CN109825490A - 低温几丁质酶基因chiA在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法 - Google Patents
低温几丁质酶基因chiA在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程、微生物学、酶工程、及发酵工程领域，提供了一种低温几丁质酶基因chiA(chitinase A)在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法。本发明方法，成功构建产低温几丁质酶chiA的重组乳酸克鲁为酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶chiA，利用镍柱亲和层析纯化得到较纯的重组几丁质酶chiA，经SDS‑PAGE分析在110kDa附近出现符合预期大小的蛋白条带。本发明使得表达的几丁质酶chiA大部分分泌到细胞外，从而降低了分离纯化成本，提高了表达效率。纯化蛋白chiA的蛋白浓度为1.26mg/mL，酶活力为51.45U/mg。本发明对纯化后的几丁质酶ChiA进行了温度及温度稳定性、pH及pH稳定性、协同降解作用等酶学性质研究，为该酶的工业化应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程、微生物学、酶工程、及发酵工程领域，提供了一种低温几丁质酶基因chiA(chitinase A)在乳酸克鲁维酵母中克隆表达、纯化及酶学性质研究的方法。
背景技术
几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的多糖，是海洋环境含量最丰富的可再生资源，其降解主要通过海洋微生物分泌的几丁质酶降解体系完成。其中几丁质酶ChiA是其中一种关键酶，它能把多糖的骨架降解成短链的寡糖。几丁质酶降解几丁质产生的高附加值几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物，具有良好的组织兼容性、生物降解性以及调节免疫力、抗菌、诱导植物抗病性、促进植物生长和抗癌等生物活性，在医药行业、食品工业、农业和养殖业等领域有着广泛的应用前景。
低温几丁质酶ChiA编码基因为chiA，其GenBank登录号为No.KF234015，该基因属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)。
目前，已有在大肠杆菌中表达来源于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)几丁质酶chiA基因的报道，虽然目的基因表达量高，但产物主要集中在细胞内，使得后续的分离纯化成本增高，而且大肠杆菌生长温度37℃，所以使得低温几丁质酶稳定性相对较差。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种在乳酸克鲁维酵母中表达几丁质酶基因chiA的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种低温几丁质酶基因chiA的表达方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建pKLAC2-chiA表达载体；
(2)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达低温几丁质酶基因chiA的工程菌；
(3)培养上述工程菌，诱导低温几丁质酶基因chiA表达；
(4)诱导表达后纯化，获得所需重组蛋白ChiA。
所述步骤(1)包括以下步骤：
①以优化后opt-chiA的基因序列为模板，以opt-chiA-F引物和opt-chiA-R引物对进行PCR扩增；
②将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD19-T-chiA；
③将质粒pMD19-T-chiA转化至大肠杆菌JM109感受态细胞培养，筛选阳性转化子，用XhoI和EcoRI酶切验证并测序正确后连接到载体pKLAC2，得到pKLAC2-chiA。
所述优化后opt-chiA的基因序列如SEQIDNO.1所示。
所述引物：
opt-chiA-F：5’–CCGCTCGAGAAAAGAATGTCCTCCAGAAAGATC-3’；
opt-chiA-R：5’–CCCGAATTCTTACAAGGTCCAGTCTGCTGTAACT-3’；
PCR反应条件为：98℃1min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min，1个循环。
所述步骤(2)包括以下步骤：
①制备乳酸克鲁维酵母电转化感受态细胞；
②将质粒pKLAC2-chiA电转化至乳酸克鲁维酵母电转化感受态细胞得到重组表达菌种K.lactis GG799/pKLAC2-chiA。
所述步骤(3)中培养时所用的YPD培养基组成为(w/v)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
所述步骤(3)中培养条件为30℃，初始pH为7，200rpm，培养36-72小时后诱导低温几丁质酶chiA的表达。
