CN105296448A

CN105296448A - 一种琼胶酶及其制备方法

Info

Publication number: CN105296448A
Application number: CN201510745912.6A
Authority: CN
Inventors: 李仁宽; 叶秀云; 陈增
Original assignee: Fujian Fuda Biotech Co Ltd
Current assignee: Fujian Fuda Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明提供一种琼胶酶及其制备方法，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述琼胶酶的核苷酸序列的如SEQ？NO.1所示；琼胶酶的氨基酸序列如SEQ？NO.2所示；核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述琼胶酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。本发明制备出能够高效表达并分泌琼胶酶的重组生产株，实现琼胶酶的生产产业化，对琼胶和龙须菜有良好的水解能力。

Description

一种琼胶酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种琼胶酶、其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的琼胶酶在大肠杆菌中的表达和在酵母细胞中的发酵生产。

技术背景

琼胶酶是一类来自海洋微生物细胞和海洋动物体内的一种水解酶，可以水解琼脂产生琼胶寡糖。近几年，随着糖生物学的高度发展和深入研究，越来越多的海藻多糖及其水解产物得到了许多学者高度的关注，其中对于琼胶寡糖的研究就是其中的重要的一例。琼胶寡糖有多种重要的生物活性，加之其在保健食品工业上的应用与发展，有关琼胶寡糖的研究及应用成为了结构化学、分子生物学、医学和食品学等研究领域的热点之一。

对琼胶酶的研究较早的是在1957年，Yaphe用来白大西洋假单胞菌属的琼胶酶进行了对美国Difco琼脂、新西兰Davis琼脂和石花菜属、江篱属、鸡毛菜属以及龙须菜等的水解研究，表明了该琼胶酶对这些底物均有水解作用。同时进行了对含有多糖结构的角叉菜胶的水解研究，该琼胶酶对其没有水解作用。该琼胶酶水解底物产生的低聚糖都以新琼二糖作为基本结构单元。

1968年，Duckworth等从一株噬细胞菌属细菌培养液中分离纯化得到胞外琼胶酶。该琼胶酶作用于紫菜胶的最佳pH条件为7.2,温度为40~41℃。其作用方式为内切，可以在低浓度下快速降低琼胶和紫菜胶的粘度。对很多多糖的水解作用表明该琼胶酶对琼脂结构的糖类具有高度的专一性。1969年，Duckworth等对同样从噬细胞菌属细菌培养液中分离纯化得到琼胶酶进行研究，表明了该琼胶酶对于新琼二糖、新琼四糖或其含有6-O-甲基-D-半乳糖还原端的类似物没有活性。对新琼八糖的作用方式表明其为切断中心的D-半乳糖苷键生成两分子的四糖，但是对于八聚糖和六聚糖的外部的D-半乳糖苷键的水解作用很弱。该琼胶酶对硫酸盐化的低聚糖的水解表明在低聚糖中必须要有新琼四糖还原端。

1990年，Aoki等采用硫酸钱沉淀、连续的柱色谱法从一株弧菌属种分离纯化出一种声琼胶酶。该琼胶酶的相对分子量20kDa，最适作用pH值为5.5,在pH4.0-9.0范围内和温度为45℃以下都很稳定。该琼胶酶是一种内切酶，并且对新琼四糖、聚合度较大的寡聚糖和琼胶都具有水解作用，但是对卡拉胶没有水解作用。

1992年，Leon等从一株交替单胞菌属菌株中分离纯化出一种胞外的琼胶酶，研究了该琼胶酶的一些酶学性质。其相对分子质量为52kDa，对一些盐敏感，最佳作用pH值约为6.5。1993年，potin等对单胞菌属的菌株GJ1B产生的琼胶酶进行了分离纯化，该琼胶酶系α-琼胶酶。他们对1978年发现的末鉴定的菌株GJ1B进行了研究，利用¹³C-NMR研究了该菌株水解琼脂的产物，并且将该菌株归类为单胞菌属。

