CN105505899A - 一种菊粉内切酶的制备方法及其应用 - Google Patents
一种菊粉内切酶的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种菊粉内切酶的制备方法及其应用，以Aspergillus？ficuum？ATCC？16882的endo-inu2基因为来源序列，通过基因工程技术对基因序列进行优化，将优化后的编码菊粉内切酶的基因序列克隆到pET-28a(+)载体上，构建出高效分泌表达菊粉内切酶的重组大肠杆菌Escherichia？coli？BL21pET28a-pelB-NSinu2。利用该重组大肠杆菌作为发酵菌株，实现了对菊粉内切酶的高效分泌表达，最后对制备得到的菊粉内切酶进行纯化并成功用于水解菊粉制备低聚果糖。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程领域，具体地说，涉及一种经基因工程技术优化后的菊粉内切酶基因经重组大肠杆菌表达后高效制备菊粉内切酶的方法及其应用。
背景技术
菊粉是由β-2,1-糖苷键连接D-呋喃果糖分子组成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖，聚合度DP通常为2～60之间，通常存在于菊苣，菊芋及雪莲果等植物的根状块茎中。菊粉酶是能够水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶类，学名β-2,1-D果聚糖水解酶(EC3.2.1)，又称β-果聚糖酶，2,1-D-果聚糖水解酶。微生物菊粉酶可以催化植物中的菊糖水解为果糖或低聚果糖。根据其对底物的作用方式不同，菊粉酶分为两类。一类是外切果聚糖水解酶(EC3.2.1.8)，又称外切菊粉酶，外切菊粉酶从菊糖或低聚果糖分子的非还原末端依次水解β-D果糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖分子的果聚糖，最终产物为果糖和葡萄糖。另一类是内切果聚糖水解酶(EC3.2.1.7)，又称内切菊粉酶。内切菊粉酶从菊糖分子内部随机切断β-2,1-呋喃果糖苷键，得到GF2、GF3、GF4、F2、F3、F4、F5等低聚果糖和短链果聚糖。内切菊粉酶在工业领域用于生产低聚果糖有很大的潜力。
应用内切菊粉酶这一催化特性，内切菊粉酶能以菊粉为底物，催化菊粉水解成低聚果糖。低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，具有重要的健康、药用开发价值。制备适合工业化生产的内切菊粉酶是生产低聚果糖技术的关键。
菊粉内切酶主要分布在微生物中，目前研究较多的产菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和细菌。其中丝状真菌有17个属40余种，酵母菌有10个属20余种，细菌有12个属10余种。研究较多的产菊粉酶丝状真菌主要包括Aspergillusniger、Penicilliumsp、Rhizopusdelemar、Fusariumoxysporum、Talaromycesflavusvarflavus和Chrysosporiumpannorum等，其菊粉酶多为胞外酶；酵母主要有Kluyveromycesfragilis、Kluyveromycesmarxianus、Debaryomycescantarellii和Saccharomycesfragilis等，其菊粉酶多为胞内酶或与细胞壁相结合；细菌主要有Bacillussubtilis、Athrobactersp.、Pseudomonassp.和Xanthomonassp.等，其菊粉酶以胞外酶为主。研究表明，大部分微生物分泌的菊粉酶主要为外切酶，或内外切混合酶。鉴于直接从野生菌中提取内切菊粉酶存在工艺复杂，提取率低且较难将内外切菊粉酶分开及成本昂贵等问题，寻找廉价、高效的外源基因表达方法是目前内切菊粉酶的研究热点。
无花果曲霉(AspergillusficuumATCC16882)具有编码内切菊粉酶的基因endo-inu2。本发明以AspergillusficuumATCC16882的endo-inu2基因为来源序列，通过基因工程技术对基因序列进行优化，选用大肠杆菌作为宿主，构建此具有内切菊粉酶活性的重组大肠杆菌。大肠杆菌遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作，是表达外源蛋白的首选体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效制备菊粉内切酶的方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种菊粉内切酶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
步骤一，构建大肠杆菌工程菌：将经过基因工程技术优化后的编码菊粉内切酶的基因序列pelB-NSinu2，插入到大肠杆菌pET28a载体上，构建出pET28a-pelB-NSinu2质粒，导入大肠杆菌EscherichiacoliBL21中，构建出高效分泌表达菊粉内切酶的重组大肠杆菌E.coliBL21pET28a-pelB-NSinu2；
步骤二，利用步骤一获得的大肠杆菌工程菌进行发酵，实现菊粉内切酶的分泌表达；
步骤三，提取发酵上清液，对该上清液进行纯化得到菊粉内切酶液。
进一步地，步骤一所述的构建大肠杆菌工程菌的具体步骤如下：
1)提取无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882总DNA；
2)设计引物，用PCR方法克隆endo-inu2基因；
3)将上述克隆出来的来源于真核菌株的endo-inu2基因片段送于南京金斯瑞公司测序并优化为适用于原核表达体系的基因片段inu2。
4)对优化后的基因片段inu2和来自pET-20b(+)载体的pelB基因运用同源重组方法设计引物，用PCR方法从inu2基因序列和pET-20b(+)载体上分别克隆缺少内源信号肽序列的NSinu2基因及pelB信号肽基因序列。
5)将PCR出来的带有同源臂序列的pelB片段及NSinu2序列片段与线性化克隆载体pET-28a(+)按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆，构建出将pelB与NSinu2融合表达的重组质粒pET28a-pelB-NSinu2.
