CN104388411B

CN104388411B - 一种琼胶酶及其基因和应用

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Publication number: CN104388411B
Application number: CN201410721829.0A
Authority: CN
Inventors: 叶秀云; 李仁宽; 陈增; 杨光; 林娟
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: CN104388411A

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种琼胶酶及其基因、含有该基因的重组载体和细胞，以及该琼胶酶的表达和应用。所述琼胶酶的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。将所述琼胶酶用于降解富含琼胶的底物，主要产物为二糖、四糖类的寡聚糖，实现琼胶酶的生产产业化。本发明利用基因工程手段克隆表达了琼胶酶，实现了琼胶酶的规模制备，获得了优质的琼胶酶产品。本发明通过酶活测定和底物特异性的分析，证明本发明的琼胶酶对琼胶和龙须菜有很好的分解能力。

Description

一种琼胶酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种琼胶酶及其基因、含有该基因的重组载体和细胞，以及该琼胶酶的表达和应用。

背景技术

海洋细菌中的琼胶降解菌是目前产生琼胶酶最多的一类微生物，目前研究者所研究的琼胶酶大部分都是来自于海洋细菌。已知的琼胶降解菌主要来自于几个菌属，包括：Vibrio（弧菌属），Pseudomonas（假单胞菌属），Pseudoalteromonsa（假交替单胞菌属），Alteromonas （交替单胞菌属），Agarivorans（食琼脂菌属），Saccharophagus（噬糖菌属），Microscilla （微颤菌属）和 Pseudozobellia（假佐贝尔氏菌属）等。另外，从土壤和淡水中也发现了一些能够产生琼胶酶的细菌，如 Cellvibrio（纤维弧菌属），Acinetobacter（不动杆菌属），Bacillus（芽孢杆菌属），Cytophaga(噬细胞菌属) 等。

根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式的不同，可以把琼胶酶分为两大类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为非还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖作为还原性末端的琼寡糖系列；而β-琼胶酶则裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为作还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖作为非还原性末端的新琼寡糖系列。在文献报道中，已确认的β–琼胶酶比α–琼胶酶更为丰富。

已报道的β-琼胶酶主要被划分为几类糖苷水解酶家族(Glycosidehydrolasefamily,GH)，如 GH-l6，GH-50和GH-86等。Jam等对来自于ZobelliagalactanivoransDsij的两个属于GH-16的琼胶酶A和B的晶体结构进行了测定，结果发现，其具有“三明治”式的三维结构以及由两个酸性氨基酸Glu构成的活性中心。还有极少数的β–琼胶酶是来自于一些新型的糖苷水解家族的，如马翠萍等在假交替单胞菌CY24中克隆了一个β–琼胶酶AgaB，经研究发现，此琼胶酶不属于任何一个已经报道过的糖苷水解家族。而已经报道的α-琼胶酶则都属于GH-96家族。

在重组酶的研究中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌通常被用于重组琼胶酶的宿主。在大多数情况下，重组琼胶酶产生于大肠杆菌的胞内，然而一些琼胶酶在自身信号肽的控制下能够分泌到培养基中。据报道，从Vibrio sp.V134和Agarivorans sp.LQ48克隆的琼胶酶存在于培养基和细胞沉淀中。目前，已有不少β–琼胶酶进行了克隆表达，克隆的β–琼胶酶的分子量从30kDa到147kDa不等。通过比较SDS-PAGE结果和预测的蛋白分子量，发现二者是一致的，这证明这些重组的琼胶酶都是单一的多肽。此外，这些琼胶酶的酶的比活大小不一，其中从来自海水的假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.CY24中克隆的rAgaB降解琼脂糖的酶比活最大，为5,000U/mg。

琼胶酶降解琼脂生成琼胶寡糖，而琼胶寡糖又分为琼寡糖和新琼寡糖。大量的报道证明，琼胶寡糖由于其特有的生理和生化特性而具有很高的经济价值。寡糖的混合物能够清除羟自由基、超氧化阴离子自由基，抑制脂质过氧化，从而表现出各种抗氧化特性。研究表明，具有硫酸基团的或高分子量的寡糖比没有硫酸基团、低分子量的寡糖的抗氧化能力强。此外，新琼寡糖还能抑制细菌的生长，减缓淀粉的降解，作为低能量的添加剂提高食品的品质。低聚合度的产物，如新琼二糖，对皮肤有保湿的作用，并且能够抑制黑色素瘤细胞的产生，具有美白功效。琼胶酶能够用于降解红藻细胞壁，以便从海藻中提取易分解的生物活性物质，例如不饱和脂肪酸、维生素和类胡萝卜素等。因此，由于新琼寡糖具有以上这些特性，使其在食品、制药和化妆品行业具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种海洋微生物来源的琼胶酶及其基因和应用，实现琼胶酶的生产产业化。

