CN1768136B - 琼脂分解酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有如下性质的琼脂分解酶。(1)作用：水解琼脂糖的β-1，4键，生成新琼脂寡聚糖。(2)底物特异性：至少作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互形成的β-1，4键和α-1，3键骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖。(3)温度的影响：于大于或等于54℃温度进行30分钟的热处理后活性仍残留。与以往的琼脂分解酶相比，此酶在高温下仍有活性，因此能够提高分解琼脂的速度，利于在工业上应用。

Description

琼脂分解酶及其应用
技术领域
本发明涉及琼脂分解酶及其应用，更具体地说，本发明涉及比以往的琼脂分解酶活性更高、耐热性更强的新型琼脂分解酶及其应用。
背景技术
琼脂是从石花菜、发菜等红藻类中得到的多糖类物质，其主要成分是琼脂糖。另外琼脂中还存在少量被总称为琼脂胶的多糖，琼脂胶是琼脂糖与硫酸、硫酸丙酮酸等成酯而形成的。
用琼脂分解酶β-琼脂糖酶水解琼脂糖可以得到新琼脂寡聚糖(ネオアガロオリゴ糖)，此物质以其防止淀粉老化作用强、经加热处理会产生抑菌作用、热量低等方面的特点在食品领域作为高性能食品的原料非常有用(例如，参照河野敏明，《琼脂寡聚糖(新琼脂寡聚糖)》，食品包装，(1990)，22(1)：100-105)。而且，用β-琼脂糖酶水解海藻成分得到的寡聚糖中具有的免疫功能活性(例如，参照Yoshizawa Y.，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，(1995)，59(10)：1933-1937.)、美白和保湿皮肤的效果(例如，参照Kobayashi R.，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，(1997)，61(1)：162-163.)已得到确认。
另一方面，作为未开发的海洋生物资源的新型有效应用，人们期待使用琼脂分解酶分解海藻类的坚固的细胞组织以提取具有生理活性的物质，或是利用使用该酶制得的原生质体(例如，参照Araki T.，et al.，J.Mar.Biotechnol.，(1998)，6(3)：193-197.)来开发海藻的有用品种。
然而，由于以往大家知道的琼脂分解酶(例如，参照特开平6-284888号公报)生产率低且价格高，因而存在难以应用于工业的问题，并且其酶活性及耐热性不充分，不能广泛应用于产业界。
因此，本发明的课题在于提供一种琼脂分解酶，其比以往的琼脂分解酶具有更出色的分解琼脂能力及耐热性，并且能够大量生产；还提供能够利用基因工程技术制造该酶的基因。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述课题，专心研究了自然界中产生琼脂分解酶的微生物，结果发现，从海底的土壤中分离的新型微球茎菌属(Microbulbifer)微生物具有极高的分解琼脂能力，并能产生耐热性等也很出色的琼脂分解酶。并且，克隆了该微生物的琼脂分解酶基因，发现了利用该基因通过基因重组技术能够大量生产琼脂分解酶，从而完成了本发明。
即，本发明的第一目的在于提供具有如下性质的琼脂分解酶。
(1)作用：水解琼脂糖的β-1，4键，生成新琼脂寡聚糖(ネオアガロオリゴ糖)；
(2)底物特异性：至少作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有上述骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖；
(3)温度的影响：于大于或等于54℃的温度进行30分钟的热处理后活性仍残留。
本发明的第二目的在于提供来源于微球茎菌属的微生物的所述琼脂分解酶。
本发明的第三目的在于提供所述琼脂分解酶，其中，微球茎菌属微生物是保藏号为FERM BP-8320的微球茎菌属sp.1325-A7，所述琼脂分解酶于大于或等于54℃的温度进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的25％或其以上。
本发明的第四目的在于提供所述琼脂分解酶，其中，微球茎菌属微生物是保藏号为FERM BP-8319的微球茎菌属sp.1325-A3，所述琼脂分解酶于大于或等于60℃的温度进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的20％以上。
本发明的第五目的在于提供所述琼脂分解酶，其中，微球茎菌属微生物是保藏号为FERM BP-8321的微球茎菌属sp.A94，所述琼脂分解酶于大于或等于60℃的温度进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的7％以上。
并且，本发明的其他目的在于提供上述琼脂分解酶。该分解酶具有下述氨基酸序列：序列号1、5或9所表示的氨基酸序列、或上述氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入而形成的序列。
还有，本发明的其他目的在于提供一种多核苷酸、具有该多核苷酸的重组载体及用该重组载体进行了转化的微生物。该多核苷酸编码下述氨基酸序列：序列号码1、5或9所表示的氨基酸序列、或上述氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入而形成的序列。
另外，本发明的其他目的还在于：提供琼脂分解酶的制造方法，其特征是培养所述经转化了的微生物并从培养物中提取琼脂分解酶；提供新琼脂寡聚糖或原生质体的制造方法，其中，通过使前述琼脂分解酶作用于藻类而得到新琼脂寡聚糖；提供回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，其特征是使所述琼脂分解酶作用于加了DNA的琼脂糖凝胶，从而回收琼脂糖凝胶中的DNA。
附图说明
图1示意表示微球茎菌属sp.1325-A7的分类学位置。
图2示意表示微球茎菌属sp.1325-A3的分类学位置。
图3示意表示微球茎菌属sp.A94的分类学位置。
图4示意表示RagaA7水解生成物的薄层色谱分析结果(P是用来源于P.atlantica的酶所制备的新琼脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新琼脂四聚糖(Neoagarotetraose)，NA6表示新琼脂六聚糖(Neoagarohexaose))。
图5示意表示RagaA7的酶活性与pH的关系。
图6示意表示于40℃保温30分钟后RagaA7的酶活性与pH的关系。
图7示意表示RagaA7的酶活性与温度的关系。
图8示意表示RagaA7及PSA的温度稳定性(●为RagaA7，○为PSA)。
图9示意表示RagaA7及PSA对SDS的稳定性(●为RagaA7，○为PSA)。
图10示意表示RagaA3水解生成物的薄层色谱分析结果(P是用来源于P.atlantica的酶所制备的新琼脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新琼脂四聚糖，NA6表示新琼脂六聚糖).
图11示意表示RagaA3的酶活性与pH的关系。
图12示意表示于40℃保温30分钟后RagaA3的酶活性与pH的关系。
图13示意表示RagaA3的酶活性与温度的关系。
图14示意表示RagaA3及PSA的温度稳定性(●为RagaA3，○为PSA)。
图15示意表示RagaA3及PSA对SDS的稳定性(●为RagaA3，○为PSA)。
图16示意表示RagaB水解生成物的薄层色谱分析结果(P是用来源于P.atlantica的酶调制的新琼脂寡聚糖的泳道，G是D-半乳糖的泳道，NA4表示新琼脂四聚糖，NA6表示新琼脂六聚糖)。
图17示意表示RagaB的酶活性与pH的关系。
图18示意表示于40℃保温30分钟后RagaB的酶活性与pH的关系。
图19示意表示RagaB的酶活性与温度的关系。
图20示意表示RagaB及PSA的温度稳定性(●为RagaB，○为PSA)。
图21示意表示RagaB及PSA对SDS的稳定性(●为RagaB，○为PSA)。
另外，表1、表2、及表3中所翻译的各细菌种属名对应的拉丁名如下：
盐水沼栖微球茎菌：Microbulbifer salipaludis
伸长假单孢菌：Pseudomonas elongata
水解微球茎菌：Microbulbifer hydrolyticus
微球茎菌属sp.2-40：Microbulbifer sp.2-40
绿脓杆菌：Pseudomonas aeruginosa
大肠杆菌：E.coli
具体实施方式
与以往的琼脂分解酶相比，本发明的琼脂分解酶(下文称为“本发明酶”)的琼脂分解能力及耐热性显著提高，优选来源于微球茎菌属微生物的琼脂分解酶。另外，所谓“来源于微球茎菌属微生物”仅是指本发明酶的存在首先在微球茎菌属微生物中被发现，利用编码从微球茎菌属微生物提取到的本发明酶的多核苷酸在其他微生物中产生的本发明酶、或是从属于其他属的微生物中得到的具有同样性质的琼脂分解酶也属于本发明的酶。
作为本发明酶的代表例，可以例举为微球茎菌属sp.1325-A7所产生的琼脂分解酶(被命名为RagaA7)；微球茎菌属sp.1325-A3所产生的琼脂分解酶(被命名为RagaA3)；以及微球茎菌属sp.A94所产生的琼脂分解酶(被命名为RagaB)。下面依次对此进行说明。
(A1)RagaA7的特性
(1)作用：水解琼脂糖的β-1，4键，生成新琼脂寡聚糖；
(2)底物特异性：至少作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类以及具有同样骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖；
(3)温度的影响：作用温度为15℃～70℃，最佳作用温度为45℃～55℃.于54℃进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的35％或35％以上，优选40％或40％以上；70℃时为25％或25％以上，优选35％或35％以上；80℃时也为25％或25％以上，优选35％或35％以上.
(4)表面活性剂的影响：不被1％的多聚仙梨醇P40(Nonidet P40)、粹通X-100(Triton X 100)、吐温20(Tween 20)及十二烷基磺酸钠(SDS)抑制。
(5)对SDS的稳定性：于40℃、1.5％的SDS中处理1小时后保持与未处理时同样的活性。
(6)比活性：大于等于100U/mg，优选大于等于200U/mg。
(7)pH稳定性及作用最佳pH：在pH4～10的范围中稳定。作用pH范围为3～10，最佳pH为5～7.5。
(8)分子量：30～49kDa(以SDS-PAGE测定)。
(9)金属盐等的影响：受Hg2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。在1M的NaCl中保持约80％的活性。于40℃在100mM的EDTA中处理1小时后保持约60％的活性。
(10)等电点：3.5～4.5
(11)对化学试剂的耐性：受0.1mM的N-溴代丁二酰亚胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及对(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、10mM的二硫苏糖醇及2-巯基乙醇的抑制。
产生所述RagaA7的微球茎菌属sp.1325-A7，具有以下的细菌学性质。
(A2)微球茎菌属sp.1325-A7的细菌学性质：
<形态>
在Marine broth 2216培养液(Difco公司制造)中生长的细胞的形态。
细胞的形态：杆菌
细胞的大小：0.5μm～0.8μm×1.5μm～5.0μm
运动性：有
鞭毛：有
革兰氏染色性：阴性
胞子形成：无
<生长状态>
在液体培养液中的生长状态。
最适温度：于10℃～43℃生长良好
食盐浓度：于0.5％～10％生长良好
<生理学性质>
O-F测试：F
过氧化氢酶测试：阳性
氧化酶测试：阳性
凝胶分解性能：有
淀粉分解性能：有
0NPG测试：阴性
尿素酶产生：无
硫化氢产生：无
吲哚产生：无
硝酸还原性能：无
利用特性(L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)：有
(B1)RagaA3的特性
(1)作用：水解琼脂糖的β-1，4键，生成新琼脂寡聚糖；
(2)底物特异性：至少作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖；
(3)温度的影响：作用温度为5℃～70℃，最佳作用温度为50℃～60℃。于60℃进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的40％或40％以上，优选50％或50％以上；80℃时为20％或20％以上，优选30％或30％以上。
(4)表面活性剂的影响：不被1％的Nonidet P40、Triton X100、Tween20及SDS抑制。
(5)对SDS的稳定性：于40℃、至少1％的SDS中处理1小时后，保持未处理时40％的活性。
(6)比活性：大于等于300U/mg，优选大于等于350U/mg。
(7)pH稳定性及作用最佳pH：在pH5～10的范围中稳定。作用pH范围为3.5～9.5，最佳pH为6.5～7.5。
(8)分子量：30～66kDa(以SDS-PAGE测定)。
(9)金属盐等的影响：受Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制。略受Fe2+的抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。
在1M的NaCl中保持约90％的活性。
于40℃、100mM的EDTA中处理1小时后保持约80％的活性。
(10)等电点：3.5～4.5
(11)对化学试剂的耐性：受0.1mM的N-溴代丁二酰亚胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及对(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、10mM的二硫苏糖醇及2-巯基乙醇的抑制。
产生所述RagaA3的微球茎菌属sp.1325-A3，具有以下的细菌学性质。
(B2)微球茎菌属sp.1325-A3的细菌学性质：
<形态>
在Marine broth 2216培养液(Difco公司制造)中生长的细胞的形态。
细胞的形态：杆菌
细胞的大小：0.4μm～0.6μm×4.0μm～8.0μm
运动性：无
鞭毛：无
革兰氏染色性：阴性
胞子形成：无
<生长状态>
在液体培养液中的生长状态。
最适温度：于15℃～35℃生长良好
食盐浓度：于1％～5％生长良好
<生理学性质>
O-F测试：F
过氧化氢酶测试：阳性
氧化酶测试：阳性
凝胶分解性能：有
淀粉分解性能：有
ONPG测试：阳性
尿素酶产生：无
硫化氢产生：无
吲哚产生：无
硝酸还原性能：有
利用特性(L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)：有
(C1)RagaB的特性
(1)作用：水解琼脂糖的β-1，4键，生成新琼脂寡聚糖；
(2)底物特异性：至少作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖；
(3)温度的影响：作用温度为10℃～70℃，最佳作用温度为50℃～60℃。于60℃进行30分钟的热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的25％或25％以上，优选30％或30％以上；80℃时为7％或7％以上，优选10％或10％以上。
(4)表面活性剂的影响：不被1％的Nonidet P40、Triton X 100、Tween20及SDS抑制。
(5)对SDS的稳定性：于40℃、2.0％的SDS中处理1小时后保持与未处理时同样的活性。于40℃、0.4％的SDS中处理1小时后，具有未处理时2倍的活性。
(6)比活性：大于等于400U/mg，优选大于等于450U/mg。
(7)pH稳定性及作用最佳pH：在pH8～9的范围中稳定。在pH4～10的范围中残留约50％的活性。作用最佳pH为6.5～7.5。
(8)分子量：30～49kDa(以SDS-PAGE测定)。
(9)金属盐等的影响：受Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制。略受Fe2+的抑制。不受Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制。在1M的NaCl中保持约90％的活性。于40℃、100mM的EDTA中处理1小时后约保持74％的活性。
(10)等电点：3.7～5.2
(11)对化学试剂的耐性：受0.1mM的N-溴代丁二酰亚胺抑制。不受0.5mM的碘代乙酰胺及对(氯汞)苯甲酸、1mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、10mM的二硫苏糖醇及2-巯基乙醇的抑制。
产生所述RagaB的微球茎菌属sp.A94，具有以下的细菌学性质。
(C2)微球茎菌属sp.A94的细菌学性质：
<形态>
在Marine broth 2216培养液(Difco公司制造)中生长的细胞的形态。
细胞的形态：杆菌
细胞的大小：0.6μm～0.8μm×3.0μm～6.0μm
运动性：有
鞭毛：有
革兰氏染色性：阴性
胞子形成：无
<生长状态>
在液体培养液中的生长状态。
最适温度：于20℃～52℃生长良好
食盐浓度：于1％～5％生长良好
<生理学性质>
O-F测试：F
过氧化氢酶测试：阳性
氧化酶测试：阳性
凝胶分解性能：有
淀粉分解性能：有
ONPG测试：阴性
尿素酶产生：无
硫化氢产生：无
吲哚产生：无
硝酸还原性能：有
利用特性(L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖)：有
含有所述微生物的产生本发明酶的微生物能够以如下方法得到，当然并不仅限于如下方法。首先，在含有琼脂或琼脂糖的平板培养基上培养提取到的微生物群，挑选具有分解琼脂能力的微生物。此培养基既可以是在含有琼脂的培养基里适量含有氮源、无机化合物等营养成分的培养基，也可以使用天然培养基或合成培养基的任意一种。
所述微球茎菌属sp.1325-A7、微球茎菌属sp.1325-A3及微球茎菌属sp.A94的每一种都是发明人从相模湾、骏河湾的海底的淤泥中得到的微球茎菌属微生物。
然后，用CLUSTAL×多重序列排列程序(Multiple SequenceAlignment Program，version 1.81)测定各微球茎菌属菌株的16S rDNA序列，解析分类学的位置。基于邻位相连法(neighbor-joining method)于图1、图2及图3表示记载了解析结果的系统树。从其结果中发现，微球茎菌属sp.1325-A7、微球茎菌属sp.1325-A3及微球茎菌属sp.A94是微球茎菌属的新型种。
另外，由于微球茎菌属sp.1325-A7及微球茎菌属sp.A94具有运动性，它们也可能属于微球茎菌属以外的新型属，但为了方便将其归为关系最近的微球茎菌属的新型种。
于是，本申请人将其分别命名为1325-A7、1325-A3及A94，并于2003年3月6日将其保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际保藏(保藏号为FERM BP-8319～8321)。