2002年，Suzuki等从杆菌MK03中分离纯化得到一种能够水解低聚合度的α-琼胶寡糖的水解酶。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析以及凝胶柱层析的方法对酶进行了分离纯化，SDS-PAGE和凝胶柱分别表明该酶的相对分子量为320kDa和42kDa，说明了其为八聚糖。该水解酶能够水解新琼二糖的a-1,3糖苷键，其N-末端的氨基酸序列和当时己知的水解琼胶寡糖的酶和琼胶酶都没有相似性，因此是个新型的α-琼胶寡糖水解酶。

Ohta等在2005年从一株嗜盐菌JAMB-A33中分离得到一种α-琼胶酶，该菌株分离自日本海域的污泥中。分离得到的a-琼胶酶相对分子质量为85kDa该琼胶酶水解琼脂的作用方式为外切型的，主要的产物为新琼四糖，同时还可以水解新琼六糖以及紫菜胶。

2008年，Fu等从嵘螺的内脏中分离到的海洋细菌Agarivoransalbus。Lee等2000年研究了从海洋中分离得到的假单胞菌W7产生的β-琼胶酶的基因序列，此琼胶酶由1926by的开放阅读框，由642个氨基酸组成，其相对分子质量为69,540Da。其中259个氨基酸的缺失会导致编码的蛋自完全失去水解琼脂的活性，说明了这259个氨基酸是编码该琼胶酶必不可少的氨基酸，有着重要的作用。

其后，随着生物工程技术的高度发展和对琼胶酶研究的日益深入，许多学者都进行了琼胶酶的基因克隆研究，使琼胶酶的产量和酶活都很大程度地提高了对科学研究和工业应用都作出了重要的贡献。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种琼胶酶及基因和制备方法，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，解决上述现有技术的不足之处，制备出能够高效表达并分泌琼胶酶的重组生产株，实现琼胶酶的生产产业化。

一种琼胶酶，所述琼胶酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

一种琼胶酶基因，编码权利要求1所述琼胶酶；所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

包含所述琼胶酶基因的重组载体，所述载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒。所述的载体为pPIC9k-Agarase。

包含所述的琼胶酶基因的细胞，所述细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述细胞由权利要求3所述重组载体转化而得。所述细胞是包含所述琼胶酶核苷酸序列或用所述重组载体转化的大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞。

琼胶酶基因的制备方法，所述琼胶酶的制备步骤包括：琼胶酶基因的获得：从海泥中筛选得到一株能在琼胶平板上产生透明圈的微生物，通过16srDNA分析鉴定为耐热微球菌Microbulbiferthermotolerans；利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，获得其一段琼胶酶的编码基因；再通过genomewalking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。

所述的琼胶酶基因的重组载体的制备方法，所述琼胶酶基因的重组载体的制备为：采用权利要求2所述琼胶酶基因编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

琼胶酶基因的细胞的构建方法，所述细胞是用所述重组载体转化来构建的；所述细胞选大肠杆菌细胞和酵母细胞，选用大肠杆菌和毕赤酵母构建表达琼胶的重组细胞。

所述的琼胶酶的制备方法，培养所述包含琼胶酶基因、的细胞或包含琼胶酶基因的重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物：通过包含本发明琼胶酶基因的酵母发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

详述

本发明涉及从海洋环境中筛选琼胶酶产生菌及克隆琼胶酶基因。实施方式之一，本发明提取经16srDNA鉴定为microbulbiferthermotolerans基因组DNA，利用Agarase氨基酸保守片段的简并引物，获取一段Agarase的编码基因；再通过genomewalking技术获得全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Agarase基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQIDNO.1所示的核酸序列，称之为Agarase。实施方式之一中，所述编码序列是SEQIDNO.1中的核苷酸1至1311所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述Agarase编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Agarase编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

本发明还制备包含本发明Agarase编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用毕氏酵母GS115构建表达Agarase的重组细胞。