本发明首先提供了一种琼胶酶，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

本发明还提供了编码所述的琼胶酶的琼胶酶基因。

所述琼胶酶基因的核苷酸序列如 SEQ NO.2所示。

本发明保护一种包含所述琼胶酶基因的重组载体。所述重组载体是大肠杆菌质粒pET28a(+)-Agarase或酵母质粒pPIC9k-Agarase。

本发明还保护一种细胞，所述细胞含有所述的琼胶酶基因的核苷酸序列；或所述细胞由包含所述的琼胶酶基因的重组载体经转化宿主细胞而得；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

本发明还提供了所述的琼胶酶基因的克隆方法，步骤包括：利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，通过PCR技术获得微泡菌（Microbulbifer sp.）一段琼胶酶的编码基因；再通过genome walking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。

以及，一种所述的重组载体的制备方法:采用所述琼胶酶基因的核苷酸序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET28a(+)-Agarase，或采用所述的琼胶酶基因的核苷酸序列经EcoRI和 Not I双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

另外，本发明还保护一种所述的琼胶酶的制备方法：培养含有琼胶酶基因的细胞或培养包含琼胶酶基因的重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

以及，所述琼胶酶的应用，利用本发明的琼胶酶降解富含琼胶的底物，主要产物为二糖、四糖类的寡聚糖。

详述

本发明涉及从微泡菌（Microbulbifer sp.）中克隆琼胶酶基因。实施方式之一，本发明利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，获取微泡菌（Microbulbifer sp.）基因中一段琼胶酶的编码基因；再通过 genome walking 技术获得全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO.2所示的核酸序列，称之为Agarase。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO.2 中的核苷酸1至824所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述琼胶酶编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明琼胶酶编码基因经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET28a(+)-Agarase。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明琼胶酶编码基因经EcoRI和 NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

本发明还制备包含本发明琼胶酶编码基因的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌BL21(DE3)和的毕赤酵母GS115 构建表达琼胶酶的重组细胞。

本发明还提供了制备和应用琼胶酶的方法，包括：培养前文所述本发明包含琼胶酶编码基因的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明琼胶酶编码基因的酵母(例如毕赤酵母GS115)发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。实施方式之一中，本发明通过设计琼胶酶降解琼胶及龙须菜实验，验证了本发明琼胶酶在琼胶寡糖制备中应用的可行性。

本发明利用基因工程手段克隆表达了琼胶酶，实现了琼胶酶的规模制备，获得了优质的琼胶酶产品。本发明通过酶活测定和底物特异性的分析，证明本发明的琼胶酶对琼胶和龙须菜有很好的分解能力。

附图说明

图1为微泡菌（Microbulbifer sp.）来源的琼胶酶基因在质粒pET28a(+)和pPIC9k上的结构图。

图2为毕赤酵母表达微泡菌（Microbulbifer sp.）来源琼胶酶的发酵过程中的SDS-PAGE；其中1-发酵60h；2-发酵84h；3-发酵98h；4-发酵122h；5-发酵146h；6-发酵170h；7-发酵194h；M- marker。

图3A为毕赤酵母表达微泡菌（Microbulbifer sp.）来源琼胶酶的纯化，阴离子交换层析条件：平衡液：Tris-HCl pH 8.0,0.05mM；洗脱液：Tris-HCl pH 8.0.0,05mM，1MNacl；流速2.5mL/min；

图3B为毕赤酵母表达微泡菌（Microbulbifer sp.）来源琼胶酶的SDS-PAGE，检验发酵液过DEAE所得到的洗脱峰。

图4为毕赤酵母表达微泡菌（Microbulbifer sp.）来源琼胶酶对琼胶的分解能力，其中1、2、3、4、5分别表示底物与酶反应时间为15min、30min、1h、2h、20h，6、7、8、9、10、11分别表示为糖标准品单糖、二糖、三糖、四糖、五糖以及混合糖。

图5为毕赤酵母表达微泡菌（Microbulbifer sp.）来源琼胶酶对龙须菜的分解能力，其中1、龙须菜悬浊液；2-4、琼胶酶液降解龙须菜的产物分析；5、二糖；6、四糖。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实施例