所述步骤(3)中诱导条件为：加入终浓度为0.2mM的IPTG。
所述步骤(4)诱导表达后10000×g离心30min，收集上清粗酶液进行镍柱纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明将低温几丁质酶chiA基因插入到表达载体pKLAC2上构建得到pKLAC2-chiA，将该表达质粒导入乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中获得的工程菌能够高效表达低温几丁质酶chiA，表达的低温几丁质酶ChiA大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，提高了表达效率。本发明对纯化后的几丁质酶ChiA进行了温度及温度稳定性、pH及pH稳定性、协同降解作用等酶学性质研究，为该酶的工业化应用奠定了基础。
附图说明
图1目的基因chiA电泳图；其中M为DNA标准分子量(bp)，1为目的基因DNA酶切回收片段；
图2表达质粒pKLAC2-chiA的酶切电泳图；其中，M为DNA标准分子量(bp)，1表示质粒pKLAC2-chiA经Xho I和EcoR I酶切后的结果；
图3酵母转化子PCR鉴定图；
图4重组菌K.lactis/pKLAC2-chiA表达产物的SDS-PAGE电泳分析；M为标准蛋白，1为重组菌株发酵液上清，2纯化后ChiA,3为K.lactis/pKLAC2空载对照；
图5酶学性质研究；其中，(A)温度对重组ChiA酶活的影响，(B)重组ChiA酶的热稳定性，(C)pH对重组ChiA酶活的影响，(D)重组ChiA酶的pH稳定性；
图6ChiA与ChiC协同降解晶体底物的产物分析；(A)ChiA、ChiC或ChiA+ChiC与底物胶体几丁质反应生成(GlcNAc)2，(B)α-几丁质反应生成(GlcNAc)2，(C)β-几丁质反应生成(GlcNAc)2。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的条件下，可以对pKLAC2-chiA的核苷酸序列进行修改，同时可以对pKLAC2的非必需区段进行替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，另外还可以对例如多克隆位点进行修改，然而这些修改并没有改变本发明的实质，均属于本发明的范围。
大肠杆菌JM109、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799,K.lactisGG799)和K.lactis GG799/pKLAC2(空载)由实验室保存，购自New England Biolabs公司；pMD19-T Simple Vector购自TaKaRa公司，pKLAC2购自New England Biolabs公司。
实施例1乳酸克鲁维酵母表达质粒pKLAC2-chiA的构建
1.1引物设计及目的基因的扩增
根据低温几丁质酶chiA(GenBank No.KF234015)基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性，去除信号肽序列，使用GeneOptimizer软件对基因成熟肽核苷酸序列进行密码子优化,密码子优化后opt-chiA基因序列如SEQIDNO.1所示。(GenBank No.MK635352)。
以密码子优化后opt-chiA的基因序列为模板，利用Primer5.0软件，优化PCR引物参数，设计添加XhoI和EcoRI限制性酶切位点和保护碱基的引物。通过TaKaRa LA TaqTM DNAPolymerase进行PCR扩增不含有信号肽的成熟目的片段，在C端引入了6×His亲和纯化标签。PCR反应条件为：98℃1min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min，1个循环。克隆结果见附图1，目的片段3180bp。
所述opt-chiA-F引物为：
5’–CCGCTCGAGAAAAGAATGTCCTCCAGAAAGATC-3’；
所述opt-chiA-R引物为：
5’–CCCGAATTCTTACAAGGTCCAGTCTGCTGTAACT-3’；
1.2从PCR反应产物中回收目的片段并筛选阳性转化子
将PCR产物纯化回收连接到pMD19-T载体后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子接种至氨苄抗性LB培养基中筛选阳性转化子，提取质粒用XhoI和EcoRI酶切验证。将验证正确的克隆子送到上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.3目的基因连接到乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2
测序结果正确的质粒pMD19-T-chiA，经限制性内切酶XhoⅠ和EcoR I双酶切后与相同酶切后的载体pKLAC2相连，转入E.coli JM109，涂布氨苄抗性平板，挑转化子，提取质粒，经XhoⅠ/EcoR I双酶切验证，得到构建成功的重组表达质粒pKLAC2-chiA。