本发明还提供了表达Agarase的方法，包括：培养前文所述本发明包含Agarase编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Agarase编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115)发酵来生产Agarase，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌Agarase的重组生产株，实现了Agarase的生产产业化，并获得了优质的Agarase产品。本发明通过酶活测定和底物特异性的分析，证明本发明的Agarase对琼胶有很好的分解能力。

附图说明

图1耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase在质粒pPIC9k上的重组子结构图。其中A为Agarase与PMD18-T载体的重组质粒.B为Agarase与pPIC9k载体的重组质粒。

图2毕氏酵母表达耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase的SDS-PAGE。1-发酵46h；2-发酵53h；3-发酵70h；4-发酵101h；5-发酵142h；6-发酵166h；7-发酵190h；M-proteinmarker。

图3毕氏酵母表达耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase的发酵过程中产酶曲线图。

图4毕氏酵母表达耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase纯化过程中样品的SDS-PAGE。其中A-毕氏酵母表达耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase的DEAE-650C阴离子色谱纯化结果，图中1为洗脱峰，色谱条件：平衡缓冲液：0.04mol/LPBSpH7.0；洗脱缓冲液：0.04mol/LPBS+0.1mol/LNaCl，pH7.0；0.04mol/LPBS+0.2mol/LNaCl，pH7.0；0.04mol/LPBS+0.3mol/LNaCl，pH7.0；0.04mol/LPBS+0.4mol/LNaCl，pH7.0；流速：2.0mL/min；上样量10mL。B-为Agarase纯化结果的SD-PAGE图，图中M-ProteinMarker，1-图4-A中的洗脱峰；2-Agarase的发酵原液。C-Agarase的最适反应pH测定结果。D-Agarase的最适反应温度测定结果。

图5毕氏酵母表达耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)来源Agarase对琼胶的分解能力。1—底物与酶的反应液；2—混合糖标准样品（单糖、二糖、三糖、四糖、五糖）。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实施例

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌JM109、DH5α及表达载体pET28a(+)购自Novagen公司，毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNAMaker、ProteinMaker均购自Fermentas（MBI），genomewalkingkit购自TaKaRa公司，琼胶购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA），龙须菜：市售；其他常规试剂为上海生工或进口。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指Agarase酶活性，均采用DNS法并按照所述的方法进行测定及计算。

实施例1Agarase基因的获得

根据genomewalkingkit进行操作。

（1）Microbulbiferthermotolerans基因组DNA的分离提取：

取1.5mL菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min，丢去上清液，收集菌体。

加入400μL裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，1mMEDTA，1%SDS，pH7.8）混匀，置于37℃水浴1h。

然后加入200μLl5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH8.0)，-20℃保存1h后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μLTE溶液中，置4℃保存备用。

（2）Agarase保守序列的获取

对NCBI已有的Agarase基因进行分析，设计简并引物以扩增Agarase基因保守序列。

本研究PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（3）genomewalking获取目的基因

以获得的Agarase保守序列为模板，根据genomewalkingkit进行操作。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（4）PCR获取目的基因

以由genomewalking扩增得到的最终序列为模板，设计上下游引物P1和P2。上、下游引物分别含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：

P1：5'gaattcGCGGACTGGGATGGCACCCCGGTAC3'

P2：5'gcggccgcttaTTAGGACTGTTTTACAAAGCGGATC3'

本研究PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（4）cDNA亚克隆：

制备好的双链cDNA插入到载体系统pMD18-T上，得到重组质粒pMD18T-Agarase（如图1所示），用化学转化法转化受体菌DH5α，在含有100mg/mlAmp的LB平板上37℃培养过夜。挑取的单克隆菌落接种到2mL含有100mg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养6-10h，10000rpm离心10min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI和E.Z.N.A.GelExtractionKit试剂盒）。将所得目的基因进行DNA序列测定（Invitrogen公司），并在NCBI数据库中进行比对分析，结果分别如SEQIDNO:1所示。

