KR101028863B1

KR101028863B1 - 복합 효소의 동시 처리에 의한 ｌ-아라비노스의 효율적분리방법

Info

Publication number: KR101028863B1
Application number: KR1020080076541A
Authority: KR
Inventors: 김태집; 한남수; 박정미; 서원준; 신철수
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; (주)에이피테크놀로지; (주)세전
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2011-04-12
Also published as: KR20100016894A

Abstract

본 발명은 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 포함하는 기질 액에, 엑소 타입의 가수분해효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 동시에 처리하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법에 관한 것으로, 식물체에 존재하는 다양한 아라비노스 함유 중합체로부터 L-아라비노스를 선택적으로 분리할 수 있고, 특히 농업 부산물을 재활용하여 처리비용을 절감하고 환경오염을 감소시키는 효과를 발휘한다.

L-아라비노스, 아라비노퓨라노시다아제, 아라비나아제, 아라비노자일란, 아라비난

Description

복합 효소의 동시 처리에 의한 Ｌ-아라비노스의 효율적 분리방법{Method for efficient isolation of L-arabinose by simultaneous dual enzyme treatment}

본 발명은 효소 처리에 의한 L-아라비노스의 효율적인 분리방법으로, 더욱 상세하게는 복합 효소의 동시 처리 공정을 이용한 L-아라비노스의 분리방법에 관한 것이다.

L-아라비노스(L-arabinose)는 주로 자연계의 식물체에 존재하는 대표적인 5탄당으로, 옥수수, 밀, 호밀, 쌀과 같은 곡식의 헤미셀룰로스(hemicellulose), 사탕무와 사과 과육의 펙틴질, 식물 검(gum)질의 주요 구성 성분이며, 아라비노자일란(arabinoxylan), 아라비난(arabinan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan)의 형태로 존재한다(Pigman W. 1957. The Carbohydrates. Chemistry, Biochemistry, Physiology. Academic Press. New York. 79). 또한 농업부산물인 쌀겨, 밀기울, 옥수수 외피에는 헤미셀룰로스가 약 25% 정도 포함되어 있으며, 이 중 25~30% 가량이 아라비노스로 구성되어 있다(Ayano Y. 1992. J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sci. 45. 209-219).

L-아라비노스는 장에서 수크라제(sucrase)를 비경쟁적으로 저해하여, 수크로스(sucrose)의 체내 흡수를 억제하며(Seri K. et al. 1996. Metabolism 45. 1368-1374, Sanai K. et al. 1997. J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sci. 50. 133-137), 지방생성효소(lipogenic enzyme)의 활성을 억제하여 간의 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 함량을 감소시키는 등 체지방의 증가를 예방한다는 사실이 알려지면서(Osaki S. et al . 2001. J. Nutr. 131. 796-799) 비만 억제 감미료로 주목받고 있다. 특히 임상실험 결과, L-아라비노스는 당뇨병 치료제로 이용되는 아카르보스(acarbose), 미그리톨(miglitol)과 같은 α-글루코시다제(α-glucosidase) 효소의 저해제나 화학합성 인공감미료와 달리 위장장애 및 기타 부작용이 적은 것으로 보고되었다(Madar Z. 1989. J. Nutr. 119. 2023-2029).

L-아라비노스의 감미도는 수크로스의 약 50%이면서도 맛의 질이 수크로스와 유사하기 때문에 수크로스를 주원료로 하는 과자, 케익, 빵, 아이스크림 등의 식품에 폭넓게 사용될 수 있으며, 고혈당 관련 질환의 예방 및 치료제로서 뿐만 아니라 체지방 축적 억제 효과를 지닌 첨가물로도 개발되고 있다.

한편, 천연의 식물 섬유로부터 L-아라비노스를 분리하는 방법으로는 식물체로부터 헤미셀룰로스를 알칼리 또는 산 추출하여 아라비난, 아라비노자일란 등의 중합체를 획득한 후, 이를 다시 산 가수분해하여 L-아라비노스를 획득하는 화학적인 방법(Park N. H. et al . 2001. Biotechnol. Lett. 23. 411-416)이 있는데, 생성물에 대한 선택성이 낮아 추가 정제공정이 필수적이고, 폐액을 발생시키는 등 경제 적, 환경적 문제를 야기할 수 있으므로 이를 대체할 효율적인 청정기술(clean technology)가 요구되는 실정이다.

