CN104130992B

CN104130992B - 来自冬虫夏草中国被毛孢的几丁质酶a、编码基因及应用

Info

Publication number: CN104130992B
Application number: CN201410308584.9A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 郑裕国; 林善; 薛亚平; 吴晖; 李邦良; 许静; 许峰; 王鸿艳
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Sino American East China Pharmaceutical Jiangdong Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104130992A

Abstract

本发明提供了一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与水解胶体几丁质生成N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖的几丁质酶(Chitinase)A，编码这个酶基因及其应用。所述几丁质酶A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因如SEQ ID No.2所示。本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节几丁质水解以及N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖合成基因的表达，赋予宿主几丁质酶A的高表达性，为扩大几丁质酶A的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

Description

来自冬虫夏草中国被毛孢的几丁质酶A、编码基因及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与水解胶体状几丁质生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖的几丁质酶(Chitinase)A，编码这个酶基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢机制机理的研究几乎为空白，尤其在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的机制机理上。

几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质，为白色或灰白色无定型半透明固体，溶于浓盐酸、硫酸、冰乙酸和78～97％磷酸及无水甲酸，也可溶于某些配合物熔剂中，如LiCl/DMAC，不溶于水、稀酸、碱、醇及其他有机熔剂。它是由N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)以β-l,4-糖苷键聚合而成的直链大分子，其结构与纤维素相似，只是在纤维素的C(2)原子上的-OH基被-NHCOCH取代，但二者的性质存在极大的不同。几丁质自然界每年生物合成的几丁质约100亿吨，在所有天然多聚物中储量占第二位，仅次于纤维素。几丁质广泛分布于甲壳类动物和昆虫的外壳以及昆虫的中肠围食膜中，另外与其他物质一起构成大多数真菌细胞壁的骨架，几丁质酶是昆虫体壁的主要组成部分，占体壁干重的17％-50％。

几丁质酶是分解几丁质的一类蛋白质，许多动物、植物、微生物都可产生几丁质酶。1905年Becneck首次在蚀几丁质内克氏茵Bacillus chitinovorus中发现几丁质酶以来，作为几丁质主要的生物降解酶类，几丁质酶的研究受到广泛重视。迄今为止已建立了一整套酶学研究方法。对各种几丁质酶来源的理化性质、生物学结构包括几丁质酶的高级结构、一级结构和核苷酸顺序以及酶作用机理等方面进行了大量研究。几丁质酶以其兼具抑制病原真菌生长和杀灭害虫的双重作用，且对动植物、人体无害，不污染环境的优势，而在植物病虫害无公害防治方面极有研究和利用价值。

绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无。植物产生的几丁质酶大部分为第19族糖基化水解酶类，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御。某些链霉菌和土壤中的细菌也能产生具杀真菌活性的19族几丁质酶。

几丁质酶是一种具有广泛应用前景的酶类，对它的利用在很大程度上直接依赖于几丁质酶基因的结构及功能的研究。随着DNA重组技术的发展，国际上广泛开展了几丁质酶基因的分离工作。

1905年Benecke首次分离了可利用几丁质作为营养物质的微生物并命名为Bacilus chhinovorus。1921年Folpmers首次发现分解几丁质的真菌、细菌和放线菌在含有几丁质的琼脂上形成透明圈，证明了培养物中含有水溶性的几丁质酶。1929年Karrer等用蜗牛肠道酶使几丁质转化成N-乙酰氨基葡萄糖，间接地表明几丁质的组成成分。1931年Grassmann等发现Aspergilus的提取物能把几丁质水解成碘可检测出来的还原性物质。1938年ZobeH等研究了海水中分解几丁质酶的细菌，推测几丁质的分解是由糖苷键断裂或氨基基团的脱落造成的。1938年Zechmeister等证明杏乳中含几丁质酶等多种水解酶。1961年Jeuniaux等从蜗牛肠道中分离的细菌和土壤中的放线菌也能产生胞外几丁质酶。2000年Hiramatsu等还发现一些病毒如Chlorella virus也能产生几丁质酶，这样把几丁质酶产生生物扩展到几乎整个生物界。目前，人们已经从多种微生物、植物和动物体中分离到几丁质酶，并对其理化性质作了相关研究。

