CN101096651B - 表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚羟基脂肪酸酯的一种表达方法及其专用工程菌。该用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌是抑制或敲除产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与脂肪酸β氧化代谢途径相关的一个或多个基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌突变株。一种表达聚羟基脂肪酸酯的方法，是用含有浓度5-20g/L的碳链长度为5-18的脂肪酸的发酵培养基对本发明的用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌进行发酵，得到聚羟基脂肪酸酯。本发明的聚羟基脂肪酸酯高产细菌突变株的构建方法简单，用其发酵生产PHA将具有操作简单、产量高、成本低廉及生产周期短的优点。基于上述优点，本发明的工程菌将在聚羟基脂肪酸酯中的生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及工程菌及其构建方法与应用，特别是涉及表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与其在发酵生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种能由许多微生物合成的胞内聚酯，在微生物胞内以颗粒状的内含物形式存在，是细菌胞内的一种碳源和能源的储备物。由于其具有与塑料相近的物理材料性能及生物可降解性能，因此被称之为生物可降解塑料。聚羟基脂肪酸酯的化学结构式如式I所示：
其中，m＝1、2、3或4，通常m＝1；n＝100-10000，表示聚合度；R为高度可变侧链，可以是饱和或不饱和、直链或支链、脂肪族或芳香族的基团。
近年来，组织工程领域的研究结果表明PHA还具有良好的生物相容性，是非常有潜力的生物医用材料。PHA按照其单体结构的不同，可以分为以下三类：短链PHA，其单体的碳原子数小于6，如聚3-羟基丁酸酯PHB，3-羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV；中长链PHA，含有碳原子数不小于6的单体；短链中长链共聚PHA，既含有短链PHA单体，又含有中长链PHA单体，这两种单体通过随机共聚的形式连接，如3-羟基丁酸己酸共聚酯PHBHHx。不同单体组成的PHA具有不同的物理性质，例如强度、延展性、结晶速率等。微生物的许多代谢途径，如β氧化途径等，与PHA的生物合成过程密切相关。脂肪酸是PHA生物合成的合适碳源，脂肪酸代谢过程的中间产物可以通过几条不同的代谢途径生成各种羟基脂肪酸单体用于PHA的合成。这三种PHA的物理性能差异很大。目前，PHA主要是从微生物中提取的，但现有的提取方法都存在较大缺陷，如回收率不高、产品纯度低、提取后产品分子量降低等，加上使用的许多有机溶剂毒性较大，沸点较低，提取过程需要高压，给生产带来安全隐患。对于中长链的PHA，现有的提取方法通常得到PHA沉淀是粘性很大的物质，较难分离和干燥，给提取带来一定的困难，而且纯度较低，带有较多杂质，限制了其在医学领域中的应用。因此，迫切需要一种工艺简单，成本低，且产率较高的生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可高效表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的专用表达工程菌。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌，是抑制或敲除产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与脂肪酸β氧化代谢途径相关的一个或多个基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌突变株。
所述与脂肪酸β氧化代谢途径相关的基因，可包括3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(fadA，GenBank号：1044992)、3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)(fadB，GenBank号：1044991)、3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(pcaF，GenBank号：1041755)、3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase)(fadAx，GenBank号：1045080)、乙酰辅酶A酰基转移酶基因(acetyl-CoA acetyltransferase)(phaD，GenBank号：1046928)和酰基辅酶A水合酶/异构酶enoyl-CoA hydratase/i somerase(fadB1x，GenBank号：1045082)等基因。
用于构建本发明产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的出发菌株-产聚羟基脂肪酸酯菌株的选择是多种多样的，可为任意一株产聚羟基脂肪酸酯的细菌，优选为产一种或多种单体碳链长度不小于6的中长链单体羟基脂肪酸酯的菌株，如Pseudomonas putidaKT2442(Kellerhals et al，Closed-loop control of bacterial high-cell-densityfed-batch cultures：Production of mcl-PHAs by Pseudomonas putida KT2442undersingle-substrate and cofeeding conditions.BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999，65(3)：306-315)、Pseudomonas putidaKT2440(ATCC编号：47054)、Pseudomonasaeruginosa PAO1(ATCC编号：39018)、Pseudomonas putida KCTC1639(Kim TK，JungYM，Vo MT，Shioya S，Lee YH.，Metabolic engineering and characterization ofphaC1and phaC2 genes from Pseudomonas putida KCTC1639 for overproduction ofmedium-chain-length polyhydroxyalkanoate.Biotechnol Prog.2006Nov-Dec；22(6)：1541-6.)、Pseudomonas sp.strain 3Y2(Delamarre SC，Chang HJ，Batt CA.Identification and characterization of two polyhydroxyalkanoatebiosynthesis loci in Pseudomonas sp.strain 3Y2.Appl Microbiol Biotechnol.2005 Dec；69(3)：293-303.Epub 2005Nov 15.)或Aeromonas hydrophila 4AK4(QiuYZ，Ouyang SP，Shen Z，Wu Q，Chen GQ.，Metabolic engineering for the productionof copolyesters consisting of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate byAeromonas hydrophila.Macromol Biosci.2004 Mar 15；4(3)：255-61.)等。