6)然后将重组载体pET28a(+)-pelB-NSinu2转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌EscherichiacoliBL21pET28a-pelB-NSinu2。
进一步地，步骤二所述发酵的具体步骤如下：
1)挑取重组菌单菌落于LB培养基中培养过夜，以含有空载体的细菌样品和重组菌做对照；
2)次日，将实验组与对照组按体积比1％接种量接种至新鲜50mL发酵培养基中，37℃，200r/min振荡培养；
3)待菌液生长至OD600到0.7左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃诱导10小时。
所述的发酵培养基包含如下组分：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，K2HPO472mmol/L，MgSO410mmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素2mL/L，该微量元素成分为CaCl2·6H2O0.74g/L，ZnSO4·7H2O0.18g/L，MnSO4·H2O20g/L，Na2·EDTA20.1g/L，CuSO40.1g/L，CoCl20.104g/L,FeSO4·7H2O2g/L。
进一步地，所述的步骤三提取发酵上清液的方法为4℃下，转速8000r/min，离心菌液15min。
本发明的另一目的是提供上述菊粉内切酶的制备方法的应用。
本发明之所以对来源于AspergillusficuumATCC16882的编码菊粉内切酶的endo-inu2基因进行密码子优化是因为原核表达体系不能够识别部分真核基因的密码子从而导致部分密码子翻译成错误氨基酸，为提高翻译准确率对编码基因进行密码子优化以适用于大肠表达体系。此外本发明对编码菊粉内切酶基因的内源信号肽进行了切除是因为预实验结果表明来源于真核的内源信号肽序列在原核体系中不仅失去了其分泌功能而且降低了目标蛋白的活性表达，使得翻译表达出的菊粉内切酶蛋白多为包涵体影响酶活力。为此本发明提供了一种在大肠杆菌表达体系中适配于菊粉内切酶的信号肽序列，其融合表达效果不仅能够提高目标蛋白的活性表达而且能实现大肠杆菌分泌表达，免除细胞破壁等后期处理过程。
而在大肠杆菌中选择使用pET-28a(+)表达载体，这是因为pET系统是有史以来在大肠杆菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET系统载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7聚合酶机制十分有效并具有选择性；充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。此外pET-28a(+)在C端设计了6个组氨酸的纯化位点，组氨酸能够提供配位电子与某些金属离子(如Ni2+)螯合，6个连续的组氨酸可以使蛋白有效吸附于含Ni2+的层析填料上，因而可以利用金属螯合来纯化融合蛋白，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合大规模制备。
本发明所述利用密码子优化基因克隆表达制备出高效分泌的菊粉内切酶在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。
将本发明所述的高效分泌菊粉内切酶的带有密码子优化基因重组大肠杆菌工程菌EscherichiacoliBL21pET28a-pelB-NSinu2进行摇瓶发酵,仅需诱导8h发酵液上清中即可达到最高酶活力75.22U/mg(蛋白)，经镍柱纯化后的酶液即可直接用于水解菊粉生产低聚果糖，转化效率高，此种菊粉内切酶的制备方法由于发酵时间短，酶活高，且无需破碎细胞后期处理方便等优点在工业化大规模生产低聚果糖的应用中具有巨大的发展前景。
本发明的有益效果是：所述含有优化后的基因序列pelB-NSinu2的工程菌株EscherichiacoliBL21pET28a-pelB-NSinu2能够利用优化后的基因提高菊粉内切酶的生物活性表达，pelB信号肽调控菊粉内切酶的分泌表达，在IPTG的诱导下仅需8小时即可达到胞外分泌最高酶活力75.22U/mg。由于常规的大肠杆菌产酶的诱导发酵时间较长，且为胞内酶需要破壁提酶，本发明所提供的菊粉内切酶的制备方法不仅发酵时间短而且为分泌的胞外酶无需破壁处理，大大提高了工业化效率，降低了生产能耗，经实验室中试预示可以用此来工业化大批量生产菊粉内切酶。并且所制备的重组菌株所产的重组菊粉内切酶可以直接作用于底物菊粉来生产高附加值的低聚果糖，酶解用量少，转化方法简单，具有巨大的商业应用价值。
附图说明
图1无花果曲霉ATCC16882全基因组的提取。其中，M表示λ-EcoT14digestDNAmarker分子量标记，1表示全基因组。
图2内切菊粉酶基因endo-inu2PCR扩增产物。其中，M表示分子标记量，1、2、3、4、5表示PCR产物。
图3重组质粒pET28a-pelB-NSinu2的构建过程图。