从包含所述微球茎菌属sp.1325-A7、1325-A3及A94的产生本发明酶的微生物中提取本发明酶时，例如可以按常规方法培养该微生物，然后从培养物中回收本发明酶。
为了得到本发明酶，可以使用如下的方法培养微生物，当然并不仅限于如下方法。将菌株接种至培养基，然后可以按照常规方法进行培养。用于培养的培养基最好含有琼脂或琼脂糖、琼脂分解物等作为碳源。另外，培养基中也可以适量含有本菌株能够利用的碳源及氮源。琼脂和琼脂糖可以单独或混合使用市面上出售的商品、或是加工精制之前的红藻类。对于其他的碳源及氮源没有特殊限制，作为氮源可以例举为牛肉浸膏、酵母浸膏、酪蛋白分解物、胰蛋白胨、蛋白胨等，优选使用酵母浸膏和蛋白胨。这些氮源也可以用作琼脂、琼脂糖以外的碳源。并且，作为盐类可以组合使用氯化钠、枸橼酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢钠等。还可以向含有琼脂、琼脂糖以外的所述成分的Marine broth 2216(Difco公司制造)中添加含有琼脂或琼脂糖的物质来使用。并且，还可以使用含有适量所述盐类的人工海水，在其中添加有蛋白胨、酵母浸膏、琼脂或琼脂糖等物质，将其用作培养基。优选琼脂或琼脂糖的浓度为0.1％～1.5％，此时通过任意改变琼脂或琼脂糖的浓度可以分别制作固体培养基和液体培养基；以生产酶为目的时，优选浓度为0.1％～0.4％的液体培养基；以保存菌株为目的时，优选浓度为1.2％～1.5％的固体培养基。培养条件根据培养基的构成稍有不同，培养温度为10℃～43℃，优选25℃～39℃；培养时间为15小时～48小时，优选18小时～24小时。
可以按照一般提取酶的方式从如此得到的培养物中回收目的物质琼脂分解酶。回收方法不仅限于如下方法，可以例举为，用超声波破碎法、法式压滤(French press)法、玻璃珠破碎法、ダイノミル破碎法等菌体破碎法得到菌体破碎物，通过离心过滤该菌体破碎物或培养物等的操作，将分离得到的培养液上清液用作粗酶液。
该粗酶液，既可以直接使用，也可以根据需要，结合使用盐析法、沉淀法、超滤法等分离手段以及离子交换色谱法、等电点色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤色谱法、吸附色谱法、亲和性色谱法、逆相色谱法等众所周知的方法，进一步分离精制后的酶液进行使用。
另外，作为得到本发明酶的其他方法，还可以例举为，从微球茎菌属sp.1325-A7、微球茎菌属sp.1325-A3、微球茎菌属sp.A94等产生本发明酶的微生物中提取编码本发明酶的基因后，用基因工程技术制作重组微生物，然后培养该重组微生物。具体地说就是，从所述菌株中提取编码本发明酶氨基酸序列的核苷酸序列，之后将此核苷酸序列导入合适的载体，然后用此载体对大肠杆菌等宿主进行转化，培养此细胞以生产本发明酶，再从培养物中提取本发明酶。
下面对使用基因工程技术制造本发明酶的方法进行具体说明。
在本发明酶中，RagaA7为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列表中序列号1所表示的氨基酸序列、或所述序列号1所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列、或与所述序列号1所表示的序列具有56％或其以上同源性的氨基酸序列。优选RagaA7为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列号1所表示的氨基酸序列、或所述序列号1所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的序列。
因此，应用基因工程技术制造与RagaA7相对应的本发明酶时，需要使用与其对应的核苷酸序列。另外，可以例举所述同源性大于等于56％，优选大于等于80％，更优选大于等于95％。
编码RagaA7的氨基酸序列的核苷酸序列具体可以例举为从如下(a1)～(d1)中选出的多核苷酸。
(a1)编码具有如序列表的序列号1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b1)编码具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为序列表的序列号1所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列；
(c1)具有如序列表的序列号2所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(d1)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列为序列表的序列号2所示的核苷酸序列中有1个或多个碱基缺失、置换、增加或插入的核苷酸序列。
同样的，在本发明酶中，RagaA3为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列号5所表示的氨基酸序列、或所述序列号5所表示的该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列、或与所述序列号1所表示的序列具有56％或其以上同源性的氨基酸序列。优选RagaA3为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列号5所表示的氨基酸序列、或所述序列号5所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的序列。
因此，应用基因工程技术制造与RagaA3相对应的本发明酶时，需要使用与其对应的核苷酸序列。另外，可以例举所述同源性大于等于56％，优选大于等于80％，更优选大于等于95％。
编码RagaA3的氨基酸序列的核苷酸序列可以具体例举为从如下(a2)～(d2)中选出的多核苷酸。
(a2)编码具有如序列表的序列号5所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b2)编码具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为序列表的序列号5所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列；
(c2)具有如序列表的序列号6所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(d2)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列为序列表的序列号6所示的核苷酸序列中有1个或多个碱基缺失、置换、增加或插入的核苷酸序列。
并且，在本发明酶中，RagaB为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列表中序列号9所表示的氨基酸序列、或所述序列号9所表示的该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列、或与所述序列号9所表示序列具有63％或其以上同源性的氨基酸序列。优选RagaB为具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为以序列号9所表示的氨基酸序列、或所述序列号9所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的序列。
因此，应用基因工程技术制造与RagaA3相对应的本发明酶时，需要使用与其对应的核苷酸序列。另外，可以例举所述同源性大于等于63％，优选大于等于80％，更优选大于等于95％。
编码RagaB的氨基酸序列的核苷酸序列可以具体例举为从如下(a3)～(d3)中选出的多核苷酸。
(a3)编码具有如序列表的序列号9所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b3)编码具有下述氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为序列表的序列号9所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、置换、增加或插入的氨基酸序列；
(c3)具有如序列表的序列号10所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(d3)具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列为序列表的序列号10所示的核苷酸序列中有1个或多个碱基缺失、置换、增加或插入的核苷酸序列。
生产本发明酶的重组微生物可以结合多种公认的方式进行制造。即，可利用该领域既成的方法，从所述微球茎菌属sp.1325-A7、微球茎菌属sp.1325-A3、微球茎菌属sp.A94中提取编码本发明酶的核苷酸序列，并扩增该核苷酸序列，然后将核苷酸序列导入载体，再以此基因对宿主进行转化。
其中，制造重组微生物可以使用例如如下所示的方法，当然并不只限于此方法。用鸟枪克隆法、或是使用特定的引物进行PCR扩增，从产生琼脂分解酶的细菌中得到琼脂分解酶基因。将此基因导入以EK系的E.coli(大肠杆菌)等为代表的革兰氏阴性菌或以BS系的B.subtilis(枯草芽孢杆菌)等为代表的革兰氏阳性菌，得到重组体。进行转化时，可以将质粒等核外基因用作载体，或是利用宿主细菌原来就具有的DNA吸收能力来进行转化。
而且，也可以按照前述方法、公知的方法、或是基于这些方法的方法，来培养如上制造的重组微生物、从培养物中提取本发明酶、并且精制该酶。
另外，本发明中，若不作特殊表示，则以0.2％精制琼脂(Nacalai公司制造)作为底物时，酶的活性是在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中测定的。以3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶反应生成的还原糖。因此，本发明中，将每分钟生成相当于1μmol的D-半乳糖的量的还原糖的酶活性表示为1个单位(U)。
与以往的琼脂分解酶相同，如上得到的本发明酶，可以用于以藻类破碎物或是提取物为原料的来源于琼脂的寡聚糖的制造(其中，藻类破碎物或提取物包含具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖)，还可以作为研究用试剂在电泳后从凝胶中回收点样在琼脂糖中的DNA。并且本发明酶还能用于从藻类、特别是红藻类制造原生质体，或是提取有用的物质。
具体地说就是，来源于琼脂的寡聚糖可以用如下方法制造，当然并不只限于此方法。将本发明的琼脂分解酶混合在藻类的破碎物或提取物中(其中，藻类破碎物或提取物包含具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖)，通过在pH4～10、30℃～55℃的条件下保温，能够生成来源于琼脂的寡聚糖等寡聚糖。
如此得到的来源于琼脂的寡聚糖等寡聚糖可以具有如下用途，当然并不限于以下用途。例如，可以用作低热量食品、对加热处理后产生的某种微生物具有抑菌作用或是具有防止淀粉老化作用的食品改良剂、具有药理作用(例如，调节免疫功能、降血压、抗癌、促进肠蠕动等)的医药品或功能性食品、或具有保湿美白作用的化妆品成分等。
另外，例如可以用如下方法从电泳后的琼脂糖凝胶中回收点样在凝胶中的DNA，当然并不只限于此方法.电泳分离DNA后，向含有目的DNA片段的琼脂糖片段中添加本发明酶，进行溶解.溶解后，还可以根据需要对含有DNA片段的溶液进一步进行精制处理，例如单独或并用苯酚处理、乙醇沉淀、以柱层析或树脂精制等方法.
并且，可以按如下顺序以藻类为原料来制造原生质体(其中，藻类的细胞组织成分中具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类)，当然不只限于此方法。在含有0.7M甘露醇的MES缓冲液(pH7.5)中用木瓜蛋白酶作用于海藻试样，之后使用含有0.7M甘露醇的MES缓冲液(pH7.5)，将上述处理后的海藻试样于40μm的尼龙网上进行过滤清洗，然后用刀片将洗净的叶片切成数毫米的碎片。将碎片于含有本发明酶和市售的纤维素酶Onozuka RS及マイセロチ一ムR-10的含有0.7M甘露醇的MES缓冲液(pH6.0)中震荡，能够得到原生质体。
如此得到的原生质体可以有如下用途，当然不止限于以下用途。例如，可用于提取海藻中的生理活性物质等有用物质、培养海藻组织、研究海藻细胞的生化及生理学性质、开发利用了细胞融合或基因导入等的海藻有用品种。
实施例
下面举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不只限于这些实施例。
在如下实施例中，分别按照Saito等(Saito H，Miura K.，BiochemBiophys Acta，72：619-629，(1963))及Birnboim等(Birnboim HC，Doly J.，Nucreic Acids Res.，7：1513-1523，(1979))记述的方法制备染色体DNA和质粒DNA。其他的基本基因操作按照Sambrook等(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2nd edn Cold SpringHarbor Larboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，(1982))记述的方法进行。并且，按照Hanahan等(Hanahan D.，J.Mol.Gen.Genet.，166：557-580，(1983))记述的方法进行了转化，按照Chang等(Chang S.，Cohen SN.，Mol.Gen.Genet.，168：111-115，(1979))记述的方法进行了对枯草杆菌的转化。
实施例1
琼脂分解细菌的筛选：
用Marine broth 2216培养液(Difco公司制造)适度稀释保存于海洋科学技术中心的海底土壤样品后，接种于Marine琼脂平板培养基，在15℃～55℃的各种温度下培养16～48小时。将分解了菌落周围的琼脂并在所应用的平板培养基上形成有凹陷的细菌再接种于另外的Marine琼脂平板培养基，在适合该细菌的温度条件下培养。然后，在同样的培养基上反复进行划线培养以分离琼脂分解细菌。
在如上筛选得到的琼脂分解细菌中得到了1325-A7菌株、1325-A3菌株及A94菌株，这些菌株是能够产生比以往被人们所知的琼脂分解酶活性更高的琼脂分解酶的微生物。用CLUSTAL×多重序列排列程序(Multiple Sequence Alignment Program，version 1.81)测定这些菌株的16SrDNA序列，解析分类学的位置后我们认为，1325-A7菌株、1325-A3菌株及A94菌株都很可能是微球茎菌属的新型种。然而，由于1325-A7菌株及A94菌株具有运动性，也不排除其属于微球茎菌属以外的的新型属的可能性。
实施例2
(1)琼脂糖酶基因的解析(1)
用HindIII和EcoRI消化微球茎菌属sp.1325-A7菌株(下文省略为“1325-A7菌株”)的染色体DNA，得到DNA片段.用高纯度PCR产品纯化试剂盒(Roche公司制造)精制该DNA片段，得到精制DNA片段.用DNA连接试剂盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)将此精制DNA片段和预先用HindIII和EcoRI消化过的质粒载体pUC18(TaKaRa公司制造)连接起来.用此连接混合液对E.coli HB101(F’supE44 hsdS20 recA13 ara-14 proA2lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5mtl-1 leuB6 thi-1)进行转化，以此制备转化体。
将如上制作的转化体接种至琼脂培养基，挑选在琼脂培养基上形成有凹陷的菌落作为具有琼脂分解活性的克隆体。将挑选出的具有琼脂分解活性的克隆在LB琼脂培养基(1％细菌培养胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化钠、7.5μg/ml的四环素或50μg/ml的氨苄青霉素)上划线培养，于37℃培养一夜。之后，用碘溶液染色培养基，将在菌体的周围形成了被认为是生成了源自琼脂的还原糖的透明光环的菌落视为目的克隆体。将如此得到的克隆体培养在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，再从培养得到的细胞中提取质粒DNA，得到重组质粒pUA7。
用与pUC18的多克隆位点的上游及下游序列相对应的如下引物，对所得重组质粒pUA7的插入片段的核苷酸序列进行解析。
引物1：5’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’
引物2：5’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’
确定此重组质粒pUA7的插入片段的核苷酸序列(序列号3)后，发现插入片段的大小为2747bp，G+C含量为55％，其中有1326bp的开放阅读框(ORF)。此开放阅读框编码由441个氨基酸组成的蛋白质。并且在起始密码子的8bp上游存在有被推断为核糖体结合位点(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在64bp上游存在有被推断为大肠杆菌(E.coli)σ70型的启动子序列5’-TTCAAA-3’(-35区域)和5’-TAACCT-3’(-10区域)(经GENETYX-MAC 10.1启动子检索，启动子值为50.9)。在终止密码子的36bp下游处存在有反向重复序列，推测其起到转录终止子的作用。
并且，对所述ORF(下文称为“AgaA7”)编码的氨基酸序列进行了FASTA同源性检索(http://www.ddbj.nig.ac.jp)，结果发现，全部氨基酸(441个氨基酸)与源自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)ND137菌株、气单胞菌属(Aeromonas sp.)B9菌株、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2种)、微颤菌属(Microscillasp.)PRE1菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的β-琼脂糖酶分别有55.3％、54.3％、52.6％、47.5％、41.2％、37.5％、34.5％的部分具有一致性。
(2)琼脂糖酶的表达及精制(1)
将编码AgaA7的DNA片段导入表达用载体pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，将得到的重组质粒命名为pA7AG。用pA7AG转化大肠杆菌HB101。将得到的转化体于LB琼脂培养基培养一夜后，通过琼脂上的凹陷来确认在大肠杆菌HB101中重组体的琼脂糖酶活性。
另外，还以革兰氏阳性菌中的枯草杆菌(B.subtilis)ISW1214(leuA8metB5 hsrM1)为宿主对重组琼脂糖酶进行了高表达.用pA7AG转化枯草杆菌ISW1214，用CSL培养基(10％谷物浸提液、0.5％鱼肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氢钾、0.02％七水硫酸镁、0.05％氯化钙、6％麦芽糖、15μg/ml四环素、pH6.8)培养该转化体72小时，得到82.5ml的培养物上清液.