其中，以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(fadB)及3-酮酰辅酶A硫解酶基因(fadA)的缺失突变株为P.putidaKTOY06。
以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(fadB)的缺失突变株为P.putida KTOY06-1。
以Pseudomonas putida KT2440为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(fadB)的缺失突变株为P.putida KTOY06-2。
以Pseudomonas aeruginosa PAO1为出发菌株，构建的敲除3-酮酰辅酶A硫解酶基因(pcaF)的缺失突变株为P.aeruginosa PACSS01。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法。
本发明所提供的构建上述用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法，包括以下步骤：
1)构建含有一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关基因的重组自杀载体；
2)将步骤1)构建的重组自杀载体导入产聚羟基脂肪酸酯细菌，使产聚羟基脂肪酸酯细菌中的所述一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关基因敲除，得到表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌。
在上述工程菌的构建方法中，步骤1)中用于构建含有一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关基因的重组自杀载体的出发载体的选择是多种多样的，可为pK18mobSacB、pGMB151、pXL275、pCVD442、pMW1823、pSUP202、pJK102或pSZ36等任一自杀载体，优选为pK18mobSacB。
其中，以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonas putida KT2442菌株的3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB及3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA的重组自杀载体为pSPK11；以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonasputida KT2442或Pseudomonas putida KT2440菌株的3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB的重组自杀载体为pSPK13；以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonas aeruginosa PAO1菌株的3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF的重组自杀载体为pSPK15。
上述重组自杀载体均可按照基因工程领域中的常规方法构建。
所述步骤2)中可将步骤1)构建的重组自杀载体通过转化有所述重组自杀载体的E.coli S17-1导入产聚羟基脂肪酸酯细菌。
步骤2)中用于构建本发明产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的出发菌株-产聚羟基脂肪酸酯菌株的选择是多种多样的，可为任意一株产聚羟基脂肪酸酯的细菌，优选为产一种或多种单体碳链长度不小于6的中长链单体羟基脂肪酸酯的菌株，如Pseudomonasputida KT2442、Pseudomonas putida KT2440(ATCC编号：47054)、Pseudomonasaeruginosa PAO1(ATCC编号：39018)、Pseudomonas putida KCTC1639、Pseudomonassp.strain 3Y2、或Aeromonas hydrophila 4AK4等。
其中，以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB及3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06；以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06-1；以Pseudomonas putida KT2440为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06-2；以Pseudomonasaeruginosa PAO1为出发菌株，构建的敲除3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.aeruginosa PACSS01。
此外，其它可抑制或敲除目的基因表达的方法均可用于构建本发明的用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌，这些方法包括：人工合成抑制目的基因表达的小干扰RNA，基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统和构建含有人工合成抑制目的基因表达小干扰RNA编码基因的干扰载体(如RNAi干扰载体，或慢病毒、腺病毒等病毒干扰载体)等。
本发明的另一个目的是提供一种表达聚羟基脂肪酸酯的方法。
本发明所提供的表达聚羟基脂肪酸酯的方法，是用含有浓度5-20g/L的碳链长度为5-18的脂肪酸的发酵培养基对上述用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌进行发酵，得到聚羟基脂肪酸酯。
所述碳链长度为5-18的脂肪酸的选择是广泛的，如辛酸、癸酸、月硅酸、十二酸、十四酸、十六酸或硬脂酸等。