图4转化菌落PCR扩增产物。其中，M表示分子标记量，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11表示从转化平板上随机挑选出的11个菌落的PCR产物。
图5pET28a-pelB-NSinu2的SDS-PAGE电泳图谱。其中，M表示蛋白分子量标准，1表示E.coliBL21(DE3)菌体蛋白，2表示未经IPTG诱导的EscherichiacolipET28a-pelB-NSinu2菌体蛋白，3表示IPTG诱导表达后的EscherichiacolipET28a-pelB-NSinu2菌体蛋白。
图6IPTG诱导时机对表达的影响。
图7不同IPTG浓度对菌体生长和表达量的影响。
图8IPTG诱导时间对表达的影响。
图9诱导温度对表达的影响。
图10内切菊粉酶蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图谱。其中，M表示蛋白分子量标准，1表示诱导表达后的EscherichiacolipET28a-pelB-NSinu2菌体蛋白，2表示经Ni-NTA柱纯化后的内切菊粉酶蛋白。
图11HPLC分析10％菊粉在60℃，2.13U/g菊粉，酶解5h反应产物；a.10％菊粉的液相分析；b.标准样品的峰:A,果糖；B,葡萄糖；C,蔗糖；D,GF2(DP3)；E,GF3(DP4)；F,GF4(DP5)；c.10％菊粉酶解产物,峰:C,蔗糖；D,DP3；E,DP4；F,DP5；G,DP6；H,DP7。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例中所有方法如无特别说明，均为常规方法。所用到的无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882购买于美国菌种保藏中心；所用质粒pET-28a(+)、pET-20b(+)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购买于Novagen公司；所用引物合成及密码子优化序列合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；限制性内切酶EcoRI、PrimeSTARHSDNAPolymerase、DL2000DNAmarker、λ-EcoT14digestDNAmarker、蛋白分子量标准均购于TaKaRa公司；小量胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒购于AXYGEN公司；真菌基因组DNA提取试剂盒购于OMEGA公司；OneStepCloningKit购买于Vazyme公司。
实施例1EscherichiacoliBL21pET28a-pelB-NSinu2基因工程菌的构建
一.无花果曲霉ATCC16882的endo-inu2基因序列的扩增与密码子优化
根据无花果曲霉ATCC16882的endo-inu2基因序列(GenBank:AJ006951.1)，用SnapGene设计扩增inu2基因的一对引物，从无花果曲霉的全基因组上克隆出编码菊粉内切酶的inu2序列并送于南京金斯瑞生物科技有限公司完成inu2序列的密码子优化工作。
(1)无花果曲霉基因组DNA提取
a)甘油冻存管保存的无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882划线活化后，接种无花果曲霉孢子于50mL马铃薯蔗糖培养基24℃培养2到3天；
b)将新鲜培养得到的无花果曲霉菌体用无菌离心管收集，液氮冻干研磨，按照真菌基因组DNA小量提取试剂盒说明书操作提取无花果曲霉ATCC16882全基因组DNA，–20℃保存。
上述提取的无花果曲霉ATCC16882全基因组经过紫外分光光度计检测，OD260nm/280nm值在1.7～1.9之间，说明DNA完整性好，且纯度高，可做PCR实验,用1％琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。
(2)PCR扩增编码菊粉内切酶基因片endo-inu2
上游引物PF5'-atgttgaatccgaaggttgcctac-3’；
下游引物PR5'-tcattcaagtgaaacactccgcacg-3’；
以无花果曲霉ATCC16882全基因DNA作为模板，利用引物PF、PR进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表1PCR反应体系
由图2可知，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在1500bp处可见一特异性条带，与预期目标片段大小一致。
(3)菊粉内切酶基因片段endo-inu2的密码子优化