于4℃或以下进行所述培养物上清液的精制。首先，以6500×g的转速离心培养物上清液10分钟，分离菌体和培养物上清液。向得到的培养物上清液中缓缓添加硫酸铵，使其达到60％的饱和。以8000×g的转速离心回收生成的盐析物，再用少量20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬沉淀物，用前述的缓冲液进行一夜透析。以8000×g的转速离心15分钟除去不溶残渣后，将其吸附在预先用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M层析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述缓冲液清洗层析柱后，用50mM～500mM NaCl的直线浓度梯度法(总溶出量为500ml)进行了酶的溶出。合并具有琼脂糖酶活性的溶出成分，用超滤膜PM-10(Amicon公司制造)进行浓缩，再用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲液交换，得到5ml的酶溶液。将此酶溶液加入预先用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡化后的羟基磷灰石层析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性几乎都在流出的部分中被检测到。接着，用超滤膜PM-10对该活性部分进行浓缩。再用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)对得到的浓缩液进行一夜透析，得到6.3ml的酶液。
以0.2％的精制琼脂(Nacalai公司制造)为底物，在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中进行琼脂糖酶活性的测定。以3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶反应生成的还原糖。将每分钟生成相当于1μmol D-半乳糖的量的还原糖的酶活性表示为1个单位(U)。并且，以BSA为标准品，用DC蛋白检测试剂盒(Bio-Rad公司制造)进行蛋白质浓度的定量。
如下表1所示，经过了阴离子交换色谱及羟基磷灰石色谱后的活性成分的酶比活性(217U/mg蛋白)比培养物上清液的比活性上升了310倍，活性收率为53.8％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中只有一条条带，由此断定酶精制得很纯净。
表1
精制方式   总蛋白质量(mg)   总活性(U)   比活性(U/mg)   收率(％)   精制度(倍数)
  培养物上清液   1763   1179   0.7   100   1.0
  60％硫酸铵   212   975   4.6   82.7   6.6
  DEAE-650M   70.4   889   12.6   75.4   18
  羟基磷灰石   2.9   635   217   53.8   310
(3)精制琼脂糖酶的性质(1)
对如上精制的琼脂糖酶(下文称为“RagaA7”)的下述性质进行研究。另外，除了特殊记述外，均以琼脂作底物。
<作用>
用TLC(薄层色谱)分析了以通用性琼脂糖(Agarose L 03：TaKaRa公司制造)为底物时RagaA7的反应生成物的经时变化(图4).通过结果发现，本发明酶是催化琼脂糖的β-1，4键分解为末端型的反应的β-琼脂糖酶.
<底物特异性>
调查了RagaA7的底物特异性后发现，其作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖，但是不分解具有与琼脂糖相同的2糖重复单位且该糖的一部分被硫酸基取代了的多糖类，如ι、κ、λ-卡拉胶。
<pH稳定性及作用最佳pH>
在pH3～pH9.5之间用50mM Britton-Robinson(BR)广域缓冲液测定了RagaA7的作用最佳pH，其在中性的pH范围内具有活性，最佳pH为pH5～pH7.5(图5)。并且，通过在pH3～pH12之间用Britton-Robinson广域缓冲液测定了于40℃分别保温30分钟后的残留活性，测定了RagaA7的pH稳定性。其在pH4～pH10之间保持了最大活性的50％或50％以上(图6)。
<分子量>
以SDS-PAGE测定的RagaA7的表观分子量约为39kDa。该值小于AgaA7基因编码的成熟蛋白质的推定分子量47kDa。推测是RagaA7受到宿主枯草杆菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。测定了RagaA7的N末端氨基酸序列，该序列为Met-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Gly-Thr-Pro-Val，此序列相当于RagaA7的第18～第27的氨基酸序列。
<温度的影响>
为了调查RagaA7的热稳定性，测定了以50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)在各种温度下保温之后的残留活性，该酶在15℃～70℃中稳定，最佳作用温度为45℃～55℃(图7)。而且，于54.8℃进行30分钟热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的43％，62.3℃时为42.6％，71.9℃时为37.9％，80.0℃时为37.9％。该酶的耐热性比PSA高(图8)。
<金属盐等的影响>
考虑到产生RagaA7的微生物是从海洋分离得到，因此海水中含有的各种离子的浓度可能会影响酶活性，于是调查了RagaA7对这些离子的活性特性。首先调查了NaCl对本发明酶活性的影响，结果发现RagaA7的琼脂分解活性中并非必须有NaCl，也几乎观察不到依赖于NaCl浓度的活性变化。即使在添加有更高浓度的NaCl(1M)时也保持了80％的活性。
而且，也几乎没有观察到由海水中主要金属离子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的变化(100％～108％)。另外，还调查了被认为是海水中含有的微量金属离子对RagaA7活性的影响，结果发现，RagaA7受浓度为1mM的Hg2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制(0％～20％)，略微受浓度为1mM的Cu2+、Fe2+的抑制(56％～89％)。另外，不受Al3+、Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制(101％～108％)。并且，由此可以认为，RagaA7的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的结构的维持是重要的。
另外还进行了EDTA抑制酶活性的试验，通过在40℃处理1小时，该酶活性受到抑制，所述抑制与EDTA的浓度成比例，不过即使在100mM的EDTA中处理后仍保持60％的活性。由此可以认为，并不是2价金属离子与RagaA7的活性中心有关，而是部分2价金属离子在维持其结构上是必须的。
<等电点>
按照等电点电泳法，用Multiphore II凝胶电聚焦系统、聚丙烯酰胺凝胶盘及广范围等电点标准试剂盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)测定了RagaA7的等电点，结果为3.5～5.5。
<表面活性剂的影响>
按如下表A2所示的种类及浓度调查了表面活性剂对RagaA7的影响。分别向RagaA7中添加了0.1％及1％的非离子性表面活性剂NonidetP40(Nacalai Tesque公司制造)和Triton X100(Nacalai Tesque公司制造)以及阴离子性表面活性剂Tween 20(和光纯药工业会社制造)和SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaA7的残留活性为不添加任何表面活性剂时的100％或其以上。
表2
  浓度(质量％)   相对活性(％)
Nonidet P40   0.11   136136
Triton X100   0.11   125127
Tween 20   0.11   123123
SDS   0.11   141123
  无添加   0   100
<对SDS的稳定性>
调查了RagaA7对SDS的稳定性后发现，于40℃、1.5％的SDS中处理1小时后保持了与未处理时同样的活性。并且，以0.1％的SDS进行同样处理后，活性上升至未添加SDS时的1.5倍。RagaA7对SDS的耐性比PSA高(图9)。
<对化学试剂的耐性>
按如下表3所示的种类及浓度调查了RagaA7对化学试剂的耐性。RagaA7受0.1mM N-溴代丁二酰亚胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(关东化学会社制造)及对(氯汞)苯甲酸(Nacalai Tesque公司制造)、1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(和光纯药工业会社制造)、10mM二硫苏糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巯基乙醇(Nacalai Tesque公司制造)的抑制。
表3
  浓度(mM)   相对活性(％)
  N-溴代丁二酰亚胺   0.1   5
  碘代乙酰胺   0.5   106
  N-乙基顺丁烯二酰亚胺   1   110
  对(氯汞)苯甲酸<sup>*</sup>   0.5   97
  二硫苏糖醇   10   109
  2-巯基乙醇   10   112
  无添加   0   100
*包含5％的二甲基亚砜
实施例3
(1)琼脂糖酶基因的解析(2)
用HindIII消化微球茎菌属sp.1325-A3菌株(下文省略为“1325-A3菌株”)的染色体DNA，得到DNA片段。用高纯度PCR产品纯化试剂盒(Roche公司制造)精制该DNA片段，得到精制DNA片段。用DNA连接试剂盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)将此精制DNA片段和预先用HindIII消化、并经过虾的碱性磷酸酶(Roche公司制造)处理的质粒载体pUC18(TaKaRa公司制造)连接起来。用此连接混合液对E.coliHB101(F’supE44 hsdS20 recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5mtl-1 leuB6 thi-1)进行转化，以此制作转化体。
将如上制作的转化体接种至琼脂培养基，挑选在琼脂培养基上形成有凹陷的菌落作为具有琼脂分解活性的克隆体。将挑选出的具有琼脂分解活性的克隆体在LB琼脂培养基(1％细菌培养胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化钠、7.5μg/ml的四环素或50μg/ml的氨苄青霉素)上划线培养，于37℃培养一夜。之后，用碘溶液染色培养基，将在菌体的周围形成了被认为是生成了源自琼脂的还原糖的透明光环的菌落视为目的克隆体。将如此得到的克隆体培养在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，再从培养得到的细胞中提取质粒DNA，得到重组质粒pUA3。
用与pUC18的多克隆位点的上游及下游序列相对应的如下引物，对所得重组质粒pUA3的插入片段的核苷酸序列进行解析。
引物3：5’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’
引物4：5’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’
此重组质粒pUA3的插入片段的大小约为3.9kb。测定pUA3的插入片段的碱基序列，比较此基因片段编码的氨基酸序列和已知蛋白质的氨基酸序列，进行同源性检索。结果显示，此基因片段编码的氨基酸序列中的一部分与源自其他微生物的琼脂糖酶具有同源性，因此此基因片段编码琼脂糖酶的一部分。但是认为，被推测编码了部分琼脂糖酶的碱基序列中不包含终止密码子，琼脂糖酶的C末端部分缺失。于是通过反向PCR法及盒式连接PCR(cassette ligation PCR)测定了此片段下游区域的碱基序列。序列号7显示了pUA3的插入片段及其下游区域的碱基序列。在其中检测出由1809bp组成的的开放阅读框(ORF)。此开放阅读框编码由602个氨基酸组成的蛋白质。并且在开始密码子的6bp上游存在有被推断为核糖体结合位点(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在136bp上游存在有被推断为大肠杆菌的σ70型的启动子序列5’-TTGTTA-3’(-35区域)和5’-TATTAT-3’(-10区域)(经GENETYX-MAC 10.1启动子检索，启动子值为50.9)。在终止位点的15bp下游处存在有反向重复序列，推测其起到转录终止子的作用。
并且，对所述ORF(下文称为“AgaA3”)编码的氨基酸序列进行了FASTA同源性检索(http://www.ddbj.nig.ac.jp)，结果发现，全部氨基酸(602个氨基酸)与源自大西洋假交替单胞菌、气单胞菌属(Aeromonassp.)B9菌株、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2种)、假单胞菌属ND137菌株、天蓝色链霉菌A3(2)菌株、微颤菌属PRE1菌株的β-琼脂糖酶分别有55.3％、54.3％、49.8％、36.8％、45.8％、34.6％、33.0％的部分具有一致性。
(2)琼脂糖酶的表达及精制(2)
将编码AgaA3的DNA片段导入表达用载体pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，将得到的重组质粒命名为pA3AG。用pA3AG转化大肠杆菌HB101。将得到的转化体于LB琼脂培养基培养一夜后，通过琼脂上的凹陷来确认在大肠杆菌HB101中重组体的琼脂糖酶活性。
另外，还以革兰氏阳性菌中的枯草杆菌ISW1214(leuA8 metB5 hsrM1)为宿主对重组琼脂糖酶进行了高表达。用pA3AG转化枯草杆菌ISW1214，用CSL培养基(10％谷物浸提液、0.5％鱼肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氢钾、0.02％七水硫酸镁、0.05％氯化钙、6％麦芽糖、15μg/ml四环素、pH6.8)培养该转化体72小时，得到82.5ml的培养物上清液。
于4℃或以下进行所述培养物上清液的精制。首先，以6500×g的转速离心培养物上清液10分钟，分离菌体和培养物上清液。向得到的培养物上清液中缓缓添加硫酸铵，使其达到90％的饱和。以8000×g的转速离心25分钟回收生成的盐析物，再用少量20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬沉淀物，用前述的缓冲液进行一夜透析。以8000×g的转速离心15分钟除去不溶残渣后，将其吸附在预先用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M层析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述缓冲液清洗层析柱后，用50mM～500mM NaCl的直线浓度梯度法(总溶出量为500ml)进行了酶的溶出.混合具有琼脂糖酶活性的溶出成分，用超滤膜PM-10(Amicon公司制造)进行浓缩，再用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲液交换，得到5ml的酶溶液.将此酶溶液加入预先用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石层析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性几乎都在流出的部分中被检测到.接着，用超滤膜PM-10对该活性部分进行浓缩.再用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)对得到的浓缩液进行一夜透析，得到2.0ml的酵母液.
以0.2％的精制琼脂(Nacalai公司制造)为底物，在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中进行琼脂糖酶活性的测定。以3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶反应生成的还原糖。将每分钟生成相当于1μmol D-半乳糖的量的还原糖的酶活性表示为1个单位(U)。并且，以BSA为标准品，用DC蛋白检测试剂盒(Bio-Rad公司制造)进行蛋白质浓度的定量。
如下表4所示，经过了阴离子交换层析及羟基磷灰石层析后的活性成分的酶比活性(364U/mg蛋白)比培养物上清液的比活性上升了530倍，活性收率为64.9％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中具有非常接近的分子量，包含3个具有琼脂糖酶活性的蛋白质。
表4
  精制方式   总蛋白质量(mg)   总活性(U)   比活性(U/mg)   收率(％)   精制度(倍数)
  培养物上清液   803   551   0.7   100   1.0
  90％硫酸铵   203   547   2.7   99.3   3.9
  DEAE-650M   10   408   40.7   74.1   59
  羟基磷灰石   1.0   358   364   64.9   529
(3)精制琼脂糖酶的性质(2)
对如上精制的琼脂糖酶(下文称为“RagaA3”)的下述性质进行研究。另外，除了特殊记述外，均以琼脂作底物。
<作用>
用TLC分析了以通用性琼脂糖(Agarose L 03：TaKaRa公司制造)为底物时RagaA3的反应生成物的经时变化(图10)。通过结果发现，本发明酶是催化琼脂糖的β-1，4键分解为末端型的反应的β-琼脂糖酶。
<底物特异性>
调查了RagaA3的底物特异性后发现，其作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖，但不分解具有与琼脂糖相同的2糖重复单位且该糖的一部分被硫酸基取代了的多糖类，如ι、κ、λ-卡拉胶。
<pH稳定性及作用最佳pH>
在pH3～pH9.5之间用50mM Britton-Robinson广域缓冲液测定了RagaA3的作用最佳pH，其在中性的pH范围内具有活性，最佳pH为pH6.5～pH7.5(图11).并且，通过在pH3～pH12之间用Britton-Robinson广域缓冲液测定了于40℃分别保温30分钟后的残留活性，测定了RagaA3的pH稳定性.其在pH4～pH10.5之间保持了最大活性的50％或以上(图12).
