CN101195677A - 聚羟基烷酸-羟基烷氧基烷酸酯及其生物合成制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种结构式如图的聚－3－羟基丁酸－β－羟基乙氧基乙酸酯共聚体，其中x、y为正整数；并提供了该共聚体的生物合成制备方法。本发明采用基因重组微生物发酵法生产聚－3－羟基丁酸－β－羟基乙氧基乙酸酯，当PHB与HEA形成共聚物后，在组织工程中不再使机体产生排斥作用，且热稳定性好，可根据需要任意调节其含量，使其硬度、韧性可调；其优异的生物降解性、生物相容性、良好的加工性能使之在组织工程、医药等领域的应用更加广泛。

Description

聚羟基烷酸-羟基烷氧基烷酸酯及其生物合成制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚羟基酯，特别涉及聚-3-羟基烷酸-β-羟基乙氧基乙酸酯及其生物合成制备方法。

背景技术

聚羟基烷酸酯(polyhtdroxyalkanoates，简称PHAs)通常是微生物在不平衡生长条件下在细胞内积累的用于存储碳源和能量的颗粒状物质，它是一种在物理性质上类似于聚乙烯、聚丙烯等化学合成塑料的热塑性聚酯材料，其具有一般合成塑料所不具备的特性：生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性、透氧性低、抗紫外辐射、抗凝血性以及在生物合成过程中可利用再生原料的特性等，在食品、医药、农业、电子、包装材料等领域具有独特而广泛的应用前景，被认为是一种“新型生物可降解材料”而倍受重视。PHAs也有一些缺点，它具有较强的疏水性，从而影响其降解速率。

聚对二氧环己酮〔poly(2-p-dioxanone)，PPDO〕是一种脂肪族聚醚酯，其分子链上含有醚键，分子链柔顺性好。它不仅具有优异的生物降解性、生物相容性和生物可吸收性，还具有优异的柔韧性、抗张强度、打结强度，可广泛应用于制造具有良好韧性和打结强度的外科单丝缝合线，在临床上代替由聚乳酸和聚乙交酯生产的多丝缝合线，克服其摩擦系数大，易损伤伤口的缺点，同时还可应用于制造骨板和组织修复材料，如螺钉、钩、片和钳等外科器具，是一种应用极为广泛的完全生物降解材料。

日本京都大学的Kawai等研究发现采用黄杆菌和假单孢菌混和发酵即可将聚乙二醇脱氢，研究同时还发现该脱氢酶的底物较宽，可以从乙二醇一直到聚乙二醇20000(PEG20000)。Kawai的研究还显示该混和培养模式可将PEG脱氢经醛到单羧酸(以及少量组分的二羧酸)。Obradors等人在Kawai的研究基础上，定向分离了PEG降解菌，从河水中分离得到目的菌株假单孢菌Pseudomonas stutzeri，并从中分离得到了PEG降解酶。

基于上述研究结果认为，采用与上述研究结果相似的途径，通过生物方法实现由二乙二醇到β-羟基乙氧基乙酸的转化是可能的。

发明内容

本发明的目的在于，根据上述现有技术的研究结果，构建出一种含有醚键的新型聚羟基烷酸酯，其结构式如下：

其中R为H、CH₃、C₂H₅、C₃H₇、......C_nH_2n+1(n为正整数)；

m、p、q为正整数；

x、y为正整数；

当R＝CH₃，m＝1，p＝2，q＝1，x、y为正整数时，上述聚羟基烷酸酯即为聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯，其结构式如下：

其中x、y为正整数。

聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯[poly(3HB-co-HEA)，P3HBHEA]是一种新型聚羟基酯共聚体，是3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate，3HB)与β-羟基乙氧基乙酸(β-hydroxyethoxy acetic acid，HEA)的共聚体，具有良好的生物降解性、生物相容性、抗凝血性，使得其在医药、组织工程等领域存在较大的应用空间。目前采用化学合成方法制备该共聚物时，是由β-丁内酯(β-butyrolactone)与对二氧环己酮(2-p-dioxanone)开环聚合而成，但是化学合成的共聚物其分子量低，机械性能差，难以满足要求高分子量的各种性能；且带有一定的催化剂残留，在组织工程中产生异体排斥作用；而且化学合成所需要的单体纯度高，催化剂活性强，且开环聚合的反应条件苛刻，其生产成本非常高。

