CN109182400A - 一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法 - Google Patents

一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法 Download PDF

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贾晓强
杨松源
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    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

本发明涉及一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs来提高乙酸同化能力，首先是扩增目标基因，并在其两端加入酶切位点，构建质粒，制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞，将构建好质粒进行电转化，筛选阳性菌落进行验证，最后对验证正确的菌株进行mcl‑PHA生产测试。本发明特点是：既提高了Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力，同时又促进代谢流流向脂肪酸合成通路，从而提高了mcl‑PHA前体(R)‑3‑Hydroxyfatty acid的合成，进而提高了mcl‑PHA的产量。

Description

一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法
技术领域
本发明涉及一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)，是一类由羟基脂肪酸为单体组成的聚酯，可被大多数微生物合成，其具有与石油基高分子聚合物相近的物理和机械特性，同时还具有生物可降解性、生物相容性等优良特性，因此被视为石油基高分子聚合物的优良替代品之一。根据单体的碳原子数不同，可将其分为短链聚羟基脂肪酸酯(3-5个碳原子，scl-PHA)和中长链聚羟基脂肪酸酯(6-14 个碳原子，mcl-PHA)。其中，中长链PHA较短链PHA具有更丰富的结构，因此其更容易被改造用于特殊应用。例如中长链PHA具有低结晶度，低玻璃化转变温度，低拉伸强度和高断裂伸长率等特性，因此可作为弹性复合物用于需要柔性生物材料的一系列生物医学应用，例如用于制造人工心脏瓣膜或控制药物输送的材料等。
但是高额的生产成本严重限制了中长链PHA的广泛应用。大量研究者开展了降低mcl-PHA生产成本的工作。研究表明，发酵底物的成本占总生产成本的50％左右，因此，利用廉价非相关碳源生产PHA是一种降低PHA生产成本的重要手段。乙酸是一种非常有前景的碳源，其价格便宜，广泛存在于废液和生物质水解液中，此外，乙酸还能通过产气菌直接发酵大量存在于自然和工业气体中的单碳气体生成，最近也有研究表明可以利用合成气电合成乙酸， Pseudomonas putida KT2440(恶臭假单胞菌KT2440)天然具有mcl-PHA合成能力，已被广泛用于合成mcl-PHA的研究，包括通过代谢改造手段强化其利用木糖、葡萄糖等非相关碳源生产mcl-PHA的能力等，但其对于乙酸的利用还未见报道，因此本发明通过代谢改造提高 Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力，提高mcl-PHA的合成，同时，Pseudomonasputida KT2440也是经过美国NIH认证的“安全、非病原菌”，营养需求低，鲁棒性高，是一种优良的工业应用菌株，提高其利用廉价乙酸的能力，也有助于利用廉价碳源合成其他高附加值产品。
发明内容
鉴于上述，本发明提出一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。
本发明通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs(如图1所示) 来提高乙酸同化能力，首先是扩增目标基因，并在其两端加入酶切位点，构建质粒，制备 Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞，将构建好质粒进行电转化，筛选阳性菌落进行验证，最后对验证正确的菌株进行mcl-PHA生产测试。
本发明的技术方案如下：
一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法；通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs来提高乙酸同化能力。
本发明的一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法，具体步骤如下：
(1)体外扩增目标基因，构建过表达质粒；
(2)制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞；
(3)电转化导入质粒至Pseudomonas putida KT2440细胞；
(4)验证正确导入细胞及mcl-PHA生产测试。
所述的步骤(1)是：通过NCBI数据库查找Pseudomonas putida KT2440的乙酰辅酶A合成酶acyl-CoA synthetase基因acs的序列信息SEQ ID No.1，根据序列信息利用primerprimer 5 设计引物，以Pseudomonas putida KT2440基因组为模板，体外PCR扩增acs基因，并在acs 基因两端引入酶切位点；将扩增得到基因片段和pBBR1MCS-2质粒双酶切后连接即质粒构建完成，将插入acs基因片段的质粒pBBR1MCS-2命名为pBBR1-acs。
所述primer primer 5设计引物为：
acs-f CCGCTCGAGAGGAGGAAAAACATATGCCCCAGCCAAGCTACACC
acs-r CGCGGATCCTCAAATCTTGGGCAAGGCCG。
所述的步骤(2)是制备用于电转化的Pseudomonas putida KT2440感受态细胞，按照电转化法制备感受态细胞，使用无菌水和10％甘油洗涤，全程无菌操作。
所述的步骤(3)是利用电转化法将步骤(1)中构建的质粒转入Pseudomonasputida KT2440 感受态细胞，并将转化后细胞涂布于卡那霉素抗性固体筛选培养基中培养。
所述的步骤(4)是：挑取筛选培养基上的菌落进行PCR验证，得到acs基因过表达的Pseudomonas putida KT2440(PP-acs)，然后对验证正确的菌株进行mcl-PHA生产测试，比较 Pseudomonas putida KT2440和acs基因过表达的Pseudomonas putida KT2440(PP-acs) mcl-PHA的产量差异。
