CN108893498B - 一种提高聚苹果酸产量的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：（1）将菌株活化培养后，制得种子液；（2）将所得种子液以10％的量接于发酵罐中进行发酵培养，第一阶段发酵：通风比0.8‑0.9vvm，发酵至40—48h；第二阶段发酵：通风比为1.1‑1.2vvm，发酵至90—96h；第三阶段发酵：通风比为1.0‑0.9vvm，发酵至144‑148h。发酵培养时，搅拌速度500r/min，罐压为0.1MPa，发酵温度为25℃。本发明的发酵方法通过考察搅拌转速及通风量两个参数对聚苹果酸合成的影响，根据发酵过程中得到的发酵动力学参数，对发酵条件进行阶段性调整，有利于提高发酵效率，简化发酵工艺，节约生产成本。

Description

一种提高聚苹果酸产量的发酵方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及提高聚苹果酸产量的发酵方法。
背景技术
聚苹果酸（Poly malic acid 或Poly malate,简称为PmLA）是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物，属于聚酯类聚合物。由于苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型 PmLA（结构如图1），生物体内存在的只有β型PmLA。
聚苹果酸结构中悬挂有可修饰的羧基，使其可作为一种分子基质与天然配体或合成配体发生特异性作用，而制得聚苹果酸酯等衍生物，这为新材料研究提供了素材，并可得到大量具有特殊功能的新聚合物。研究发现聚苹果酸具有良好的水溶性、可化学衍生性、可降解性、可再生性、生物安全性等特点。在生物制药领域，聚苹果酸可作为微胶囊材料及药物载体。聚苹果酸具有较大的溶水性和吸水性，可以作为吸水材料使用，也可以用作化妆产品。聚苹果酸对一些生物物质（如豌豆、土豆、蛋清蛋白等）的蛋白酶和某些微生物的DNA聚合酶有抑制作用，可阻止某些生物的生长、繁殖。因此也可作为包装材料应用于食品生产加工。
目前，聚苹果酸的生产主要有化学合成法和微生物发酵法两种，生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成，生物合成聚苹果酸具有突出的优点，通过微生物发酵，产物均为β型、产物分子量高、生产条件温和、生成产物纯度较高，但是到目前为止，有关溶解氧影响聚苹果酸发酵的研究都集中在恒定搅拌转速上。事实上，出芽短梗霉细胞的生长和聚苹果酸的生物合成对溶解氧的需求可能会有所差异，因此，在发酵过程中仅始终保持恒定转速可能难以解决不同培养阶段需要不同溶氧水平的矛盾，造成发酵周期长，产率低，生产成本高的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高聚苹果酸产量的发酵方法。本发明的发酵方法通过考察搅拌转速及通风量两个参数对聚苹果酸合成的影响，根据发酵过程中的得到的发酵动力学参数，对发酵条件进行阶段性调整，有利于提高发酵效率，简化发酵工艺，节约生产成本。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）将菌株活化培养后，制得种子液；
（2）将所得种子液以10 v/v％(v/v)的量接于发酵罐中进行发酵培养，第一阶段发酵：通风比0.8-0.9vvm，发酵至40—48h；第二阶段发酵：通风比为1.1-1.2vvm，发酵至90—96h；第三阶段发酵：通风比为1.0-0.9vvm，发酵至144-148h。
进一步地，发酵培养时，搅拌速度500r/min，罐压为0.1MPa，发酵温度为25℃。
进一步地，制得种子液的具体步骤为：将出芽短梗霉菌株活化2~3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为180-200r/min，培养时间为36-42h。
进一步地，种子培养基组成为：蔗糖 120-140g/L，酵母膏 2.5-3g/L，硫酸铵 0.7-1g/L，丁二酸 1.6-2g/L，玉米浆 0.08-0.1v/v，K2CO3 0.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.1g/L，KH2PO4 0.8-1g/L，ZnSO4·7H2O 0.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
进一步地，发酵培养的具体步骤为：接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。
进一步地，发酵培养基为：蔗糖 160-180g/L，蛋白胨 30-35g/L，KH2PO4 0.08-0.1g/L，NaNO3 1.7-2g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L，KCl 0.3-0.5g/L，MnSO4 0.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
进一步地，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
发明原理：
到目前为止，发酵法生产聚苹果酸没有大规模的应用，其主要原因是：没有适宜大规模生产聚苹果酸的发酵工艺，在分批发酵过程中，聚苹果酸的产量与氧气的供给量是成正比的。出芽短梗霉是好氧菌，好氧菌在进行发酵时需要较高的搅拌速度以满足菌体生长所需的氧气量，并且聚苹果酸的发酵周期长，从而会使工业化发酵聚苹果酸的生产成本大大提高。在分批发酵中，控制发酵液中溶氧水平最方便和可行的操作方法就是改变搅拌转速和通气比，但是过量的通气会导致泡沫的产生，过高的搅拌转速产生的强剪切力会影响菌体细胞形态并对细胞生长起到不良的作用，出芽短梗霉在其生活史中主要具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，而能生成聚苹果酸的出芽短梗霉主要为酵母形，所以要通过二者的协调控制来进行发酵生产。
本发明先固定通气量，分别测定了不同搅拌转速对发酵聚苹果酸的影响，确定最优转速，然后对发酵过程中分别测定蔗糖、菌体量和聚苹果酸等过程参数，研究其变化趋势，固定搅拌转速，分别测定了不同通气量对发酵聚苹果酸的影响，从而确定最优的通气量。因此本发明发酵过程中分别测定蔗糖、菌体量和聚苹果酸等过程参数，研究其变化趋势，通过确定最优的搅拌速度和通气量协调控制来进行发酵生产。
有益效果
本发明通过测定蔗糖、菌体量和聚苹果酸三个过程参数，确定了聚苹果酸发酵过程中的最优转速，避免恒定转速过高，使聚苹果酸发酵能耗过高，造成生产成本上升；
本发明通过分阶段调整搅拌转速和通风量，有利于菌体快速大量的积累，从而缩短发酵周期，简化发酵工艺，节约生产成本。
附图说明
图1为聚苹果酸的三种结构。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液。按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。本发明所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。
种子培养基组成为：蔗糖 140g/L，酵母膏 3g/L，硫酸铵 1g/L，丁二酸 2g/L，玉米浆 0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水。
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速300r/min，通风比1.0vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵周期为144h。
发酵培养基为：蔗糖 180g/L，蛋白胨 35g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaNO3 2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余为蒸馏水。
（3）聚苹果酸的测定
本专利使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量为23.5g/L。
实施例2
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比1.0vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵周期为144h。发酵培养基同实施例1。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为28.5g/L。
实施例3
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速700r/min，通风比1.0vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵周期为144h。发酵培养基同实施例1。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为26.7g/L。
从实施例1-3可以得出，在转速500r/min的条件下，聚苹果酸的产量最高，可以确定最优的搅拌速度为500r/min。
实施例4
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比0.8vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵周期为144h。发酵培养基同实施例1。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为24.7g/L。
实施例5
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比1.2vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵周期为144h。发酵培养基同实施例1。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为26.7g/L。
从实施例4-5中可以看出，即使在确定最优的转速下，若发酵过程中的通气比不能有效控制也不会有高的聚苹果酸产量。
实施例6
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比0.8vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵至40—48h，通风比改为1.2vvm，直至发酵结束。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为29.2g/L。
实施例7
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
同实施例1
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比0.8vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵至40h后，通风比改为1.2vvm，发酵至90h，通风比改为1.0vvm，直至发酵144结束。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为31.3g/L。
通过分阶段调整搅拌转速和通风量，避免过量的通气会导致泡沫的产生，过高的搅拌转速产生的强剪切力会影响菌体细胞形态并对细胞生长起到不良的作用，通过二者的协调控制来进行发酵生产有利于菌体快速大量的积累，从而缩短发酵周期，简化发酵工艺，提高发酵成本。
实施例8
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液。按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖 120g/L，酵母膏 2.5g/L，硫酸铵 0.7g/L，丁二酸 1.6g/L，玉米浆 0.08v/v，K2CO3 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.08g/L，KH2PO4 0.8g/L，ZnSO4·7H2O0.03g/L，其余为蒸馏水。
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比0.8vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵至40h后，通风比改为1.2vvm，发酵至90h，通风比改为1.0vvm，直至发酵144结束。
发酵培养基为：蔗糖 160g/L，蛋白胨 30g/L，KH2PO4 0.08g/L，NaNO3 1.7g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KCl 0.3g/L，MnSO4 0.03g/L，其余为蒸馏水。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为31.8g/L。
实施例9
一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化2h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液。按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
种子培养基组成为：蔗糖 130g/L，酵母膏 2.8g/L，硫酸铵 0.9g/L，丁二酸 1.8g/L，玉米浆 0.09v/v，K2CO3 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.09g/L，KH2PO4 0.9g/L，ZnSO4·7H2O0.04g/L，其余为蒸馏水。
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。转速500r/min，通风比0.8vvm，罐压在0.1MPa，培养温度为25℃，发酵至40h后，通风比改为1.2vvm，发酵至90h，通风比改为1.0vvm，直至发酵144结束。
发酵培养基为：蔗糖 170g/L，蛋白胨 32g/L，KH2PO4 0.09g/L，NaNO3 1.9g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KCl 0.4g/L，MnSO4 0.04g/L，其余为蒸馏水。
（3）聚苹果酸的检测
使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，测得聚苹果酸的产量为31.8g/L。

