CN112175982A

CN112175982A - 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112175982A
Application number: CN202011047620.2A
Authority: CN
Inventors: 许正宏; 徐国强; 曹蓉; 段艳婷; 王籍阅; 张晓娟; 张晓梅; 史劲松
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112175982B

Abstract

本发明公开了一种γ‑PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用，是一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺，属于合成生物学和发酵工程领域。本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，利用不同强度的RBS调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ‑PGA分子量为295.47～28018kDa。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径，实现理性控制γ‑PGA分子量的目的，节省了原料和过程控制成本，提高了经济效益，拓展了聚谷氨酸的应用范围，具有很好的工业应用价值和前景。

Description

一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及应用合成生物学技术，具体是一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用技术，通过调节γ-聚谷氨酸合成酶调节其分子量，属于合成生物学和发酵工程领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对重金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。聚谷氨酸分子量是限制其应用的一个重要因素，例如用于水处理领域的聚谷氨酸分子量需要在150-200kDa左右，而化妆品领域需要80-120kDa左右的聚谷氨酸，医药载体领域则需要低分子量聚谷氨酸，例如，分子量30-60kDa的聚谷氨酸可以用于合成水溶性γ-PGA-紫杉醇偶联物抗肿瘤，11kDa大小的γ-PGA可以促进钙吸收。目前，主要有物理、化学、酶法降解等方法控制其分子量。物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差，化学法引入化学试剂，造成污染，反应条件复杂，产生大量工业废水，而酶解法利用γ-PGA降解酶酶解，步骤繁琐，也不是控制γ-PGA分子量大小的高效方法。

为解决上述问题，相关研究以B.subtilis 168为底盘微生物，异源表达不同来源的γ-PGA合成酶基因，通过微生物发酵法直接合成得到了一定分子量范围的聚谷氨酸。但是其仍然不能达到精确控制γ-PGA分子量，以满足不同应用需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在谷氨酸棒杆菌中合成不同分子量的γ-聚谷氨酸。本发明选用高产L-谷氨酸的工业菌株----谷氨酸棒杆菌F343菌株为底盘微生物，应用合成生物学技术，对地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联，在Corynebacterium glutamicum F343菌株中成功表达，成功构建了重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A，获得不同产量且不同分子量的γ-聚谷氨酸。

本发明的第一个目的是γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联，先提取地衣芽孢杆菌基因组，通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，选取2种强度的基因调控元件，分别单独调控聚合酶基因capB、capC、capA，再通过同尾酶技术得到串联表达重组质粒，转化到感受态细胞C.glutamicum F343中，最终构建了单独调控聚合酶基因重组菌株。

进一步的，所述γ-聚谷氨酸合成酶基因，在本发明的一种实施方式中，来自于地衣芽孢杆菌，从ATCC购买，菌株号为ATCC 9945a。

进一步的，所述的基因调控元件，在本发明的一种实施方式中，是双顺反子结构标准化的RBS，即BCD-RBS。

进一步的，所述的2种强度，在本发明的一种实施方式中，是低强度BCD-RBS1和高强度BCD-RBS10。

进一步的，所述同尾酶连接技术，在本发明的一种实施方式中，是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。

进一步的，所述的串联表达重组质粒，在本发明的一种实施方式中，是pZMI(Ptac)-BCD-R1/R10-capBcapCA、pZMI(Ptac)-capB-BCD-R1/R10-capC-capA、pZMI(Ptac)-capBC-BCD-R1/R10-capA。

本发明的另一个目的是提供一种单独调控聚合酶基因重组菌株，在本发明的一种实施方式中，是Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A。

本发明的另一个目的是提供一种利用表达所述基因工程菌发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。

进一步的，所述方法，在本发明的一种实施方式中，是用于生产不同分子量的γ-聚谷氨酸。

进一步的，所述方法，在本发明的一种实施方式中，是将Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A从保菌冻存管中吸取2-5μL菌液，在LB-Glu(含卡那霉素25mg/L)平板中划线，培养24h(30℃)。挑单菌落到种子培养基中，32℃，120rpm往复培养12h，按5％的接种量接入发酵培养基中，32℃、120rpm培养2h，加入IPTG诱导1h后温度调为37℃培养96h。