S.marcescens可以产生5种几丁质酶，它们的分子量分别为21、36、48、52和57kDa。1986年，Fuchs等用EcoR I内切酶不完全酶切pLAFRI质粒构建了粘端文库，转化到E.coli后利用几丁质平板筛选出能降解几丁质的4个不同克隆。该克隆子(重组子)插入片段为22～27kb，亚克隆后得到一个9.5kb编码75KDa几丁质酶的基因。该研究开启了微生物几丁质酶基因克隆的先河。1986年，Wortman等在对Vibrio vulnifiels的几丁质酶基因克隆时，采用了[3H]标记的几丁质为底物，利用液体闪烁计数器监测分解出的可溶性产物。1988年，Robbins等用4-Methylumbelliferyl(4-MU)糖苷的氨基葡萄寡糖作为底物，来检测Streptomyces plicatus的几丁质酶基因在E.coli中的表达。

1993年，Tsujibo等通过将海洋中分离出Alteromonas sp.Strain0-7的几丁质酶基因克隆到表达载体大肠杆菌JM109中，结果表明，产生的几丁质酶不分泌到胞外培养基中，而是在壁膜间隙中聚集。此外，该研究团队利用定点诱变技术克隆到Aheromonassp.Strain0-7的chi85基因中的保守序列，并研究了该保守序列的作用，结果表明，Asp-290和Glu-292对chi85几丁质酶的作用是十分必要的。

1993年，Miyashita等克隆了S.lividans的几丁质酶基因(ch/A)，在对其序列进行分析后发现，该几丁质酶的基因序列与其他Streptomyces几丁质酶的基因序列没有任何同源性，但该基因序列内包含的催化部位和类型Ⅲ重复单位的C端与B.circulars几丁质酶D的基因序列有36％的同源性。1993年，Fujii等克隆的S.lividans几丁质酶C基因，得到2kb的片段包含2个方向相反的开放阅读框(ORF1和ORF2)，Northern杂交后结果表明，只有ORF1的互补mRNA才被转录，说明该基因在表达时受到几丁质的诱导和萄萄糖的抑制。

1994年，Ueda等将Aeromonas sp.No.10S-24的几丁质酶Ⅱ基因克隆得到1626bp的基因编码序列，可编码542个氨基酸，分析后发现该段序列含有一个信号肽。1997年，Chernin等从成团肠杆菌Enterobacter agglomerans中克隆得到的几丁质酶基因，进行全序列分析后发现，该序列包含一个编码562个氨基酸的开放阅读框，形成一个有引导多肽的61kDa的蛋白前体，对该基因进行表达后发现能产生和分泌几丁质酶。通过对Fusariumoxyspomm的孢子萌发抑制试验证明了该转基因菌在体外具有抗真菌活性，且可抑制平板上的Rhizoctonia solani和温室中引起棉花幼苗根腐病的真菌生长。

1999年，Tanaka等发现嗜热古细菌Pyrococcus kodakaraensis KOD1能产生胞外几丁质酶并克隆了几丁质酶基因。对其序列分析表明，该序列长3645bp，可编码1215个氨基酸，分子量为134.259kDa，这是目前已知产酶分子量最大的菌株。1997年，Morimoto等克隆的Clostridium paraputriftcum的c基因，其核苷酸序列长2493bp，为一个独立的开放阅读框，编码831个氨基酸。该酶的分子量也较大，约为90kDa。

2001年，Thiery等从南极冰盖的海底分离得到的革兰氏阳性菌Arthrobacter亚种菌株TAD20中克隆得到几丁质酶基因，通过研究该菌株主要分泌2种几丁质酶chiA和chiB。

2008年，Z.H.Liu等从Chaetomium globosum中克隆到了一个新的几丁质酶，并在毕赤酵母中进行了表达。对这个新酶的酶学性质进行了研究，最适转化温度为45℃，最适pH为5.0，并且在5mmol/L的Cu²⁺条件下有最大酶活，可以达到1.42U/ml。

2009年，Chi-Yea Yang等从台湾土豆中新分离到一株新的菌株Bacillussubtilis，并且中这株菌中克隆得到了具有抗真菌活性的几丁质酶基因。这个基因的开放读码框长度为1791bp，编码595个氨基酸序列。构建重组质粒转化至大肠杆菌中具有几丁质酶活性，并且能使水稻纹枯病菌致病活性下降90％以上。