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌BL21（DE3）、JM109、DH5α及表达载体pET28a(+)购自Novagen公司，毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Maker、Protein Maker均购自Fermentas（MBI），genomewalking kit购自TaKaRa公司，琼胶购自上海生工，龙须菜：市售；其他常规试剂为上海生工或进口。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指琼胶酶酶活性，均采用DNS法并按照所述的方法进行测定及计算。

实施例1 琼胶酶基因的获得

（1）微泡菌（Microbulbifer sp.）基因组DNA的分离提取：

取1.5mL微泡菌（Microbulbifer sp.）（中国海洋微生物菌种保藏管理中心）菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；加入400μL裂解液（40mMTris-醋酸，20 mM醋酸钠，1mM EDTA，1% SDS，pH 7.8）混匀，置于37℃水浴1h；然后加入200μL l5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH8.0)，-20℃保存1h后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μLTE溶液中，置4℃保存备用。

（2）琼胶酶保守序列的获取

对NCBI已有的琼胶酶基因进行分析，设计简并引物以扩增琼胶酶基因保守序列。

PCR程序为： 94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（3）genome walking 获取目的基因

以获得的琼胶酶保守序列为模板，根据genome walking kit进行操作。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因，测序。

（4） PCR获取目的基因

以由genome walking扩增得到的最终序列为模板，设计上下游引物P1和P2。上、下游引物分别含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：

P1：5' gaattcGACTGGGATGGCACCCCGGTACCGG 3'

P2：5' gcggccgcTTAACCGCCGCCGGTCGCCACTGGC 3'

PCR程序为： 94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（5）亚克隆：

制备好的双链cDNA插入到载体系统pMD18-T上，得到重组质粒pMD18-Agarase，用化学转化法转化受体菌DH5α，在含有100mg/ml Amp的LB平板上37℃培养过夜。挑取的单克隆菌落接种到2ml含有100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养6-10h，10000rpm离心10min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A. Gel Extraction Kit试剂盒）。将所得目的基因进行DNA序列测定（Invitrogen公司），并在NCBI数据库中进行比对分析，表明所得基因及编码的氨基酸序列为全新基因及氨基酸序列。

由此所得到的琼胶酶的编码序列共有834bp（SEQ ID NO:2），其中第832-834位为终止密码子TAA、第1-831位编码不含信号肽的成熟蛋白，该成熟蛋白含有277个氨基酸（SEQID NO:1）。

实施例2 琼胶酶编码基因在大肠杆菌中的表达

将实施例1-(4)中所得到的目的基因，与经过EcoR I 和NotI双酶切的pET28a(+)质粒连接，得到重组质粒pET28a(+)-Agarase（如图1所示）。

取10μL构建好的质粒DNA，加入到100μL制备好的感受态细大肠杆菌BL21(DE3)中，摇匀置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中热击90s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入400μL SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mMMgCl₂，10mM MgSO₄，20mM 葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h（80rpm～200rpm）；离心，4000rpm×5min，除去400μL上清，剩余部分混匀；涂平板（LB-agar平板，含100μg/ml Amp），37℃正置1h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)，接种于50ml LB培养液中（250ml三角瓶，100μLg/ml Amp），37℃ 250rpm振荡培养1-1.5h，加入IPTG诱导（终浓度为2μmol/ml），37℃ 250rpm再振荡培养3-3.5h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/5体积pH6.0，50mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60%功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液分析琼胶酶活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明该琼胶酶可在大肠杆菌中表达，且酶活力约为50 U/ml。

实施例3 酵母重组表达载体的构建与表达

将实施例1-(4)中所得到的目的基因，与经过EcoR I 和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-Agarase（如图1所示）。

以所得pPIC9k 重组质粒为模板，以引物P1和引物P2构成的引物对进行PCR，同时，以实施例2制备的pET28a(+)重组质粒与引物P1和引物P2所构成的引物对做PCR，从DNA 水平上验证外源基因插入是否正确。PCR 所得到的2种产物序列长度均为894bp，与实施例1中从微泡菌（Microbulbifer sp.）中所得到的琼胶酶原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