本发明的另一目的还在于，提供一种聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯的生物合成制备方法，包括以下步骤：

1).从相关微生物中克隆用于生物合成聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯的phaA酶、phaB酶、phaC酶以及PEG降解酶的编码基因；

2).采用基因工程技术构建上述几种生物合成酶的表达载体并导入相应微生物中，得到重组菌株；

3).将重组菌株进行发酵，收集菌体，提取出聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯共聚物。

上述制备方法中，步骤1)中的编码基因来自自然分离的能够合成聚羟基脂肪酸酯及能够降解PEG的微生物。

上述制备方法中，步骤1)中用于克隆所述β-酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)所采用的微生物是假单包菌属(Pseudomonas)，用于克隆PEG降解酶编码基因所采用的微生物是鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。

上述制备方法中，步骤2)中所述的微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、假单包菌属(Pseudomonas)、气单包菌属(Aeromonas)，其中优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonas hydrophila)。

上述制备方法中，步骤1)中的编码基因通过PCR获得。

上述制备方法中，所述PCR的引物是：

Pegdh1：5’-CC ATG GAC AAA TTC GAC TTT GTC GTG-3’和Pegdh2：5’GG TAC CTA GGT GTA AGA TTC GGC TTC ATC-3’；

pha1：5’-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG-3’和pha2：5’-AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3’。

上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵基质是：4.72g/L KH₂PO₃，4.62g/L(NH₄)₂SO₄，1.23g/L MgSO₄，2.04g/L(NH₄)₂HPO₄，1g/L柠檬酸，100mg/L氨苄青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g)：0.05FeSO₄·7H₂O，0.011ZnSO₄·7H₂O，0.0025MnSO₂·4H₂O，0.005CuSO₄·5H₂O，0.0005(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.0001Na₂B₄O₇，0.01CaCl₂)。

上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵温度为25～45℃，发酵的pH值为6.0～8.0。

上述制备方法中，其中步骤3)中所述的发酵方式为：两步法流加分批发酵。

本发明采用基因重组微生物发酵法生产出一种新型聚羟基烷酸酯--聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯(P3HBHEA)。当PHB与HEA形成共聚物后，在组织工程中不再使机体产生排斥作用，且热稳定性好，可根据需要任意调节其含量，使其硬度、韧性可调；其优异的生物降解性、生物相容性、良好的加工性能使之在组织工程、医药等领域的应用更加广泛。

附图说明

图1是本发明中含有用于生物合成聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯相关基因的质粒图谱；

图2是本发明中P3HBHEA的合成代谢流程图。

具体实施方式

下面通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明本发明。以下描述并不限制本发明。

实施例1构建用于生产聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯的工程菌株

根据文献报道(Sugimoto et al.2001 J.Bacteriol 183，6694-6698)，设计了一对引物Pegdh1：5’-CC ATG GAC AAA TTC GAC TTT GTC GTG-3’和Pegdh2：5’-GG TAC CTA GGT GTA AGA TTC GGC TTC ATC-3’，在5’和3’端分别引入Nco I和Kpn I酶切位点，利用PCR从Sphingomonas terrae基因组DNA中扩增得到1.6kb的聚乙二醇脱氢酶基因编码序列，PCR条件为：94℃5分，94℃1分，60℃1分，72℃2分，35循环；72℃7分；4℃保存。将PCR产物用T₄DNA连接酶(Promega公司)与pGEM-T载体(Promega公司)在16℃连接12小时，得到质粒pGEM-T/pegdh。测序结果表明，克隆产物与文献报道基本一致，只是由于引入酶切位点的需要，第二个氨基酸编码序列由CAC变为GAC(见序列表1)。

pGEM-T/pegdh质粒用Nco I/Kpn I双酶切后回收1.6kb片段，与经过同样酶切的大肠杆菌表达载体pTrc99A(Pharmacia公司)在16℃连接12小时，然后采用CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选氨苄抗性的阳性克隆，从中提取得到pTrc/pegdh质粒。