表达质粒pKLAC2-chiA的检测结果见附图2，结果表明外源片段(3180bp)和载体(9100bp)大小均正确。
实施例2低温几丁质酶基因chiA在乳酸克鲁维酵母GG799中的分泌表达
2.1乳酸克鲁维酵母GG799(实验室保藏)电转化感受态细胞的制备及其电击转化
(1)挑取新鲜的酵母单菌落于5ml组成为酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％的YPD液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养；
(2)取500μl的培养物接种至含有50ml新鲜YPD液体培养基的250mL三角摇瓶中，30℃、200rpm培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；
(3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
(4)按步骤3离心，用20ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
(5)按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
(6)按步骤3离心，用0.2ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
(7)将其分装为80μl一份的包装。
(8)将10μl的线性化表达质粒pKLAC2-chiA与80μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
(9)将电转杯冰浴5min；
(10)电击：电压1.5KV；电容25μF；电阻250Ω，电击时间为4-10ms。
(11)电击完毕后，加入1ml4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至1.5ml的EP管中，30℃静置孵育5h；
(12)将200μl菌体悬液涂布于YCB平板上；所述YCB培养基100ml配方：1M Tris-HCl储液(pH7.0)3ml，YCB培养基粉末(NEB)1.17g，进口细菌用琼脂粉2g，加去离子水定容至99ml，121℃高温高压灭菌15分钟，自然冷却至60℃左右时，加入1ml100×Acetamide储液(NEB)，混匀后倒平板。
(13)将平板倒置于30℃培养，直至单个菌落出现，大约3-4天。
2.2转化子的筛选与验证
通过Sac II酶切重组质粒pKLAC2-chiA与pKLAC2-chiC，得到线性化DNA后电转K.lactis GG799，涂布YCB(配方见2.1)平板，于30℃恒温培养箱培养4d后得到单菌落，挑取转化子在YPD(配方见2.1)平板上纯化，30℃培养2天。
挑取单菌落，接入3ml YPD液体培养基中，30℃、200r/min培养过夜，室温下3 000×g离心5min收集菌体，提取基因组作为PCR反应的模板，利用鉴定引物Primer1/Primer2进行PCR扩增，筛选出发生同源重组的转化子。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。见附图3，挑选出的菌落均能扩增出约2.4kb的条带，筛选到发生同源重组的转化子，说明目的基因已重组到酵母基因组中。
所用鉴定引物
Primer1：ACACACGTAAACGCGCTCGGT；
Primer2：ATCATCCTTGTCAGCGAAAGC；
2.3乳酸克鲁维酵母重组几丁质酶chiA的表达和纯化
将筛选得到的重组菌K.lactis GG799/pKLAC2-chiA、和K.lactis GG799/pKLAC2接种于50mL液体YPD培养基中，30℃、200r/min培养5d，将发酵液于10000×g离心30min，收集上清，利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，具体步骤为：
(1)将Ni-NTA层析柱垂直固定，除去Ni-NTA层析柱下端塑料塞，使NiSO4溶液去尽；
(2)5V Bind Buffer平衡柱子，所述Bind Buffer溶液1L配方：NaCl固体2.922g，Tris固体2.422g，加入800ml去离子水溶解，浓盐酸调pH至8.5，加去离子水定容至1L；
(3)上清粗酶液上柱，收集过柱溶液；
(4)10mL Bind Buffer过柱，收集过柱溶液；
(5)3V20mM咪唑过柱，收集过柱溶液；
(6)2V40mM咪唑过柱，收集过柱溶液；
(7)1V80mM咪唑过柱，收集过柱溶液；
(8)1V150mM咪唑过柱，收集过柱溶液；
(9)1V300mM咪唑过柱，收集过柱溶液；
(10)1.5mL100mM EDTA(pH8.0)溶液过柱；
(11)5V Bind Buffer过柱；
(12)2V NiSO4溶液挂柱，4℃保存。
利用SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度及分子量。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)测定蛋白质含量。见附图4，与重组菌K.lactis/pKLAC2相比，重组菌K.lactis GG799/pKLAC2-chiA经纯化后在110kDa附件可见单一蛋白条带，说明在ChiA在K.lactis GG799中得到有效的分泌表达。