在国内，有关微生物几丁质酶基因克隆研究较少。1998年，彭辉银等将核型多角体病毒(HaSNP:V)的几丁质酶基因分别定位，获得RXbaI-H片段克隆。1998年，郑洪武等克隆了环状芽孢杆菌C-2的几丁质酶基因。2002年，周樱等从厦门海域分离到了一株高效几丁质降解菌一豚鼠气单胞菌CB101(Aeromonas caviae)，它能产生并分泌多种分子量不同的几丁质酶。熊国如等通过将枯草芽孢杆菌XF-1的发酵液进行硫酸铵沉淀、高温加热处理、SDS-PAGE电泳、氨基酸测序后发现一种耐热几丁质酶，并对该耐热几丁质酶进行了克隆，该几丁质酶对根肿病菌孢子有一定的裂解作用。

2003年，中国农科院烟草所首次将来源于杆状病毒的几丁质酶基因构建在表达载体上，并导入烟草，经PCR和Western Blot等方法检测，得到了转几丁质酶基因的转基因烟草株系。酶活性测定的结果表明，外源几丁质酶基因在烟草中得到了表达，并产生了生物学活性，转基因株系的几丁质酶活性比未转基因的亲本高。

但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中几丁质酶的基因相关信息。

(三)发明内容

本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制的一种几丁质酶A、以及编码的基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种冬虫夏草中国被毛孢参与水解胶体几丁质生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖的几丁质酶A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(记为chiA蛋白)。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

由胶体几丁质获得对应N-乙酰-D-氨基葡萄糖的路径如下所示：

本发明还涉及所述的几丁质酶A在微生物催化胶体几丁质制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖中的应用。所述应用为：以本发明几丁质酶A为催化剂催化胶体几丁质制备相应的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

具体的，所述应用按如下步骤进行：以含几丁质酶A基因的重组工程菌经诱导培养后的湿菌体用磷酸盐缓冲液(优选50mM、pH8.0)悬浮，超声破碎后，离心，取上清液作为催化剂，以胶体几丁质溶液为底物，于pH值为4.6的醋酸缓冲液中，37℃反应，反应结束后将反应液离心，取上清液即为含有N-乙酰-D-氨基葡萄糖的混合液，将混合液分离纯化，获得N-乙酰-D-氨基葡萄糖，所述分离纯化为本领域公知操作，通常采用亲和层析的方法；所述底物的体积用量以几丁质粉质量计为3.33mg/L(终浓度)，所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的质量计为8.3g/L(终浓度)。

所述催化剂按如下方法制备：将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)100mL悬浮，高压破碎仪在功率40％、破1s停1s条件下破碎3次(35Kpa)，每次5min，过滤除去菌体，取滤液即得到粗酶液。更进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含几丁质酶A的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取1mL培养物，将其转接(接种体积浓度为2％)于50mL含有终浓度50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎(优选3次，每次5min)，离心，取上清液即为催化剂。

所述胶体几丁质溶液按如下方法制备：将几丁质粉末加入丙酮中研磨，其间可添加丙酮，充分搅拌至糊状，在10℃下边研磨边慢慢加入浓盐酸(质量浓度36～38％)，几分钟后，用滤纸过滤，然后将滤液缓缓加入到剧烈搅拌的体积浓度50％乙醇水溶液(至少是滤液的5倍体积以上)中，使胶态几丁质沉淀析出，离心去上清液，收集胶态几丁质，用蒸馏水a冲洗数次至中性，混于蒸馏水b中即为胶体几丁质溶液；所述浓盐酸的体积用量以几丁质粉末质量几为40mL/g，所述蒸馏水b的体积用量以几丁质粉末质量几为100mL/g(所述蒸馏水a和蒸馏水b均为蒸馏水，为了便于区分不同步骤用量不同而命名，字母没有含义)。

本发明还涉及编码所述几丁质酶A的基因。具体的，所述基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示(记为chiA基因；chiA基因编码chiA蛋白)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明还涉及所述的基因在构建能够催化胶体状几丁质制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖的基因工程菌中的应用，以扩大几丁质酶A的应用，具体为：构建含有所述几丁质酶A基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有几丁质酶A基因的菌体细胞。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

能够提供本发明所述冬虫夏草几丁质酶A及其编码基因的菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)L0106，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从原理上对几丁质制备相应的N-乙酰-D-氨基葡萄糖进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的几丁质酶A及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节几丁质水解以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成基因的表达，赋予宿主几丁质酶A的高表达性，为扩大几丁质酶A的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

(四)附图说明

图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；

图2为中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图；

图3为几丁质酶A基因PCR扩增产物凝胶电泳图；

图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET-28a物理图谱；

图5为重组克隆质粒pMD18-T/chi A物理图谱；

图6为重组表达质粒pET-28a/chi A构建过程示意图；

图7为重组表达质粒pET-28a/chi A物理图谱；

图8为几丁质酶A蛋白的SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为：葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水；在12～16℃培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余量为水；置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：

