CN110066777A

CN110066777A - 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用

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Publication number: CN110066777A
Application number: CN201910359719.7A
Authority: CN
Inventors: 钮成拓; 包敏; 罗骄阳; 李崎; 刘春凤; 王金晶; 郑飞云
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110066777B

Abstract

本发明公开了一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明提供的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切菊粉酶INU3B具有高比酶活和催化活性，其比酶活、最大反应速率(V_max)、催化常数(K_cat)、底物亲和力(K_m)和催化效率(K_cat/K_m)分别可达2262.82±82.25U/mg、2564.1μmol·mg^‑1min^‑1、2393.2s^‑1、10.6mg·mL^‑1、225.77s^‑1·mg^‑1·mL，能满足内切菊粉酶以及低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)工业化生产的要求，在食品领域具有极高的应用前景。

Description

一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用

技术领域

本发明涉及一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

低聚果糖为由2～10个果糖组成的低聚化合物，又称果寡糖，具有抗肿瘤和改善胃肠功能的作用，也可作为膳食纤维用于防治糖尿病和减肥，还可用于降低血脂和预防高胆固醇等，因此，低聚果糖在食品领域有着极其广泛的应用，常被用于糖果、水果制品、牛奶制品、酸奶、鲜奶酪、烘焙食品和冰淇淋等的制作中。

目前，国内外生产低聚果糖的工艺主要有两种，一种是利用果糖基转移酶水解蔗糖生产低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)，此水解过程会产生大量的副产物葡萄糖，而葡萄糖又会进一步抑制水解反应并降低产率，这使得利用此水解过程获得低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)的最终产率低于55％且所得产物不易分离纯化；另一种是利用内切菊糖酶(EC3.2.1.7)水解菊粉来获得较高纯度的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)，此水解过程的副产物仅有少量的蔗糖、葡萄糖和果糖，这使得利用此水解过程获得的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的纯度可高达90％且所得产物易分离纯化。因此，利用内切菊糖酶(EC3.2.1.7)水解菊粉生产低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的工艺有极大的潜力取代传统的利用果糖基转移酶水解蔗糖生产低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)的工艺，成为低聚果糖工业化生产中最重要的工艺之一。

但是，现有的内切菊糖酶(EC3.2.1.7)普遍具有比酶活较低的缺陷，完全不能满足低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)工业化生产的要求，例如，Tohru Kobayashi等人从Microbulbifer sp.中分离得到的内切菊粉酶的比酶活仅可达到38.2U/mg(参考文献：Cloning and sequencing of inulinase and beta-fructofuranosidase genes of adeep-sea Microbulbifer species and properties of recombinant enzymes)；YangLi等人从Arthrobacter sp.S37中分离得到的内切菊粉酶的比酶活仅可达到93.4U/mg(参考文献：Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonasoryzae No.5)。

这无疑大大限制了低聚果糖的工业化生产进程，因此，急需获取一种具有高比酶活的内切菊粉酶以促进低聚果糖的工业化生产进程。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种具有高比酶活的内切菊粉酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种内切菊粉酶(EC3.2.1.7)，所述内切菊粉酶为：

(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有内切菊粉酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码上述内切菊粉酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ IDNo.4所示。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET22b(+)载体。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了上述内切菊粉酶的制备方法，将权利要求5或6所述宿主细胞加入到培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8后，在发酵液中添加IPTG继续诱导培养10～30h，得到内切菊粉酶。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含LB培养基或TB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为20℃、转速为220rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述IPTG在发酵液中的浓度为0.1mmol/L。

本发明还提供了应用上述方法制备得到的内切菊粉酶。

本发明还提供了上述内切菊粉酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述制备得到的内切菊粉酶在生产低聚果糖方面的应用。

本发明还提供了一种生产低聚果糖的方法，将上述内切菊粉酶加入到含有菊粉的缓冲液进行转化，得到低聚果糖。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为乙酸铵缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酸铵缓冲液的浓度为50mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酸铵缓冲液的pH为5.5。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的温度为40～70℃、时间为0.5～2h。

[有益效果]