重组蛋白的酶活测定：酶液0.1mL与0.9mL，1％胶体几丁质混合，30℃下保温30min后，反应混合物沸水浴中10分钟终止反应，10,000×g离心5min，取上清0.5mL，加入1mLSchales’试剂，沸水浴10min，测定OD420nm，设3个重复，取平均值，根据N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线计算酶活力。酶活单位定义(U)：在上述条件下，1min催化产生相当于lμmoL N-乙酰-D-氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。
纯化蛋白ChiA的蛋白浓度分别为1.26mg/mL，酶活力分别为51.45U/mg。
实施例3重组几丁质酶ChiA的最适温度及温度稳定性、最适pH及pH稳定性研究
温度对酶ChiA的影响
(1)最适反应温度：在pH值为8.0(50mmol/L Tris-HCl缓冲液)的条件下，以4MU-(GlcNAc)2为底物，在4℃～70℃的温度范围内测定酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应温度。
(2)酶的热稳定性：将酶液分别置于不同温度(4℃～70℃)下保温1h，然后在最适反应pH和最适反应温度下检测残余酶活，并和未处理的酶活进行比较，计算相对活性。
pH对酶ChiA的影响
(1)最适反应pH值：酶活反应温度为20℃，以[4MU-(GlcNAc)2]为底物，在pH值为3～12的50mmol/L缓冲液中测定酶活，根据酶在不同的pH值下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH值。
(2)酶的pH值稳定性：将酶液分别置于50mmol/L不同pH的缓冲液中，20℃下放置24h，然后在最适反应pH和最适反应温度下检测残余酶活，并和未处理的酶活进行比较，计算相对活性。
见附图5。
由图5-A可知，ChiA在10～40℃温度时有较高酶活，达到80％以上，最适反应温度为20℃，在4℃时酶活在60％以上；在40～70℃温度内，随着温度的升高酶活力降低，且在50℃时酶活力骤降，酶活为最适温度下酶活的50％左右。
由图5-B可知，ChiA在30℃以下环境下具有较好的热稳定性，经过温育1h处理后酶活仍保留80％以上，且在20℃时稳定性最好；而ChiA经高于40℃温育处理后，酶活下降，酶活剩余50％以上，说明ChiA有较好的热稳定性。
由图5-C可知，ChiA在pH8.0-9.0酶活性很高，达到95％以上，反应的最适pH为8.0，当pH小于8.0或大于9.0时，酶活急剧下降，pH为7.0时，酶活下降至60％，在pH为3.0-6.0时酶活力低于40％；pH为10.0时，酶活力下降至70％左右，pH为12.0时，酶活低于40％，该重组酶较为适合在偏碱性pH范围内作用。
由图5-D可知，ChiA在pH8.0-12.0间剩余酶活力在70％以上较为稳定，当pH为7.0时，相对酶活力剩余60％，pH低于6.0时，相对酶活力剩余不足40％。所以该酶适合保存在偏碱性的环境中。
实施例4酶ChiA与酶ChiC协同降解作用研究
通过相同的密码子优化方法，获得opt-chiC基因序列，如SEQIDNO.2所示(GenBankNo.MK635353)。然后以实施例中相同方法克隆表达获得重组ChiC。
采用HPLC检测几丁质酶系协同降解几丁质的效率。1mL反应体系：ChiA(1μM)，ChiC(1μM)或ChiA(0.5μM)+ChiC(0.5μM)，1mg/mL胶体几丁质；5mL反应体系：ChiA(5μM)，ChiC(5μM)或ChiA(2.5μM)+ChiC(2.5μM)，2mg/mL粉状几丁质，0.01％(w/v)NaN3，40μg/mL四环素，20℃或30℃下温育，分别于0、2、4、6、8、10、24h取样，加入等体积70％乙腈终止酶反应，反应产物经0.22μm滤膜过滤后，进行HPLC分析检测。
HPLC分析条件：谱柱TSK-Gel Amide-80column(0.46×25cm；Tosoh)，粒径5μM。采用70％乙腈等梯度洗脱，流速0.7mL/min，柱温25℃。水解产物用紫外检测器或电喷雾检测器进行检测，检测波长190nm。
见附图6。
由图6-A可知，ChiA和ChiC都可单独降解胶体几丁质，且ChiC降解能力高于ChiA；24h降解胶体几丁质生成的(GlcNAc)2的含量ChiC为ChiA的1.3倍；ChiA和ChiC协同降解胶体几丁质的效率明显高于ChiA或ChiC单独水解，24h降解生成(GlcNAc)2的含量分别为ChiA和ChiC产量的3.0倍和2.3倍。
由图6-B可知，ChiA和ChiC都可单独降解α-chitin，ChiC的降解能力高于ChiA，24h时ChiC水解α-chitin生成的(GlcNAc)2含量是ChiA的8.6倍；ChiA和ChiC协同降解α-chitin的效率明显高于ChiA或ChiC单独水解，24h生成的(GlcNAc)2的含量是ChiA降解产量的19.0倍，是ChiC降解产量的2.2倍。