1)液氮研磨：取1g新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。

3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。

4)RNA洗涤：加入1mL75％(v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。

5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。

实施例3：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(200～700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GA IIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续分析。

实施例4：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhu et al.De novo assembly of humangenomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue<0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene用软件ESTScan(Iseli,Jongeneel et al.ESTScan:a program for detecting,evaluating,andreconstructing potential coding regions in EST sequences[J].In Proceedingsof9th International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology.AAAIPress,Menlo Park,CA,pp.1999,138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5'到3'方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和GeneOntology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa,Gotz et al.Blast2GO:a universal toolfor annotation,visualization and analysis in functional genomics research[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.)得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye,Fang et al.WEGO:a web tool for plotting GOannotations[J].Nucleic Acids Research,2006,34:293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例6：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制和过程的分析

图2是中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图，每年7-8月冬虫夏草子实体成熟后，子蘘孢子弹出随雨水渗入土中，经过发育变化形成分生孢子。此时如附在蝙蝠蛾幼虫表，经2-3天后即开始萌发伸出芽管，通过酶和机械力的协同作用侵入幼虫体内。吸收体液养分生长并断裂成菌丝段，以酵母状出芽发迅速增值不断扩大体积。前期其代谢产物在血液中不断积累，造成血液酸碱度变化，使血液失去原有的透明性而变浑浊。但不产生毒素与寄主幼虫共生。后期，由于菌体增多，弥漫于幼虫血腔，肠道亦受机械封阻，血液梨花性质发生改变造成病理伤害，出现代谢紊乱，幼虫行动痴呆，不取食。这时菌丝体迅速向体表蔓延，在幼虫体表上出现细线稀疏的白色菌丝，菌丝体大量吸收幼虫体内水分，致使幼虫干硬僵死形成僵虫(即菌核)。通常，中国被毛孢会产生一些降解寄主昆虫的细胞壁、细胞膜和细胞内物质的酶，如几丁质酶、蛋白酶、脂酶等，以降解体壁含有的几丁质、蛋白质、类脂等成份，从而有利于侵袭。从中国被毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了几丁质酶的Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框(SEQ IDNo.2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID No.1)。

实施例7：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢几丁质酶A基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢侵染机制的几丁质酶A基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列：

chiA基因：正向引物5’AGAGAATTCATGCCTCCCTCCACACAGCG3’

反向引物5’ATAGCGGCCGCTCAATCCTCGCCGCGTT3’

chiA基因长度为1089bp(SEQ ID No.2)。

实施例8：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。

采用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

1)在Microtube管中配制下列混合液。

2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下：

65℃，5min

3)退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃ 15～30min

70℃ 15min

一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列(PrimeScript1st StrandcDNA Synthesis Kit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。实施例9：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制几丁质酶A基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测

1、几丁质酶A基因的PCR扩增

以实施例8中得到的cDNA第一链为模板，用实施例7中合成的几丁质酶A基因引物：5’AGAGAATTCATGCCTCCCTCCACACAGCG3’和5’ATAGCGGCCGCTCAATCCTCGCCGCGTT’进行Pfu DNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下：

Pfu PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

2、几丁质酶A基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：

1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；

2)取15mL琼脂糖凝胶，待琼脂糖凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Goldview，混合均匀后倒入电泳琼脂糖凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；

3)琼脂糖凝胶板上凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；

4)取5μL样品然后加入6×Loading Buffer1.5μL和ddH₂O4μL混合后用移液枪上样，上样量为10μL；

5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；

6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；

7)当样品跑过琼脂糖凝胶板的2/3时可终止电泳；

8)切断电源后，将琼脂糖凝胶板上凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测几丁质酶A基因的大小为1089bp，琼脂糖凝胶电泳结果表明已成功扩增出了几丁质酶A基因，大小约为1000bp。图3为“百令”生产菌中国被毛孢侵染机制几丁质酶功能基因PCR产物凝胶电泳图。

3、几丁质酶A基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

4、几丁质酶A基因与克隆载体的连接

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，其物理图谱见图4，将步骤3纯化后的几丁质酶A基因与克隆载体连接构建重组质粒pMD18-T/chiA，物理图谱见图5，连接体系和连接条件如下。