이에 본 발명은 L-아라비노스를 함유한 식물성 중합체로부터 L-아라비노스를 선택적으로 분리하면서도 L-아라비노스의 생산성을 높이기 위해 효소 분해법을 이용한 Ｌ-아라비노스 분리방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 포함하는 기질 액에, 엑소 타입의 가수분해효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 동일한 시기에 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 과제해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 포함하는 기질 액에 필수적으로 엑소 타입의 가수분해 효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 동일한 시기에 첨가하여 반응시키는데, 서로 다른 가수분해 특성을 갖는 두 효소의 동일한 시기 첨가에 의한 시너지 효과를 활용함에 본 발명의 특징이 있고, 이로 인한 L-아라비노스의 생산성 향상이 실험예 2로부터 입증되었다.

아라비노퓨라노시다아제는 L-아라비노스를 포함하는 고분자인 아라비노자일란(arabinoxylan)과 아라비난(arabinan) 등으로부터 선택적으로 L-아라비노스를 분 리시키는 엑소 타입의 가수분해 효소로, L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체의 말단으로부터 L-아라비노스를 순차적으로 가수분해하는 특징이 있다. 예를 들어, 사탕무우 아라비난(sugar beet arabinan; SA)을 기질로 아라비노스를 생산할 경우, 주로 말단의 α-1,3-결합을 분해하여 아라비노스를 유리시킬 수 있다.

그런데, 엑소 타입의 효소는 분지된 부위의 1,5-결합은 신속히 분해하지 못하기 때문에, 이 효소만을 단독 처리하여서 L-아라비노스를 높은 수율로 생산하는데에는 어려움이 있다.

이에 이와 같은 문제점을 해결하고자 본 발명은 아라비노퓨라노시다아제와 함께 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 동시에 처리한다.

아라비나아제(endo-1,5-α-L-arabinosidase)는 엔도 타입의 가수분해효소로서 아라비난 중합체를 구성하는 내부의 α-1,5-결합을 무작위적으로 가수분해한다.

따라서, 본 발명은 말단의 α-1,3-결합을 분해하여 아라비노스를 유리시킬 수 있는 AFase의 특성과 중심부 α-1,5-결합을 용이하게 가수분해할 수 있는 ABNase의 특성을 동시에 복합적으로 활용하여 시너지효과를 발휘함으로써 L-아라비노스를 단위시간당 높은 수율 및 생산성으로 분리할 수 있는 것이다.

한편, L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체는 특정의 것에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 L-아라비노스만 상호 중합된 호모 형태의 L-아라비노스 함유 고분자 또는 L-아라비노스가 다른 분자와 상호 중합된 헤테로 형태의 L-아라비노스 함유 고분자인 것이 좋은데, 이때, L-아라비노스만 상호 중합된 호모 형태의 L-아라비노스 함유 고분자는 일 예로 아라비난이 있고, L-아라비노스가 다른 분자와 상 호 중합된 헤테로 형태의 L-아라비노스 함유 고분자는, 일 예로 아라비노자일란이 있다. 아라비난은 아라비노스로만 구성된 동형중합체(homo-polymer)형태이고, 아라비노자일란은 자일란이 연결된 사슬에 아라비노스가 곁가지로 붙어 있는 이형중합체(hetero-polymer) 형태이다.

한편, L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 포함하는 기질 액에, 엑소 타입의 가수분해효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 동시처리하여 반응시키는 경우, 바람직하게 KCl을 첨가하는 것이 좋은데, L-아라비노스를 효율적으로 생산할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명에서 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 함유하는 기질 액은 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 포함하는 것이라면 특정의 것에 국한되지 않고 사용할 수 있으나, 바람직하게는 L-아라비노스가 포함된 고분자 중합체를 함유하는 식물로부터 유래한 것이 좋다. 이때 식물은 가장 바람직하게 옥수수피, 쌀겨, 사탕무우 펄프, 미강 및 사과 섬유 중 선택되는 어느 하나 이상의 것이 좋은데, 농업 부산물을 재활용하여 처리 비용을 절감하고 환경오염을 줄일 수 있기 때문이다.

L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체는 기질 중에 높은 순도로 존재하는 것이 효소 반응성 및 전체 공정의 생산성을 높일 수 있어 바람직한데, 상기 식물들로부터 L-아라비노스가 함유된 고분자 중합체를 함유하는 기질 액을 고 순도로 회수하는 방법은, 일 예로 산 처리 또는 알칼리 처리를 포함하는 방법 및 단백질분해효소 또는 펙틴분해효소를 사용하는 방법 등이 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 효소들은 특정의 미생물로부터 유래한 것으로 반드시 한정되는 것은 아니고, 정제효소를 사용하여도 무방하고, 미생물 내에서 발현시켜 사용하여도 무방하다. 다만, 경제적인 측면에서 유전자의 클로닝 및 발현을 통해 미생물로부터 생산하여 사용하는 것이 유리하다.