由此所得到的Agarase的编码序列(不含信号肽基因序列)共有1311bp（SEQIDNO:1），其中第1309-1311位为终止密码子TAA、第1-1308位编码不含信号肽的成熟蛋白，该成熟蛋白含有437个氨基酸（SEQIDNO:2）。根据在NCBI数据库里同源性比对的结果初步确定所得到的基因片段为Agarase。

取重组大肠杆菌菌株pMD18-T，接种于50mlLB培养液中（250ml三角瓶，含100μg/mLAmp），37℃250rpm振荡培养6-10h，取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI和E.Z.N.A.GelExtractionKit试剂盒）。

实施例2酵母重组表达载体的构建

将实施例1中所得到的目的基因，与经过到EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-Agarase（如图1所示）。

以所得pPIC9k重组质粒为模板，以引物P1和引物P2构成的引物对进行PCR，同时，以实施例1制备的pMD18-T重组质粒与引物P1和引物P2所构成的引物对做PCR，从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。PCR所得到的2种产物序列长度均为1311bp，与实施例1中从Microbulbiferthermotolerans中所得到的Agarase原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例3毕氏酵母发酵生产重组Agarase

将实施例2制备的重组质粒经SacI酶切，得到线性化质粒pPIC9k-Agarase1。

取构建好的线性重组质粒DNA50μg，直接加入到仍在0℃以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0ml含5μg/ml的鲑鱼精DNA的溶液II(40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2MN,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5μL1mg/ml的鲑鱼精DNA并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0mL的溶液III(0.15MNaCl，10mMN,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800μL上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200μL菌液涂YPD平板(YP和20%D单独灭菌，倒平板之前按1:9向YP中加入20%D；筛选抗性为80ug/mlAmp)，30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组质粒pPIC9k-Agarase1转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150mLYPD培养液中，30℃250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾,15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，Glucose40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸铜，0.54mM碘化钠，17.6mM硫酸锰，0.80mM钼酸钠，0.32mM硼酸，2.4mM氯化钴，0.18mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25mL/h的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/LPTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到160g/L。

在诱导阶段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/LPTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔24hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定Agarase活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图2所示。发酵190h时，菌湿重可达到243.57g/L，Agarase的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到4444.03U/ml，这说明Microbulbiferthermotolerans来源的Agarase基因均在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例4重组Agarase的纯化

将实施例3所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用截留分子量为6000Da的外压式中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至55％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，置于截留分子量为6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mMTris-HCl为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16h，中间每隔4h更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。

取20mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2mlTris-HCl（pH8.0，50mM）缓冲液，使其充分溶解后，上TOSOHToyopearlDEAE-650C阴离子柱。先用pH8.0，50mMTris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.8mol/LNaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定Agarase活力及蛋白电泳分析。SDS-PAGE结果（图3）表明，Microbulbiferthermotolerans来源的Agarase纯化后仅有单一的条带，分子量均约为44kDa。

实施例5重组Agarase的酶学性质分析

将实施例4所制备的Agarase在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH4.0-8.0的广泛缓冲液（柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、巴比妥）。Agarase在不同的pH的缓冲液中，50℃下测定pH的适性结果，表明Microbulbiferthermotolerans来源的Agarase的最适pH为7.0（图4）。

最适反应温度的测定在磷酸盐（pH7.0）缓冲体系及不同温度下（35℃-75℃）进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理10-60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果（图4）表明，Agarase的最适反应温度为50℃。

实施例6重组Agarase酶解琼胶的分析

琼胶能够用于制备琼胶寡糖，琼胶寡糖因在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌等众多方面具有生理活性而备受关注。然而，作为一种天然多糖，琼胶的分子量大、粘度高、溶解性低，因此难以被人体分解吸收，不能发挥琼胶寡糖的生理活性。因此，通过降解琼胶制备能够被人体直接吸收的琼胶寡糖，就成为一个极为有意义的研究。本专利中利用生产的重组Agarase来探讨其降解琼胶的效果。