由图6-C可知，ChiA和ChiC都可单独降解β-chitin，且ChiC对β-chitin的降解能力明显高于ChiA；24h ChiC水解β-chitin生成的(GlcNAc)2含量是ChiA的3.0倍。ChiA和ChiC协同降解β-chitin的效率明显高于ChiA或ChiC单独水解，24h生成的(GlcNAc)2的含量分别为ChiA和ChiC产量的4.8倍和1.6倍。
由图6-A、6-B、6-C对比可知，同菌株来源的ChiA和ChiC表现协同降解底物α-chitin、β-chitin和胶体几丁质作用，对协同降解胶体几丁质效果最显著，而酶解晶体底物α-chitin效果强于β-chitin。ChiA、ChiC、ChiA+ChiC对胶体几丁质的降解效率明显高于α-chitin或β-chitin。24h ChiA降解β-chitin生成几丁二糖为16.0mg/mL，而降解α-chitin生成(GlcNAc)2的产量仅为4.3mg/mL；ChiC降解β-chitin生成几丁二糖为48.3mg/mL，而降解α-chitin生成(GlcNAc)2的产量为36.7mg/mL，说明ChiA和ChiC对β-chitin的降解效率高于α-chitin，推测这可能与β-chitin的结构有关，与α-chitin相比，β-chitin结构相对松散粗糙。
序列表
<110> 大连大学
<120> 低温几丁质酶基因chiA 在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgagaaaa gaatgtcctc cagaaagatc atcaagaacg ccttcaagtt gtccgctttg 60
ccattgtccg ctttctcctt gaacgtctac gcttccaccg attgttccac tttgaccgct 120
tgggaattgg gtcaaaccca taccgcaggt tctcaagtca aggctcagaa caacgcttac 180
gaagctaagt ggtggaccca agctaaccca ttggaaaacg caggacagta ccaggattgg 240
ttgttgttgg gagtttgtga ctccgccgtt aacgataacc agtccccaat catcaccgaa 300
tttactccag aaaacggttc attgttctcc gacaaggact ccgtcgttat cttcgctcaa 360
gctaccgatt ccgacggttc agttgcttcc gtcgaatttt tcatcgacgg tatctccatc 420
gcagtcgata acacagctcc attctccgtc aattggcaag ctatcgccgg agaacatcaa 480
atctccgcag ttgctactga cgataaggga gctaactcag cagaagtcgt caacaccttg 540
tccgtttccg attccgttgt cgtcgatcca actaaccaag ctccagttgc ttccatctcc 600
ttctccatct tgccagaaca attgatcgtc ggttctcagg tcgaatttat tttgtccggt 660
accgattccg acggtcaagt tacagctttg tccttcgccg aaaacggtgt cgatatccac 720
caatcctcct cttccgcttc ttctttcgct tggcaagcta cagctttggg tcaaactacc 780
ttcaccttga ccgttaccga caacgaagga gctacctctc aaactaccaa ggtcttgacc 840
gtcgtcgaag aaaacaccgg tccagttact tccaccgatt gtagaccaca gggtttgtac 900
caaactccag gagtcaacac cccatattgt accatctacg acgccgaagg tagagaaatc 960
atgggagcag accacccaag aagagtcatc ggttacttca cctcttggag aaacggagct 1020
aacggtcaac catcctactt ggtcaacgac atcccttggg acaagatcac ccacatcaac 1080
tacgctttcg ctcacgttga cgctaacaac aaggtctcca tcggtgatcc aacttccgtt 1140
aacaacccag ctaccaacat ggaatggcca ggagttgttg gagccgaaat ggacccagaa 1200
tttaattaca agggtcactt caacttgttg aacaagtaca agaagcagca cccagacgtc 1260
aagaccttga tatccgttgg aggttgggca gaaacaggag gttacttcga cgaaaccggt 1320
agagttgctt ccggaggttt ctacaccatg accactaacg ctgacggttc tatcaaccac 1380