本发明的另一个目的是提供所述方法得到的聚谷氨酸。

进一步的，所述聚谷氨酸，在本发明的一种实施方式中，分子量为295.47～28018kDa。

本发明的另一个目的是提供本发明得到的聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医学、环境保护领域的应用。

本发明的有益效果：(1)构建的重组菌株能够合成不同产量的γ-PGA，为进一步提高γ-PGA产量提供有效方法；(2)通过单独调控聚谷氨酸合成酶基因，可以合成不同分子量大小的γ-PGA，分子量为295.47～28018kDa。本研究通过高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA，并且通过双顺反子标准化后的核糖体结合位点RBS分别单独调控聚合酶基因capBCA，实现γ-PGA的分子量的精准调控。因此，本发明所提供的方案，对于利用谷氨酸棒杆菌高产不同分子量的γ-聚谷氨酸的研究具有普遍的意义。

附图说明

图1：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的菌落PCR验证；

图2：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A发酵评价之重组菌生长情况；

图3：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A发酵评价之γ-PGA产量；

图4：利用葡聚糖标准品分子量与峰停留时间绘制的保准曲线图；

图5：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所产γ-PGA分子量变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下面实施例涉及的测定方法或培养方法如下：

聚谷氨酸产量测定方法：

样品处理：将发酵液12000rpm离心15min，取上清，稀释适当倍数，用0.45μm过滤膜过滤，取500μL于2mL进样瓶中，待测。使用凝胶渗透色谱柱：TSKgel super Aw 4000、TSKgelsuper Aw 5000。柱温：40℃，进样量50μL。流动相为0.2M Na₂SO₄，用冰醋酸调节流动相pH为4.0左右。检测器为：waters液相RID示差检测器。

生物量的测定方法(紫外可见光光度计)：将各个取样点的样品稀释合适倍数，至OD₆₀₀值为0.2-0.8，量取200μL，在波长600nm处测取吸光度。

种子培养基：玉米浆35g·L^-1，葡萄糖25g·L^-1，K₂HPO₄ 1.5g·L^-1，MgSO₄ 0.6g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.005g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.005g·L^-1，尿素2.5g·L^-1(分消灭菌)，pH6.8-7.0，每250mL三角瓶中装液25mL，121℃灭菌20min。

发酵培养基：玉米浆10g·L^-1，葡萄糖120g·L^-1，K₂HPO₄ 1.0g·L^-1，MgSO₄ 0.6g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.002g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.002g·L^-1，尿素7.0g·L^-1(分消灭菌)，pH6.8-7.0，每500mL三角瓶装液50mL，121℃灭菌20min。

重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的构建方法：以构建重组菌Cg1BCA为例，以B.licheniformis ATCC9945a基因组为模板，扩增出capB、capC和capA基因片段，长度分别为1179bp、447bp和1167bp，将PCR产物和诱导型载体进行Nde I和BamH I双酶切、连接，得到重组质粒pZM(Ptac)-capB、pZM(Ptac)-capC和pZM(Ptac)-capA。利用引物BCD-R1-F/R扩增出BCD-R1片段，利用Xba I和Nde I进行双酶切，连接到同样用Xba I和NdeI双酶切处理后的pZM(Ptac)-capB质粒上，构建重组质粒pZMI-BCD-R1-capB。对其进行NheI和Sal I双酶切，对pZM(Ptac)-capC进行Avr II和Sal I双酶切，利用Nhe I和Avr II是一对同尾酶，酶切后具有相同的粘性末端，T4连接两段酶切后的片段，连接处的Nhe I和AvrII两酶切位点消失，得到重组片段pZMI-BCD-R1-capB-capC。再利用Nhe I和Sal I双酶切pZMI-BCD-R1-capB-capC，Avr II和Sal I双酶切pZM(Ptac)-capA，T4连接两段酶切产物，得到重组质粒pZMI-BCD-R1-capB-capC-capA(1BCA)，重复此方法，构建重组质粒pZMI-BCD-R10-capB-capC-capA(10BCA)、pZMI-capB-BCD-R1/10-capC-capA(B1CA/B10CA)和pZMI-capB-capC-BCD-R1/10-capA(BC1A/BC10A)。转化到C.glutamicum F343中，重复此方法，构建重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A。

谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒)：(1)取单菌落接种至种子培养基中，32℃，120rpm培养过夜；将适量的种子培养物接种于感受态培养基中，使初始OD₆₀₀＝0.3；30℃，120rpm培养使OD₆₀₀＝0.7-0.8，4h左右；将培养基置于冰上10min，将菌液分装到离心管中，离心10min，4000rpm，获得菌株；用25ml冰浴10％甘油洗涤4遍；用1.5mL-2mL10％甘油悬浮，用冰浴后的1.5mL Ep管分装，得到感受态细胞。(2)电击杯提前放置超净台吹洗，放置冰箱；

(3)取感受态细胞置于冰上融化，加入3-5μL DNA混合，加入电击杯中，1.8kV，5mS电转，电转后立即加入1mL BHIS至电极杯中悬浮；(4)悬浮后转至1.5mL EP管中，46℃，温育6min；(5)温育后于30℃，培养2h，使细胞复苏及表达抗性；(6)温育好后，12000rpm，离心1min，涂布至含有50μg/mL Kan⁺抗性的LBHIS平板1-2d。

实施例1：单独调控聚合酶基因的重组菌株的构建

利用NCBI查找来自B.licheniformis菌株的γ-PGA聚合酶基因capB、capC、capA，设计包含Nde I和BamH I酶切位点的扩增引物(如表1，序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.6所示)，按照上述重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的构建方法，PCR扩增、双酶切、连接、转化和验证构建重组质粒pZMI(Ptac)-capB、pZMI(Ptac)-capC和pZMI(Ptac)-capA。然后利用同尾酶Avr II和Nhe I，对要串联的两个基因片段分别进行Nhe I和Sal I、Avr II和Sal I进行双酶切、连接、转化构建基因串联表达重组质粒，转化到C.glutamicum F343，在含有25μg/L的Kan培养基中进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR，验证正确(如图1)，重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A构建成功。图1中，M：DNAMarker；1：重组菌Cg 1BCA；2：重组菌Cg 10BCA；3：重组菌Cg B1CA；4：重组菌Cg B10CA；5：重组菌Cg BC1A；6：重组菌Cg BC10A，在3000bp左右有明显条带，这与各重组质粒中多片段总长长度相一致，表明在C.glutamicum F343中利用双顺反子结构改造后的不同强度RBS单独调控γ-PGA聚合酶基因表达的重组菌株构建成功。

表1本研究中用得到的引物

实施例2：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A摇瓶发酵性能检测

将重组菌株Cg 1BCA和Cg 10BCA、Cg B1CA和Cg B10CA、Cg BC1A和Cg BCA10A按照上述谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒)方法进行摇瓶发酵，评价其发酵特性，以没有RBS调控的重组菌C.glutamicum pZMI-capBCA(Cg BCA)作为对照菌株。每隔4h对发酵液进行取样用于菌体生长、γ-PGA产量及生物量的测定，结果如图2、3所示。

(1)重组菌生物量比较

根据BCD-RBS的强度来比较各重组菌生长情况，由图2可以发现，重组菌Cg BC1A生长最佳，在24h其生物量达到了12.36，1BCA菌体生物量次之与之相近(OD₆₀₀ 11.88)，第三为BC10A(OD₆₀₀ 9.33)。