本发明特点是：通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs(如图1所示)，既提高了Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力，同时又促进代谢流流向脂肪酸合成通路，从而提高了mcl-PHA前体(R)-3-Hydroxyfatty acid的合成，进而提高了mcl-PHA的产量。
附图说明
图1：基因工程原理图；
图2：Pseudomonas putida KT2440和改造菌mcl-PHA产量对比，PP为Pseudomonasputida KT2440，PP-acs为将Pseudomonas putida KT2440的acs基因过表达后得到工程菌。
具体实施方式
Pseudomonas putida KT2440购买于美国组织培养库(American Tissue CultureCollection)，保藏编号为ATCC 47054。所使用的质粒pBBR1MCS-2购买于武汉淼灵生物科技有限公司，货号P0306。如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业购买获得。
以具体实例对本发明进行说明，具体步骤如下：
1.培养基配方
LB培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，pH7.0；
卡那霉素工作浓度：50μg/mL；
M9培养基(g/L)：12.8Na2HPO4·7H2O，3KH2PO4，1NH4Cl，0.5NaCl，高压蒸汽灭菌后加入2ml滤膜过滤除菌的1mol/L MgSO4和1ml微量元素，pH7.0；
微量元素(mg/L)：6.0FeSO4·7H2O，2.7CaCO3，2.0ZnSO4·H2O，1.16MnSO4·H2O，0.37
CoSO4·7H2O，0.33CuSO4·5H2O，0.08H3BO3。
2.构建质粒
查找Pseudomonas putida KT2440的乙酰辅酶A合成酶(acyl-CoA synthetase)基因acs的序列信息，根据序列信息利用primer primer 5设计引物(如表1所示)，以Pseudomonas putida KT2440基因组为模板，使用引物acs-f和acs-r体外PCR扩增acs基因并在其5’端引入RBS 序列和一段保守区，在两端引入酶切位点，PCR体系和程序如表2、3所示。将片段和质粒双酶切后连接即质粒构建完成，酶切体系和连接体系如表4、5所示。
表1引物序列
表2 PCR体系
表3 PCR程序
表4酶切体系
表5连接体系
3.制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞
按照电转化法制备Pseudomonas putida KT2440感受态细胞，用双蒸水和10％甘油洗涤，全程无菌操作，具体过程为：
1)用移液枪头从平板挑取Pseudomonas putida KT2440单菌落接入装有4-5ml LB液体培养基的试管中，培养12-14小时；
2)从上步培养好的试管中吸取1-2ml菌液接种到装有50-55ml液体LB培养基的锥形瓶中，菌体培养至OD600为0.4-0.6；
3)将菌液转移到50ml预冷的无菌离心管中，冰上放置10-11min冷却菌液；
4)4℃，6500rpm离心5-6min，倒掉上清，加入30ml预冷的双蒸水，重悬菌体；
5)如上述步骤4)，再用预冷的双蒸水和10％甘油溶液分别洗一次，倒掉上清；
6)向离心管中加入1ml预冷的10％甘油，重悬菌体，并以100微升/管分装到1.5ml或2ml 离心管中，于-80℃保存，以备后续使用；
4.电转化导入质粒至Pseudomonas putida KT2440细胞
利用电转化法将连接好质粒转入Pseudomonas putida KT2440中，具体过程为：
1)取1管新制备的或-80℃保存的Pseudomonas putida KT2440感受态细胞，在冰上放置 8-10分钟，使其融化。
2)将构建好的质粒(pBBR1-acs)加入到感受态细胞中，充分混匀；
3)将步骤2)的感受态细胞加入预冷的2mm电击杯中；
4)将电击杯放入电转仪中，1800V电击约5-6ms；
5)电击结束后，将电击杯拿出，并加入1ml LB培养基，混匀后转移到1.5ml或2ml离心管中，30℃摇床培养40-45min；
6)4200rpm离心2-3min，吸出约0.95ml上清，用剩余培养液重悬菌体，涂布于带有卡那霉素抗性的LB平板上。
5.验证正确导入细胞及mcl-PHA生产测试
挑取筛选培养基上的菌落进行PCR验证，验证引物如表6所示，然后对验证正确的菌株进行mcl-PHA生产测试，即挑取已验证正确的菌落于装有5ml LB培养基的15ml试管中，30℃过夜培养，吸取1ml培养物加入到含有25ml M9培养基的250ml的锥形瓶中，碳源为5g/L葡萄糖和5g/L乙酸钠，30℃、220rpm过夜培养，吸取5ml培养物接种到装有50ml M9培养基的500ml锥形瓶中，碳源为20g/L乙酸钠，30℃、220rpm培养72h，取10-15ml培养物4℃、9000rpm离心10min，倒掉上清液，将细胞冷冻干燥后用于mcl-PHA检测。
表6验证引物序列
通过上述方法，在Pseudomonas putida KT2440中过表达了乙酸同化关键基因acs，结果如图2所示，过表达acs基因的Pseudomonas putida KT2440与原始菌相比，mcl-PHA产量和细胞干重均得到提高。此外，Pseudomonas putida KT2440作为工业“细胞工厂”，提高其利用廉价碳源乙酸的能力，亦可将其用于合成其他高附加值产品。
序列表
SEQ ID No.1
ATGCCCCAGCCAAGCTACACCCAGGGCACCCAGGACAAGCCCCTGCTGACCCAATGCAT CGGCGACGCCTTCGACGCCACCGTAGCCCGCTTCCCCGACCGTGAGGCGCTGGTGGTTC ACCATCAGGCCCTGCGCTACACGTGGCGGCAACTGGCCGATGCCGTCGACCAGCACGCC CGCGCGCTGATGGCCCTGGGCGTGCAGCCCGGTGACCGTCTTGGCATCTGGGCACCCAA CTGCGCCGAGTGGTGCATTACCCAGTTCGCCAGCGCCAAGGTTGGCGCGATCCTGGTCA ACATCAACCCGGCCTACCGTTCCAGCGAACTGGACTATGCCCTTGGCCAGTCCGG
CTGCCGCTGGGTGATCTGTGCCGACGCATTCAAGACGTCCGATTACCACGCCATGCTGC AGGGCCTGCTCCCGGGCCTGGCCAGCAGCCAACCGGGTGCGCTGATCTGCGAGCGGTTC CCCGAACTGCGTGGCGTGGTCAGCCTGGCGCTGTCGCCACCGCCGGGGTTTCTGGCCTG GCACGCATTGCAGGCCCGTGCCGAGGTTGTCAGCGGCGAGGCCCTGGCCGCGCGCCAG GCACAACTGCGTTGCGACGACCCGATCAACATCCAGTACACCTCAGGCACCACCGGTTT CCCCAAGGGGGCCACCCTTAGCCACAGCAATATCCTCAACAACGGGTACATGGTCG