본 발명에서는 유전자의 클로닝 및 발현을 통한 미생물 내에서의 효소 생산의 일 예로서, 엑소 타입 AFase는 제오바실러스(Geobacillus sp.), 바실러스 하로듀란스(Bacillus halodurans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 세르모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 엔도 타입 ABNase는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 분리하였다. 분리한 AFase와 ABNase의 유전자 및 아미노산 서열로부터 높은 수준의 유사성이 확인되었으며(도 1, 2 참조), 이로부터 분리된 유전자들은 각각 유사한 특성의 효소 유전자일 것으로 추론할 수 있었다.

하기 본 발명의 실험예에서는 상기 각각의 미생물로부터 분리한 AFase와 ABNsae 유전자들을 PCR로 증폭시킨 후, 대장균용 항시 발현 벡터에 클로닝하여 발현도를 확인하였는데, AFase와 ABNase 모두 잘 발현된 것을 확인할 수 있었고(도 3 참조), 실험예 1로부터 각각 효소들의 가수분해 특성이 제대로 발휘되는 것을 확인하였다(도 4 참조).

한편, 본 발명에서 사용하는 AFase는 상기의 다양한 미생물 유래의 것 중 바람직하게 제오바실러스 (Geobacillus sp. KCTC 3012; Park J. M. et al. 2007. J. Microbiol. Biotechnol. 17. 481-489)로부터 유래한 것이 좋은데, 효소 발현량이 상대적으로 높기 때문이다. 또한, ABNase는 상기의 다양한 미생물 유래의 것 중 바람직하게 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis DSM13)으로부터 유래된 것이 좋은데, 제오바실러스(Geobacillus sp.)에서 유래한 AFase와 작용 온도 및 pH가 유사하여 단일 공정으로 동시 처리할 수 있는 장점이 있고, 효소의 활성 또한 높기 때문이다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 효소 분해법을 이용하기 때문에 산 가수분해로 수득된 L-아라비노스에 비해 생성물의 안정성 및 회수율이 높고, 엑소 타입의 가수분해효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소의 동시처리에 의해 서로 다른 가수분해 특성을 복합적으로 활용하여 L-아라비노스를 선택적으로 분리할 수 있으며, 농업 부산물을 재활용하여 환경오염을 줄일 수 있는 효과를 발휘한다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 제조예 1> L- 아라비노스 중합체를 함유하는 기질 액의 제조

사탕무우 펄프(SBP)를 20메쉬로 분쇄하고, 물에 침지한 후, 탈수처리하였다. 이어 0.5%의 사과산을 가하고 100℃, pH 3.0의 조건에서 24시간 동안 교반하여 추출한 후, 여과하였다. 여과 후, 여액을 약염기 이온교환수지에 통과시키고, pH를 5.0로 조정하여 기질 액을 최종 회수하였다.

< 실시예 1> 미생물로부터의 효소 생산

아라비노퓨라노시다아제(Arabinofuranosidase; 이하 AFase)는 제오바실러스 (Geobacillus sp.), 바실러스 하로듀란스(Bacillus halodurans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 세르모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 유전자를 분리하였고, 아라비나아제(Arabinanase; 이하 ABNase)는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) DSM13, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유전자를 분리하였다. 분리 후, 각 효소들 간의 유전자 및 아미노산 서열의 상동성을 비교하였는데(도 1, 2), AFase와 ABNase 모두 각 효소들 간 매우 높은 유전자 및 아미노산 서열의 유사성을 보였고, 이로부터 상호 유사한 효소 특성을 나타내는 것으로 판단할 수 있었다.

각 효소의 유전자들의 클로닝을 위하여 미생물 유전체 데이터 베이스 검색을 통해 PCR 프라이머(primer)를 고안하였는데, 사용한 각 효소 유전자의 프라이머는 표 1과 같았다.