菊粉内切酶基因片段endo-inu2来源于无花果曲霉真核菌株，其编码氨基酸的密码子适用于真核体系，当克隆表达于原核体系时部分密码子所编码的氨基酸不再翻译出原表征的氨基酸，或者说大肠表达体系缺少部分稀有密码子翻译的氨基酸，因此对原序列endo-inu2进行优化以适用于大肠表达变得很有必要。将PCR扩增的菊粉内切酶基因片段endo-inu2送于南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序并进行密码子优化。
二.菊粉内切酶优化序列inu2和pelB序列的扩增
根据经过密码子优化后的编码菊粉内切酶的inu2基因序列用SnapGene设计扩增缺少内源信号肽的NSinu2基因的一对引物，及设计以pET-20b(+)为模板扩增pelB基因序列的一对引物，因后期要将pelB与缺少内源信号肽的NSinu2序列融合表达，所以设计两对引物时需要根据同源重组的原理在引物两端加酶切位点的同源臂及融合同源臂，酶切位点为pET-28a(+)载体多克隆位点上的EcoRI。pelB与NSinu2序列的扩增和融合克隆过程如图3所示。引物设计如下：
扩增pelB的一对引物：
Primer15'-TGTCGACGGAGCTCGAATTCATGAAATACCTGCTGCCGAC-3’
Primer25'-GGACGGTAGTCATTAGACTGGGCCATCGCCGGCTGGGCAG-3’
扩增缺少内源信号肽的优化密码子后的菊粉内切酶基因NSinu2的一对引物：
Primer35'-CTGCCCAGCCGGCGATGGCCCAGTCTAATGACTACCGTCC-3’
Primer45'-TGGGTCGCGGATCCGAATTCTTATTCCAAAGACACAGAAC-3’
(1)PCR扩增编码pelB信号肽序列的pelB基因片段
以pET-20b(+)作为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测及回收，pelB片段最终胶回收核酸浓度为30.2ng/ul。
表2PCR反应体系
(2)PCR扩增缺少内源信号肽的优化密码子后的菊粉内切酶基因NSinu2
以优化密码子后的编码菊粉内切酶的基因序列inu2作为模板，利用扩增inu2的引物P1、P2进行PCR扩增。PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测及回收，NSinu2片段最终胶回收核酸浓度为104ng/uL。
表3PCR反应体系
三.pelB和NSinu2融合片段的克隆
将PCR产物pelB片段及NSinu2连接到pET-28a(+)载体并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞进行克隆，用菌落PCR方法筛选阳性重组质粒，对阳性重组质粒进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pET-28a-pelB-NSinu2质粒，具体按如下操作步骤进行；
(1)单酶切反应
将质粒pET-28a(+)进行EcoRⅠ单酶切，单酶切体系如表4所示。按照表4所示，配制单酶切体系，于37℃水浴过夜，1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带。
表4单酶切反应体系
(2)连接反应
PCR扩增出的带有EcoRⅠ同源臂和融合同源臂的产物与经EcoRⅠ线性化的pET-28a(+)进行连接,连接成重组质粒。
按照表5所示，配置连接体系，将单酶切后的pET-28a(+)载体与PCR扩增出的带有EcoRⅠ同源臂和荣恶化同源臂的产物用一步克隆试剂盒在37℃连接反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化。
表5连接反应体系
(3)转化及鉴定
将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态，提取重组质粒经菌落PCR筛选阳性重组质粒，对阳性重组质粒进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pET-28a-pelB-NSinu2质粒。具体操作如下：
转化
按照《分子克隆手册》上的方法制作E.coliDH5α感受态并将重组质粒用42℃热激法热激90s转化E.coliDH5α感受态
菌落PCR鉴定重组子
用灭菌牙签挑取单菌落作模板，按表6配置PCR反应液，反应条件与PCR反应条件相同。用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
表6菌落PCR反应体系
由图4可知，菌落PCR扩增产物约为1500bp，与预期片段大小相符。
质粒测序
经菌落PCR筛选的pET-inu2重组质粒送至南京金斯瑞公司测序，结果如SEQIDNo.1所示。将测序结果与预期序列相比较，结果一致，表明上述克隆的pelB-NSinu2无花果曲霉内切菊粉酶序列正确。
四.构建EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2基因工程菌
将重组质粒pET-28a-pelB-NSinu2转化到大肠杆菌BL21(DE3)，具体操作步骤与本实施例中步骤三.pelB和NSinu2融合片段的克隆中的转化操作相同。