(1)本发明提供的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切菊粉酶INU3B具有高比酶活和催化活性，其比酶活、最大反应速率(V_max)、催化常数(K_cat)、底物亲和力(K_m)和催化效率(K_cat/K_m)分别可达2262.82±82.25U/mg、2564.1μmol·mg^-1min^-1、2393.2s^-1、10.6mg·mL^-1以及225.77s^-1·mg^-1·mL，能够满足内切菊粉酶以及低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)工业化生产的要求，在食品领域具有极高的应用前景；

(2)利用本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切菊粉酶INU3B水解菊粉生产得到的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)纯度较高，可高达93.8％，并且，利用本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切菊粉酶INU3B水解菊粉生产低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的副产物较少，仅有少量的蔗糖，易分离纯化，更适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1：INU3B与已知内切菊粉酶的氨基酸序列比对结果图。

图2：inu3A、inu3B、inu3C基因的结构示意图。

图3：重组质粒pET22b(+)-inu3B的图谱。

图4：INU3B表达纯化后的SDS-PAGE凝胶图。

图5：INU3B在不同温度条件下的酶活变化。

图6：INU3B在不同温度条件下保存1h后的酶活变化。

图7：INU3B在不同pH条件下的酶活变化。

图8：INU3B在不同pH条件下保存24h后的酶活变化。

图9：INU3B的酶反应初速度与底物浓度的关系；其中，V表示INU3B的酶反应初速度，[S]表示底物浓度。

图10：INU3B以菊粉为底物进行转化反应时的产物分析HPLC图谱；其中，(a)为标准品G、GF、GF2、GF3、GF4和GF5的HPLC图谱分析；(b)为转化反应0min时的产物分析HPLC图谱；(c)为转化反应30min时的产物分析HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的酵母(Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557)购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center)，产品编号为：NBRC 10381；下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北京索莱宝科技有限公司；下述实施例中涉及的pET-20b(+)载体购自Novagen公司；下述实施例中涉及的果糖、菊粉购自Sigma-Aldrich公司。

(酵母(Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557)、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，氨苄青霉素100μg·mL^-1。

LB固体培养基：蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1，琼脂20g·L^-1，氨苄青霉素100μg·mL^-1

TB液体培养基：蛋白胨12g·L^-1，酵母粉24g·L^-1，磷酸二氢钾2.31g·L^-1，磷酸氢二钾12.54g·L^-1，甘油4mL·L^-1，氨苄青霉素100μg·mL^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

内切菊粉酶比酶活的检测：

配置1mg/mL的果糖溶液，按表1所示稀释成不同浓度的果糖溶液，测定不同浓度的果糖溶液于540nm波长处的吸光值，以吸光值为纵坐标，相对应的果糖浓度为横坐标，绘制标准曲线；

将纯化后的内切菊粉酶稀释1000倍，获得酶液，取800μL浓度为2.0％(w/v)的菊粉溶液，加入200μL酶液，于温度为70℃、pH为5.5的条件下反应10min，加入1mL的DNS试剂中止反应，得到反应液；将到反应液与未经反应的200μL酶液分别于100℃下加热5min灭酶，冷却，稀释10倍并测定灭酶反应液于540nm波长处的吸光值，根据此吸光值在绘制的标准曲线上找到对应的果糖浓度，即可计算出酶液的酶活，从而计算出纯化后的内切菊粉酶的比酶活；

内切菊粉酶酶活的定义为：在pH为5.5、温度为70℃的条件下，每分钟水解菊粉生成1μmol还原糖所需的酶量(mL)为1个酶活力单位(U)；

内切菊粉酶比酶活的定义为：在pH为5.5、温度为70℃的条件下，单位重量(mg)内切菊粉酶所具有的酶活力单位数(U)。

表1标准曲线制作

编号	1	2	3	4	5	6	7
								1.0mg/mL果糖溶液(mL)	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1
去离子水(mL)	1	0.9	0.8	0.6	0.4	0.2	0
								DNS(mL)	1	1	1	1	1	1	1