包括phaC、phaA和phaB编码基因的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因完整的操纵子同样利用PCR从假单胞菌基因组DNA中扩增得到。所用引物为pha 1：5’-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG-3’和pha2：5’AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3’，在5’和3’端分别引入了Xba I和Hind III酶切位点。PCR条件为：94℃，5分；94℃1分，60℃1分，72℃5分-30循环；72℃7分；4℃保存。PCR产物同样连接到pGEM-T载体，得到质粒pGEM-T/pha。经序列测定，结果见序列表2。

pGEM-T/pha经Xba I/Hind III双酶切，回收4.4kb片段，pTrc/pegdh质粒经同样酶切，回收大片段。将两片段在16℃连接过夜，得到载体，定名为pDEPH(图一)。将pDEPH转入具有合成PHA能力的微生物〔埃希氏菌属、假单包菌属、气单包菌属等，优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonashydrophila)〕，如大肠杆菌JM109，得到用于P3HBHEA生产的基因工程菌。

含有pDEPH质粒的大肠杆菌JM109接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中37℃培养过夜，1∶100转接到100ml LB培养基中于37℃，200rpm培养16小时，离心收集菌体，用于P3HBHEA的分析。

实施例2重组菌产P3HBHEA

菌体生长培养基(LB)：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH7.2。

发酵培养基：4.5g/L KH₂PO₃，3.6g/L(NH₄)₂SO₄，1.23g/L MgSO₄，2.04g/LNH₄Cl，1g/L柠檬酸，100mg/L氨苄青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g)：0.05FeSO₄·7H₂O，0.011ZnSO₄·7H₂O，0.0025MnSO₂·4H₂O，0.005CuSO₄·5H₂O，0.05CoCl₂·6H₂O，0.1CrCl₃·6H₂O，0.01CaCl₂)，pH6.92。葡萄糖40g/L，二乙二醇1％(V/V)。

取实施例1中得到的含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌，以100μl的接种量接入含5mlLB培养液的试管中，37℃，250rpm培养5h。将在试管中培养好的菌体分别接入含有125ml发酵培养基的500ml三角烧瓶中，30℃，250rpm培养40h。离心收集菌体，提取P3HBHEA共聚物干燥称重。

共进行十批次试验，结果见表1。

表1含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌摇瓶发酵试验结果

批次	细胞干重(CDW)(g/L)	P3HBHEA干重/CDW(％)	HEA含量(％)
				1	4.89	36.88	9.68
2	4.56	40.21	10.52
				3	4.92	35.65	9.46
4	5.08	35.26	9.42
				5	4.64	40.06	10.38
6	5.02	36.72	9.75
				7	4.54	40.18	10.46
8	5.03	36.63	9.58
				9	4.60	39.25	10.25
10	4.76	38.96	9.96
				平均值	4.80	37.98	9.95

其中：细胞干重(CDW)为发酵菌体细胞干重；

P3HBHEA干重/CDW(％)为P3HBHEA含量占细胞干重的百分比；

HEA含量(％)为P3HBHEA中HEA摩尔数占3HB与HEA摩尔数总和的摩尔百分比。

所得发酵细胞干重平均为4.80g/L，所得产物经分析验证为含9.95％HEA的P3HBHEA共聚物。检测方法：称取10mg干细胞，加入2ml氯仿，然后加入1.7ml乙醇，再加入0.3ml35％浓盐酸，110℃酯化4小时，酯化后的液体加入1ml水，振荡后取下层有机相用Hewlett Packard 6890进行气相色谱检测。气相色谱条件如下：毛细血管柱SPB-1，设定柱头温度为140℃，进样器温度为220℃，检测器温度为250℃，以10℃/min升温至200℃，载气为N₂。经检测计算得到P3HBHEA含量占细胞干重的37.98％，HEA摩尔百分含量为9.95％。

实施例3生产P3HBHEA共聚物

取实施例1中得到的含有pDEPH质粒的重组大肠杆菌，以100ml的接种量接入3L发酵罐中，发酵基质：4.72g/L KH₂PO₃，4.62g/L(NH₄)₂SO₄，1.23g/LMgSO₄，2.04g/L(NH₄)₂HPO₄，1g/L柠檬酸，100mg/L氨苄青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g)：0.05FeSO₄·7H₂O，0.011ZnSO₄·7H₂O，0.0025MnSO₂·4H₂O，0.005CuSO₄·5H₂O，0.0005(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.0001Na₂B₄O₇，0.01CaCl₂)，pH6.92。

采用两步法流加分批发酵：第一步为种子生长阶段，在37℃培养8小时；第二步为高分子合成阶段，在30℃培养32小时，此时采用流加方式补入葡萄糖和二乙二醇，共补入葡萄糖600g，二乙二醇20g。