首先，从整体上比较BCD-R1调节组和BCD-R10调节组的生物量，可以看出，利用BCD-R1调节各聚合酶强度后的重组菌1BCA、B1CA和BC1A生长状况都优于BCD-R10调节后的各重组菌10BCA、B10CA和BC10A，其中1BCA和10BCA菌体生物量差异最大；这可能是因为BCD-R10元件强度较高，各聚合酶的高强度表达水平给菌体生长带来负担。

其次，进一步的，单从BCD-R1对capB、capC和capA不同基因片段的调节效果进行比较，调节效果依次为：BC1A(OD₆₀₀ 12.36)＞1BCA(OD₆₀₀ 11.88)＞B1CA(OD₆₀₀ 7.63)，其中，BC1A和1BCA的促进作用明显，而最低的B1CA(OD₆₀₀ 7.63)则低于对照菌株BCA生物量(OD₆₀₀8.71)，生长最佳的BC1A菌体生物量较对照菌株BCA生物量(OD₆₀₀ 8.71)提高42％，较B1CA(OD₆₀₀ 7.63)提高了62％。另一方面，从BCD-R10对capB、capC和capA不同基因片段的调节效果进行比较，也是BC10A(OD₆₀₀ 9.33)＞10BCA(OD₆₀₀ 7.27)＞B10CA(OD₆₀₀ 7.24)的变化趋势，也符合上述分析。

最后，进一步分析capB、capA、capC经BCD-R1、BCD-R10调节后的结果可以看出，不同于capB、capA用BCD-R1、BCD-R10调节后生物量差异明显，尤其是用BCD-R1调节后有明显的促进效果；capC无论是经BCD-R1或BCD-R10调节后，重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的生长状况都较弱，24h菌体生物量OD₆₀₀都只有7左右，低于对照菌株BCA的生物量。

可以看出，γ-PGA聚合酶capB、capC和capA表达强度的调控对γ-PGA的合成具有不同的影响，这可能是与γ-PGA各聚合酶的主要结构和功能有关。研究发现pgsBCA(与capBCA同源)具有跨膜结构，Ashiuchi等人认为pgsB(与capB同源)存在酰胺连接酶结构，其与高度疏水性细胞膜蛋白pgsC紧密联系，具有谷氨酸依赖的ATP酶活性，共同构成复合酶的催化活性位点，而pgsA属于A1型锚定蛋白，位于细胞膜外侧，pgsBCA复合酶通过其定地锚定在细胞膜中，pgsA可以有效地从酶的活性位点上移除γ-PGA延长链以助于单体谷氨酸的聚合，负责γ-PGA的延伸以及转运。

综上，从重组菌生物量比较结果可以得出，将capB、capA使用BCD-R1调节后得到的重组菌株能获得相对更佳的生物量结果。

(2)重组菌γ-PGA产量比较

各重组菌γ-PGA产量的结果如图3所示，生长状况最好的重组菌Cg BC1A产量明显高于其他重组菌，36h产量达到最大4.03g/L，这较对照菌株Cg BCA(1.04g/L)提高了近4倍。重组菌Cg BC10A的γ-PGA产量次之，36h能达到1.68g/L。由此说明，与对照菌株相比，改变capA前基因调控元件中的RBS，不管是调高了其表达水平，亦或是调低，对于γ-PGA的产量都有促进作用。这与上面第(1)点中Cg BC1A和Cg BC10A生物量都较高、菌株生长较佳是对应的。

与capA现象相反的是，通过更换不同强度的RBS，调控capC的表达水平对于其产量有较强的抑制作用，重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的γ-PGA最高产量各只有0.14g/L和0.78g/L，这也与上面第(1)点中重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的生物量低、菌株生长较弱有关。