1、重组Agarase酶解琼胶的分析

（1）材料：发酵得到的琼胶酶酶液，0.3%琼胶底物，层析纸，层析液（其中各体积比正丁醇:乙醇:水=2:1:1），染色液（苯胺-二苯胺），糖标准品等。

（2）实验过程：①将0.5mL的琼胶酶液与0.5mL的底物在混合液50℃下保温1h。

②取保温后的混合液10μL在层析纸中上样，上样过程中要保证层析纸一直保持干燥状态。取2μL糖标准品在层析纸中上样。

③上样完成后，将层析纸放入层析液中，3-4h。

④将层析纸层析液中拿出，用吹风机吹干。再用染色液对层析纸染色，保证染色均匀。染完色后，放入70℃烘箱烘干，15min后观察实验结果。结果由图可知，琼胶酶与底物的最终产物主要是二糖和四糖。实验结果如图5所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建福大百特科技发展有限公司

<120>一种琼胶酶及其制备方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1311

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcggactgggatggcaccccggtaccggcagacccaggtgaaggcaatgtttgggagctg60

cacccgctttccgacgatttcaattatgaggccccggctgccggtaaaagcacggcattt120

tacgagcgctggaaggaaggctttatcaacccctggaccgggccgggcctgaccgaatgg180

cacccggaatactcactggtcagcaatggccgcctgcaaatcaaatccggccgcaagccg240

ggcaccaatcaggtgtatctgggcagcattacctcaaagaccaccctcacctatccgctg300

tatatggaagcgcgtgccaaactgagcaatatggtactggcttccgatttctggctgctg360

agtgcggattccaccgaagagatcgacgtgattgaggcctacggcagtgaccgcccaggg420

caggagtggtttgccgagcgcctgcacctttcgcaccacgtgtttatccgcgagccattc480

caggattaccagccaaccgatgctggtacttggtacgccgatggcaagggcacccactgg540

gccgatggctatcatcgtgtcggggtttactggcgtgatccctggcacctggagtactac600

gtggatgggcagctggtacgcacggcgtccgggtccgagatcatcgatcccaacggcttt660

accagcggcaccggtctgagcaagccgatgcacgccattatcaatatggaagatcagagc720

tggcgctccgacaacggcatcactcctacagatgccgagctggccgatccaaatcgcaat780

acctacaacgtggactgggtgcgcttttataagccagtggcgaccggcggcggttccagc840

agtggcggcagcagctctggtggtagttcaggtggcagttccggcggcagcacagacggc900

gacgtgaccaccgttgagttgggagatttctatagcaccgggaaagacggggtgagcgtg960

tctggcgatacggtgcctggcttcaaccgcaatggcagtaacatcaactacaacaccagc1020

ggcgactggggcgattacaccgtcaccctgccagaagccggcgattaccgggtagagctg1080

gtcaccgcttcccccatgaccggcgagctgggtgcagaactgcagtttaacggcagcaca1140

ctcgtatcagcgctcggtaacaccggaggctgggagtcgtaccaggccacccagtttgcg1200

cagaccgtatcggtcagtgctgccggtgactacggcttcagggtgaaaagcatcggtacc1260

agtgcctggcagtggaatggcgatgcgatccgctttgtaaaacagtcctaa1311

<210>2

<211>436

<212>PRT

<213>氨基酸

<400>2

AlaAspTrpAspGlyThrProValProAlaAspProGlyGluGlyAsn

151015

ValTrpGluLeuHisProLeuSerAspAspPheAsnTyrGluAlaPro

202530

AlaAlaGlyLysSerThrAlaPheTyrGluArgTrpLysGluGlyPhe

354045

IleAsnProTrpThrGlyProGlyLeuThrGluTrpHisProGluTyr

505560

SerLeuValSerAsnGlyArgLeuGlnIleLysSerGlyArgLysPro

65707580

GlyThrAsnGlnValTyrLeuGlySerIleThrSerLysThrThrLeu

859095

ThrTyrProLeuTyrMetGluAlaArgAlaLysLeuSerAsnMetVal

100105110

LeuAlaSerAspPheTrpLeuLeuSerAlaAspSerThrGluGluIle

115120125

AspValIleGluAlaTyrGlySerAspArgProGlyGlnGluTrpPhe

130135140