筛选出阳性克隆后命名为EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2。
实施例2EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2基因工程菌表达
一、IPTG诱导EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2基因工程菌表达
利用重组大肠杆菌表达外源蛋白使用IPTG作为诱导剂，所述的发酵培养基包含如下组分：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，K2HPO472mmol/L，MgSO410mmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素(CaCl2·6H2O0.74g/L，ZnSO4·7H2O0.18g/L，MnSO4·H2O20g/L，Na2·EDTA20.1g/L，CuSO40.1g/L，CoCl20.104g/L,FeSO4·7H2O2g/L)2mL/L。
(1)挑取重组菌单菌落于LB培养基中培养过夜，以含有空载体的细菌样品和E.coliBL21(DE3)做对照；
(2)次日，将实验组与对照组按体积比1％接种量接种至新鲜50mL发酵培养基中，37℃，200r/min振荡培养；
(3)待菌液生长至OD600到0.7左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃诱导10小时；
(4)菌液离心(4℃，8000r/min，15min)收集发酵上清液。
二.表达产物SDS-PAGE电泳检测
吸取上述离心收集的表达产物10μL样品，用常规SDS-PAGE方法进行检测(浓缩胶浓度4.5％，分离胶浓度12.5％)。取EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2基因工程菌诱导的蛋白质上清液进行SDS-PAGE电泳检测，以E.coliBL21(DE3)和未经诱导的重组菌菌体蛋白为对照组。由图5可知，实验组比对照组在55KDa多出一蛋白质条带，与重组内切菊粉酶蛋白质分子量相符。由此表明，实验组中该特异蛋白可能为在重组大肠杆菌中表达的内切菊粉酶蛋白，但表达产物的活性还需进一步检测。
三.表达产物的酶活测定
对表达产物蛋白液进行酶活测定，用未经诱导的菌液蛋白作对照。
(1)内切菊粉酶活性测定：取50μL稀释液加入450μL5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时),立即取出沸水浴5min(精确计时)灭活，从反应液中取出50μL，加入1.5mLDNS试剂+1.95mL水，混匀，沸水浴中5min(精确计时),冷水冷却，用容量瓶定容至25mL,测OD520nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)。设置对照：发酵上清液，沸水5min灭活，取50μL加入450μL5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时),立即取出沸水浴5min(精确计时)灭活，从反应液中取出50μL，加入1.5mLDNS试剂+1.95mL水，混匀，沸水浴中5min(精确计时),冷水冷却，用容量瓶定容至25mL,作为对照，调零。
(2)酶活计算方法：
酶活单位定义：每分钟产生1微摩尔还原糖所需要的酶量。
每毫升发酵上清液中菊粉酶活为：
稀释倍数的确定
第一步：取50μL酶相当于1/20mL的酶量
第二步：从500μL体系取50μL进行果糖检测，果糖数据相当于是1/20mL的酶量反应10min所产生果糖的1/10，算起来是1/200。
(3)蛋白含量测定：蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白BSA为标准品。
分别对未经诱导和经IPTG诱导的EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2的表达粗酶液中的内切菊粉酶进行活性测定。结果显示，未诱导的重组菌未检测到酶活性，而经IPTG诱导的EscherichiacolipET-28a-pelB-NSinu2基因工程菌中的内切菊粉酶活性为8.012U/mgDCW。
实施例3不同诱导时机、不同IPTG浓度及不同诱导时间及不同诱导温度对内切菊粉酶重组蛋白分泌表达的影响
通过对诱导时机、IPTG诱导浓度、诱导时间及诱导温度的进一步研究，优化了基因工程菌的表达条件。
一.不同诱导时机的影响
(1)甘油冻存管菌液1％接种量接种于LB培养基过夜；
(2)次日，将种子液按体积比1％接种至新鲜50mL发酵培养基中，37℃，200r/min振荡培养；
(3)分别在接种后1h(OD600约为0.1)、2h(OD600约为0.26)、3h(OD600约为0.7)、4h(OD600约为2.0)、5h(OD600约为3.1)、6h(OD600约为3.9)加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，25℃诱导20小时。结果如图6所示。