实施例1：编码内切菊粉酶INU3的基因的筛选与生物信息学分析

具体步骤如下：

以已知的来源于Aspergillus ficuum的内切菊粉酶的氨基酸序列(NCBI编号为O94220.1)为探针在NCBI中进行BLAST比对，发现，来源于Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557的氨基酸序列(NCBI编号为ODQ71402.1)与探针的同源性高达67％，即判断此氨基酸序列可能为内切菊粉酶的氨基酸序列，命名为目标氨基酸序列(氨基酸序列为SEQ IDNo.3)。

为进一步验证目标氨基酸序列是否为内切菊粉酶的氨基酸序列，将目标氨基酸序列与其他已知的内切菊粉酶(NCBI编号分别为XP 001394322.1、O94220.1、CAB63119.1、AAF24999.1以及BAA12321.1)的氨基酸序列进行保守区比对，比对结果见图1。

研究结果表明，通常情况下，内切菊粉酶一般含有6个保守区，此6个保守区分别标记为WMNEPNGL、Q、FT、RDP、EVP和SVEVF，由图1可知，目标氨基酸序列中含有内切菊粉酶的6个保守区序列，因此，进一步确认目标氨基酸序列为内切菊粉酶的氨基酸序列，将目标氨基酸序列所对应的基因命名为inu3(核苷酸序列为SEQ ID No.4)，对应的蛋白命名为INU3。

一般而言，内切菊粉酶的氨基酸序列大约有500AA，而SEQ ID No.3所示的目标氨基酸序列则有1500AA左右，为获得目标氨基酸序列中真正具有内切菊粉酶活性的区域，先根据氨基酸序列比对结果，初步估计目标氨基酸序列的结构可能如图2的inu3所示，然后，按照图2对目标氨基酸序列进行截断，分别截断为三段，将这三段氨基酸序列所对应的基因分别命名为inu3A(核苷酸序列为SEQ ID No.6)、inu3B(核苷酸序列为SEQ ID No.2)以及inu3C(核苷酸序列为SEQ ID No.8)，对应的蛋白分别命名为INU3A(氨基酸序列为SEQ IDNo.5)、INU3B(氨基酸序列为SEQ ID No.1)以及INU3C(氨基酸序列为SEQ ID No.7)；

其中，inu3A是通过将inu3 N端的SP区域、C端的黑色区域以及中段的intron区域截去后获得的；inu3B是通过将inu3 C端的黑色区域以外的所有部分截去后获得的；inu3C是通过将inu3 N端的SP区域以及中段的intron区域截去后获得的。

实施例2：inu3A、inu3B以及inu3C在大肠杆菌中的表达

具体步骤如下：

1、inu3A、inu3B以及inu3C的提取

以Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557基因组为模板，通过重叠PCR的方法扩增得到inu3C，而后以inu3C为模板，扩增获得inu3A、inu3B，扩增所用引物见表2；其中，PCR反应体系为：25μL Premix PrimeSTAR HS，10mM正向引物2μL，10mM反向引物2μL，基因组100ng，加入双蒸水补齐至50μL；PCR反应扩增条件为：94℃预变性5min；随后进行94℃ 30s，55℃30s，72℃ 1min32个循环。

PCR扩增产物经过切胶回收后使用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，并与经过EcoR I和Xho I双酶切的pET22b(+)质粒连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3A、E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3B以及E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3C(重组质粒pET22b(+)-inu3B的图谱见图3)。

表2引物序列及其用途

2、inu3A、inu3B以及inu3C的表达

将实施例1获得的挑取重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3A、E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3B以及E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3C分别涂布于LB固体培养基上，37℃、220rpm培养10～12h，挑取长出的单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养10～12h，按4％(v/v)的接种量转接至含100μg/mL氨苄西林的TB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度0.1mM的IPTG，20℃、220rpm继续诱导表达20h，得到发酵液；将发酵液于5000rpm的条件下离心5min，去掉上清，收集菌体并加入50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.5)重悬，5000rpm的条件下离心5min，弃上清，收集菌体并加入50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.5)重悬至OD₆₀₀为5，得到细胞重悬液；将细胞重悬液在冰浴条件下超声波破碎，破碎条件为：20％功率超声3s，间隔7s，120次，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于4℃、12000rpm的条件下离心5min，得到细胞破碎上清液；其中，重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3A、E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3B以及E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-inu3C发酵得到的细胞破碎上清液分别命名为细胞破碎上清液A、细胞破碎上清液B以及细胞破碎上清液C。