本发明提供了表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法。该工程菌是通过基因工程手段抑制或敲除野生型产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关的基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌突变株。摇瓶发酵实验结果表明，与野生型产聚羟基脂肪酸酯细菌相比，本发明的菌株经发酵后PHA的表达水平显著提高，PHA含量可提高到占细胞干重的85％(野生型产聚羟基脂肪酸酯细菌的PHA产量一般为40-50％)，此外，所合成的PHA中的单体结构还与脂肪酸底物的结构高度一致，因此，可以根据脂肪酸的结构获得含有大量相同脂肪酸碳链长度单体的PHA。本发明的聚羟基脂肪酸酯高产细菌突变株的构建方法简单，用其发酵生产PHA将具有操作简单、产量高、成本低廉及生产周期短的优点。基于上述优点，本发明的工程菌将在聚羟基脂肪酸酯中的生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为质粒pK18mobSacB的物理图谱
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
所用酶试剂均购自大连宝生物工程有限公司，提取质粒、回收DNA片断所用的试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制，培养基灭菌条件为：115℃加热20分钟。
如无特殊说明，下述实施例中的微生物培养条件均为：发酵温度30-35℃，发酵时间36-72h。
所用发酵培养基中除去碳源部分的组成为：(NH4)2SO44.0g/L，MgSO41.0g/L，Na2HPO4·12H2O4.5g/L，KH2PO41.5g/L，Fe(III)-NH4-citrate0.05g/L，CaCl20.02g/L和1mL/L的微量元素溶液；其中，微量元素溶液的配方为：ZnSO4·7H2O100mg/L，MnCl2·4H2O30mg/L，H3BO3300mg/L，CoCl2·6H2O200mg/L，CuSO4·5H2O10mg/L，NiCl2·6H2O20mg/L，NaMoO4·2H2O30mg/L，HCl0.5mol/L。
其它培养基配方：
LB液体培养基：每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水。
LB-Km液体培养基：每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LB-Km固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LBS-Amp固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LB-Km-Amp固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
实施例1、Pseudomonas putida KT2442 3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，fadB)及3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase，fadA)缺失突变株的构建
一、用于缺失突变Pseudomonas putida KT2442中fadB及fadA基因的重组自杀载体的构建
1)以Pseudomonas putida strain KT2442(van der Meer，J R，van Neerven，AR，de Vries，E J，et al.Cloning and characterization of plasmid-encoded genes forthe degradation of 1，2-dichloro-，1，4-dichloro-，and 1，2，4-trichlorobenzene ofPseudomonas sp.strain P51.J Bacteriol 173(1)：6-15Jan 1991)的基因组DNA为模板，在引物P1：5’-ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC-3’和P2：5’-CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC-3’的引导下，PCR扩增相连的两个基因，包括3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA片段(该基因的NCBI gene ID号为：1044992)和3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB片段(该基因的NCBI gene ID号为：1044991)，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小约为2783bp的DNA片段，用限制性内切酶Xba I和Hind III对PCR扩增产物进行双酶切后，回收大小约为2.8kb的酶切片段。
2)用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒pK18mobSacB(购自the NationalInstitute of Genetics，Japan，其物理图谱如图1所示)进行双酶切，回收约5.7kb的酶切片段；
3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1(ATCC编号：47055)中，然后将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及2.783kb的DNA片段，将构建正确的含有PCR扩增的fadA及fadB基因片段的大肠杆菌克隆载体命名为pSPK10。
5)用限制性内切酶Sal I对质粒pSPK10进行酶切，回收6.648kb的酶切片段；
6)将步骤5)的回收片段用T4DNA连接酶进行自连，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
7)挑取步骤6)在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及0.949kb的DNA片段。将构建正确的fadB及fadA基因的自杀载体命名为pSPK11，将含有质粒pSPK11的重组大肠杆菌命名为E.coli S17-1(pSPK11)。
二、通过构建好的自杀质粒pSPK11敲除Pseudomonas putida KT2442中fadB及fadA基因，获得基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06
1)挑取步骤一中获得的含有质粒pSPK11的重组菌E.coli S17-1(pSPK11)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonasputida KT2442菌株接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取0.5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，8000rpm离心2min，弃去上清液，再加入1mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30℃培养箱中培养1h，然后用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，置于30℃培养箱中培养24h；