发酵结束收集菌体，提取共聚物P3HBHEA。共得到发酵液2.1L，干菌体重210g，提取到P3HBHEA重126g。所得产物经分析验证为含5％HEA的P3HBHEA共聚物。

整个P3HBHEA的合成代谢流程如图2所示。

序列表

SEQ  NO1

<110>深圳市奥贝尔科技有限公司

<120>聚羟基烷酸-羟基烷氧基烷酸酯及其生物合成制备方法

<160>2

<210>1

<211>1615

<212>DNA(序列类型)

<213>Sphingomonas terrae

<220>

<223>聚乙二醇脱氢酶基因

<400>1

CCATGGACAA ATTCGACTTT GTCGTGGTGG GAGCTGGATC TGCGGGATGC ACAGTTGCCA  60

GTAGATTGTC AGAGAATGGA AAGTATCAAG TTGCTCTCCT CGAAGCTGGA GGATCTCATA  120

ATAATCCGCT GATTTCGATT CCATTCAACT TCGCCTTCAC GGTCCCCAAA GGCCCGCATA  180

ACTGGAGCTT CGAAACCGTG CCACAGGAGG GGCTGAATGG TCGGCGCGGA TATCAACCGC  240

GCGGCAAGGT GTTGGGTGGT TCTTCTTCAA TAAATGCGAT GGTATACATA CGCGGCGCCA  300

AGGAAGATTA TGAGCACTGG GCGGCATTGG GGAATGAGGG TTGGTCATAC GAAGAGGTGC  360

TGCCATTCTT TAAGAAGGCG CAAAACAGGG TTAAGGGTGC GAACGAATAT CACGCGCAGG  420

GCGGCCCCCT AACCGTGTCC CCTCCGCGCA GCCCCAACCC GCTCAACGAC ATGTTCATTA  480

AGGCTGGCAT GGATTGCCAG CTGCCTTACA ATGAGGATTT CAACGGCGAA ACTCAGGAAG  540

GCATTGGCTA TTATGAGTTG ACGCAGGATC GCGGCAAGCG CTGCTCAGCC GCGCTCGCCT  600

ATGTTACGCC AGCTGAAAAG CGCAAGAATC TAACCATCTT CAAACAAGCA TTTGTCGAGA  660

AGGTTCTGGT TGAAAACGGT CAGGCGACCG GCGTGATGGT CAAGTTAAAC GGCAACTTGC  720

AGCTAATCAA AGCCAGGCGG GAGGTCATTC TTTCTTGCGG CGCGTTCCAA AGCCCACAGT  780

TGCTGTTGCT TTCGGGCATT GGCGCCAAGG ACAAGTTGGA TCCGCATAAA ATCAAGGTGG  840

TTCATGAACT TCCTGGTGTC GGAGAGAACC TCTACGACCA TGTAGATTTC TGCTTAATGT  900

ACCAATCTGA CAGCGAGCAT GTTCTGGGCA AAAATGCGCG CTCGGTGTTT CGTGTTGCGT  960

GGAACCAATT CAAATATTTT GCCGGAAGGC GCGGTATTTT GACGACGAAC TTCAATGAAT  1020

CTGGTGCCTT CTATTTCACC AATCCGGATG AGCGTTCGCC GGATATTCAG CTGCATTTTG  1080

CCTTCACATT GGTCGATCAA CACGGACTAA AACGGCACGG CCGCGGCGGA TTTAGCTGCC  1140

ACGTTTGTGT CCTCAGACCC AAGAGTCATG GTAATTTGAC TTTAGCCGAC GCAAACCCGG  1200

CAACGCCGCC GCTCATCGAT CCAGCATTTC TAAAGGATGA GCGTGACGTC GCAACGTTGC  1260

TTGCCGGAGT CAAACGCGCG CAACAAATCT TACAGGCTCC TGCATTCGAT GAGATTAGAG  1320

GCAAGCCGGT ATATGCGACC GCCAGCAATA ATGATGATGA ATTGATCGAG GACATTCGAA  1380

ACCGTGCCGA TACGATCTAT CATCCGGTTG GCACCTGCAA GATGGGTCCG GACAGTGATC  1440

CGATGGCGGT TGTCGATTCA TCACTTAGGG TGAGGGGCAT CAGGAACCTA CGCGTTATCG  1500

ATGCCTCGAT CATGCCTTCT ATTGTATCGG GAAACACAAA TGCGCCTACC ATCATGATCG  1560

GCGAAAAAGG GGCGCAAATG ATACTCGATG AAGCCGAATC TTACACCTAG GTACC       1615

<210>2

<211>4418

<212>DNA

<213>Pseudomonas

<220>