<分子量>
以SDS-PAGE测定的RagaA3的表观分子量约为34kDa。该值小于AgaA3基因编码的成熟蛋白质的推定分子量47kDa。推测是RagaA3受到宿主枯草杆菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。测定了RagaA3的N末端氨基酸序列，该序列为Ala-Leu-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Asn-Ile-Pro，此序列相当于RagaA3的第17～第26的氨基酸序列。
<温度的影响>
为了调查RagaA3的热稳定性，测定了以50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)在各种温度下保温之后的残留活性，该酶在50℃以下稳定，最佳作用温度为50℃～60℃(图13)。而且，于50℃进行30分钟热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的96.3％，64℃时为52.3％，74℃时为39.5％，83℃时为32.6％。该酶的耐热性比PSA高(图14)。
<金属盐等的影响>
考虑到产生RagaA3的微生物是从海洋分离得到，因此海水中含有的各种离子的浓度可能会影响酶活性，于是调查了RagaA3对这些离子的活性特性。首先调查了NaCl对本发明酶活性的影响，结果发现RagaA3的琼脂分解活性中并非必须有NaCl，也几乎观察不到依赖于NaCl浓度的活性变化。即使在添加有更高浓度的NaCl(1M)时也保持了90％的活性。
而且，也几乎没有观察到由海水中主要金属离子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的变化(107％～121％)。然后又调查了被认为是海水中含有的微量金属离子对RagaA3活性的影响，结果发现，RagaA3受浓度为1mM的Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制(残留活性0％～13％)，略受Fe2+的抑制(53％)。另外，不受Co2+、Cs+、Fe3+、Li+、Mn2+的抑制(100％～111％)。并且，由此可以认为，RagaA3的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的结构的维持是重要的。
另外还进行了EDTA抑制酶活性的试验，通过在40℃处理1小时，该酶活性受到抑制，所述抑制与EDTA的浓度成比例，不过即使在100mM的EDTA中处理后仍保持80％的活性。由此可以认为，并不是2价金属离子与RagaA3的活性中心有关，而是部分2价金属离子在维持其结构上是必须的。
<等电点>
按照等电点电泳法，用Multiphore II凝胶电聚焦系统、聚丙烯酰胺凝胶盘及广范围等电点标准试剂盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)测定了RagaA3的等电点，结果为3.5～4.5。
<表面活性剂的影响>
按如下表5所示的种类及浓度调查了表面活性剂对RagaA3的影响。分别向RagaA3中添加了0.1％及1％的非离子性表面活性剂NonidetP40(Nacalai Tesque公司制造)和Triton X100(Nacalai Tesque公司制造)以及阴离子性表面活性剂Tween 20(和光纯药工业会社制造)和0.1％的SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaA3的残留活性为不添加任何表面活性剂时的100％以上。不过，添加了1％的SDS时的残留活性约为不添加任何表面活性剂时的50％。
表5
  浓度(质量％)   相对活性(％)
Nonidet P40   0.11   137140
Triton X100   0.11   130144
Tween 20   0.11   136138
SDS   0.11   10348
  无添加   0   100
<对SDS的稳定性>
调查了RagaA3对SDS的稳定性后发现，于40℃、至少1％的SDS中处理1小时后保持了未处理时48％的活性。RagaA3对SDS的耐性比PSA高(图15)。
<对化学试剂的耐性>
按如下表6所示的种类及浓度调查了RagaA3对化学试剂的耐性。RagaA3受0.1mM N-溴代丁二酰亚胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(关东化学会社制造)及对(氯汞)苯甲酸(Nacalai Tesque公司制造)、1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(和光纯药工业会社制造)、10mM二硫苏糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巯基乙醇(Nacalai Tesque公司制造)的抑制。
表6
  浓度(mM)   相对活性(％)
  N-溴代丁二酰亚胺   0.1   3
  碘代乙酰胺   0.5   104
  N-乙基顺丁烯二酰亚胺   1   129
  对(氯汞)苯甲酸<sup>*</sup>   0.5   120
  浓度(mM)   相对活性(％)
  二硫苏糖醇   10   94
  2-巯基乙醇   10   97
  无添加   0   100
*包含5％的二甲基亚砜
实施例4
(1)琼脂糖酶基因的解析(3)
用Pst I消化微球茎菌属sp.A94菌株(下文省略为“A94菌株”)的染色体DNA，得到DNA片段。用高纯度PCR产品纯化试剂盒(Roche公司制造)精制该DNA片段，得到精制DNA片段。用DNA连接试剂盒ver.2.0(TaKaRa公司制造)将此精制DNA片段和预先用PstI消化、并经过虾的碱性磷酸酶(Roche公司制造)处理过的质粒载体pUC18(TaKaRa公司制造)连接起来。用此连接混合液对E.coli HB101(F’supE44 hsdS20 recA13ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-l leuB6 thi-1)进行转化，以此制作转化体。
将如上制作的转化体接种至琼脂培养基，挑选在琼脂培养基上形成有凹陷的菌落作为具有琼脂分解活性的克隆体。将挑选出的具有琼脂分解活性的克隆体在LB琼脂培养基(1％细菌培养胨、0.5％酵母浸膏、1％氯化钠、7.5μg/ml的四环素或50μg/ml的氨苄青霉素)上划线培养，于37℃培养一夜。之后，用碘溶液染色培养基，将在菌体的周围形成了被认为是生成了源自琼脂的还原糖的透明光环的菌落视为目的克隆体。将如此得到的克隆体培养在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，再从培养得到的细胞中提取质粒DNA，得到重组质粒pUB。
用与pUC18的多克隆位点的上游及下游序列相对应的如下引物，对所得重组质粒pUB的插入片段的核苷酸序列进行解析。
引物5：5’-GTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’
引物6：5’-CGAAAGGGGGATGTGCTGC-3’
确定此重组质粒pUB的插入片段的核苷酸序列后(序列号11)，发现插入片段的大小为3910bp，G+C含量为51％，其中有1302bp的开放阅读框(ORF)。此开放阅读框编码由433个氨基酸组成的蛋白质。并且在ATG(起始密码子)的9bp上游存在有被推断为核糖体结合位点(RBS)的序列5’-AAGGAG-3’，在起始密码子42bp上游存在有与大肠杆菌的启动子保守序列5’-TTGACA-3’(-35区域)和5’-TATAAT-3’(-10区域)具有同源性的序列区域5’-TTGTAG-3’(-35区域)和5’-TATGGT-3’(-10区域)(经GENETYX-MAC 10.1启动子检索，启动子值为56.2)。在终止密码子的48bp下游处存在有反向重复序列，推测其起到转录终止子的作用。
并且，对所述ORF(下文称为“AgaB”)编码的氨基酸序列进行了FASTA同源性检索(http://www.ddbj.nig.ac.jp)，结果发现，全部氨基酸(433个氨基酸)与源自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)ND137菌株、气单胞菌属(Aeromonas sp.)B9菌株、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)、Zobellia galactaninovorans Dsij菌株(2种)、微颤菌属(Microscillasp.)PRE1菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的β-琼脂糖酶分别有61.8％、54.3％、52.1％、55.0％、44.6％、36.5％、37.5％的部分具有一致性。
(2)琼脂糖酶的表达及精制(3)
将编码AgaB的DNA片段导入表达用载体pHSP64(Sumitomo N，Ozaki K，Hitomi J，Kawaminami S，Kobayashi T，Kawai S，ItoS.(1995).Biosci.Biotechnol.Biochem.59，2172-2175)中，将得到的重组质粒命名为pBAG1。用pBAG1转化大肠杆菌HB101。将得到的转化体于LB琼脂培养基培养一夜后，通过琼脂上的凹陷来确认在大肠杆菌HB101中重组体的琼脂糖酶活性。
另外，还以革兰氏阳性菌中的枯草杆菌ISW1214(leuA8 metB5 hsrM1)为宿主对重组琼脂糖酶进行了高表达。用pBAG1转化枯草杆菌ISW1214，用CSL培养基(10％谷物浸提液、0.5％鱼肉浸膏、0.05％酵母浸膏、0.2％磷酸二氢钾、0.02％七水硫酸镁、0.05％氯化钙、6％麦芽糖、15μg/ml四环素、pH6.8)培养该转化体72小时，得到669ml的培养物上清液。
于4℃或以下进行所述培养物上清液的精制。首先，以6500×g的转速离心培养物上清液10分钟，分离菌体和培养物上清液。向得到的培养物上清液中缓缓添加硫酸铵，使其达到80％的饱和。以8000×g的转速离心25分钟回收生成的盐析物，再用少量20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬沉淀物，用前述的缓冲液进行一夜透析。以8000×g的转速离心15分钟除去不溶残渣后，将其吸附在预先用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl 650M层析柱(Tosoh公司制造，2.5cm×15cm)。用200ml包含50mM NaCl的前述缓冲液清洗层析柱后，用50mM～500mM NaCl的直线浓度梯度法(总溶出量为500ml)进行了酶的溶出。混合具有琼脂糖酶活性的溶出成分，用超滤膜PM-10(Amicon公司制造)进行浓缩，再用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲液交换，得到5ml的酶溶液。将此酶溶液加入预先用2.5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石层析柱(日本Chemical公司制造，2.5cm×15cm)后，活性几乎都在流出的部分中被检测到。接着，用超滤膜PM-10对该活性部分进行浓缩。再用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)对得到的浓缩液进行一夜透析，得到0.6ml的酵母液。
以0.2％的精制琼脂(Nacalai公司制造)为底物，在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中进行琼脂糖酶活性的测定。以3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶反应生成的还原糖。将每分钟生成相当于1μmol D-半乳糖的量的还原糖的酶活性表示为1个单位(U)。并且，以BSA为标准品，用DC蛋白检测试剂盒(Bio-Rad公司制造)进行蛋白质浓度的定量。
如下表7所示，经过了阴离子交换层析及羟基磷灰石层析后的活性成分的酶比活性(459U/mg蛋白)比培养物上清液的比活性上升了219倍，活性收率为9.0％。在得到的酶溶液的SDS-PAGE和活性染色中只有一条条带，由此断定酶精制得很纯净。
表7
精制方式   总蛋白质量(mg)   总活性(U)   比活性(U/mg)   收率(％)   精制度(倍数)
  培养物上清液   669   1393   2.1   100   1.0
  80％硫酸铵   97.6   1239   12.7   88.9   6.1
  DEAE-650M   12.1   686   56.8   49.2   27.2
  羟基磷灰石   0.3   126   459   27.2   220
(3)精制琼脂糖酶的性质(3)
对如上精制的琼脂糖酶(下文称为“RagaB”)的下述性质进行研究。另外，除了特殊记述外，均以琼脂作底物。
<作用>
用TLC分析了以通用性琼脂糖(Agarose L 03：TaKaRa公司制造)为底物时RagaB的反应生成物的经时变化(图16)。通过结果发现，本发明酶是催化琼脂糖的β-1，4键分解为末端型的反应的β-琼脂糖酶。
<底物特异性>
调查了RagaB的底物特异性后发现，其作用于具有由琼脂、琼脂糖等D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖相互进行β-1，4键合以及α-1，3键合而形成的骨架的多糖类及具有相同骨架的寡聚糖，生成来源于琼脂的寡聚糖，但不分解具有与琼脂糖相同的2糖重复单位且该糖的一部分被硫酸基取代了的多糖类，如ι、κ、λ-卡拉胶。
<pH稳定性及作用最佳pH>
在pH3～pH11之间用50mM Britton-Robinson广域缓冲液测定了RagaB的作用最佳pH，其在中性的pH范围内具有活性，最佳pH为pH6.5～pH7.5(图17)。并且，通过在pH3～pH12之间用Britton-Robinson广域缓冲液测定了于40℃分别保温30分钟后的残留活性，测定了RagaB的pH稳定性。其在pH4～pH10之间保持了最大活性的50％以上(图18)。
<分子量>
以SDS-PAGE测定的RagaB的表观分子量为32kDa。该值小于以AgaB基因编码的成熟蛋白质的推定分子量46kDa。推测是RagaB受到宿主枯草杆菌ISW1214分泌的蛋白酶的分解，被低分子化了。测定了RagaB的N末端氨基酸序列，该序列为Tyr-Ala-Ala-Asp-Trp-Asp-Gly-Val-Pro-Val，此序列相当于RagaB的第19～第28的氨基酸序列。
<温度的影响>
为了调查RagaB的热稳定性，测定了以50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)在各种温度下保温之后的残留活性，该酶在50℃或其以下稳定，最佳作用温度为50℃～60℃(图19)。而且，于50℃进行30分钟热处理后的残留活性为未经热处理(0℃，30分钟)时的88.0％，64℃时为17.6％，74℃时为15.1％，83℃时为11.3％。该酶的耐热性比PSA高(图20)。
<金属盐等的影响>
考虑到产生RagaB的微生物是从海洋分离得到，因此海水中含有的各种离子的浓度可能会影响酶活性，于是调查了RagaB对这些离子的活性特性。首先调查了NaCl对本发明酶活性的影响，结果发现RagaA7的琼脂分解活性中并非必须有NaCl，也观察不到依赖于NaCl浓度的活性变化。即使在添加有更高浓度的NaCl(1M)时也保持了90％的活性。
而且，也几乎没有观察到由海水中主要金属离子Ca2+、Mg2+、K+(5mM及100mM)的添加引起的活性的变化(96％～114％)。还调查了被认为是海水中含有的微量金属离子对RagaB活性的影响，结果发现，RagaB受浓度为1mM的Hg2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+的强烈抑制(0％～35％)。另外，不受Al3+、Co2+、Cs+、Fe2+、Fe3+、Li+、Mn2+、Ni2+的抑制(101％～118％)。并且，由此可以认为，RagaB的活性中，涉及SH基、CO基、NH基的酶蛋白的结构的维持是重要的。
另外还进行了EDTA抑制酶活性的试验，通过在40℃处理1小时，该酶活性受到抑制，所述抑制与EDTA的浓度成比例，不过即使在100mM的EDTA中处理后仍保持74％的活性。由此可以认为，并不是2价金属离子与RagaB的活性中心有关，而是部分2价金属离子在维持其结构上是必须的。
<等电点>
按照等电点电泳法，用Multiphore II凝胶电聚焦系统、聚丙烯酰胺凝胶盘及广范围等电点标准试剂盒(Pharmacia Fine Chemica AB，Uppsala，Sweden)测定了RagaB的等电点，结果为3.7～5.2。
<表面活性剂的影响>
按如下表8所示的种类及浓度调查了表面活性剂对RagaB的影响。分别向RagaB中添加了0.1％及1％的非离子性表面活性剂NonidetP40(Nacalai Tesque公司制造)和Triton X100(Nacalai Tesque公司制造)以及阴离子性表面活性剂Tween 20(和光纯药工业会社制造)和SDS(Bio-Rad公司制造)后，RagaB的残留活性为不添加任何表面活性剂时的100％或其以上。
表8
  浓度(质量％)   相对活性(％)
Nonidet P40   0.11   156147
Triton X100   0.11   146162
Tween 20   0.11   145144
  浓度(质量％)   相对活性(％)
SDS   0.11   137139
  无添加   0   100
<对SDS的稳定性>
调查了RagaB对SDS的稳定性后发现，于40℃、2.0％的SDS中处理1小时后保持了与未处理时同样的活性。并且，以0.4％的SDS进行同样处理后，活性上升至未添加SDS时的2.0倍。RagaB对SDS的耐性比PSA高(图21)。
<对化学试剂的耐性>
按如下表9所示的种类及浓度调查了RagaB对化学试剂的耐性。RagaB受0.1mM N-溴代丁二酰亚胺(Sigma公司制造)的抑制，不受0.5mM碘代乙酰胺(关东化学会社制造)及对(氯汞)苯甲酸(Nacalai Tesque公司制造)、1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(和光纯药工业会社制造)、10mM二硫苏糖醇(Pharmacia Biotech公司制造)及2-巯基乙醇(Nacalai Tesque公司制造)的抑制。
表9
  浓度(mM)   相对活性(％)
  N-溴代丁二酰亚胺   0.1   5
  碘代乙酰胺   0.5   100
  N-乙基顺丁烯二酰亚胺   1   121
  对(氯汞)苯甲酸<sup>*</sup>   0.5   118
  二硫苏糖醇   10   98
  2-巯基乙醇   10   101
  无添加   0   100
*包含5％的双甲基亚砜
工业上的可利用性
由本发明提供具有耐热性的新型琼脂分解酶及编码所述琼脂分解酶的核苷酸序列。
应用此酶可以提供在工业中大量生产源自琼脂的寡聚糖的生产方法，该寡聚糖在医药品、化妆品、食品领域中有用.