将细胞破碎上清液A、细胞破碎上清液B以及细胞破碎上清液C经过镍柱亲和层析，获得纯化后的INU3A、INU3B以及INU3C，检测纯化后的INU3A、INU3B以及INU3C的比酶活，检测结果为：INU3A和INU3C的比酶活几乎没有，INU3B的比酶活为2262.82±82.25U/mg。

将纯化后的INU3B进行SDS-PAGE分析，分析发现，INU3B主要出现在350mM咪唑洗脱液中，且条带单一(SDS-PAGE分析见图4)。

实施例3：INU3B的酶学性质分析

具体步骤如下：

1、最适反应温度

分别以40、45、50、55、60、65、70、75、80℃作为反应温度测定实施例2获得的纯化后INU3B的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用温度(检测结果见图5)。

由图5可知，INU3B的最适温度较高，为70℃。

2、热稳定性

实施例2获得的纯化后INU3B分别置于40、45、50、55、60、65、70、75、80℃下保温1h后迅速冰浴冷却，在50℃、pH6.5的条件下测定其酶活，以40℃下保温的酶活为100％，其余酶活与之相比计算残留酶活，以考察其温度稳定性(检测结果见图6)。

由图6可知，INU3B的热稳定性较好，于65℃下保温1h后酶活依旧有80％以上。

3、最适反应pH

配制pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0的含有2.0％(w/v)菊粉的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)代替内切菊粉酶酶活测定方法中的浓度为2.0％(w/v)的菊粉溶液，在50℃下测定实施例2获得的纯化后INU3B的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用pH(检测结果见图7)。

由图7可知，INU3B的最适pH为4～6，范围较广。

4、pH稳定性测定

配制pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0的含有2.0％(w/v)菊粉的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)代替内切菊粉酶酶活测定方法中的浓度为2.0％(w/v)的菊粉溶液，将实施例2获得的纯化后INU3B分别在上述缓冲体系下于4℃保存24h后，在50℃下测定其酶活，以初始酶活为100％，保存后酶活与之相比计算残留酶活，以考察其pH稳定性(检测结果见图8)

由图8可知，INU3B的pH稳定性较好，在pH为3～8时均具有较好的稳定性。

实施例4：INU3B的动力学常数分析

具体步骤如下：

在酶促反应动力学研究中，K_m和K_cat是酶促反应最重要的特征常数，分别反映了酶与底物的亲和力及酶的反应速率，本实施例采用双倒数作图法来测定内切菊粉酶INU3B的K_m和V_max值，具体步骤如下：

分别以浓度为0.25～20mg·mL^-1的菊粉作为底物，加入200μL稀释1000倍的实施例2获得的纯化后INU3B，于温度为70℃、pH为6.5的条件下反应10min，以单位时间内生成的还原糖量作为酶反应的初速度V；根据米氏方程V＝{Vmax·[S]}/{Km+[S]}，将酶反应的初速度V和底物浓度[S]进行非线性拟合(具体可见图9)，可以计算得出INU3B的Km值和Vmax值分别为10.6mg·mL^-1和2564.1μmol·mg^-1min^-1，根据INU3的分子量大小为56KDa，可以计算出INU3B的Kcat值和K_cat/K_m值分别为1866s^-1和225.77s^-1·mg^-1·mL，可见，INU3B的催化活性高。