连接体系：

连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

5、几丁质酶A重组质粒pMD18-T/chiA的转化

将重组质粒pMD18-T/chiA转入大肠杆菌E.coli JM109中，构建携带几丁质酶A基因的重组菌E.coli JM109/pMD18-T/chiA，具体步骤为：1)将10μL反应体系(即步骤4的连接产物)转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；2)热击：42℃，90s；3)冰浴：2-3min；4)加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；5)涂布平板(含Amp抗性，终浓度50μg/ml)；6)37℃培养箱培养过夜。

6、几丁质酶A E.coli JM109/pMD18-T/chiA阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水的1.5mL离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，PCR程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。

7、几丁质酶A重组质粒pMD18-T/chiA的测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌液体接种至LB培养基，37℃、150rpm培养过夜后，取4mL菌液提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID No.2已重组至pMD18-T/chiA中。

8、几丁质酶A重组表达质粒pET-28a/chiA的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和几丁质酶A基因酶切位点比对情况，确定了chiA用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切位点，并对重组大肠杆菌E.coliJM109/pMD18-T/chiA进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。

几丁质酶A基因的重组质粒pMD18-T/chiA及表达载体pET-28a分别用EcoRⅠ/NotⅠ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：

EcoRⅠ/NotⅠ双酶切体系：

酶切结束后，65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。

几丁质酶A基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后，再用T4连接酶16℃连接过夜，构建重组表达质粒pET-28a/chiA，其构建过程见图6，构建得到的重组表达质粒pET-28a/chiA图谱见图7。连接体系组成如下：

连接体系：

9、几丁质酶A重组表达质粒的转化以及阳性单克隆的筛选

将构建好的表达质粒热激转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，然后涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性(终浓度50μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以步骤7中合成的几丁质酶A基因引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆。

10、几丁质酶A重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度的IPTG(终浓度0.05mmol/L)诱导培养8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

11、几丁质酶A重组菌表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21(DE3)菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养7h后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，图8中的“A”泳道为大肠杆菌BL21(DE3)空细胞的SDS-PAGE图，“B”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a加IPTG诱导后的SDS-PAGE图，“C”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA未加IPTG的对照SDS-PAGE图，“D”泳道即为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA诱导表达的SDS-PAGE图。表明重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA含几丁质酶A(经测序验证其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)。

12、几丁质酶A重组菌的蛋白活力检测

(1)几丁质酶A的蛋白活力检测

①胶体几丁质溶液的制备：称取1g细粉几丁质，加入4ml丙酮研磨，其间可添加丙酮，充分搅拌至糊状。在10℃下边研磨边慢慢加入浓盐酸(质量浓度36～38％)40ml，几分钟后，用滤纸过滤，然后将滤液缓缓加入到剧烈搅拌的体积浓度50％乙醇水溶液(至少是滤液的5倍体积以上)中，使胶态几丁质沉淀析出，离心去上清液，收集胶态几丁质，用蒸馏水冲洗数次至中性，然后直接混溶于100mL蒸馏水中，即胶体几丁质溶液100ml，避光保存于冰箱中。

②1％对二甲氨基苯甲醛(1％DMAB)：称取1g对二甲氨基苯甲醛，加入少量冰醋酸溶解，再加1.25mL浓HCl(质量浓度36～38％)，最终用冰醋酸定容至100mL(溶液呈黄色)。

③饱和硼砂水溶液：称取5.0g四硼酸钠(Na₂B₄O₇·10H₂O)，溶于100mL热水中，冷却后备用。

④N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备：配制100μg/mL N-乙酰葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)母液，按表1配制并制作标准曲线，标准曲线方程为：y＝0.0053x+0.003，R²＝0.9976其中y为585nm下的吸光值，x为标准品的浓度。

表1 N-乙酰葡萄糖胺标准曲线

酶液制备：称取步骤10收集的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA湿菌体2g，用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)100mL悬浮，高压破碎仪(型号FS-600，上海生析超声仪器有限公司)在功率40％、破1s停1s条件下破碎3次(35Kpa)，每次5min，离心除去菌体，取上清液即得到粗酶液80.2ml。

几丁质酶A转化体系：在1.5mL EP管中加入E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA高压破碎后收集的粗酶液各0.4mL、0.4mL醋酸缓冲液(0.05mol/L，pH4.6)和0.4mL胶体几丁质溶液。37℃水浴反应2h后，12000r/min离心5min，终止反应，取上清液即为含N-乙酰葡萄糖胺的混合液。