gcaggtatca acgctttcgc taagtccacc gtcgaattta ttgaaaagta cggtttcgac 1440
ggagtcgaca tcgactacga atacccatcc tccatgaacg actcaggtca tccagacgat 1500
ttcccaatct ccaacgctag aagagcaggt ttgaacgctt cctaccaggt cttgatgaag 1560
aaggtcagag aagaattgga cagagcagga gaagcagcag gtaagcacta cttattgacc 1620
atcgcctccc catcttccgg ttacttgttg agaggtatgg aaaccttcca agccgtccaa 1680
tacttggact acgtcaacat catgtcctac gacttgcacg gagcttggaa ctctcacgtt 1740
ggtcacaacg cagctttgtt cgataccggt ttggactccg aattaaccca gtggaacgtc 1800
tacggtacca aggaatttga aggtatcggt tacttgaaca ccgattgggc cgttagatac 1860
ttcagaggag ctatgtccgc cggtagaatc aacatcggtt tgccatacta caccagaggt 1920
ttcaaggacg tctcaggagg tactaacggt ttgtggggtc aagcagcttt gccaaaccaa 1980
gcagattgtg ctaccggtac aggagtcgga gaaaagaaca agtgtggtaa cggagccttg 2040
ggtatcgata acttgtggca cgacaagaac gacgcaggtc aagaaatgcc agcaggttct 2100
tctcctttgt ggcacgtcaa gaacttggaa aacggtatcg tcggttccta cttgggagta 2160
tacggtttga ccccagatac agacgcagac gatagattga ccggtaccta caccagacac 2220
tacgattccg ttgcagtagc tccttggttg tggaacgccg ataaaaaggt cttcttgtcc 2280
atcgaagacg aagaatctat ggctaccaag gtcgactacg tcatcaacaa cggtttggga 2340
ggtatcatgt tttgggaatt ggccggagat ttcgattacg acgcagccaa gggagaatac 2400
ttcatgggtt ctaccttgac ctccttggcc tacaacaagt tcaaccaatc cggagttgct 2460
tacgacgttc acggaggtaa cccaaacttc aacactccag ctgaagccgt tgacgtcgtt 2520
ttcgaagcta aggacttccc agtcggagac gaaaactacc caatctctcc aaccttcgcc 2580
ttcaccaaca actccaactt ggacttgtcc ggagccaaga tctctttcga cgttccagtt 2640
tccacttccg ctatcttcaa gtccaattgg aacgcccagg aaaagttggg tatggcagtc 2700
gaagtcaacg gttctaacgc agccggtaat aacatcggag gtttcgaaaa cgaatttcat 2760
agattctcca tcaccttgaa caacgaatgg ggaggacagc caaaggattt ctcagcagga 2820
gctaccgtca acgctcaggt catgtactac atgccaatca ccggtccatc caacttcacc 2880
atcgaaaagg acggtaagac ctacgccttc aaggccgaat actctatgtt gccagacgct 2940
actccaggag acggtacagg taatccagat aacggaggag gagatccagt cggtacttgt 3000
gaaggagtcg atatcgctac catcccagtc tacccaaact tcccacaaac cgattgggca 3060
ggtaatccat ctcacgcagc aggaggagat ttgatggttc ataacaacgc cgtctacaaa 3120
gccaagtggt ggactacttc cgaaccagga gttacagcag actggacctt gtaagaattc 3180
<210> 2
<211> 2649
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagaaaa gaatgaacat caagcagttg tccgcagcta tgggtgttgc tttgttcgca 60
ggttccgttt cagctgctcc atctactcca tccatcaatt gggaaccaca gcagtactcc 120