AlaGluArgLeuHisLeuSerHisHisValPheIleArgGluProPhe

145150155160

GlnAspTyrGlnProThrAspAlaGlyThrTrpTyrAlaAspGlyLys

165170175

GlyThrHisTrpAlaAspGlyTyrHisArgValGlyValTyrTrpArg

180185190

AspProTrpHisLeuGluTyrTyrValAspGlyGlnLeuValArgThr

195200205

AlaSerGlySerGluIleIleAspProAsnGlyPheThrSerGlyThr

210215220

GlyLeuSerLysProMetHisAlaIleIleAsnMetGluAspGlnSer

225230235240

TrpArgSerAspAsnGlyIleThrProThrAspAlaGluLeuAlaAsp

245250255

ProAsnArgAsnThrTyrAsnValAspTrpValArgPheTyrLysPro

260265270

ValAlaThrGlyGlyGlySerSerSerGlyGlySerSerSerGlyGly

275280285

SerSerGlyGlySerSerGlyGlySerThrAspGlyAspValThrThr

290295300

ValGluLeuGlyAspPheTyrSerThrGlyLysAspGlyValSerVal

305310315320

SerGlyAspThrValProGlyPheAsnArgAsnGlySerAsnIleAsn

325330335

TyrAsnThrSerGlyAspTrpGlyAspTyrThrValThrLeuProGlu

340345350

AlaGlyAspTyrArgValGluLeuValThrAlaSerProMetThrGly

355360365

GluLeuGlyAlaGluLeuGlnPheAsnGlySerThrLeuValSerAla

370375380

LeuGlyAsnThrGlyGlyTrpGluSerTyrGlnAlaThrGlnPheAla

385390395400

GlnThrValSerValSerAlaAlaGlyAspTyrGlyPheArgValLys

405410415

SerIleGlyThrSerAlaTrpGlnTrpAsnGlyAspAlaIleArgPhe

420425430

ValLysGlnSer

435

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaattcgcggactgggatggcaccccggtac31

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcggccgcttattaggactgttttacaaagcggatc36

Claims

1.一种琼胶酶，其特征在于：所述琼胶酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种琼胶酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述琼胶酶；所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.包含权利要求2所述琼胶酶基因的重组载体，其特征在于：所述载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述的载体为pPIC9k-Agarase。

5.一种包含权利要求2所述的琼胶酶基因的细胞，其特征在于：所述细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述细胞由权利要求3所述重组载体转化而得。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细胞是包含所述琼胶酶核苷酸序列或用所述重组载体转化的大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞。

7.一种如权利要求2所述的琼胶酶基因的制备方法，其特征在于：所述琼胶酶的制备步骤包括：琼胶酶基因的获得：从海泥中筛选得到一株能在琼胶平板上产生透明圈的微生物，通过16srDNA分析鉴定为耐热微球菌(Microbulbiferthermotolerans)；利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，获得其一段琼胶酶的编码基因；再通过genomewalking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。

8.一种如权利要求3所述的琼胶酶基因的重组载体的制备方法，其特征在于：所述琼胶酶基因的重组载体的制备为：采用权利要求2所述琼胶酶基因编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。

9.一种如权利要求5所述的的琼胶酶基因的细胞的构建方法，其特征在于：所述细胞是用所述重组载体转化来构建的；所述细胞选大肠杆菌细胞和酵母细胞，选用大肠杆菌和毕赤酵母构建表达琼胶的重组细胞。

10.一种如权利要求1所述的琼胶酶的制备方法，其特征在于：培养所述包含琼胶酶基因的细胞或包含琼胶酶基因的重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物：通过包含本发明琼胶酶基因的酵母发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。