并且，通过将此酶作用于海藻，可以用于从海藻中提取具有生理活性等的有用物质、并可用于开发藻类的有用品种。
并且，通过基因工程技术利用所述核苷酸序列，能够简单、高效地生产制造本发明的琼脂分解酶。
序列表
<110>独立行政法人海洋研究开发机构
<120>琼脂分解酶及其应用
<130>FCI05JP2002
<150>JP2003-98284
<151>2003-04-01
<150>JP2003-98285
<151>2003-04-01
<150>JP2003-98286
<151>2003-04-01
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>441
<212>PRT
<213>琼脂分解酶(RagaA7)
<220>
<223>发明人：大田优佳莉；秦田勇二；能木裕一；伊藤进；掘越弘毅
<400>1
Met Lys Thr Thr Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Phe Ser Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly
            20                  25                  30
Pro Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr
        35                  40                  45
Ser Ala Pro Ala Ser Gly Lys Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser
    50                  55                  60
Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Pro Asn Ser Ser Val Glu Ser Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser
                85                  90                  95
Arg Lys Ala Gly Thr Thr Lys Ile His Ala Gly Ala Ile His Ser Asn
            100                 105                 110
Glu Ser Val Thr Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Val Gln Val Thr
        115                 120                 125
Asn Leu Thr Met Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Gln Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu
145                 150                 155                 160
Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg
                165                 170                 175
Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Pro
            180                 185                 190
Asn Pro Asn Gly Gly Thr Trp Arg Asp Gln Trp Ile Arg Ile Gly Thr
        195                 200                 205
Tyr Trp Val Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His
    210                 215                 220
Val Arg Thr Val Thr Gly Pro Ser Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu
                245                 250                 255
His Gln Pro Trp Arg Asp Thr Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Pro Asp Thr Asn Gly Gly Gly Pro Gly Asn Gly
    290                 295                 300
Ser Ile Ser Val Glu Lys Glu Ala Glu Asp Phe Asp Asn Val Gly Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Phe Ser Asp Gly Gln Ser Gln Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Gly
                325                 330                 335
Ala Thr Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Arg Glu Asp Tyr Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Thr Val Thr Val Pro Glu Asp Arg Ile Tyr Asn Ile Thr Tyr Asn Ile
        355                 360                 365
Ser Ser Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ile Asp Phe Leu Val Asn Glu Ser
    370                 375                 380
Gly Thr Trp Ser Asn Lys Thr Gln Thr Ala Val Pro Asn Ala Gly Trp
385                 390                 395                 400
Asn Asn Phe Gln Pro Leu Ser Gly Gly Thr Val Tyr Leu Glu Ala Gly
                405                 410                 415
Thr His Thr Val Arg Leu Tyr Gly Ala Gly Thr His Asp Trp Gln Trp
            420                 425                 430
Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu Ser Asn
        435                 440
<210>2
<211>1326
<212>DNA
<213>琼脂分解酶(RagaA7)
<400>2
atgaaaacca ctcagtgcgc cctggcggcg ctcgtgttta gtacccccct gatggccgcc    60
gactgggacg gcactccggt tccagccgat gcgggccccg gcaacacctg ggagctacac    120
ccgctctctg atgacttcaa ctactcggca ccagcttccg gtaagagcgc cacattcttc    180
gagcgctgga gcgaaggctt tatcaacccc tggctaggcc cgggcgaaac cgagtactac    240
ggcccaaact cctcggtaga aagcggtaac ctggtcatta aagccagccg caaggccgga    300
accaccaaga ttcatgccgg cgctatccac tccaatgaaa gcgtcaccta ccccctgtat    360
atggaagcgc gcgttcaggt caccaacctc accatggcca acgccttctg gttgctgagc    420
tctgattcca cccaggaaat cgacgtactg gaatcctacg gcagtgaccg tcccagcgag    480
acctggttcg atgagcgcct gcacctcagc catcacgtgt ttatccgcga gccgttccag    540
gactaccagc ccaaagatga cggcagctgg tacccaaacc ccaatggcgg cacctggcgc    600
gatcaatgga ttcgaatcgg cacctactgg gtagatccct ggacactgga gtactacgtc    660
aacggcgagc acgtacgcac tgtcaccggc ccgagtatga tcgaccccta cggctataca    720
ggcggcacgg gcctcagcaa accgatgcag gtaatcttcg acgcagaaca ccaaccctgg    780
cgcgatacgc agggcacagc gccgccgaca gatgaagaac tggccgatcc gagccgaaac    840
aaattcctgg ttgactgggt tcgcttttat aaacccgtgc ctgataccaa tggcggtggc    900
cccggcaatg ggagcatcag tgtcgagaaa gaggcggaag atttcgataa cgttggaggc    960
tatttttcag acggccaatc gcaagccatt agcacctaca caacgggagc tacgacagcg    1020
atcaattacg tgaatcgcga agactatgca gactataccg tcaccgtgcc tgaagatcgc    1080
atctacaaca ttacctataa catcagtagc ggtattaccg gtggacgtat tgacttcctt    1140
gtcaatgaaa gtggaacctg gagcaacaag acacagacag cggtacctaa tgccggctgg    1200
aacaatttcc aaccattaag cggaggtacg gtttatctcg aagccggtac acatactgtg    1260
agactttacg gggcaggtac acacgactgg cagtggaatc tcgacaaatt tacgttgagc    1320
aactga                                                               1326
<210>3
<211>2747
<212>DNA
<213>Microbulbifer sp.1325-A7
<220>
<221>-35_信号
<222>(782)..(787)
<223>
<220>
<221>-10_信号
<222>(805)..(810)
<223>
<220>
<221>RBS
<222>(861)..(866)
<223>
<220>
<221>信号肽
<222>(874)..(930)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(874)..(2196)
<223>
<400>3
aagcttgcga ctggagaagg ccagacggat attgccccag ctcaccgccg cggaacgttc    60
accgacattt accgaagact tctgatcccg ctcttggctc gccgcagcgc caatgtcact    120
ctcgggctca cgatacagcc agtaccagat cgccgcccag acgatgccga tcaccccaga    180
gataataaac agcccgcgcc agccaaaaca ctcctgaatc aaagccagta ccggcatcaa    240
aaatgcgaga ccgataaact gcccggaggt atacaccgca atcgcactgg cccgctcctg    300
ctgagaaaac cattgggtaa cgatcttatt attcgcgggg taggacggcg cctcgaaaaa    360
accgatcgcc atgcggcatc ccaccagcgc cgccagtgaa ctgaccagac cctgtacgat    420
ggtcgccagc gaccaggcca ccagaatgaa gggatacagg atccgcacct tcaccacatc    480
cacaatcatc ccaccgggaa tctgcatgat ggaataggtc caggcgaagg cagagaagat    540
aatccccatc tgtacggatg tgaggctcag atcctcagaa atcgcattgg ccgccaccga    600
gatattggtg cggtccatat agttgatcac cacactgata aagatcagtg ccagaacccc    660
gaatttattg gctgctttca taccgctact gcatcgtcgt tgttatgtgg tcgcgacgcg    720
gcattgagtg cctggaaatg cgaacgagtc cccattccgt acctgcgcaa tcaatggcca  780
cttcaaattg tcaacaatta acagtaacct aaccgctcca atataacaat aacgcgctca  840
tccagtacca gaatgagcgc aaggagcaaa gca atg aaa acc act cag tgc gcc   894
                                     Met Lys Thr Thr Gln Cys Ala
                                     1               5
ctg gcg gcg ctc gtg ttt agt acc ccc ctg atg gcc gcc gac tgg gac    942
Leu Ala Ala Leu Val Phe Ser Thr Pro Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp
        10                  15                  20
ggc act ccg gtt cca gcc gat gcg ggc ccc ggc aac acc tgg gag cta    990
Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly Pro Gly Asn Thr Trp Glu Leu
    25                  30                  35
cac ccg ctc tct gat gac ttc aac tac tcg gca cca gct tcc ggt aag    1038
His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Ser Ala Pro Ala Ser Gly Lys
40                  45                  50                  55
agc gcc aca ttc ttc gag cgc tgg agc gaa ggc ttt atc aac ccc tgg    1086
Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp
                60                  65                  70
cta ggc ccg ggc gaa acc gag tac tac ggc cca aac tcc tcg gta gaa    1134
Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr Gly Pro Asn Ser Ser Val Glu
            75                  80                  85
agc ggt aac ctg gtc att aaa gcc agc cgc aag gcc gga acc acc aag    1182
Ser Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser Arg Lys Ala Gly Thr Thr Lys
        90                  95                  100
att cat gcc ggc gct atc cac tcc aat gaa agc gtc acc tac ccc ctg    1230
Ile His Ala Gly Ala Ile His Ser Asn Glu Ser Val Thr Tyr Pro Leu
    105                 110                 115
tat atg gaa gcg cgc gtt cag gtc acc aac ctc acc atg gcc aac gcc    1278
Tyr Met Glu Ala Arg Val Gln Val Thr Asn Leu Thr Met Ala Asn Ala
120                 125                 130                 135
ttc tgg ttg ctg agc tct gat tcc acc cag gaa atc gac gta ctg gaa    1326
Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr Gln Glu Ile Asp Val Leu Glu
                140                 145                 150
tcc tac ggc agt gac cgt ccc agc gag acc tgg ttc gat gag cgc ctg    1374
Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu
            155                 160                 165
cac ctc agc cat cac gtg ttt atc cgc gag ccg ttc cag gac tac cag    1422
His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln
        170                 175                 180
ccc aaa gat gac ggc agc tgg tac cca aac ccc aat ggc ggc acc tgg    1470
Pro Lys Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Pro Asn Pro Asn Gly Gly Thr Trp
    185                 190                 195
cgc gat caa tgg att cga atc ggc acc tac tgg gta gat ccc tgg aca    1518
Arg Asp Gln Trp Ile Arg Ile Gly Thr Tyr Trp Val Asp Pro Trp Thr
200                 205                 210                 215
ctg gag tac tac gtc aac ggc gag cac gta cgc act gtc acc ggc ccg    1566
Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His Val Arg Thr Val Thr Gly Pro
                220                 225                 230
agt atg atc gac ccc tac ggc tat aca ggc ggc acg ggc ctc agc aaa    1614
Ser Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys
            235                 240                 245
ccg atg cag gta atc ttc gac gca gaa cac caa ccc tgg cgc gat acg    1662
Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu His Gln Pro Trp Arg Asp Thr    
        250                 255                 260
cag ggc aca gcg ccg ccg aca gat gaa gaa ctg gcc gat ccg agc cga    1710
Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg
    265                 270                 275
aac aaa ttc ctg gtt gac tgg gtt cgc ttt tat aaa ccc gtg cct gat    1758
Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr Lys Pro Val Pro Asp
280                 285                 290                 295
acc aat ggc ggt ggc ccc ggc aat ggg agc atc agt gtc gag aaa gag    1806
Thr Asn Gly Gly Gly Pro Gly Asn Gly Ser Ile Ser Val Glu Lys Glu
                300                 305                 310
gcg gaa gat ttc gat aac gtt gga ggc tat ttt tca gac ggc caa tcg    1854
Ala Glu Asp Phe Asp Asn Val Gly Gly Tyr Phe Ser Asp Gly Gln Ser
            315                 320                 325
caa gcc att agc acc tac aca acg gga gct acg aca gcg atc aat tac    1902
Gln Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ile Asn Tyr
        330                 335                 340
gtg aat cgc gaa gac tat gca gac tat acc gtc acc gtg cct gaa gat    1950
Val Asn Arg Glu Asp Tyr Ala Asp Tyr Thr Val Thr Val Pro Glu Asp    
    345                 350                 355
cgc atc tac aac att acc tat aac atc agt agc ggt att acc ggt gga    1998
Arg Ile Tyr Asn Ile Thr Tyr Asn Ile Ser Ser Gly Ile Thr Gly Gly
360                 365                 370                 375
cgt att gac ttc ctt gtc aat gaa agt gga acc tgg agc aac aag aca    2046
Arg Ile Asp Phe Leu Val Asn Glu Ser Gly Thr Trp Ser Asn Lys Thr
                380                 385                 390
cag aca gcg gta cct aat gcc ggc tgg aac aat ttc caa cca tta agc    2094
Gln Thr Ala Val Pro Asn Ala Gly Trp Asn Asn Phe Gln Pro Leu Ser
            395                 400                 405
gga ggt acg gtt tat ctc gaa gcc ggt aca cat act gtg aga ctt tac    2142
Gly Gly Thr Val Tyr Leu Glu Ala Gly Thr His Thr Val Arg Leu Tyr
        410                 415                 420
ggg gca ggt aca cac gac tgg cag tgg aat ctc gac aaa ttt acg ttg    2190
Gly Ala Gly Thr His Asp Trp Gln Trp Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu
    425                 430                 435
agc aac tgacaatcac caaagcaaaa ggccggagcg gaagctccct ccggcctttt     2246
Ser Asn
440
tctcagaaaa attcaggaga aaatgatccg atagagctcc gcccccacaa accgagcccg  2306
gttgcccaga ctccgttcga tccgcagtat ctcattccac ttcaccatcc gctcactccg  2366
ggcaaaggaa cccaccttga gctgaccggc gttagtggcc accgccaggt gtgcgatgaa  2426
ggcatcttcg gtttcgccgg agcgtgcaga gacgacgggg agccagccgg cttgctgggt    2486
catttcgatg gcggccatgg tttcggagac tgtgccgatc tgattgagtt tgatcagtac    2546
cgaattggcc agttggctgt cgatgccgtt ctggatgcgc tcgatattgg tggtgaacag    2606
gtcgtcgccg atgacctgca cgcgcttgcc cacttctgtg gtgaagcgtt tccagctgtc    2666
aaagtcagta tcggcgaagg gatcttctat ggagatgatg gggtacttgt cgcaccactg    2726
gatcatcaga tcgcagaatt c                                              2747
<210>4
<211>441
<212>PRT
<213>Microbulbifer sp.1325-A7
<400>4
Met Lys Thr Thr Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Phe Ser Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly
            20                  25                  30
Pro Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr
        35                  40                  45
Ser Ala Pro Ala Ser Gly Lys Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser
    50                  55                  60
Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Pro Asn Ser Ser Val Glu Ser Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser
                85                  90                  95
Arg Lys Ala Gly Thr Thr Lys Ile His Ala Gly Ala Ile His Ser Asn
            100                 105                 110
Glu Ser Val Thr Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Val Gln Val Thr
        115                 120                 125
Asn Leu Thr Met Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Gln Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu
145                 150                 155                 160
Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg
                165                 170                 175
Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Asp Gly Ser Trp Tyr Pro
            180                 185                 190
Asn Pro Asn Gly Gly Thr Trp Arg Asp Gln Trp Ile Arg Ile Gly Thr
        195                 200                 205
Tyr Trp Val Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His
    210                 215                 220