ttcgttgaag tcgacttgga aggtaacggt tcctacaagc agttggtcac cagagtcgaa 180
caggtcaaca tcaacatcga atggtcagct tggtcaggtg acggtggtga ttcctacaag 240
gtctacttcg acgacatgtt ggtcaacgaa ggtactttgg cagccggttc taagtccggt 300
actatcactt tcccatacga caaggccggt agacatacca tgtacgtcga attgtgtgaa 360
ggtggtacca cttgtgctag atcagcaggt aagccaatcg tgatcgcaga tacagacggt 420
ggtcatttgg ctccattgcc aatggacgtt gacccaaaca acagagacat cggtatcaag 480
cagggtttgg tcacaggtgc ttacttcgtc gaatggggta tctacggtag agactacgac 540
gttaccaaca tgccagctca gaacttgtcc cacatcttgt acggtttcat cccaatttgt 600
ggtgaaaacg cctccttgtc aggtggtcca aagagagcct tggatacagc ttgtgcaggt 660
tcagccgatt acgaagttgt tatccacgat ccttgggcag cagttcaaaa ggctttgcca 720
ggtgttgacg ctaaggatcc aatcagaggt acctactccc agttgatggc cttgaagcag 780
agatacccag acatcaagat cttgccatca gtgggtggtt ggactttgtc agacccattc 840
ggtggtttca ccaacaaggc taacagagac accttcgtcg cttccatgga agaatttttg 900
agaacttgga agttctacga cggtgtcgac atcgattggg aatttccagg tggtgacggt 960
ccaaatccag acattggtga tccaatcaac gacggtccag cttacgttgc cttgatgcag 1020
gaattgagag ccatgttgga caagttggaa gccgaaaccg gtagaaccta cgaattgacc 1080
tccgctattg gtgcaggtta cgacaagatc gaagacgtcg attaccaagc cgcttctcag 1140
tacatggact acatcttcgc catgacctac gacttctacg gtgcttggtc taacgttacc 1200
ggtcatcaaa ccgccttgta ttgtggtgaa cacatgtccg ttggtcagtg taacggtacc 1260
ggtttggacg aaaacggtga accaagaaag ggtccagctt acactaccga caacgccgtc 1320
cagttattgt tggctcagaa cgtcccatcc aagaagatcg ttgtcggtac cgctatgtac 1380
ggtagaggtt gggaaggtgt ttacccacaa aacgcagcca tcgacggtaa tccaatgaca 1440
gctccaggta acggtccatt gaagggttct acagctcaag gtgtttggga agacggtgtc 1500
atcgactaca agggtgttaa ggctaacatg attggtgcag ccggtacagg tatcaacggt 1560
ttcgaagtcg gttacgacga acaagctcaa gccgcttacg tttggaacag agctaccggt 1620
aagttgatca cctacgactc cagaaagtcc gtcttggcta agggtgctta cgtcaaccag 1680
tacaacttgg gtggtttgtt cgcttgggaa atcgacgccg ataacggtga catcttgaac 1740
gctatgcacg acggtttggg tggtgttgtt gctccaccaa ctaacaagaa gccagtcgtc 1800
tccgtttcct cttccgtttc cgtcaattcc ggtgaatcca tcaccgttac agcttcagct 1860
acagacgcag ataacgatcc attgtccttc tcttggtccg cagataacgc tttggtggtt 1920
tccggtcaga actccgcttc tttggttatt accgctccaa ccgttaccgc cgatactcaa 1980
tacgttgcta ccgttgcagt ttcagacggt gaagcaacag tcaacagaga cgtcgtcgtt 2040