효소	소스	유전자클로닝에 사용한 PCR 프라이머들
GAF	제오바실러스 KCTC 3012 (Geobacillus sp.)	5’-TCATATGAACACGAAAAAAGCTAAAA-3’ 5’-TCTCGAGTTTCTTAGCCAAACGAATCAC-3’
BHAF	바실러스 하로듀란스 (Bacillus halodurans)	5’-TGAATTCACACTTACAGCAACAATGG-3’ 5’-TCTGCAGTTTTTTCCCTAGCCGAAT-3’
BSAF	바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)	5’-TGAATTCGAAAAAGCGCGAATGATTG-3’ 5’-TTTTCTCGAGTGACTGTTTTTTCAGGCGGATC-3’
TAF	세르모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)	5’-AGCTCGAGACATATGTCCTACAGG-3’ 5’-GGGGAAAGATCTTTACTCCAATTCTAC-3
BLABN	바실러스 리체니포르미스 DSM13 (Bacillus licheniformis)	5’-TTTTGGATCCCATATGTTAAAGACATCGAAATTT-3’ 5’-TTTTCTCGAGATACTTCGGCCAGCCTTTA-3’
BSABN	바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)	5’-TTTTGGATCCCATATGAAAAAGAAAAAAACATGG-3’ 5’-TTTTCTCGAGATAGGACGGCCAGCCCGAG-3’

각 효소들의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한 후, 증폭된 유전자를 대장균용 항시 발현벡터로 상용 벡터인 pHCEIIB-NdeI (BioLeaders Co., Korea)를 모벡터로 하여 본 발명자가 제작한 pHCXHD에 클로닝하였다.

각 효소유전자들의 대장균 내 발현도를 확인하기 위해 엠피실린(ampicillin) 함유 배지에서 12~14시간 배양한 후, 세포를 파쇄하고 SDS-PAGE 분석을 수행하였으며(도 3), 발현된 효소 단백질은 Ni-NTA 컬럼 클로마토그래피(Ni-NTA column chromatography) 방법으로 간단히 정제할 수 있었다.

정제된 효소의 최적 온도 및 pH를 확인하기 위하여 실험을 수행하였는데, AFase 효소 중에서는 발현량과 활성이 높은 GAF, BHAF, TAF에 대해, ABNase 효소 중에서는 높은 효소활성을 보인 BLABN에 대해 최적 온도 및 pH를 측정하였다(표 2).

	TAF	BHAF	GAF	BLABN
반응용 완충액(Reaction buffer)	50mM sodium acetate	50mM sodium acetate	50mM sodium acetate	50mM sodium acetate
최적온도 (Optimal temp)	80℃	30~35℃	60℃	55℃
최적pH (Optimal pH)	4.5	6.0	5.0	6.0

효소들의 최적 온도 및 pH를 측정한 결과, AFase인 GAF와 ABNase인 BLABN의 최적 온도가 유사한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 하기 실시예 2에서는 GAF와 BLABN을 제조예 1에서 제조한 기질 액에 처리하여 효소 반응을 수행하였다.

<실험예 1> 효소의 가수분해 특성 분석

본 실험예 1에서는 상기 실시예 1에서 효소 생산을 통해 수득한 AFase와 ABNase의 가수분해 특성을 확인하기 위하여 Megazyme사에서 구입한 아라비난(sugar beet arabinan; SA)에 각각 GAF와 BLABN을 처리한 후, 그 반응물을 HPAEC(High Performance Anion Exchange Chromatography)와 TLC(Thin Layer Chromatography)로 분석하였다.

아라비난에 대한 작용특성을 분석한 결과(도 4), 엑소 타입 효소인 GAF의 경우는 각각의 아라비난 기질을 말단부터 분해하여 아라비노스만을 생산하는데 반하여, 엔도 타입 효소인 BLABN의 경우는 중합체 내부의 결합을 절단하여 아라비노스 외에도 아라비노바이오스(arabinobiose), 아라비노트리오스(arabinotriose) 등 다양한 중합도를 가지는 중간물질을 생산하였다.

상기의 결과로부터 실시예 1로부터 수득한 효소들이 예상대로 작용한다는 사실을 확인할 수 있었고, 이들 효소의 각기 다른 가수분해 특성을 적절히 활용한다면 Ｌ-아라비노스의 효율적인 분리가 가능할 것으로 추론할 수 있었다.

<실시예 2> GAF와 BLABN을 동시 처리하여 아라비노스 분리

제조예 1에서 제조한 1% 기질 액 1 ml에 실시예 1에서 제조된 GAF와 BLABN를 각각 0.13 unit 만큼(두 효소의 활성도 총합은 0.26 unit) 동시에 처리하여 55℃에서 360분 이상 충분히 반응시킨 후, L-아라비노스를 분리하였다.