Val Arg Thr Val Thr Gly Pro Ser Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu
                245                 250                 255
His Gln Pro Trp Arg Asp Thr Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Pro Asp Thr Asn Gly Gly Gly Pro Gly Asn Gly
    290                 295                 300
Ser Ile Ser Val Glu Lys Glu Ala Glu Asp Phe Asp Asn Val Gly Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Phe Ser Asp Gly Gln Ser Gln Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Gly
                325                 330                 335
Ala Thr Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Arg Glu Asp Tyr Ala Asp Tyr
            340                 345                 350
Thr Val Thr Val Pro Glu Asp Arg Ile Tyr Asn Ile Thr Tyr Asn Ile
        355                 360                 365
Ser Ser Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ile Asp Phe Leu Val Asn Glu Ser
    370                 375                 380
Gly Thr Trp Ser Asn Lys Thr Gln Thr Ala Val Pro Asn Ala Gly Trp
385                 390                 395                 400
Asn Asn Phe Gln Pro Leu Ser Gly Gly Thr Val Tyr Leu Glu Ala Gly
                405                 410                 415
Thr His Thr Val Arg Leu Tyr Gly Ala Gly Thr His Asp Trp Gln Trp
            420                 425                 430
Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu Ser Asn
        435                 440
<210>5
<211>602
<212>PRT
<213>琼脂分解酶(RagaA3)
<400>5
Met Lys Thr Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Asp Trp Asp Asn Ile Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly
            20                  25                  30
Ala Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr
        35                  40                  45
Ala Ala Pro Pro Val Gly Lys Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser
    50                  55                  60
Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Pro Asn Ser Tyr Val Glu Gly Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser
                85                  90                  95
Arg Lys Pro Gly Thr Ile Lys Val His Thr Gly Ala Ile His Ser Lys
            100                 105                 110
Glu Ser Met Thr Tyr Pro Leu Phe Met Glu Ala Arg Val Lys Ile Thr
        115                 120                 125
Asn Leu Thr Leu Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Glu Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu
145                 150                 155                 160
Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg
                165                 170                 175
Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Pro
            180                 185                 190
Asn Pro Asp Gly Gly His Trp Arg Asp Gln Phe Phe Arg Ile Gly Val
        195                 200                 205
Tyr Trp Ile Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His
    210                 215                 220
Val Arg Thr Val Ser Gly Val Glu Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Asn Gly Asn Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu
                245                 250                 255
His Gln Pro Trp Arg Asp Ala Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Ala Asp Asn Asn Gly Gly Gly Asp Pro Asp Asn
    290                 295                 300
Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly Asn Pro Gly Ser Gly Glu Thr Ile
305                 310                 315                 320
Arg Val Glu Met Gly Ser Phe Ser Ala Thr Gly Lys Ala Gly Ala Ala
                325                 330                 335
Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Gly Phe Asn Ser Asn Gly Asp Asn Ile
            340                 345                 350
Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Gly Asp Tyr Thr Val Asn Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Ala Gly Asn Tyr Asn Val Glu Leu Leu Ala Ala Ser Pro Thr Thr
    370                 375                 380
Ser Gly Ile Ala Ala Asp Val Gln Val Asp Gly Ser Tyr Val Gly Thr
385                 390                 395                 400
Ile Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Trp Glu Leu Tyr Asn Thr Phe Thr
                405                 410                 415
Leu Pro Ser Thr Ile Tyr Ile Ala Ser Ala Gly Asn His Thr Ile Arg
            420                 425                 430
Val Gln Ser Ala Gly Gly Ser Ala Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile
        435                 440                 445
Arg Phe Thr Lys Thr Glu Asp Asp Asn Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala
    450                 455                 460
Thr Gly Ala Thr Ile Asn Val Glu Ala Glu Ser Phe Ala Ser Val Gly
465                 470                 475                 480
Gly Thr Tyr Ala Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ile Ser Val Tyr Thr Thr
                485                 490                 495
Asn Gly Ser Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Ala Gly Asp Phe Ala Asp
            500                 505                 510
Tyr Thr Ile Asn Val Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Ala Ile Thr Tyr His
        515                 520                 525
Val Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Ile Glu Phe Leu Val Asn Glu
    530                 535                 540
Gly Gly Ser Trp Asn Ser Lys Thr Ala Thr Pro Val Pro Asn Gln Gly
545                 550                 555                 560
Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asp Gly Gly Ser Val Tyr Leu Glu Ala
                565                 570                 575
Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly Val Gly Ser Asn Asp Trp Gln
            580                 585                 590
Trp Asn Leu Asp Lys Phe Val Leu Ser Asn
        595                 600
<210>6
<211>1809
<212>DNA
<213>琼脂分解酶(RagaA3)
<400>6
atgaaaacca cctctctcac tttggcggcc cttgcgctgt catcctccgc gctggctgcg    60
gactgggaca atattcccgt tcctgccgat gccggagccg gaaacacctg ggaactccac    120
agcctttctg acgatttcaa ctacgccgca ccacccgtcg gcaagagtgc gacctttttt    180
gagcgctgga gcgaaggctt tatcaacccc tggctgggcc cgggtgaaac cgagtactac    240
gcccccaact cctatgtgga aggcggtaac ctggtcatca aggccagccg caagcccggt    300
accatcaagg tgcatacagg cgccatccac tccaaggaga gcatgaccta tccgctgttt    360
atggaagcgc gggtaaaaat caccaacctc acactggcca atgcgttctg gctgctgagc    420
tcggattcca cagaagagat cgatgtactg gagtcctacg gcagtgaccg ccccagcgag    480
acctggtttg acgagcgcct gcacctcagc catcacgtat ttatccgcga gccgtttcag    540
gactaccagc cgaaagatgc ggggagctgg tatccgaacc ccgatggcgg ccactggcgt    600
gaccagtttt tccgtattgg cgtttactgg atcgacccgt ggacactgga gtactacgta    660
aatggtgagc acgtgcgcac cgtctccggt gttgaaatga ttgaccctta tggctacacc    720
aacggcaatg gcctcagcaa gccgatgcag gtcatctttg atgcggagca ccagccctgg    780
cgcgatgcgc aaggcactgc gccccccacc gatgaagagc tcgccgaccc aagccgcaac    840
aagttcctgg tggactgggt acgcttctac aagccagtgg cagacaacaa cgggggcggc    900
gacccagata atggcggtga tccaggtaat gggggcaacc caggaagtgg cgaaaccatt    960
cgcgttgaaa tgggcagctt ctccgctacc ggtaaagcag gcgccgccgt tgccggcgac    1020
accgttgctg gcttcaactc caatggcgac aacatcaact acaacaccct cggggattgg    1080
ggcgactaca ccgtaaactt cccggaagcg ggtaactaca acgtggaatt gctcgccgcc    1140
tcccccacca cttccggcat cgcagcggat gtgcaggtgg acggcagcta cgtaggtacc    1200
attcccctta gcagtaccgg tgactgggag ctgtacaaca catttaccct gccgagcacg    1260
atttatattg cttcagcagg caaccacacc atccgtgtac aaagcgctgg tggcagtgcc    1320
tggcagtgga acggcgatga aatacgcttt accaaaaccg aggatgacaa cacaccaccg    1380
ccgccaccag cgactggtgc caccatcaat gtggaagcgg aaagctttgc ttctgtcggc    1440
ggcacctatg ccgacgggca ggcgcagccc atcagcgttt acaccaccaa tggcagcacc    1500
gcgattaact acgtgaatgc cggtgacttt gccgactaca ccatcaatgt tgccgacgca    1560
ggcacctatg ccattaccta tcacgtgggt agcggcgtaa ccggtggcag cattgagttt    1620
ctggtgaacg aaggcggtag ctggaatagt aaaacggcaa cgcctgtacc gaaccagggc    1680
tgggacaact tccagccact agacggtggc agcgtctact tggaggcagg tacgcatcag    1740
gtgcgcctgc acggtgtcgg cagtaacgac tggcagtgga acctggataa gtttgtgctg    1800
agtaactaa                                                            1809
<210>7
<211>5021
<212>DNA
<213>Microbulbifer sp.1325-A3
<220>
<221>-35_信号
<222>(2259)..(2264)
<223>
<220>
<221>-10_信号
<222>(2284)..(2289)
<223>
<220>
<221>RBS
<222>(2414)..(2419)
<223>
<220>
<221>信号肽
<222>(2425)..(2481)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(2425)..(4230)
<223>
<400>7
aagctttggt ccctgggtcc aaccaccgaa gcgagagcgc ccctccagtg gttgctcgcg    60
caggatggat ccttcttcct cagcttgctg gcgcaaagtt gcaaccgaat ctaccttgcc    120
tgcaaattcg cgctttgtac tttgcccgaa ggcatcgact aaatctttca ggtagtcctg    180
atccaacgat tgcggttgaa tcaaacgaac attgtcgatg cgaatctctt tgtcttccag    240
cactccgaca acgttgaatt caatacgcgc aattgcgctc acatccaaat ctttcgcgcc    300
gtagcgaaag ataatgtctt ggtactcact ttcccatgaa ggcgggttgg accggatgcc    360
ggtctctacc ccaagatccg gacctttcag ctcaaagaag taggtgttat ccgagcgttc    420
tggcacgaca aaactgcggt tatgggtctt accctgttga tcgtgggctt tcacataaaa    480
atgcacggaa gatggctgct gattggcgat gtccagtgca aatgcaaacg tacccagttc    540
actccagtcc catggcgatt ggggtgaaaa ggaaaagccg gcggtgtagt ggttttccgt    600
ttgcagcttg atattcagtg cctgcccact cttgtcagtt gtgcctccaa ccaacgtggc    660
caccgcgtta tgcaatttga tctctggcgg tactgcagtg tcttcgaaat cccataaggc    720
ttcgccaatc gggcgcttat ccaattgcgc cgcactggtc tgctgctggc catccaaacg    780
ctcgccacag gcagctacca gcgctcccgc aaagcaagta aaagccagca acaagattcg    840
ataccgcatt gtgagtccca cctgaatgat tatgaaaata tggtgtgttt acgcaacctg    900
tggctcgacc gtggattctt cttcgccttc gtgaagcgta atttgctcga tttttccaac    960
gagaaacaaa taggaacaaa gccccaccac ggcaagcgca ccaatcaatg ccagggcagg    1020
acgaaaatca ccatcgtgtg cgagcgcccc gattgcgacc gggataatta cggcggacaa    1080
tccaccaaca aaattaaaac aaccgcctac cagtccgacc atatttttgg gcgcaatcaa    1140
ggagacaaat acccaggtga tagaggcgag gccattgcca aaaaaggcaa gagagaggaa    1200
aaatgtcacc gcggccgtag actccacata atttgcccca atcatcgagc aggagagcat    1260
tagcccaatg atgaccgggg ttttacgtga aaattcattg gagaaaccgc gccgcaccag    1320
ccaatcggag gtgaagccgg agagcaagac accgcaaaaa gcagcgagaa aaggaatgga    1380
agcaagaaag ccggttttta ggtcacccat accgcggtac tcggcgagat aggtaggaaa    1440
ccaggttaaa aagaaaatca gggtactgcc aaggcaaaac tggccgatgt aaattcccca    1500
cagtttgcgg ctagaaaacg ccaggcgcag gctctgccaa ttaattgccg cctgttgcgg    1560
ggccgcacgt acaggtttcg ccgccgctga atgggtttct gcttgcccgg catcctcttc    1620
ccgctctttg acgacgtctt gggaatctcc cgattcgcga tacaggaaat accaaaccac    1680
cgcccacacg atgccgataa ggcccgacac gataaacagg ccacgccaac caaaccactc    1740
ctgaatcacc gccagcacgg gcatcagaaa ggccaatcca ataaattgcc cagaggtata    1800
cacggcaatg gcactggcgc gctcacgctc agggaaccaa tgggtaacaa ttttattgtt    1860
cgcaggatac gagggcgctt caaacagccc gatcgccata cggcagccca ccagggccgc    1920
gagggagcta accaacccct gcacaaccgt cgccaacgac caggcgatca ggataaaggg    1980
gtacaggatc cgtacacgca ccgcatccac gatcatgccg ccgggaatct gcatgatgga    2040
ataggtccag gcgaacgccg aaaaaataat ccccatttgt accggagaga gctccaggtc    2100
ctgtgagatc gcattggccg caaccgaaat attggtgcgg tccatgtagt tgatcaccac  2160
actgatgaaa atcagtgcga gcacaccaaa cttgtcgctc tttacgctag cactgccgct  2220
ccgtcctttg gtcccgccgc tcatctgcct ggttactctt gttaatgcgc ttatcagcac  2280
tcttattatt ttgtgacgtg atcgagcaat cgctggctac accatcacga gaacaaggtc  2340
gccccttaca attgttaaca atttacatta ctctcctcgg cataacaata accgcccctc  2400
aaaccggggg cacaaggaga cgcg atg aaa acc acc tct ctc act ttg gcg     2451
                           Met Lys Thr Thr Ser Leu Thr Leu Ala
                           1               5
gcc ctt gcg ctg tca tcc tcc gcg ctg gct gcg gac tgg gac aat att    2499
Ala Leu Ala Leu Ser Ser Ser Ala Leu Ala Ala Asp Trp Asp Asn Ile
10                  15                  20                  25
ccc gtt cct gcc gat gcc gga gcc gga aac acc tgg gaa ctc cac agc    2547
Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly Ala Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Ser
                30                  35                  40
ctt tct gac gat ttc aac tac gcc gca cca ccc gtc ggc aag agt gcg    2595
Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Val Gly Lys Ser Ala
            45                  50                  55
acc ttt ttt gag cgc tgg agc gaa ggc ttt atc aac ccc tgg ctg ggc    2643
Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly
        60                  65                  70
ccg ggt gaa acc gag tac tac gcc ccc aac tcc tat gtg gaa ggc ggt    269l
Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr Ala Pro Asn Ser Tyr Val Glu Gly Gly
    75                  80                  85
aac ctg gtc atc aag gcc agc cgc aag ccc ggt acc atc aag gtg cat    2739
Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser Arg Lys Pro Gly Thr Ile Lys Val His
90                  95                  100                 105
aca ggc gcc atc cac tcc aag gag agc atg acc tat ccg ctg ttt atg    2787
Thr Gly Ala Ile His Ser Lys Glu Ser Met Thr Tyr Pro Leu Phe Met
                110                 115                 120
gaa gcg cgg gta aaa atc acc aac ctc aca ctg gcc aat gcg ttc tgg    2835
Glu Ala Arg Val Lys Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Asn Ala Phe Trp
            125                 130                 135
ctg ctg agc tcg gat tcc aca gaa gag atc gat gta ctg gag tcc tac    2883
Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr Glu Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr
        140                 145                 150
ggc agt gac cgc ccc agc gag acc tgg ttt gac gag cgc ctg cac ctc    2931
Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu Thr Trp Phe Asp Glu Arg Leu His Leu
    155                 160                 165
agc cat cac gta ttt atc cgc gag ccg ttt cag gac tac cag ccg aaa    2979
Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys
170                 175                 180                 185
gat gcg ggg agc tgg tat ccg aac ccc gat ggc ggc cac tgg cgt gac    3027
Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Pro Asn Pro Asp Gly Gly His Trp Arg Asp
                190                 195                 200
cag ttt ttc cgt att ggc gtt tac tgg atc gac ccg tgg aca ctg gag    3075
Gln Phe Phe Arg Ile Gly Val Tyr Trp Ile Asp Pro Trp Thr Leu Glu
            205                 210                 215