GTGAAAGCCTGGGCCTTACCGAGCACGATCGGCTGGTGGTGCCGGTGCCGCTGTACCAC TGCTTCGGCATGGTCATGGCCAACCTTGGCTGCATGACACACGGCAGCGCACTGATTTA CCCCAGCGATGCCTTCGACCCGCTGGCCACGCTGCGCGCAGTGGCGCAGGAAAAAGCC ACTGCGCTGTATGGCGTGCCGACCATGTTCATTGCCGAACTGGACCATCCACAGCGTGG TGAATTCGACCTGTCGAGCCTGCGCACCGGGATCATGGCCGGTGCGACCTGCCCGATCG AGGTGATGCGCCGGGTGATTGGCGAGATGCACATGGCCGAAGTGCAGATTGCCTAT
GGCATGACCGAGACCAGCCCGGTGTCCTTGCAGACCGGTGCCGCTGACGACCTGGAGCGTCGCGTGACCAGCGTCGGTCGC
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr
1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly
35 40 45
Ala Cys Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly
50 55 60
Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Cys
65 70 75 80
Cys Gly Thr Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys
85 90 95
Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly
100 105 110
Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Cys
115 120 125
Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Cys Gly Thr Gly Gly
130 135 140
Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly
145 150 155 160
Cys Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Cys
165 170 175
Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys
180 185 190
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly
195 200 205
Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr
210 215 220
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys
225 230 235 240
Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala
245 250 255
Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys
260 265 270
Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Thr Cys
275 280 285
Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys
290 295 300
Cys Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly
305 310 315 320
Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys
325 330 335
Cys Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr
340 345 350
Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly
355 360 365
Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly
370 375 380
Ala Cys Gly Thr Cys Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Gly
385 390 395 400
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr
405 410 415
Gly Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys
420 425 430
Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly
435 440 445
Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly
450 455 460
Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Thr
465 470 475 480
Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly
485 490 495
Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys
500 505 510
Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly
515 520 525
Cys Ala Cys Gly Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys
530 535 540
Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
545 550 555 560
Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys
565 570 575
Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys
580 585 590
Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys
595 600 605
Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Thr Ala Cys