2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
3)用无菌接种环通过划线法将一环步骤2)中培养得到的菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
4)挑取步骤3)中在LBS-Amp固体培养平板上长出的20个单菌落，编号，并按次序将各单菌落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
5)挑取步骤4)中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体培养平板上生长的单菌落，分别接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
6)将步骤5)获得的不同菌落的培养液各取1mL，离心，弃上清，用200μl无菌水重悬，将重悬的菌液置于沸水浴中水浴10分钟，冷却后，以该菌液为模板，在引物P1和P2的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，能够获得大小约为949kb DNA片段的菌落为构建正确的敲除fadB及fadA基因的Pseudomonas putida KT2442突变株，将此突变株命名为Pseudomonasputida KTOY06。
实施例2、用Pseudomonas putida KTOY06转化月桂酸生产PHA的摇瓶实验
对实施例1获得的基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06进行生产PHA的摇瓶实验，具体方法如下：
1)将Pseudomonas putida KTOY06接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养9h；
2)将月硅酸加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KTOY06的发酵液中，使得发酵液中月硅酸的浓度为12g/L，然后在30℃、200rpm下继续摇床培养39h。
培养结束后，按照文献(Ouyang，S.P.；Liu，Q.；Fang，L.；Chen，G.Q.Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putidaKT2442and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate)Production.Macromol.Biosci.2007，7，227-233)中记载的方法检测用上述方法发酵后的Pseudomonasputida KTOY06菌体细胞干重以及PHA含量、组成。检测结果如表1所示，经发酵后菌体细胞内PHA获得了高水平的表达，PHA含量可达细胞干重的84.3±4.6％，且所合成的PHA中的单体结构还与脂肪酸底物的结构高度一致，证明本发明的工程菌可用于PHA的发酵生产中。
表1发酵后菌体细胞干重以及PHA含量、组成的检测结果
实施例3、Pseudomonas putida KT2442 3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，fadB)缺失突变株的构建
一、用于缺失突变Pseudomonas putida KT2442中fadB基因的重组自杀载体的构建
1)以Pseudomonas putida strain KT2442的基因组DNA为模板，在引物P3：5’-ATTTCTAGAATCAAACGGGCGTATG-3’和P4：5’-ATCAAGCTTCCATTTCACGCAGCTT-3’的引导下，PCR扩增3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB片段，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小约为2279bp的DNA片段，用限制性内切酶Xba I和Hind III对PCR扩增产物进行双酶切后，回收大小约为2.3kb的酶切片段。
2)用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒pK18mobSacB进行双酶切，回收约5.7kb的酶切片段；
3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1中，然后将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及2.279kb的DNA片段，将构建正确的含有PCR扩增的fadB基因片段的大肠杆菌克隆载体命名为pSPK12。
5)用限制性内切酶Sal I对质粒pSPK12进行酶切，回收6.486kb的酶切片段；
6)将步骤5)的回收片段用T4DNA连接酶进行自连，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
7)挑取步骤6)在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及0.787kb的DNA片段。将构建正确的fadB基因的自杀载体命名为pSPK13，将含有质粒pSPK13的重组大肠杆菌命名为E.coli S17-1(pSPK13)。
二、通过构建好的自杀质粒pSPK13敲除Pseudomonas putida KT2442中fadB基因，获得基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06-1
1)挑取步骤一中获得的含有质粒pSPK13的重组菌E.coli S17-1(pSPK13)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonasputida KT2442菌株接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取0.5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，8000rpm离心2min，弃去上清液，再加入1mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30℃培养箱中培养1h，然后用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，置于30℃培养箱中培养24h；
2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
3)用无菌接种环通过划线法将一环步骤2)中培养得到的菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
4)挑取步骤3)中在LBS-Amp固体培养平板上长出的20个单菌落，编号，并按次序将各单菌落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