制备的重组质粒经SacI酶切，得到线性化质粒pPIC9k-Agarase。取构建好的线性重组质粒DNA 50μg，直接加入到仍在0℃以下的感受态细胞中(毕赤酵母GS115)；加入1.0ml含5μg/ml 的鲑鱼精DNA 的溶液II(40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5μL 1mg/ml 的鲑鱼精DNA 并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h 以上，每隔15min 轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0mL 的溶液III(0.15M NaCl，10mM N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g 离心5min，移去800μL 上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200μL 菌液涂YPD 平板(YP 和20%D 单独灭菌，倒平板之前按1:9 向YP 中加入20%D；筛选抗性为80ug/ml Amp)，30℃倒置培养3-4 天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组质粒pPIC9k-Agarase转化的毕赤酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150mLYPD培养液中，30℃ 250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2 ml/L磷酸，0.80 g/L硫酸钙，18.7 g/L硫酸钾,15.5 g/L硫酸镁，4.17 g/L氢氧化钾，Glucose 40 g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1 (30 mM硫酸铜，0.54 mM碘化钠，17.6 mM硫酸锰，0.80 mM钼酸钠，0.32 mM硼酸，2.4 mM氯化钴，0.18 mM氯化锌，0.24 mM硫酸亚铁，1.6 mM生物素，0.19 M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25mL/h的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到160g/L。

在诱导阶段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔24hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定琼胶酶活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图2所示。发酵达194h时，菌湿重可达到330g/L，重组琼胶酶的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到5020U/ml，这说明微泡菌（Microbulbifer sp.）来源的琼胶酶基因均在毕赤酵母中得到了高效表达。

实施例4 重组琼胶酶的纯化

将实施例3所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用截留分子量为6000Da的外压式中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至55％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，置于截留分子量为6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mM Tris-HCl为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16h，中间每隔4h更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。

取20mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2ml Tris-HCl（pH8.0，50mM）缓冲液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl EDAE-650C阴离子柱。先用pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定琼胶酶活力及蛋白电泳分析。（图3A）

纯化完成后，微泡菌（Microbulbifer sp.）来源的琼胶酶比活性从粗酶液的1237U/mg提高到纯酶的6447U/mg，纯化倍数为5.21，得率为41.8。SDS-PAGE结果（图3B）。

实施例5 重组琼胶酶酶解琼胶和龙须菜的分析

琼胶能够用于制备琼胶寡糖，琼胶寡糖因在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌等众多方面具有生理活性而备受关注。然而，作为一种天然多糖，琼胶的分子量大、粘度高、溶解性低，因此难以被人体分解吸收，不能发挥琼胶寡糖的生理活性。因此，通过降解琼胶制备能够被人体直接吸收的琼胶寡糖，就成为一个极为有意义的研究。本专利中利用生产的重组琼胶酶来探讨其降解琼胶和龙须菜的效果。

1、重组琼胶酶酶解琼胶的分析

（1）材料：实施例4发酵得到的琼胶酶酶液，0.3%琼胶底物，层析纸，层析液（正丁醇:乙醇:水=2:1:1），染色液（苯胺-二苯胺），糖标准品等。

（2）实验过程：①将0.5mL的琼胶酶液与4.5mL的底物在混合液50℃下保温，分别保温15min、30min、1h、2h、20h；②将保温后的混合液在层析纸中上样，各加50 μL；糖标准品也依次在层析纸中上样；③层析3-4h；④将层析纸吹干，用染色液对层析纸染色。染完色后，放入70℃烘箱烘干，15min后观察实验结果。

结果由图可知，琼胶酶与底物的最终产物主要是二糖和四糖。实验结果如图4所示。

2、重组琼胶酶酶解龙须菜的分析

参照（实施例5：重组琼胶酶酶解琼胶的分析）进行实验。染完色后，放入70℃烘箱烘干，15min后观察实验结果。结果显示琼胶酶对龙须菜有很强分解能力，且其产物主要是二糖和四糖。实验结果如图5所示。

<110> 福州大学

<120> 一种琼胶酶及其基因和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> 微泡菌（Microbulbifer sp.）

<400> 1

Asp Trp Asp Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Gly Glu Gly Asn Val

1 5 10 15

Trp Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Glu Ala Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Lys Ser Thr Ala Phe Tyr Glu Arg Trp Lys Glu Gly Phe Ile

35 40 45

Asn Pro Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Glu Trp His Pro Glu Tyr Ser

50 55 60

Leu Val Ser Asn Gly Arg Leu Gln Ile Lys Ser Gly Arg Lys Pro Gly

65 70 75 80

Thr Asn Gln Val Tyr Leu Gly Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr Leu Thr

85 90 95

Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Ala Lys Leu Ser Asn Met Val Leu