<223>聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因

<400>2

TCTAGAAAGG GCCGTGCATG CGTGCTCACG GAAGATGAAA TGATCGCATG GGGAAAACGA  60

TAATTAAAAA AATATCGCAC TGCGGCAAAA TCGGGGCAAA GCATTGACAT GCCTGATCCT  120

CGGGAGCAAG AATGTTCCCG GAATGTCAAA TATCGGGCAC GACGTGGCAA GGTCACCTTC  180

CACCGCGCAG TATCGCGTCT CATTGCGCGC TGGTCTCGGC GAGCCCTACA CAGCGCCTGC  240

AACAGCAATC AGTCTTTCGA GACTCACAGG TCAAAAGCGG GTATGGCTGC CTCCAAAACT  300

TCTTCTTCAT CTTCCCGCCC AGATACCGCC GACAGCACAT CGGCCGGAAC GCGTCCGCCG  360

ACACGGCCGG CGTGCAGCAA GTGTTCGAGC AATGGCTCAA CGCATGGCGT TCGGTCGCCG  420

ATCCGTCACA GTGGACGACG CTCGCGCAGC AGGCGCAGCC GGGTCAGCCG AATGGCCCCG  480

ACGGCGGCAA TGCCGCAGCG TCGGCAGCGG CATCGGCCAA TCCGTTCGCC GCTTTCGCAG  540

CCGTTCCCGG AATGCCGGCG GCGCCGTTCG CGATGCCGAC GGTGCCTGAT TTCGCGAAGC  600

TCGGCACGAT GCCCGACTTC TCGAAGCTCG CGGGCAGCAT GCCCGGCTTC GGCGCCGCGA  660

TGCCTGCCAT GCCGGCGATG CCGCAGATTC CGGGCGCGGC CATCGCGCCG GAGCGTCTTC  720

AGCAGATTGC AGGGCGACTA TTCGCGCGAT GTGATCGACC TGCTCAAGCA GGCGAGCGCG  780

CAGAGCATCG ACCCCGCAGC GCTGAAGGAC CGGCGCTTCA GCACGACGGC GTGGCAGTCC  840

ACGCCGGCTA ACGCGTTCAC GGCCGCGTGG TATCTGCTCA ACGCGCGCTA TCTCCAGGAA  900

CTCGCCGACG CCGTCGAGGC CGATCCCAAG ACGCGCGAGC GCATCCGCTT CACGGTGCAG  960

CAGTGGACGG CCGCGGCCTC GCCGAGCAAC TTTCTCGCGT TCAATCCCGA AGCGCAGCAG  1020

ACGCTCATCG AGAGCAAGGG GGAGAGTCTG CGCCAGGGCA TGCTGAATCT GCTGCACGAC  1080

ATGCAGCGCG GCAAGATCTC GCAATCCGAC GAGTCGCGTT TCGTGGTCGG CAAGAACATC  1140

GCGACGACGG AAGGGTCGGT CGTGTTCGAG AACGACCTGC TGCAACTGAT CCAGTACAAG  1200

CCGCATACGG AAGAAGTCTT CGAGCGGCCG CTCCTGATCG TGCCGCCGTG CATCAACAAG  1260

TTGTACATCC TCGACCTGCA GCCGCAGAGC TCGCTCGTCG CCCATGCGCT CGATGCGGGC  1320

CATCAGGTGT TCATCCTGTC CTGGCGCAAC GCGGATCAGT CGATCGCGCA CAAGACCTGG  1380

GACGACTACG TGCAGGAAGG CGTGCTCGAT CCGATCGAAG CCGTCAAGGC GATCACCGGG  1440

CGCGAGCAGA TCAACACGCT CGGCTTTTGC ATCGGCGGAA CGATCCTCGC TACCGCGCTT  1500

TCGGTGGCGG CGGCGCGCGG CGAGCACCCG GCGGCGTCGA TGACGCTCCT CACCGCGATG  1560

CTCGACTTCT CCGACACCGG CGTGCTCGAC GTCTTCGTCG ACGAGGCGCA CGTGCAGATG  1620

CGCGAGCAGA CGATCGGCGG CAAGGGCGGC ACGCCGACCG GGCTCATGCG CGGCTTCGAG  1680

TTCGCGAACA CGTTCTCGTA CCTGCGCCCG AACGATCTGG TGTGGAACTA CGTCGTCGAC  1740

AACTACCTGA AGGGCGCAAC GCCGCAGGCG TTCGATCTGC TCTTCTGGAA CAGCGACTCG  1800

ACCAATCTGC CGGGGCCGAT GTGCGTCTGG TACCTGCGCA ACACGTATCT GGAAAACAAG  1860