5)挑取步骤4)中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体培养平板上生长的单菌落，分别接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
6)将步骤5)获得的不同菌落的培养液各取1mL，离心，弃上清，用200μl无菌水重悬，将重悬的菌液置于沸水浴中水浴10分钟，冷却后，以该菌液为模板，在引物P3和P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，能够获得大小约为787kb DNA片段的菌落为构建正确的敲除fadB基因的Pseudomonas putida KT2442突变株，将此突变株命名为Pseudomonas putidaKTOY06-1。
实施例4、用Pseudomonas putida KTOY06-1转化癸酸生产PHA的摇瓶实验
对实施例1获得的基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06-1进行生产PHA的摇瓶实验，具体方法如下：
1)将Pseudomonas putida KTOY06-1接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养9h；
2)将癸酸加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KTOY06-1的发酵液中，使得发酵液中癸酸的浓度为12g/L，然后按5％(V/V)的比例将菌液接种到含12g/L癸酸的LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下继续摇床培养到48h。
培养结束后，按照与实施例2相同的方法检测用上述方法发酵后的Pseudomonasputida KTOY06-1菌体细胞干重以及PHA含量、组成。检测结果如表2所示，经发酵后菌体细胞内PHA获得了高水平的表达，PHA含量可达细胞干重的68.2±6.4％，此外，所合成的PHA中的单体结构还与脂肪酸底物的结构高度一致，证明本发明的工程菌可用于PHA的发酵生产中。
表2发酵后菌体细胞干重以及PHA含量、组成的检测结果
实施例5、Pseudomonas putida KT2440 3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，fadB)缺失突变株的构建
一、用于缺失突变Pseudomonas putida KT2440中fadB基因的重组自杀载体的构建
由于Pseudomonas putida KT2440(ATCC编号：47054)与Pseudomonas putidaKT2442的fadB基因序列一致，因此使用实施例3中构建的fadB基因的自杀载体pSPK13及含有该质粒的重组菌E.coli S17-1(pSPK13)即可。
二、通过构建好的自杀质粒pSPK13敲除Pseudomonas putida KT2440中fadB基因，获得基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06-2
1)挑取实施例3中构建的含有质粒pSPK13的重组菌E.coli S17-1(pSPK13)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonasputida KT2440菌株接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取0.5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，8000rpm离心2min，弃去上清液，再加入1mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30℃培养箱中培养1h，然后用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，置于30℃培养箱中培养24h；
2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
3)用无菌接种环通过划线法将一环步骤2)中培养得到的菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
4)挑取步骤3)中在LBS-Amp固体培养平板上长出的20个单菌落，编号，并按次序将各单菌落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
5)挑取步骤4)中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体培养平板上生长的单菌落，分别接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
6)将步骤5)获得的不同菌落的培养液各取1mL，离心，弃上清，用200μl无菌水重悬，将重悬的菌液置于沸水浴中水浴10分钟，冷却后，以该菌液为模板，在引物P3和P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，能够获得大小约为787kb DNA片段的菌落为构建正确的敲除fadB基因的Pseudomonas putida KT2442突变株，将此突变株命名为Pseudomonas putidaKTOY06-2。
实施例6、用Pseudomonas putida KTOY06-2转化辛酸生产PHA的摇瓶实验
对实施例1获得的基因工程菌Pseudomonas putida KTOY06-2进行生产PHA的摇瓶实验，具体方法如下：
1)将Pseudomonas putida KTOY06-2接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养9h；
2)将辛酸加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KTOY06-2的发酵液中，使得发酵液中癸酸的浓度为12g/L，然后在30℃、200rpm下继续摇床培养39h。
培养结束后，按照与实施例2相同的方法检测用上述方法发酵后的Pseudomonasputida KTOY06-2菌体细胞干重以及PHA含量、组成。检测结果如表3所示，经发酵后菌体细胞内PHA获得了高水平的表达，PHA含量可达细胞干重的6.7±0.8％，此外，所合成的PHA中的单体结构还与脂肪酸底物的结构高度一致，证明本发明的工程菌可用于PHA的发酵生产中。
表3发酵后菌体细胞干重以及PHA含量、组成的检测结果
实施例7、Pseudomonas aeruginosa PAO1 3-酮酰辅酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase，pcaF)缺失突变株的构建
一、用于缺失突变Pseudomonas aeruginosa PAO1中pcaF基因的重组自杀载体的构建