<비교예 1> GAF만을 처리하여 아라비노스 분리

제조예 1에서 제조한 1% 기질 액 1 ml에 GAF만을 0.26 unit 처리하고 55℃에서 360분 이상 충분히 반응시킨 후, L-아라비노스를 분리하였다.

<비교예 2> BLABN만을 처리하여 아라비노스 분리

제조예 1에서 제조한 1% 기질 액 1 ml에 BLABN만을 0.26 unit 만큼 처리하여 55℃에서 360분 이상 충분히 반응시킨 후, L-아라비노스를 분리하였다.

<비교예 3> GAF 처리 후, BLABN을 순차적으로 처리하여 아라비노스 분리

제조예 1에서 제조한 1% 기질 액 1 ml에 GAF효소를 0.26 unit 만큼 처리하고 180분 후에 열을 가하여 불활성화시킨 다음, 다시 BLABN 0.26 unit를 처리하여 55 ℃에서 180분 이상 충분히 반응시킨 후, L-아라비노스를 분리하였다.

<비교예 4> BLABN 처리 후, GAF를 순차적으로 처리하여 아라비노스 분리

제조예 1에서 제조한 1% 기질액 1 ml에 BLABN효소 0.26 unit를 처리하고 180분 후에 열을 가하여 불활성화시킨 다음, 다시 GAF효소 0.26 unit를 처리하여 55℃에서 180분이상 충분히 반응시킨 후, L-아라비노스를 분리하였다.

< 실험예 2> 상기 실시예 2와 비교예 1, 2, 3, 4에서 분리된 아라비노스의 양 측정

상기 실시예 2와 비교예 1, 2, 3, 4에서 분리된 아라비노스의 양을 측정하였는데, 그 결과는 도 5와 같았다. 세로축은 환원당 정량을 통해 각각의 상대적인 기질 분해도(Relative hydrolysis; %)를 나타낸 것이다.

분리된 아라비노스의 양을 측정한 결과, GAF와 BLABN를 동시에 처리한 실시예 2의 아라비노스 생산성에 비해 GAF만을 처리한 비교예 1과 BLABN만을 처리한 비교예 2의 생산성은 낮았는데, 특히 비교예 2에서는 분리된 아라비노스가 거의 확인되지 않아 실험 결과 중 가장 낮은 생산성을 나타냈다.

그리고 기질 액에 GAF을 우선 처리한 후, 순차적으로 BLABN을 처리한 비교예 3과 반대로 BLABN을 먼저 처리한 후, GAF를 처리한 비교예 4는 한가지 효소만 처리한 비교예 1 및 비교예 2 보다는 분리된 아라비노스의 양이 높았으나, 실시예 2보다는 낮은 것을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합하여 기질 액에 함유된 총 아라비노스 함량을 기준으로 하여 분리된 아라비노스의 양을 비교하였다(도 6).

결과적으로, 기질 액에 함유된 아라비노스 총량을 100%로 보았을 때, 실시예 2의 경우 92% 이상의 높은 아라비노스 분리율을 나타냈다. 이는 엑소 및 엔도 타입의 두 가지 효소를 동시에 처리할 경우, 대부분의 아라비난 중합체가 아라비노스로 전환될 수 있음을 의미하는 것이다.

이상과 같은 결과로부터 기질 액에 엑소 타입 가수분해 효소인 아라비노퓨라노시다아제와 엔도 타입 가수분해 효소인 아라비나아제의 처리에 있어서 각 효소의 단독처리나 두 효소의 단계적 처리에 비해 동시 처리의 경우에 아라비노스의 분리율을 극대화할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었고, 두 효소의 서로 다른 가수분해 특성을 활용하여 더욱 효율적이고 경제적으로 L-아라비노스를 분리할 수 있다는 점을 입증할 수 있었다.

또한, 본 발명의 복합효소 동시처리반응을 이용한 L-아라비노스 분리방법이 다른 효소반응에 비해 상대적으로 생산성이 높음을 확인할 수도 있었다.

< 실험예 3> KCl 첨가에 의한 효소반응 속도의 변화 조사

본 실험예 3에서는 기질 액에 KCl을 첨가할 경우의 효소반응 속도에 변화가 생기는지를 조사하였는데, 실험예 2에서 실시한 각 효소반응에 대해 1M 농도의 KCl을 첨가한 다음, 최종 아라비노스 생성량을 비교하여 그 효율을 확인하였다.