参考Reissig等的方法测定上清液中的N-乙酰葡萄糖胺量。方法是取0.4mL上清液，加0.2mL饱和硼砂水溶液，沸水浴7min，冷却后再加2mL冰醋酸和1mL1％对二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液，37℃水浴保温15min后(溶液呈红色)，585nm处测定溶液吸光值。

一个酶活性单位(U)定义为几丁质酶A每分钟分解胶体几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

检测几丁质酶A酶活的空白对照为煮沸20min后失活的粗酶液替代原粗酶液。另外，同样条件下也检测了E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)/pET-28a诱导后的粗酶液的活力，均未发现有颜色变化，即均未检测到几丁质酶酶活。

利用考马斯亮蓝法测得几丁质酶A粗酶液中的蛋白含量为0.107mg/mL，通过Bandscan软件，对SDS-PAGE中的粗酶液条带含量进行分析，几丁质酶A占总蛋白的13.1％，故参与催化反应的几丁质酶A为0.107mg/mL×0.4mL×0.131＝0.00563mg。当添加5mM的Ba²⁺时具有最大酶活：6.48μg/mL×1.2mL÷120min＝0.0648U，故最大比酶活为：0.0648U÷0.00563mg＝11.51U/mg。因此，上述构建所得几丁质酶A重组菌所表达的几丁质酶A的最大比酶活为11.51U/mg，上述反应的转化率为18.1％。比酶活计算公式为：比酶活＝酶活/酶的蛋白总量。转化率计算公式为：转化率＝(初始浓度-平衡浓度)/初始浓度。

(2)几丁质酶A的催化过程研究

考察了不同温度(30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、55℃、65℃)下几丁质酶A转化活力的影响：在1.5mL EP管中加入E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA高压破碎后收集的粗酶液0.4mL(同步骤12的方法)、0.4mL醋酸缓冲液(0.05mol/L，pH4.6)和0.4mL胶体几丁质溶液。分别于30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、55℃、65℃水浴反应2h后，12000r/min离心5min，终止反应，按照前述方法检测比酶活。结果显示35℃为最佳反应温度，此时的比酶活为5.47U/mg。

还考察了不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)对几丁质酶A转化的影响：在1.5mL EP管中加入E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA高压破碎后收集的粗酶液0.4mL、0.4mL不同pH的磷酸盐缓冲液和0.4mL胶体几丁质溶液。于37℃水浴反应2h后，12000r/min离心5min，终止反应，按照前述方法检测比酶活。结果显示最佳反应pH为5.0，此时的比酶活为9.46U/mg。

还考察了不同金属离子(5mM)对几丁质酶A转化的影响：在1.5mL EP管中加入E.coli BL21(DE3)/pET-28a/chiA高压破碎后收集的粗酶液0.4mL、0.4mL醋酸缓冲液(0.05mol/L，pH4.6)和0.4mL胶体几丁质溶液，并分别加入5mM的Mn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Ca²⁺等和EDTA，37℃水浴反应2h后，12000r/min离心5min，终止反应，按照前述方法检测比酶活。结果显示Mn²⁺、Ba²⁺对转化有明显的促进作用，此时的比酶活分别达到了10.83U/mg和11.51U/mg，而Al³⁺、Ca²⁺、EDTA对转化有抑制作用，此时的比酶活分别为3.3U/mg、3.5U/mg和2.5U/mg。

检测结果见下表：

Claims

1.一种几丁质酶A在生物催化胶体几丁质生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖中的应用，所述几丁质酶A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含几丁质酶A重组工程菌经诱导培养后的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，过滤，取滤液作为催化剂，以胶体几丁质溶液为底物，于pH值为4.6的醋酸缓冲液中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含N-乙酰-D-氨基葡萄糖的混合液；

所述胶体几丁质溶液按如下方法制备：将几丁质粉末加入丙酮中研磨至糊状，在10℃下边研磨边慢慢加入浓盐酸，用滤纸过滤，然后将滤液缓缓加入到剧烈搅拌的体积浓度50％乙醇水溶液中，析出沉淀，离心去上清液，收集胶态几丁质，用蒸馏水a冲洗数次至中性，混于蒸馏水b即为胶体几丁质溶液；所述浓盐酸的体积用量以几丁质粉末质量计为40mL/g，所述蒸馏水b的体积用量以几丁质粉末质量计为100mL/g。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述底物的体积用量以几丁质粉质量计，终浓度为3.33mg/L；所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的质量计，终浓度为8.3g/L。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含几丁质酶A的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2％的接种量转接于含有终浓度50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。