의 작용온도 및 pH 4 ~ 9범위의 작용 pH를 가지며, 아라비노자일란(arabinoxylan)을 특이적으로 분해하여 아라비노스를 생산하는 α-L-아라비노푸라노시데이즈(α-L-arabinofuranosidase) 효소.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 서모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소.
제 2 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 염기서열에 의해서 암호화되는 효소.
서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 염기서열을 가지는, 써모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소를 코딩하는 유전자.
제 4 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드인 유전자.
제 1항 내지 3항중 어느 한항에 따른 서모토가 마리티마의 α-L-아라비노푸라노시데이즈 효소를 이용하여, 아라비노스를 구성당으로 함유한 기질로부터 아라비노스를 제조하는 공정을 포함하는 아라비노스의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 아리비노푸라노시데이즈 효소는 정제된 효소 또는 효소 배양액인 아라비노스의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 제조공정에서 써모토가 마리티마의 자일라네이즈 (xylanase)를 아라비노푸라노시데이즈 처리와 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 아라비노스의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 공정의 반응온도가 75 내지 110 ℃ 범위이고, 반응 pH가 4-9 범위인 아라비노스의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 기질은 쌀겨, 밀기울, 또는 옥수수 외피인 아라비노스의 제조방법.