그 결과, 제조예 1에서 제조된 1% 아라비난 기질 액 1 ml 에 KCl 1M을 첨가한 후 GAF 0.13 unit 과 BLABN 0.13 unit를 동시에 처리한 실험구의 경우, 약 96%의 아라비노스 생성률을 나타내어 가장 효율적이었으며, BLABN 단독처리구를 제외한 나머지 실험구에서도 각각 14~33%의 생산성 향상을 확인할 수 있었다(도 6).

상기의 결과로부터 본 발명은 기질 액에 KCl을 첨가할 경우, 엑소 타입인 GAF 효소의 가수분해활성이 증가되어 전체적인 효소의 반응속도와 기질 분해도가 비약적으로 향상됨을 알 수 있었으며, 이를 활용하면 기존 효소공정을 개선하여 더욱 효율적인 아라비노스 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 요약하면, 본 발명의 엔도 및 엑소 타입 효소의 동시처리반응에 의한 아라비노스 생산기술은 기존의 엔도 및 엑소 타입 효소의 단독 처리방법에 비해 그 생산효율이 월등할 뿐 아니라, 두 가지 효소의 단계적 처리방법과 비교하여도 그 효율이 높음을 확인하였다.

따라서 최적 반응조건이 유사한 다양한 효소를 동시에 복합사용할 경우, 그 시너지효과를 극대화할 수 있을 것이다.

또한, KCl의 첨가에 의한 효소의 반응성 증대를 통해 이러한 복합효소의 동시처리반응 속도가 급격히 향상되어 보다 효율적이고 경제적인 아라비노스 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.

도 1은 제오바실러스(Geobacillus sp.), 바실러스 하로듀란스(Bacillus halodurans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 세르모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)로 부터 분리한 아라비노퓨라노시다아제(GAF, BHAF, BSAF, TAF)의 아미노산 서열 상동성을 비교한 도이다.

도 2는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 세르모디니트리피칸스(Bacillus thermo- denitrificans; Makoto T. et al. 2002. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66. 430-433)로 부터 유래한 아라비나아제(BSABN, BLABN, BTABN)의 아미노산 서열 상동성을 비교한 도이다.

도 3은 클로닝한 각 효소 유전자들(TAF, GAF, BHAF, BSAF, BLABN)의 대장균 내 발현도 및 정제도를 SDS-PAGE로 분석한 도이다(M: 표준 단백질, CE: 세포추출물, E: 정제된 효소).

도 4는 효소공정을 통해 수득한 엑소 타입 AFase와 엔도 타입 ABNase의 특성이 제대로 작용하는지 확인하기 위하여 아라비난에 GAF (A)와 BLABN (B)을 각각 처리하여 HPAEC 및 TLC로 분석한 도이다.

도 5는 아라비난 기질에 대한 GAF와 BLABN의 동시 처리구(실시예 2), GAF 단일 처리구(비교예 1), BLABN 단일 처리구(비교예 2), GAF와 BLABN의 순차적 처리구(비교예 3), BLABN과 GAF의 순차적 처리구(비교예 4) 각각의 상대적인 기질 분해도(Relative hydrolysis; %)를 환원당 정량을 통해 비교한 도이다.

도 6은 기질 액에 함유된 아라비노스의 양을 100%로 하여 각 처리구에서 생성된 아라비노스 함량을 HPLC로 정량한 결과를 비교한 도이며, 도 5에서 비교한 각 처리구 간의 아라비노스의 분리율 및 1M KCl을 첨가한 경우 각 처리구의 아라비노스의 분리율 변화를 상호 비교한 도이다.

Claims

아라비난을 포함하는 기질 액에 엑소 타입의 가수분해효소인 아라비노퓨라노시다아제 및 엔도 타입의 가수분해 효소인 아라비나아제 효소를 첨가하되,

상기 두 효소를 동일한 시기에 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법
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제1항에 있어서,

상기 반응시,

KCl을 첨가하는 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법
제1항에 있어서,

아라비난은,

아라비난을 함유하는 식물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법
제6항에 있어서,

상기 식물은,

옥수수피, 쌀겨, 사탕무우 펄프, 미강 및 사과 섬유 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법
제1항에 있어서,

아라비노퓨라노시다아제는,

제오바실러스(Geobacillus sp.) KCTC 3012 유래이고,

아라비나아제 효소는,

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) DSM13 유래인 것을 특징으로 하는 효소 분해법에 의한 L-아라비노스의 분리 방법