aacgtgatcg ctccaacttc aggtggtgaa aacacagctc catccgttga cgctattgct 2100
aacatctccg tcgaagaagg tgcttctacc tcagttgccg ttgttgcttc agacgctcaa 2160
aacgacgccg ttacttacac ttggaccgtt ccagcaggtt tgactttggt tggttccggt 2220
tccaacgtca ctatcgaagc aggtgcagtt gacgcagata cagatttcac cgtctccgtt 2280
gccgtttcag atggtgcttt gactaccacc caatctttct ccgtcaccgt taccaacgtc 2340
gataccacta acccaccaac aggttcttgg gacgcttcag ttgcttacgt tggtggtgac 2400
gttgtgactt acaacggtgt ggaatacaag gctaagtggt ggactcaggg tgaaagacca 2460
gatttgggtg gtgcttggga agctactact caaccaacag acggtacagg tgttgcagtt 2520
tggcaaccaa ccgctatcta caactcaggt gacgaagtct cctaccaggg taacaagtac 2580
caagccaagt ggtggactca aggtaacgaa ccaggttcta ccgacgtttg gttggctttg 2640
taagaattc 2649
Claims (9)
1.一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建pKLAC2-chiA表达载体；
(2)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达低温几丁质酶基因chiA的工程菌；
(3)培养上述工程菌，诱导低温几丁质酶基因chiA表达；
(4)诱导表达后纯化，获得所需重组蛋白ChiA。
2.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：
①以优化后opt-chiA的基因序列为模板，以opt-chiA-F引物和opt-chiA-R引物对进行PCR扩增；
②将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD19-T-chiA；
③将质粒pMD19-T-chiA转化至大肠杆菌JM109感受态细胞培养，筛选阳性转化子，用XhoI和EcoRI酶切验证并测序正确后连接到载体pKLAC2，得到pKLAC2-chiA。
3.如权利要求2所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，所述优化后opt-chiA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求2所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法所述步骤(1)，其特征在于，所述引物
opt-chiA-F：5’–CCGCTCGAGAAAAGAATGTCCTCCAGAAAGATC-3’；
opt-chiA-R：5’–CCCGAATTCTTACAAGGTCCAGTCTGCTGTAACT-3’；
PCR反应条件为：98℃1min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min，1个循环。
5.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)包括以下步骤：
①制备乳酸克鲁维酵母电转化感受态细胞；
②将质粒pKLAC2-chiA电转化至乳酸克鲁维酵母电转化感受态细胞得到重组表达菌种K.lactis GG799/pKLAC2-chiA。
6.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，步骤(3)中培养时所用的YPD培养基组成为(w/v)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
7.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶chiA的表达方法，其特征在于，步骤(3)中培养条件为30℃，初始pH为7，200rpm，培养36-72小时后诱导低温几丁质酶基因chiA的表达。
8.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，步骤(3)中诱导条件为：加入终浓度为0.2mM的IPTG。
9.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiA的表达纯化方法，其特征在于，步骤(4)诱导表达后10000×g离心30min，收集上清粗酶液进行镍柱纯化。
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