二.不同IPTG浓度对菌体生长和表达量的影响
(1)(2)均与本实施例步骤一不同诱导时机的影响(1)(2)操作相同；
(3)待菌液生长至OD600约为0.7时，分别加入IPTG至终浓度0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.15mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L、1.1mmol/L后，25℃诱导20小时。结果如图7所示。
三.不同诱导时间的影响
(1)(2)均与本实施例步骤一不同诱导时机的影响(1)(2)操作相同；
(3)待菌液OD600生长至0.7左右时，加入IPTG至终浓度0.15mmol/L后，25℃，200rpm振荡培养，分别诱导4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，20h下摇瓶测酶活选取最佳诱导时间。结果如图8所示。
四.不同诱导温度的影响
(1)(2)均与本实施例步骤一不同诱导时机的影响(1)(2)操作相同；
(3)待菌液OD600生长至0.7左右时，加入IPTG至终浓度0.15mmol/L后，分别在20℃、25℃、30℃、35℃下诱导，200rpm振荡培养18h后，下摇瓶测酶活选取最佳诱导温度。结果如图9所示。
五.最佳诱导条件下的试验
根据步骤一二三四筛选出来的各因素的最佳诱导条件进行试验
(1)(2)均与本实施例步骤一不同诱导时机的影响中(1)(2)的操作相同；
(3)待菌液OD600生长至0.7左右时，加入IPTG至终浓度0.15mmol/L后，在20℃、200rpm振荡培养条件下诱导8h。
(4)收集发酵上清液，经内切菊粉酶活性测定其酶活达75.22U/mgDCW。
实施例4重组内切菊粉酶蛋白质纯化
蛋白质纯化方法为使用HisSepharoseHP凝胶柱进行亲和层析。本发明的纯化方法，通过使用亲和层析具有特异性高，纯化效率高，产物纯度高等优点，但价格昂贵、成本较高；本发明采用金属Ni2+螯合亲和层析，其利用表达的融合蛋白上6个组氨酸所提供的配位电子与Ni2+螯合，6个连续的组氨酸序列可以使重组蛋白很好地吸附于含金属Ni2+的层析填料上，从而利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，极大的简化了重组蛋白的下游纯化工作，纯度达95％以上，其纯化效率高，成本低，非常适合大规模制备。
一、镍柱的准备
第一次使用镍柱时，先用蒸馏水过柱，如有空气存在应反复冲洗直至空气全部排出；然后用10mL(含20mM咪唑)结合缓冲液和10mL洗脱缓冲液(含40mM咪唑)分别过柱；最后再用10mL结合缓冲液过柱。
二、粗酶液纯化
(1)粗酶液的准备
粗酶液制备：将离心收集的发酵上清液表达产物作为粗酶液，粗酶液用0.45μm膜过滤后方可上柱；
(2)纯化
HissepharoseHP凝胶柱用10ml双蒸水洗涤后用10ml结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，40mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，pH＝7.5)平衡，将上述准备好的粗酶液过柱，使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，pH＝7.5)除去，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，pH＝7.5)洗脱，得到目的蛋白。
(3)脱盐
因过镍柱纯化的目的蛋白中含有咪唑及盐离子等小分子物质，需要将镍柱纯化的产物过一遍脱盐柱除去小分子物质，得到最终纯化出的目的蛋白，用于酶解菊粉生产低聚果糖。
三.SDS-PAGE鉴定蛋白
常规SDS-PAGE方法进行检测(浓缩胶浓度4.5％，分离胶浓度12.5％)，记录结果如图10所示。
实施例5菊粉内切酶酶解菊粉制备低聚果糖
利用纯化后的重组菊粉内切酶酶解生产低聚果糖，在最适反应pH4.6和底物浓度为10％菊粉时，酶解正交实验设计如表7所示，变量分析如表8所示。实验结果表明在酶解温度为60℃，酶用量为2.13U/g菊粉，酶解时间5小时条件下，低聚果糖收率即可达94.41％，酶解产物所占比列分析如表9及图11所示。酶解中酶的用量低，反应时间短可以降低工业化能耗。
表7重组菊粉内切酶酶解菊粉生产低聚果糖正交实验
表8正交实验方差分析表
表9酶解菊粉生产低聚果糖液相分析结果
Claims (8)
1.一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
步骤一，构建大肠杆菌工程菌：将经过基因工程技术优化后的编码菊粉内切酶的基因序列pelB-NSinu2，克隆到pET-28a(+)载体，构建出pET28a-pelB-NSinu2质粒，导入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中，构建出分泌表达菊粉内切酶的重组大肠杆菌E.coliBL21pET28a-pelB-NSinu2；