CTGCGCGAGC CGGGCAAGGT CACGACGTGC GGCGAACCGG TCGATCTGTC GCGCATGGAC  1920

GTGCCCACTT TCATTTACGG TTCACGGGAG GACCATATCG TGCCCTGGAC GTCGGCGTAC  1980

GCGTCGGCGC CGCTCCTTGC CGGGCCGCAG AAATTCGTGC TCGGCGCTTC GGGGCACATT  2040

GCGGGCGTCA TCAACCCGCC GGCGAAGAAC AAGCGCAGCT TCTGGATTTT CGACACCGAC  2100

GACAAGGCGT TGCCGGCGGA CCCGGACGCC TGGCTCGAAG CCGCGACGGA GCATCCGGGA  2160

AGCTGGTGGC CCACCTGGAC CGCTTGGCTC GACGGCTACG CGGGCAAGAA GACGAAGGCG  2220

CCGGCGGCGC CCGGGTCGAA GCAGTACCCT GTCATCGAGC CGGCCCCCGG CCGCTATGTG  2280

CTGCAGCGTG ACCAGTAACC GTTTCGTCGT CCGGCCGTGC GCGACGCGCG CGGCATGACG  2340

ACCCCGCTTT AACATTCGTT GCCAGAGGAA ACTGAAAATG ACTGACGTAG TGATCGTATC  2400

GGCCGCACGT ACCGCGGTCG GCAAATTCGG CGGGTCGCTC GCGAAGATCG CAGCACCCGA  2460

ATTGGGCGCA ACCGTGATCC GCGCGGTATT GGAGCGCGCG AACCTGAAAC CCGAGCAGGT  2520

GAGCGAAGTG ATCCTCGGCC AGGTGCTCGC CGCCGGCTCC GGACAGAATC CCGCACGCCA  2580

GTCGCTCATC AAGGCGGGGC TGCCCTCGGC CGTTCCCGGC ATGACGATCA ACAAGGTCTG  2640

CGGCTCGGGC CTGAAGGCGG TGATGCTGGC GGCCAACGCG ATCATCGCAG GCGACGCCGA  2700

CATCGTGATC GCCGGTGGCC AGGAAAACAT GAGCGCCGCG CCGCACGTGC TGATGGGCTC  2760

GCGCGACGGC TTTCGCATGG GCGACGCGAA GCTGATCGAC TCGATGATCG TCGACGGCCT  2820

GTGGGACGTG TTCAACCAGT ACCACATGGG CACGACCGCC GAGAACGTCG CGAAGGAAAA  2880

CGGCATCTCG CGCGAGGATC AGGACAAGTT CGCGGCGCTC TCGCAGAACA AGGCCGAAGC  2940

CGCGCAGAAG TCGGGCCGCT TCAACGAGGA GATCGTGTCG GTCGACATTC CCCAGCGCAA  3000

GGGAGACCCC GTCAAGTTCG CCACCGACGA ATTCGTGCGC CACGGCGTGA CGGCCGAAGC  3060

GCTCGCGAGC CTGAAGCCCG CCTTCTCGAA GGAAGGCACG GTGACGGCCG CCAACGCATC  3120

GGGCCTGAAC GACGGCGCGG CCGCCGTGAT CGTGATGTCG GCGAAGAAGG CCGAGGCGCT  3180

CGGCCTCACG CCGCTCGCGC GCATCAAGGC CTACGCGAAC GCGGGCGTCG ATCCGAAGGT  3240

GATGGGCATG GGCCCGGTGC CGGCATCGAA GCGCTGTCTG GAGCGCGCGG GCTGGTCGGT  3300

GGGTGATCTC GATCTGATGG AGATCAACGA AGCGTTCGCG GCGCAGGCGC TCGCGGTGCA  3360

CAAGCAGATG GGCTGGGACA CGTCGAAGAT CAACGTCAAC GGCGGCGCGA TCGCGATCGG  3420

GCACCCGATC GGCGCGTCCG GTTGCCGGAT CCTCGTCACG CTGCTGCACG AAATGCAGAA  3480

GCGCGATGCG AAAAAGGGCC TGGCGTCGCT GTGTATCGGC GGCGGCATGG GCGTGGCGCT  3540

GGCGGTCGAA CGTCCGTAAG AACGAAGGCT ATAACCGGCA CGGCCATGCG GGAAGCGCAC  3600

GGGCAGCAGG CGGGCGCTTC CCGCATAACG AAAATGGAGT GAGGAATGAC GAAACGCATA  3660

GCGTACGTGA CGGGCGGCAT GGGCGGCATT GGCACAAGCA TCTGCCAGCG TCTGCATAAG  3720

GACGGCTATA CGGTCGTCGC GGGTTGCGGC CCGAACTCTC CGCGCCGTGT CAAATGGCTC  3780