610 615 620
Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly
625 630 635 640
Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys
645 650 655
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr Ala Gly Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys
660 665 670
Ala Ala Thr Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly
675 680 685
Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Gly Gly Thr Gly Ala
690 695 700
Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Ala Cys Cys
705 710 715 720
Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly
725 730 735
Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr
740 745 750
Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Gly Gly Cys
755 760 765
Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys
770 775 780
Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala
785 790 795 800
Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr
805 810 815
Thr Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr
820 825 830
Thr Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Cys
835 840 845
Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Gly
850 855 860
Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly
865 870 875 880
Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys
885 890 895
Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys
900 905 910
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys
915 920 925
Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Ala
930 935 940
Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys
945 950 955 960
Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly
965 970 975
Gly Thr Gly Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Thr
980 985 990
Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly
995 1000 1005
Gly Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys
1010 1015 1020
Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala
1025 1030 1035 1040
Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly
1045 1050 1055
Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly
1060 1065 1070
Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly
1075 1080 1085
Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly
1090 1095 1100
Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala
1105 1110 1115 1120
Gly Cys Gly Thr Cys Gly Gly Thr Cys Gly Cys
1125 1130

Claims (4)

1.一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法；其特征是通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs来提高乙酸同化能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤如下：
(1)体外扩增目标基因，构建过表达质粒；
(2)制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞；
(3)电转化导入质粒至Pseudomonas putida KT2440细胞；
(4)验证正确导入细胞及mcl-PHA生产测试。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤(1)是：通过NCBI数据库查找Pseudomonas putida KT2440的乙酰辅酶A合成酶acyl-CoA synthetase基因acs的序列信息SEQ ID No.1，根据序列信息利用primer primer 5设计引物，以Pseudomonas putidaKT2440基因组为模板，体外PCR扩增acs基因，并在acs基因两端引入酶切位点；将扩增得到基因片段和pBBR1MCS-2质粒双酶切后连接即质粒构建完成。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是primer primer 5设计引物为：
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