实施例5：INU3B的水解产物分析

具体步骤如下：

为了分析实施例2获得的纯化后INU3B水解菊粉的水解产物，将含有0.2mL浓度为5.94μg/mL的INU3B和0.8mL浓度为5％(w/v)的菊粉的混合物溶于50mM乙酸铵缓冲液(pH5.5)中，于70℃水浴30min，采用高效液相色谱电雾式检测器法(HPLC-CAD)检测水解产物(检测结果见图10)；其中，使用XbridgeAmide柱(4.6mm×250mm，5.0μm)在ThermoULtimate3000上进行分析，流动相为70％乙腈，流速为1mL·min^-1；柱温控制在30℃；葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)和蔗果六糖(GF5)用作标准品；F、FF、FF2、FF3、FF4和FF5的含量分别以G、GF、GF2、GF3、GF4和GF5为标准品来定量；所有标准品均为分析纯，纯度超过9％。

由图10可知，INU3B水解菊粉的水解产物的主要是GF2，GF3和GF4；其中，产物的组成为34.0％蔗果四糖(GF3)、26.1％的蔗果三糖(GF2)、23.1％蔗果五糖(GF4)、10.7％蔗果六糖(GF5)以及6.2％蔗糖，可见，利用INU3B水解菊粉生产得到的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)纯度较高，可高达93.8％，并且，利用INU3B水解菊粉生产低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的副产物较少，仅有少量的蔗糖，易分离纯化。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 520

<212> PRT

<213> Lipomyces starkeyi

<400> 1

Met Ser Asn Thr Ser Thr Thr Ser Val Gly Ser Thr Leu Thr Thr Ser

1 5 10 15

Thr Ile Thr Ala Thr Ser Ala Ser Pro Thr Ser Thr Ala Pro Tyr Asp

20 25 30

Phe Arg Pro Val Phe His Phe Val Pro Glu Glu Asn Trp Met Asn Glu

35 40 45

Pro Asn Gly Leu Ile Lys Ile Gly Pro Thr Trp His Leu Phe Phe Gln

50 55 60

His Asn Pro Thr Gly Asn Phe Trp Gly Asn Leu Ser Trp Gly His Ala

65 70 75 80

Thr Ser Thr Asp Leu Val Ser Trp Asn Tyr Glu Pro Ile Ala Ile Ser

85 90 95

Ser Ala Asp Gly Ile Trp Ala Phe Thr Gly Thr Ser Tyr Phe Asp Ala

100 105 110

Glu Asn Leu Ser Gly Leu Gly Thr Ser Ser Asn Pro Pro Tyr Leu Ala

115 120 125

Phe Tyr Thr Gly Tyr Ala Pro Ser Ser Gly Val Gln Asp Gln Arg Leu

130 135 140

Ala Tyr Ser Leu Asp Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Lys Tyr Gln Gly Asn

145 150 155 160

Pro Ile Ile Pro Gln Ser Gln Glu Ala Pro His Asp Ile Thr Gly Gly

165 170 175

Leu Glu Ile Arg Asp Pro Lys Val Phe Tyr His Ser Pro Thr Ser Glu

180 185 190

Trp Val Met Val Leu Ala His Gly Gly Gln Asn Lys Val Ser Phe Trp

195 200 205

Thr Ser Thr Asp Thr Thr Asn Trp Thr Trp Val Ser Asp Phe Thr Ala

210 215 220

Ser Asn Ile Val Gly Phe Pro Gly Gly Ile Ser Gly Trp Glu Val Pro

225 230 235 240

Asp Phe Phe Glu Leu Gln Ile Glu Gly Thr Thr Gln Thr Lys Trp Val

245 250 255

Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala Gly Ser Pro Ala Gly Gly Asn Gly Val

260 265 270

Phe Ala Leu Thr Gly Ser Phe Asp Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Thr

275 280 285

Val Asp Pro Thr Thr Leu Trp Leu Asp Tyr Gly Arg Asp Trp Asp Gly

290 295 300

Ala Met Ser Trp Glu Asn Val Pro Ala Ser Asp Gly Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Ala Ala Val Met Asn Ser Tyr Gly Val Asn Pro Pro Thr Asn Thr Trp