步骤二，利用步骤一获得的大肠杆菌工程菌进行发酵，实现菊粉内切酶的分泌表达；
步骤三，提取发酵上清液，对该上清液进行纯化得到菊粉内切酶液。
2.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤一所述的构建大肠杆菌工程菌的具体步骤如下：
1)提取无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882总DNA；
2)用PCR方法克隆无花果曲霉AspergillusficuumATCC16882的endo-inu2基因；
3)将上述克隆出来的endo-inu2基因片段优化为基因片段inu2；
4)对基因片段inu2和来自pET-20b(+)载体的pelB基因运用同源重组方法设计引物，用PCR方法从inu2基因序列和pET-20b(+)载体上分别克隆缺少内源信号肽序列的NSinu2基因及pelB信号肽基因序列；
5)将PCR出来的带有同源臂序列的pelB片段及NSinu2序列片段与线性化克隆载体pET-28a(+)混合后，反应30min进行转化，完成定向克隆，构建出将pelB与NSinu2融合表达的重组质粒pET28a-pelB-NSinu2；
6)然后将重组载体pET28a(+)-pelB-NSinu2转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌重组菌EscherichiacoliBL21pET28a-pelB-NSinu2。
3.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤二所述发酵的具体步骤如下：
1)挑取重组菌单菌落于LB培养基中培养过夜，以含有空载体的细菌样品和重组菌做对照；
2)次日，将实验组与对照组按体积比1％接种量接种至新鲜50mL发酵培养基中，37℃，200r/min振荡培养；
3)待菌液生长至OD600到0.7左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃诱导10小时。
4.根据权利要求3所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，K2HPO472mmol/L，MgSO410mmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素2mL/L，该微量元素成分为CaCl2·6H2O0.74g/L，ZnSO4·7H2O0.18g/L，MnSO4·H2O20g/L，Na2·EDTA20.1g/L，CuSO40.1g/L，CoCl20.104g/L,FeSO4·7H2O2g/L。
5.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤三提取发酵上清液的方法为4℃下，转速8000r/min，离心菌液15min。
6.根据权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，步骤三所述的纯化采用HisSepharoseHP凝胶柱进行亲和层析。
7.根据权利要求6所述的一种菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，所述的纯化具体包括以下步骤：
1)镍柱的准备：第一次使用镍柱时，先用蒸馏水过柱，如有空气存在则反复冲洗直至空气全部排出，然后用10mL含20mM咪唑的结合缓冲液和10mL含40mM咪唑的洗脱缓冲液分别过柱；最后再用10mL结合缓冲液过柱；
2)粗酶液纯化：将离心收集的发酵上清液表达产物作为粗酶液，粗酶液用0.45μm膜过滤；
3)纯化：HissepharoseHP凝胶柱用10mL双蒸水洗涤后用10mLpH7.5的结合缓冲液平衡，该结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠，40mmol/L咪唑和0.5mol/LNaCl，将步骤2)准备好的粗酶液过柱，使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用pH7.5的洗涤缓冲液除去，该洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑和0.5mol/LNaCl，最后用pH7.5洗脱缓冲液洗脱，该洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑和0.5mol/LNaCl，得到目的蛋白；
4)脱盐：将上述镍柱纯化的产物过一遍脱盐柱除去小分子物质，得到最终纯化出的目的蛋白，用于酶解菊粉生产低聚果糖。
8.权利要求1所述的一种菊粉内切酶的制备方法的应用。
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