GAGGAACAGA AGGCGAACGG CTATGACTTC ATCGCGTCCG AGGGCAACGT CGGCGACTGG  3840

GAGTCCACCA AGAACGCCTT CGACAAGGTG AAAGCCGAAG TCGGCGAAGT CGACATCCTG  3900

GTGAACAACG CGGGCATCAC GCGCGACGTC GTGTTCCGCA AGATGACGCA CGAGGACTGG  3960

ACGGCCGTCA TCCACACCAA CCTGACGAGC CTCTTCAACG TGACCAAGCA GGTGGTCCAC  4020

GGCATGGTGG AGCGCGGTTT CGGGCGGATC ATCAACATTT CGTCGGTGAA CGGCCACAAA  4080

GGGCAGTTCG GCCAGACCAA CTACTCTACG GCGAAAGCCG GCATCCACGG CTTCACGATG  4140

GCGCTCGCGC AGGAAGTGGC GACCAAGGGC GTGACGGTCA ACACCGTGTC GCCAGGCTAT  4200

ATCGGCACGG ACATGGTCAA GGCGATCCGC CCCGAGGTGC TGGAGAAGAT CGTCGCGACG  4260

ATTCCGGTGC GCCGTCTCGG CCGCCCGGAC GAGATCGGCT CGATCGTGTC GTGGCTGGCA  4320

TCGGAGGAAT CGGGCTTCTC GACCGGTGCG GACTTCTCGC TCAACGGCGG GCTGCACATG  4380

GGCTGACGGG CGGTGGCTCG CGCGGCCTGG AAAAGCTT                          4418

Claims (9)

1.聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯，其结构式如下：

其中x、y为正整数。

2.一种权利要求1所述的聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯的生物合成制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1).采用分子生物学方法克隆用于生物合成聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯的β-酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)以及PEG降解酶的编码基因；

2).采用基因工程技术构建上述几种生物合成酶的表达载体并导入具有合成PHA能力的微生物中，得到重组菌株；

3).将重组菌株进行发酵，收集菌体，提取出聚-3-羟基丁酸-β-羟基乙氧基乙酸酯共聚物。

3.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤1)中的编码基因来自自然分离的能够合成聚羟基脂肪酸酯及能够降解PEG的微生物。

4.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤1)中用于克隆所述β-酮硫解酶(phaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaB)、PHA合酶(phaC)所采用的微生物是假单包菌属(Pseudomonas)，，用于克隆PEG降解酶编码基因所采用的微生物是鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。

5.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、假单包菌属(Pseudomonas)、气单包菌属(Aeromonas)，其中优选大肠杆菌(E.Coli)或嗜水气单包菌(Aeromonashydrophila)。

6.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤1)中的编码基因通过PCR获得。

7.根据权利要求6所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述PCR的引物是Pegdh1：5’-CC ATG GAC AAA TTC GAC TTT GTC GTG-3’，

Pegdh2：5’GG TAC CTA GGT GTAAGA TTC GGC TTC ATC-3’；

pha1：5’-TCTAGAAAGGGCCGTGCATGCGTGCTCACG-3’，

pha2：5’-AAGCTTTTCCAGGCCGCGCGAGCCACCGC-3’。

8.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的发酵的温度为25～45℃，发酵的pH值为6.0～8.0。

9.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的发酵方式是两步法流加分批发酵。

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