325 330 335

Lys Gly Met Leu Ser Phe Pro Arg Thr Leu Glu Leu Thr Gln Leu Asn

340 345 350

Gly Lys Leu Gln Phe Leu Gln Leu Pro Val Ser Glu Leu Asp Gly Val

355 360 365

Ser Thr Ser Val Ala Thr Ile Thr Asn Gln Thr Leu Ala Pro Gly Gln

370 375 380

Thr Leu Leu Ser Asn Ile His Ser Arg Gln Leu Asp Ile Arg Ile Thr

385 390 395 400

Phe Val Pro Thr Gln Gly Ser Thr Leu Ser Leu Ser Val Arg Lys Gly

405 410 415

Gly Ser Gln Gln Thr Val Ile Glu Tyr Ile Gln Ser Asn Asn Gln Leu

420 425 430

Ser Val Asp Arg Asn Ala Ser Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Ala

435 440 445

Gly Gly Val His Thr Ala Ala Leu Gln Thr Asp Ala Asn Gly Lys Val

450 455 460

Gln Leu Arg Val Leu Val Asp Glu Cys Ser Ile Glu Val Phe Gly Gly

465 470 475 480

Gln Gly Glu Ala Val Ile Ser Asp Leu Ile Phe Pro Asp Ile Ser Ser

485 490 495

Asp Gly Leu Ala Leu Ser Thr Ser Gln Gly Asn Val Val Leu Glu Ser

500 505 510

Val Asp Val Arg Ser Ile Ser Leu

515 520

<210> 2

<211> 1563

<212> DNA

<213> Lipomyces starkeyi

<400> 2

atgagtaaca ccagcactac ctctgtaggt agcaccctaa ccactagtac aataaccgcc 60

actagcgcta gccctacgtc cacggcgccc tacgattttc gtcctgtttt ccatttcgtg 120

ccagaagaga actggatgaa tgagcccaat ggactgatca aaatcggccc tacctggcac 180

cttttctttc aacacaaccc aactggaaac ttttggggca acttaagttg gggacatgcc 240

actagcactg accttgtgtc ctggaattat gaaccgattg caatttcgag cgcagatggg 300

atatgggctt tcacaggaac ctcttacttt gatgcagaga atctctcggg gcttggcacg 360

tcatcaaacc cgccgtacct tgccttttat actggctacg ccccctcaag tggcgtacag 420

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Ala Glu Gln Leu Ile Pro Glu Thr Trp Asp Val Thr Asp Leu Ile Gly

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Gln Ser Ala Val Ile Glu Ile Val Asp Leu Ser Thr Ala Gly Trp Gly

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His Ile Leu Ile Asp Glu Ile Ser Phe Ser Asn Ile Ser Ile Glu Pro

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Tyr Gly Pro Asn Trp Met Asp Tyr Gly Pro Asp Phe Tyr Ala Ala Thr

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Thr Phe Asn Gly Leu Ser Ser Thr Asn Gln Ile Asp Ile Ala Trp Met

645 650 655

Asn Asn Trp Gln Tyr Ala Ser Val Ile Pro Thr Ser Pro Trp Arg Gly

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Ile Val Ala Gly Ser Ser Ser Ser Gln Phe Gly Ile Ile Leu Arg Ala

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Thr Ser Asp Leu Ala Gln Gln Thr Arg Ile Gly Tyr Glu Phe Thr Thr

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725 730 735

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<400> 16

cgcttagaaa ggtattgact agtagctgac ttccggcgta tc 42

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatacgccgg aagtcagcta ctagtcaata cctttctaag cggag 45

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccctcgagtc agagcgaaat cgatcgc 27

Claims

1.一种内切菊粉酶，其特征在于，所述内切菊粉酶为：

2.编码权利要求1所述内切菊粉酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET22b(+)载体。

5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.权利要求1所述内切菊粉酶的制备方法，其特征在于，将权利要求5或6所述宿主细胞加入到培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8后，在发酵液中添加IPTG继续诱导培养10～30h，得到内切菊粉酶。

8.权利要求1所述内切菊粉酶或权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒或权利要求5或6所述宿主细胞或权利要求7所述制备方法在生产低聚果糖方面的应用。

9.一种生产低聚果糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述内切菊粉酶加入到含有菊粉的缓冲液中进行转化，得到低聚果糖。

10.如权利要求9所述的一种生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述转化的温度为40～70℃、时间为0.5～2h。