tac tac gta aat ggt gag cac gtg cgc acc gtc tcc ggt gtt gaa atg    3123
Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His Val Arg Thr Val Ser Gly Val Glu Met
        220                 225                 230
att gac cct tat ggc tac acc aac ggc aat ggc ctc agc aag ccg atg    3171
Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Asn Gly Asn Gly Leu Ser Lys Pro Met
    235                 240                 245
cag gtc atc ttt gat gcg gag cac cag ccc tgg cgc gat gcg caa ggc    3219
Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu His Gln Pro Trp Arg Asp Ala Gln Gly
250                 255                 260                 265
act gcg ccc ccc acc gat gaa gag ctc gcc gac cca agc cgc aac aag    3267
Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys
                270                 275                 280
ttc ctg gtg gac tgg gta cgc ttc tac aag cca gtg gca gac aac aac    3315
Phe Leu Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr Lys Pro Val Ala Asp Asn Asn
            285                 290                 295
ggg ggc ggc gac cca gat aat ggc ggt gat cca ggt aat ggg ggc aac    3363
Gly Gly Gly Asp Pro Asp Asn Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly Asn
        300                 305                 310
cca gga agt ggc gaa acc att cgc gtt gaa atg ggc agc ttc tcc gct    3411
Pro Gly Ser Gly Glu Thr Ile Arg Val Glu Met Gly Ser Phe Ser Ala
    315                 320                 325
acc ggt aaa gca ggc gcc gcc gtt gcc ggc gac acc gtt gct ggc ttc    3459
Thr Gly Lys Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Gly Phe
330                 335                 340                 345
aac tcc aat ggc gac aac atc aac tac aac acc ctc ggg gat tgg ggc    3507
Asn Ser Asn Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Gly
                350                 355                 360
gac tac acc gta aac ttc ccg gaa gcg ggt aac tac aac gtg gaa ttg    3555
Asp Tyr Thr Val Asn Phe Pro Glu Ala Gly Asn Tyr Asn Val Glu Leu
            365                 370                 375
ctc gcc gcc tcc ccc acc act tcc ggc atc gca gcg gat gtg cag gtg    3603
Leu Ala Ala Ser Pro Thr Thr Ser Gly Ile Ala Ala Asp Val Gln Val
        380                 385                 390
gac ggc agc tac gta ggt acc att ccc ctt agc agt acc ggt gac tgg    3651
Asp Gly Ser Tyr Val Gly Thr Ile Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Trp
    395                 400                 405
gag ctg tac aac aca ttt acc ctg ccg agc acg att tat att gct tca    3699
Glu Leu Tyr Asn Thr Phe Thr Leu Pro Ser Thr Ile Tyr Ile Ala Ser
410                 415                 420                 425
gca ggc aac cac acc atc cgt gta caa agc gct ggt ggc agt gcc tgg    3747
Ala Gly Asn His Thr Ile Arg Val Gln Ser Ala Gly Gly Ser Ala Trp
                430                 435                 440
cag tgg aac ggc gat gaa ata cgc ttt acc aaa acc gag gat gac aac    3795
Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile Arg Phe Thr Lys Thr Glu Asp Asp Asn
            445                 450                 455
aca cca ccg ccg cca cca gcg act ggt gcc acc atc aat gtg gaa gcg    3843
Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Gly Ala Thr Ile Asn Val Glu Ala
        460                 465                 470
gaa agc ttt gct tct gtc ggc ggc acc tat gcc gac ggg cag gcg cag    3891
Glu Ser Phe Ala Ser Val Gly Gly Thr Tyr Ala Asp Gly Gln Ala Gln
    475                 480                 485
ccc atc agc gtt tac acc acc aat ggc agc acc gcg att aac tac gtg    3939
Pro Ile Ser Val Tyr Thr Thr Asn Gly Ser Thr Ala Ile Asn Tyr Val
490                 495                 500                 505
aat gcc ggt gac ttt gcc gac tac acc atc aat gtt gcc gac gca ggc    3987
Asn Ala Gly Asp Phe Ala Asp Tyr Thr Ile Asn Val Ala Asp Ala Gly
                510                 515                 520
acc tat gcc att acc tat cac gtg ggt agc ggc gta acc ggt ggc agc    4035
Thr Tyr Ala Ile Thr Tyr His Val Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser
            525                 530                 535
att gag ttt ctg gtg aac gaa ggc ggt agc tgg aat agt aaa acg gca    4083
Ile Glu Phe Leu Val Asn Glu Gly Gly Ser Trp Asn Ser Lys Thr Ala
        540                 545                 550
acg cct gta ccg aac cag ggc tgg gac aac ttc cag cca cta gac ggt    4131
Thr Pro Val Pro Asn Gln Gly Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asp Gly
    555                 560                 565
ggc agc gtc tac ttg gag gca ggt acg cat cag gtg cgc ctg cac ggt    4179
Gly Ser Val Tyr Leu Glu Ala Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly
570                 575                 580                 585
gtc ggc agt aac gac tgg cag tgg aac ctg gat aag ttt gtg ctg agt    4227
Val Gly Ser Asn Asp Trp Gln Trp Asn Leu Asp Lys Phe Val Leu Ser
                590                 595                 600
aac taatcaccag tcatacaaac taaaaaaggg ggccagtggc cccctttttt         4280
Asn
agttacgcga tacaaaatac agcactacaa gtcactacca ctaaaaggca gtggctgctc  4340
gcttacctct tgcgggtcaa acggtaactt tttgggatca accggtgcgg tataaatctc    4400
cacggtctca ggtcgcacat tttccagtcc agtcaatgca ggtcccggcg ttgcgtccgg    4460
gcgattgggg tattttttaa tccacagttc gtggcgctgc cgctgccggt tgaacatgct    4520
ctttacatga aactgttcga tcatctcgcc atgcatttca cgcgggtcgg taaacaggtc    4580
gtagaactca ttttttgaca agcccacttc ggcattcttc cagtcccgct tgaagcgccc    4640
cttaacgcca gccgccagat atggcccctg gtaaatcatc acatagtcgc ggcgactgaa    4700
cccgtcccca ttcaggaaca gcgacgtctg gtccacgcca tcgataatcc ggtcgcgcgg    4760
tatgtatttc ttggcgccac ccaggttggc gaacgtggta tacaaatcgg tgacatgcaa    4820
tatatccccg acaatctgcc cgggcttaat gacacccggc caggttgcca gcatgggcac    4880
ccgcaccccg ccctcggtaa agtccccttt accgccacgg tataaggtct ccaccatgcc    4940
gcgcgggccg tagtggataa agggaccatt gtcggccatc actattacca gcgtattttc    5000
ggcgatgccg  tgtctctgca g                                             502l
<210>8
<21l>602
<212>PRT
<213>Microbulbifer sp.1325-A3
<400>8
Met Lys Thr Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Asp Trp Asp Asn Ile Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly
            20                  25                  30
Ala Gly Asn Thr Trp Glu Leu His Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr
        35                  40                  45
Ala Ala Pro Pro Val Gly Lys Ser Ala Thr Phe Phe Glu Arg Trp Ser
    50                  55                  60
Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Leu Gly Pro Gly Glu Thr Glu Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Pro Asn Ser Tyr Val Glu Gly Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Ser
                85                  90                  95
Arg Lys Pro Gly Thr Ile Lys Val His Thr Gly Ala Ile His Ser Lys
            100                 105                 110
Glu Ser Met Thr Tyr Pro Leu Phe Met Glu Ala Arg Val Lys Ile Thr
        115                 120                 125
Asn Leu Thr Leu Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Glu Glu Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Ser Glu
145                 150                 155                 160
Thr Trp Phe Asp G1u Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg
                165                 170                 175
Glu Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Pro
            180                 185                 190
Asn Pro Asp Gly Gly His Trp Arg Asp Gln Phe Phe Arg Ile Gly Val
        195                 200                 205
Tyr Trp Ile Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu His
    210                 215                 220
Val Arg Thr Val Ser Gly Val Glu Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Asn Gly Asn Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln VaI Ile Phe Asp Ala Glu
                245                 250                 255
His Gln Pro Trp Arg Asp Ala Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Arg Asn Lys Phe Leu Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Ala Asp Asn Asn Gly Gly Gly Asp Pro Asp Asn
    290                 295                 300
Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly Asn Pro Gly Ser Gly Glu Thr Ile
305                 310                 315                 320
Arg Val Glu Met Gly Ser Phe Ser Ala Thr Gly Lys Ala Gly Ala Ala
                325                 330                 335
Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Gly Phe Asn Ser Asn Gly Asp Asn Ile
            340                 345                 350
Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Gly Asp Tyr Thr Val Asn Phe Pro
        355                 360                 365
Glu Ala Gly Asn Tyr Asn Val Glu Leu Leu Ala Ala Ser Pro Thr Thr
    370                 375                 380
Ser Gly Ile Ala Ala Asp Val Gln Val Asp Gly Ser Tyr Val Gly Thr
385                 390                 395                 400
Ile Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Trp Glu Leu Tyr Asn Thr Phe Thr
                405                 410                 415
Leu Pro Ser Thr Ile Tyr Ile Ala Ser Ala Gly Asn His Thr Ile Arg
            420                 425                 430
Val Gln Ser Ala Gly Gly Ser Ala Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile
        435                 440                 445
Arg Phe Thr Lys Thr Glu Asp Asp Asn Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala
    450                 455                 460
Thr Gly Ala Thr Ile Asn Val Glu Ala Glu Ser Phe Ala Ser Val Gly
465                 470                 475                 480
Gly Thr Tyr Ala Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ile Ser Val Tyr Thr Thr
                485                 490                 495
Asn Gly Ser Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Ala Gly Asp Phe Ala Asp
            500                 505                 510
Tyr Thr Ile Asn Val Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Ala Ile Thr Tyr His
        515                 520                 525
Val Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Ile Glu Phe Leu Val Asn Glu
    530                 535                 540
Gly Gly Ser Trp Asn Ser Lys Thr Ala Thr Pro Val Pro Asn Gln Gly
545                 550                 555                 560
Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asp Gly Gly Ser Val Tyr Leu Glu Ala
                565                 570                 575
Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly Val Gly Ser Asn Asp Trp Gln
            580                 585                 590
Trp Asn Leu Asp Lys Phe Val Leu Ser Asn
        595                 600
<210>9
<211>433
<212>PRT
<213>琼脂分解酶(RagaB)
<400>9
Met Arg Lys Ile Thr Ser Ile Leu Leu Thr Cys Val Met Gly Cys Thr
1               5                   10                  15
Ala Thr Tyr Ala Ala Asp Trp Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Asn Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Gly Lys Thr Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn
        35                  40                  45
Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser Thr Arg Phe Tyr Glu Arg Trp
    50                  55                  60
Lys Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Glu Trp
65                  70                  75                  80
His Pro His Tyr Ser Tyr Val Ser Gly Gly Lys Leu Ala Ile Thr Ser
                85                  90                  95
Gly Arg Lys Pro Gly Thr Asn Gln Val Tyr Leu Gly Ser Ile Thr Ser
            100                 105                 110
Lys Ala Pro Leu Thr Tyr Pro Val Tyr Met Glu Ala Arg Ala Lys Leu
        115                 120                 125
Ser Asn Met Val Leu Ala Ser Asp Phe Trp Phe Leu Ser Ala Asp Ser
    130                 135                 140
Thr Glu Glu Ile Asp Val Ile Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Gln Glu Trp Tyr Ala Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile
                165                 170                 175
Arg Asp Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Thr Asp Ala Gly Ser Trp Tyr
            180                 185                 190
Ala Asp Gly Lys Gly Thr Lys Trp Arg Asp Ala Phe His Arg Val Gly
        195                 200                 205
Val Tyr Trp Arg Asp Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Val Asp Gly Lys
    210                 215                 220
Leu Val Arg Thr Val Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asp Pro Asn Gly Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Tyr Ala Ile Ile Asn Met
                245                 250                 255
Glu Asp Gln Asn Trp Arg Ser Asp Asn Gly Ile Thr Pro Thr Asp Ala
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Asn Arg Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Pro Ile Asn Gly Asn Ala Thr Thr Val Glu Leu
    290                 295                 300
Gly Asn Phe His Asn Thr Gly Lys Asp Gly Ala Asn Val Thr Gly Asp
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu Gly Phe Asn Lys Asn Gly Asn Asn Ile Asn Tyr Asn Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Asp Trp Ala Asp Tyr Thr Val Asn Leu Pro Ala Ala Gly Glu
            340                 345                 350
Tyr Arg Val Asp Leu Val Ile Ala Ser Pro Met Ser Ser Gly Leu Gly
        355                 360                 365
Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly Asn Ala Ala Lys Thr Val Thr Leu Ser
    370                 375                 380
Asn Thr Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Gln Thr Phe Thr Leu Pro Gln Thr
385                 390                 395                 400
Ile Ser Val Ser Ser Pro Gly Asn Tyr Asn Phe Arg Leu Lys Ser Thr
                405                 410                 415
Gly Ser Ser Asn Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile Arg Phe Val Lys
            420                 425                 430
Leu
<210>10
<211>1302
<212>DNA
<213>琼脂分解酶(RagaB)
<400>10
atgagaaaaa taacctcaat actactcacg tgtgtaatgg gctgtaccgc gacatacgcc    60
gcagattggg atggagttcc cgtacccgcc aaccccggga gcggcaaaac ctgggagcta    120
catcccctct cagacgactt caactacgag gcaccggccg ccggtaaaag cacccgcttc    180
tacgagcgtt ggaaagaggg ctttattaac ccctggaccg ggccaggcct gaccgagtgg    240
cacccgcact actcctacgt cagcggcggc aaactggcta tcacctccgg gcgcaaaccg    300