100 105 110

Ala Ser Asp Phe Trp Leu Leu Ser Ala Asp Ser Thr Glu Glu Ile Asp

115 120 125

Val Ile Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly Gln Glu Trp Phe Ala

130 135 140

Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe Gln

145 150 155 160

Asp Tyr Gln Pro Thr Asp Ala Gly Thr Trp Tyr Ala Asp Gly Lys Gly

165 170 175

Thr His Trp Ala Asp Gly Tyr His Arg Val Gly Val Tyr Trp Arg Asp

180 185 190

Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Val Asp Gly Gln Leu Val Arg Thr Ala

195 200 205

Ser Gly Ser Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gly Phe Thr Ser Gly Thr Gly

210 215 220

Leu Ser Lys Pro Met His Ala Ile Ile Asn Met Glu Asp Gln Ser Trp

225 230 235 240

Arg Ser Asp Asn Gly Ile Thr Pro Thr Asp Ala Glu Leu Ala Asp Pro

245 250 255

Asn Arg Asn Thr Tyr Asn Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr Lys Pro Val

260 265 270

Ala Thr Gly Gly Gly

275

<210> 2

<211> 834

<212> DNA

<213> 微泡菌（Microbulbifer sp.）

<400> 2

gactgggatg gcaccccggt accggcagac ccaggtgaag gcaatgtttg ggagctgcac 60

ccgctttccg acgatttcaa ttatgaggcc ccggctgccg gtaaaagcac ggcattttac 120

gagcgctgga aggaaggctt tatcaacccc tggaccgggc cgggcctgac cgaatggcac 180

ccggaatact cactggtcag caatggccgc ctgcaaatca aatccggccg caagccgggc 240

accaatcagg tgtatctggg cagcattacc tcaaagacca ccctcaccta tccgctgtat 300

atggaagcgc gtgccaaact gagcaatatg gtactggctt ccgatttctg gctgctgagt 360

gcggattcca ccgaagagat cgacgtgatt gaggcctacg gcagtgaccg cccagggcag 420

gagtggtttg ccgagcgcct gcacctttcg caccacgtgt ttatccgcga gccattccag 480

gattaccagc caaccgatgc tggtacttgg tacgccgatg gcaagggcac ccactgggcc 540

gatggctatc atcgtgtcgg ggtttactgg cgtgatccct ggcacctgga gtactacgtg 600

gatgggcagc tggtacgcac ggcgtccggg tccgagatca tcgatcccaa cggctttacc 660

agcggcaccg gtctgagcaa gccgatgcac gccattatca atatggaaga tcagagctgg 720

cgctccgaca acggcatcac tcctacagat gccgagctgg ccgatccaaa tcgcaatacc 780

tacaacgtgg actgggtgcg cttttataag ccagtggcga ccggcggcgg ttaa 834

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaattcgact gggatggcac cccggtaccg g 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggccgctt aaccgccgcc ggtcgccact ggc 33

Claims

1.一种琼胶酶，其特征在于：所述琼胶酶的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

2.一种琼胶酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的琼胶酶。

3.根据权利要求2所述的琼胶酶基因，其特征在于：所述琼胶酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

4.包含如权利要求2所述的琼胶酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为大肠杆菌质粒pET28a(+)-Agarase或酵母质粒pPIC9k-Agarase。

6.一种细胞，其特征在于：所述细胞含有权利要求2所述的琼胶酶基因的核苷酸序列；或所述细胞由包含权利要求2所述的琼胶酶基因的重组载体经转化宿主细胞而得；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

7.一种如权利要求2所述的琼胶酶基因的克隆方法，其特征在于：所述琼胶酶的克隆方法包括以下步骤：利用琼胶酶氨基酸保守片段设计简并引物，通过PCR技术获得微泡菌（Microbulbifer sp.）一段琼胶酶的编码基因；再通过genome walking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。

8.一种如权利要求5所述的重组载体的制备方法，其特征在于：所述重组载体的制备方法为：采用权利要求2所述琼胶酶基因的核苷酸序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体pET28a(+)-Agarase，或采用所述的琼胶酶基因的核苷酸序列经EcoRI和 Not I双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

9.一种如权利要求1所述的琼胶酶的制备方法，其特征在于：培养含有琼胶酶基因的细胞或培养包含琼胶酶基因的重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

10.一种如权利要求1所述的琼胶酶的应用，其特征在于：利用所述琼胶酶降解富含琼胶的底物。