Claims (5)

1.一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将菌株活化培养后，制得种子液；
(2)将所得种子液以10v/v％的量接于发酵罐中进行发酵培养，第一阶段发酵：通风比0.8-0.9vvm，发酵至40—48h；第二阶段发酵：通风比为1.1-1.2vvm，发酵至90—96h；第三阶段发酵：通风比为1.0-0.9vvm，发酵至144-148h；
发酵培养时，搅拌速度500r/min，罐压为0.1MPa，发酵温度为25℃；
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
2.根据权利要求1所述的一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，其特征在于，制得种子液的具体步骤为：将出芽短梗霉菌株活化2～3h，然后用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬浮液；按照10v/v％的接种量将孢子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为180-200r/min，培养时间为36-42h。
3.根据权利要求2所述的一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，其特征在于，种子培养基组成为：蔗糖120-140g/L，酵母膏2.5-3g/L，硫酸铵0.7-1g/L，丁二酸1.6-2g/L，玉米浆0.08-0.1v/v，K2CO3 0.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.1g/L，KH2PO4 0.8-1g/L，ZnSO4·7H2O0.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，其特征在于，发酵培养的具体步骤为：接种口在火焰保护下，将所得种子液以10v/v％的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的一种提高聚苹果酸产量的发酵方法，其特征在于，发酵培养基为：蔗糖160-180g/L，蛋白胨30-35g/L，KH2PO4 0.08-0.1g/L，NaNO3 1.7-2g/L，MgSO4·7H2O0.2-0.3g/L，KCl 0.3-0.5g/L，MnSO40.03-0.05g/L，其余为蒸馏水。
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