ggcacaaacc aggtatatct cggcagcatt acatcaaaag cgccccttac ctaccccgtc    360
tatatggaag cccgagccaa actgagcaat atggttctgg cctccgattt ctggttcctg    420
agtgcagact caacagaaga gatcgatgtt atcgaagcct acggcagtga ccgcccaggg    480
caggaatggt atgcagaacg gctgcacctc agccaccatg tattcattcg cgaccccttt    540
caggactatc agcccacgga tgcgggttcc tggtatgcgg acggcaaagg aaccaagtgg    600
cgggatgctt tccaccgtgt cggcgtttac tggcgtgacc cctggcacct ggagtactac    660
gtggatggaa agctggttcg cactgtttcg ggccaggaca tcatagaccc caacgggttc    720
actggcggca ccggtctcag taaacctatg tacgccatta tcaatatgga agatcaaaac    780
tggcgctcgg ataacggcat tacccctacc gatgccgagc tagccgatcc caaccgcaat    840
acctactacg tagactgggt acggttctac aagcccgttc ccatcaacgg caatgcaacc    900
accgttgagc ttggaaactt ccacaacacg ggtaaagacg gcgctaatgt gaccggtgat    960
acagtgttgg gcttcaacaa aaacggcaac aacatcaact acaacaccaa gggcgactgg    1020
gctgactaca ctgtcaacct gcccgctgcc ggcgagtacc gcgtcgatct ggttatcgcg    1080
tctcccatga gcagcggtct gggcgcagaa ctcacctttg ccggcaatgc agccaaaacc    1140
gtgacactct caaataccgg cggctgggag tcctatcaaa cattcactct cccacaaacc    1200
attagcgtct catcccccgg caactacaac ttccgattga aaagcactgg cagcagtaac    1260
tggcagtgga atggcgatga aatccgcttt gtgaagctgt aa                       1302
<210>11
<211>3910
<212>DNA
<213>Microbulbifer sp.A94
<220>
<221>-35_信号
<222>(442)..(447)
<223>
<220>
<221>-10_信号
<222>(465)..(470)
<223>
<220>
<221>RBS
<222>(498)..(503)
<223>
<220>
<221>信号肽
<222>(512)..(571)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(512)..(1810)
<223>
<400>11
ctgcagggac tcagccaaat tggtatccgg gaatttgccg atgtcctcgg cggaaattgc    60
ctccacaaca ccggaagagt ctctcttaat atccatggca ttggtcaagg actggcggat    120
accggttacg gtaatctctt ccagagccgc gtcaccatag ttagaagtct cttgcgcttg    180
cagattgaca ctggcggcaa ctacagcagc ggacaaggcg ctcaagtgga agcgcttatt    240
attgataggc atgggtgctt ctctcttcat ccgggcgctc gatgcctagg tccaagtcct    300
tttgaccaag ggatagagtg cctcattgtt attggataga acctctcggt acagccgccg    360
ggagtggtgg attattggtt atccactcac gtggctgacg cgaatatcct gggcgcatgc    420
tcacccaatg tcaatagtta attgtagatt gtcaacaaaa ctgctatggt cgcggctcca    480
ataatgataa tgacccaaag gagaaaccgc g atg aga aaa ata acc tca ata       532
                                   Met Arg Lys Ile Thr Ser Ile
                                   1               5
cta ctc acg tgt gta atg ggc tgt acc gcg aca tac gcc gca gat tgg      580
Leu Leu Thr Cys Val Met Gly Cys Thr Ala Thr Tyr Ala Ala Asp Trp
        10                  15                  20
gat gga gtt ccc gta ccc gcc aac ccc ggg agc ggc aaa acc tgg gag      628
Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Asn Pro Gly Ser Gly Lys Thr Trp Glu
    25                  30                  35
cta cat ccc ctc tca gac gac ttc aac tac gag gca ccg gcc gcc ggt      676
Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Gly
40                  45                  50                  55
aaa agc acc cgc ttc tac gag cgt tgg aaa gag ggc ttt att aac ccc      724
Lys Ser Thr Arg Phe Tyr Glu Arg Trp Lys Glu Gly Phe Ile Asn Pro
                60                  65                  70
tgg acc ggg cca ggc ctg acc gag tgg cac ccg cac tac tcc tac gtc    772
Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Glu Trp His Pro His Tyr Ser Tyr Val
            75                  80                  85
agc ggc ggc aaa ctg gct atc acc tcc ggg cgc aaa ccg ggc aca aac    820
Ser Gly Gly Lys Leu Ala Ile Thr Ser Gly Arg Lys Pro Gly Thr Asn
        90                  95                  100
cag gta tat ctc ggc agc att aca tca aaa gcg ccc ctt acc tac ccc    868
Gln Val Tyr Leu Gly Ser Ile Thr Ser Lys Ala Pro Leu Thr Tyr Pro
    105                 110                 115
gtc tat atg gaa gcc cga gcc aaa ctg agc aat atg gtt ctg gcc tcc    916
Val Tyr Met Glu Ala Arg Ala Lys Leu Ser Asn Met Val Leu Ala Ser
120                 125                 130                 135
gat ttc tgg ttc ctg agt gca gac tca aca gaa gag atc gat gtt atc    964
Asp Phe Trp Phe Leu Ser Ala Asp Ser Thr Glu Glu Ile Asp Val Ile
                140                 145                 150
gaa gcc tac ggc agt gac cgc cca ggg cag gaa tgg tat gca gaa cgg    1012
Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly Gln Glu Trp Tyr Ala Glu Arg
            155                 160                 165
ctg cac ctc agc cac cat gta ttc att cgc gac ccc ttt cag gac tat    1060
Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Asp Pro Phe Gln Asp Tyr
        170                 175                 180
cag ccc acg gat gcg ggt tcc tgg tat gcg gac ggc aaa gga acc aag    1108
Gln Pro Thr Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Ala Asp Gly Lys Gly Thr Lys
    185                 190                 195
tgg cgg gat gct ttc cac cgt gtc ggc gtt tac tgg cgt gac ccc tgg    1156
Trp Arg Asp Ala Phe His Arg Val Gly Val Tyr Trp Arg Asp Pro Trp
200                 205                 210                 215
cac ctg gag tac tac gtg gat gga aag ctg gtt cgc act gtt tcg ggc    1204
His Leu Glu Tyr Tyr Val Asp Gly Lys Leu Val Arg Thr Val Ser Gly
                220                 225                 230
cag gac atc ata gac ccc aac ggg ttc act ggc ggc acc ggt ctc agt    1252
Gln Asp Ile Ile Asp Pro Asn Gly Phe Thr Gly Gly Thr Gly Leu Ser
            235                 240                 245
aaa cct atg tac gcc att atc aat atg gaa gat caa aac tgg cgc tcg    1300
Lys Pro Met Tyr Ala Ile Ile Asn Met Glu Asp Gln Asn Trp Arg Ser
        250                 255                 260
gat aac ggc att acc cct acc gat gcc gag cta gcc gat ccc aac cgc    1348
Asp Asn Gly Ile Thr Pro Thr Asp Ala Glu Leu Ala Asp Pro Asn Arg
    265                 270                 275
aat acc tac tac gta gac tgg gta cgg ttc tac aag ccc gtt ccc atc    1396
Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr Lys Pro Val Pro Ile
280                 285                 290                 295
aac ggc aat gca acc acc gtt gag ctt gga aac ttc cac aac acg ggt    1444
Asn Gly Asn Ala Thr Thr Val Glu Leu Gly Asn Phe His Asn Thr Gly
                300                 305                 310
aaa gac ggc gct aat gtg acc ggt gat aca gtg ttg ggc ttc aac aaa    1492
Lys Asp Gly Ala Asn Val Thr Gly Asp Thr Val Leu Gly Phe Asn Lys
            315                 320                 325
aac ggc aac aac atc aac tac aac acc aag ggc gac tgg gct gac tac    1540
Asn Gly Asn Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Lys Gly Asp Trp Ala Asp Tyr
        330                 335                 340
act gtc aac ctg ccc gct gcc ggc gag tac cgc gtc gat ctg gtt atc    1588
Thr Val Asn Leu Pro Ala Ala Gly Glu Tyr Arg Val Asp Leu Val Ile
    345                 350                 355
gcg tct ccc atg agc agc ggt ctg ggc gca gaa ctc acc ttt gcc ggc    1636
Ala Ser Pro Met Ser Ser Gly Leu Gly Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly
360                 365                 370                 375
aat gca gcc aaa acc gtg aca ctc tca aat acc ggc ggc tgg gag tcc    1684
Asn Ala Ala Lys Thr Val Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gly Trp Glu Ser
                380                 385                 390
tat caa aca ttc act ctc cca caa acc att agc gtc tca tcc ccc ggc    1732
Tyr Gln Thr Phe Thr Leu Pro Gln Thr Ile Ser Val Ser Ser Pro Gly
            395                 400                 405
aac tac aac ttc cga ttg aaa agc act ggc agc agt aac tgg cag tgg      1780
Asn Tyr Asn Phe Arg Leu Lys Ser Thr Gly Ser Ser Asn Trp Gln Trp
        410                 415                 420
aat ggc gat gaa atc cgc ttt gtg aag ctg taatgccacc ctaccccgca        1830
Asn Gly Asp Glu Ile Arg Phe Val Lys Leu
    425                 430
gtgcctgcca cgggcgctgc ggcaaccatt gcaccaccgc gccggctctc cggcgcggtg    1890
gtcccgacac cagagatgcc atagcacaac agccccaatc taacgccaac tggcacactc    1950
gtacagttta aaaattgacc atctcttgcc gaacagacac cttctggctg agccccgtct    2010
aatcagcgaa acgcagacaa atgctatcta tgatcgcaaa ttaataaatt attgctatga    2070
cttctattcc accactctac cgcttcgaat taagggaccg ctgattaatt ctcggggttt    2130
tcccagatac ttcactcccg gctcttaaag aaggcgggcg ccaggggaaa gaagctcaac    2190
tgatggggtg ggcatttaag gaacctctga ttaagtcact ttctggtggc agaggcgctt    2250
cgggggcgga tgtgaagctc aggtgatagg acggacattt cgaaaccgtc ggagctacag    2310
ggaagtactc gtgcgttttc gaaatgcccg tcctatttcc tgagcgcccc ggaagctacc    2370
atagtgtcca cgcgaattaa tcagaggttc cttaaagccc atcgaatacg ggatgagagc    2430
tacagcgaag tacttgtgcg cttccgaaat attcacccat tgcctgagca tcttggaagt    2490
tgtacagcac ttagctaaat aaatcacaag cccgtctgtt aatcagttag caggtacaat    2550
ttggaagccc tctaatcttc ctattgcatt ttgctacgtt gctttacttt ttccgtaaat    2610
ctcgcactaa gtatgatttt cgagggctct agtggccagc tctttttggc catcacaaca    2670
ttacaggacg gatggaaaca caatacaaaa tcttcagaac agctacttaa acaccgaagc    2730
ccgcacatta aaaagcacca ggtctacaag tctctcttaa aaacttatta cgtgtcagaa    2790
ccagggcatt tacgctctac ttttggtaga accactccat ctaaaccagc atgtgcacca    2850
caagagaaga tgtatcttgc acagtgcgca tttgtgtcac ttattgttaa ttttccgccc    2910
tcaaaagaaa ataccaactt gcagttaata tcgtattctg gatcgtcctc actatagaca    2970
agcgtgttat caacatatgc cattttcagc ggaccttcat ctccctcaag cggagaacct    3030
atatggcaaa catgaaagtt ccccccctga atgacgccat ccacaaagaa gtcatcggca    3090
acctttgaga cttctatata tgttagtttt ccctctgact cattggacac aaggctggtg    3150
atttcatcac ttttcaaata gcagccttcc attgcaacag cctgcgtcga gcccacaaaa    3210
agcaatccag tcaacggtat aaactttatc atctcatcct cataacacag aacacccggc    3270
taatggcgcc aacgctgtga acagcctact ttaagctgtt tattatactt acggctcttc    3330
gcacagtatg agctctggtt ctgattaaag tattttggcc aacttatcat tcagcttccc    3390
cagaggagac gttaaggaac ctctgattaa ttcgcgtaag cgctccggaa tcaactacag    3450
cgctcattcg aattaatccg agtctcccta aataaagtga gtgaagaatg gaggcacggc    3510
tgacgggtgt aactggttat tgctcaaacc atccgccgca gtggctgccc ttccctcaga    3570
gccttttcgt agacttctgc aaaatgctcc ttcagccaat ccattagccc acgtactctt    3630
ttcagttgat gccggtgcgg tgggcagacc agtgacagct gagttgtttc ggaccactct    3690
ggaagcactt ccaccagatc accccgcgcg atatctgcct gcacatgggt gtcggtcagc    3750
cgtgtgactc caagaccgga aagagccgcc tgacgcatgg cacgtccgct tacaattcta    3810
aaaccatttt ttgctcgaat cagttgctgc tcgtctcccc gctccagtag ccaatggtca    3870
acactaccgt agataagcgg cagctcccgt aggtctgcag                          3910
<210>12
<211>433
<212>PRT
<213>Microbulbifer sp.A94
<400>12
Met Arg Lys Ile Thr Ser Ile Leu Leu Thr Cys Val Met Gly Cys Thr
1               5                   10                  15
Ala Thr Tyr Ala Ala Asp Trp Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Asn Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Gly Lys Thr Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn
        35                  40                  45
Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser Thr Arg Phe Tyr Glu Arg Trp
    50                  55                  60
Lys Glu Gly Phe Ile Asn Pro Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Glu Trp
65                  70                  75                  80
His Pro His Tyr Ser Tyr Val Ser Gly Gly Lys Leu Ala Ile Thr Ser
                85                  90                  95
Gly Arg Lys Pro Gly Thr Asn Gln Val Tyr Leu Gly Ser Ile Thr Ser
            100                 105                 110
Lys Ala Pro Leu Thr Tyr Pro Val Tyr Met Glu Ala Arg Ala Lys Leu
        115                 120                 125
Ser Asn Met Val Leu Ala Ser Asp Phe Trp Phe Leu Ser Ala Asp Ser
    130                 135                 140
Thr Glu Glu Ile Asp Val Ile Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Gln Glu Trp Tyr Ala Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile
                165                 170                 175
Arg Asp Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Thr Asp Ala Gly Ser Trp Tyr  
            180                 185                 190
Ala Asp Gly Lys Gly Thr Lys Trp Arg Asp Ala Phe His Arg Val Gly
        195                 200                 205
Val Tyr Trp Arg Asp Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Val Asp Gly Lys
    210                 215                 220
Leu Val Arg Thr Val Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asp Pro Asn Gly Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Gly Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Tyr Ala Ile Ile Asn Met
                245                 250                 255
Glu Asp Gln Asn Trp Arg Ser Asp Asn Gly Ile Thr Pro Thr Asp Ala
            260                 265                 270
Glu Leu Ala Asp Pro Asn Arg Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Trp Val Arg
        275                 280                 285
Phe Tyr Lys Pro Val Pro Ile Asn Gly Asn Ala Thr Thr Val Glu Leu
    290                 295                 300
Gly Asn Phe His Asn Thr Gly Lys Asp Gly Ala Asn Val Thr Gly Asp
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu Gly Phe Asn Lys Asn Gly Asn Asn Ile Asn Tyr Asn Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Asp Trp Ala Asp Tyr Thr Val Asn Leu Pro Ala Ala Gly Glu
            340                 345                 350
Tyr Arg Val Asp Leu Val Ile Ala Ser Pro Met Ser Ser Gly Leu Gly
        355                 360                 365
Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly Asn Ala Ala Lys Thr Val Thr Leu Ser
    370                 375                 380
Asn Thr Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Gln Thr Phe Thr Leu Pro Gln Thr
385                 390                 395                 400
Ile Ser Val Ser Ser Pro Gly Asn Tyr Asn Phe Arg Leu Lys Ser Thr
                405                 410                 415
Gly Ser Ser Asn Trp Gln Trp Asn Gly Asp Glu Ile Arg Phe Val Lys
            420                 425                 430
Leu

Claims (10)

1.一种琼脂分解酶，其氨基酸序列是序列号9所表示的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸，其为(a3)编码如序列表的序列号9所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其为(c3)核苷酸序列是序列表的序列号10所示的核苷酸序列的多核苷酸。
4.一种重组载体，其具有权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种微生物，其以权利要求4所述的重组载体进行了转化。
6.一种琼脂分解酶的制造方法，其特征在于，对权利要求5所述的微生物进行培养，从培养物中提取琼脂分解酶。
7.一种新琼脂寡聚糖的制造方法，其特征在于，将权利要求1所述的琼脂分解酶作用于藻类，从而得到新琼脂寡聚糖。
8.一种藻类原生质体的制造方法，其特征在于，将权利要求1所述的琼脂分解酶作用于藻类，从而得到原生质体。
9.一种回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，其特征在于，将权利要求1所述的琼脂分解酶作用于施用了DNA的琼脂糖凝胶，以此回收琼脂糖凝胶中的DNA。
10.保藏号为FERM BP-8321的微球茎菌属sp.A94。
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