而生长状况较好的重组菌Cg 1BCA的γ-PGA产量并不如预期结果，其最高产量只有0.89g/L，低于对照菌株Cg BCA产量14％；而重组菌Cg 10BCA的γ-PGA产量则更低，仅有0.54g/L。与capC相似，聚合酶capB表达水平的调控对γ-PGA积累也存在抑制作用，24h Cg1BCA和Cg 10BCA产量分别为0.89g·L^-1和0.54g·L^-1，这较对照菌株Cg BCA产量下降14.42％和48.07％。

综合以上对重组菌株摇瓶发酵性能检测结果的分析，可以得出，capBCA对重组菌生长和发酵合成γ-PGA有显著影响，其中，对重组菌生长具有促进作用的重组菌株优选为Cg BC1A和Cg BC10A，进一步优选方式为Cg BC1A。

实施例3：重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所产γ-PGA分子量变化通过GPC继续对各重组菌重组菌株Cg 1BCA和Cg 10BCA、Cg B1CA和Cg B10CA、Cg BC1A和CgBCA10A发酵合成的γ-PGA分子量进行检测。首先利用葡聚糖标准品分子量与峰停留时间绘制保准曲线，如图4得到函数关系y＝-0.739363x+17.3566(R²＝0.997567)，然后根据重组菌的γ-PGA样品的出峰时间计算其分子量大小。如图5，与对照菌株Cg BCA最大分子量(36h，3.5×10³kDa)相比，重组菌株Cg BC1A的分子量有大幅度提高，在48h时能够达到最大分子量约2.8×10⁴kDa；同时，重组菌株Cg B10CA的分子量也有明显提高，在36h达到最大分子量1.4×10⁴kDa。

此外，从图5可以看出，经过不同基因调控后得到的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ-PGA分子量为295.47～28018kDa，包含了低分子量到高分子量的各个范围，适用于不同领域，可根据目标γ-PGA分子量的需求选择不同的基因调控元件，以实现对不同分子量的调控。

综上，本发明提供了一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺，将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，所生产的γ-PGA分子量为295.47～28018kDa，有效实现了理性控制γ-PGA分子量的效果，以满足不同应用需求。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径，节省了原料和过程控制成本，提高了经济效益，拓展了聚谷氨酸的应用范围，具有很好的工业应用价值和前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种获得不同分子量γ-PGA的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

aaaactgcag catatgtggg taatgctatt agcctg 36

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cgcggatccc tagctaacga gctgcttaat cttg 34

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tatacatatg tttggatcag atttatatat cgc 33

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cgcggatcct tagattagat agtaagcata cataatgacg 40

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tatacatatg aaaaaacaac tgaactttca gc 32

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cgcggatcct catttgttca ccactccgt 29

Claims

1.一种聚合酶基因重组菌株构建方法，其特征在于，在串联表达聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA的基础上，利用基因表达调控元件分别单独调控单个基因的表达水平，构建单独调控聚合酶基因重组菌株。

2.根据权利要求1所述的聚合酶基因重组菌株构建方法，其特征在于，所述基因调控元件为双顺反子标准化的RBS，包括低强度BCD-RBS1和高强度BCD-RBS10。

3.根据权利要求1所述的聚合酶基因重组菌株构建方法，其特征在于，以C.glutamicumF343为感受态细胞；所述聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA选自地衣芽孢杆菌。

4.根据权利要求1-3任一所述方法过程中构建的串联表达重组质粒。

5.根据权利要求1-4任一所述方法构建的单独调控聚合酶基因重组菌株。

6.一种利用权利要求5所述菌株合成聚谷氨酸的方法。

7.根据权利要求6所述的合成聚谷氨酸的方法，其特征在于，该方法为：将产聚谷氨酸的单独调控聚合酶基因重组菌株的种子液，接种至发酵培养基，先于32℃培养，再添加IPTG低温诱导，最后于37℃培养；所述发酵培养基中含有7g/L尿素。

8.根据权利要求6或7所述方法得到的聚谷氨酸。

9.根据权利要求8所述的聚谷氨酸，其特征在于，分子量为295.47-28018kDa。

10.根据权利要求8所述的聚谷氨酸应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护领域。