1)以Pseudomonas aeruginosa PAO1(ATCC编号：39018)的基因组DNA为模板，在引物P5：5’-ATTTCTAGAGCAGCGCCAAGGAAG-3’和P6：5’-ATCAAGCTTCTGACCGTGCGACGG-3’的引导下，PCR扩增3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF片段(该基因的NCBI gene ID号：877715)，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小约为1733bp的DNA片段，用限制性内切酶Xba I和Hind III对PCR扩增产物进行双酶切后，回收大小约为1.7kb的酶切片段。
2)用限制性内切酶XbaI和Hind III对质粒pK18mobSacB进行双酶切，回收约5.7kb的酶切片段；
3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1中，然后将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶Xba I和Hind III对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及1.733kb的DNA片段，将构建正确的含有PCR扩增的pcaF基因片段的大肠杆菌克隆载体命名为pSPK14。
5)用限制性内切酶SalI对质粒pSPK14进行酶切，回收6.535kb的酶切片段；
6)将步骤5)的回收片段用T4DNA连接酶进行自连，将连接产物用电转化法导入E.coli S17-1中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；
7)挑取步骤6)在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和Hind III对质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为5.699kb及0.836kb的DNA片段。将构建正确的pcaF基因的自杀载体命名为pSPK15，将含有质粒pSPK15的重组大肠杆菌命名为E.coli S17-1(pSPK15)。
二、通过构建好的自杀质粒pSPK15敲除Pseudomonas aeruginosa PAO1中pcaF基因，获得基因工程菌Pseudomonas aeruginosa PACSS01
1)挑取步骤一构建的含有质粒pSPK15的重组菌E.coli S17-1(pSPK15)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonasaeruginosa PAO1菌株接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取0.5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，8000rpm离心2min，弃去上清液，再加入1mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30℃培养箱中培养1h，然后用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，置于30℃培养箱中培养24h；
2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养24h；
3)用无菌接种环通过划线法将一环步骤2)中培养得到的菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
4)挑取步骤3)中在LBS-Amp固体培养平板上长出的20个单菌落，编号，并按次序将各单菌落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；
5)挑取步骤4)中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体培养平板上生长的单菌落，分别接种至LB-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇/床培养24h；
6)将步骤5)获得的不同菌落的培养液各取1mL，离心，弃上清，用200μl无菌水重悬，将重悬的菌液置于沸水浴中水浴10分钟，冷却后，以该菌液为模板，在引物P5和P6的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，能够获得大小约为836kb DNA片段的菌落为构建正确的敲除pcaF基因的Pseudomonas aeruginosa PAO1突变株，将此突变株命名为Pseudomonasaeruginosa PACSS01。
实施例8、用Pseudomonas aeruginosa PACSS01转化月桂酸生产PHA的摇瓶实验
对实施例1获得的基因工程菌Pseudomonas aeruginosa PACSS01进行生产PHA的摇瓶实验，具体方法如下：
1)将Pseudomonas aeruginosa PACSS01接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养9h；
2)将月桂酸加入到步骤1)中含有Pseudomonas aeruginosa PACSS01的发酵液中，使得发酵液中月桂酸的浓度为12g/L，然后在30℃、200rpm下继续摇床培养39h。
培养结束后，按照与实施例2相同的方法检测用上述方法发酵后的Pseudomonasaeruginosa PACSS01菌体细胞干重以及PHA含量、组成。检测结果如表4所示，经发酵后PHA含量占细胞干重的4.6±0.8％，此外，所合成的PHA中的单体结构还与脂肪酸底物的结构高度一致，证明本发明的工程菌可能应用于PHA的发酵生产中。
表4发酵后菌体细胞干重以及PHA含量、组成的检测结果
Claims (7)
1.用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌，是抑制或敲除产聚羟基脂肪酸酯细菌中的与脂肪酸β氧化代谢途径相关的一个或多个基因后得到的产聚羟基脂肪酸酯菌突变株；
所述与脂肪酸β氧化代谢途径相关的基因包括GenBank号为1044992的3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA，GenBank号为1044991的3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB，GenBank号为877715的3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF，GenBank号为1046928的乙酰辅酶A酰基转移酶基因pdaD和GenBank号为1045082的酰基辅酶A水合酶/异构酶fadB1x；
所述产聚羟基脂肪酸酯细菌为产一种或多种单体碳链长度不小于6的中长链单体羟基脂肪酸酯的菌株；
所述菌株为Pseudomonas putida KT2442、Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas putida KCTC1639、Pseudomonas sp.strain 3Y2或Aeromonas hydrophila 4AK4。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06、P.putida KTOY06-1、P.putida KTOY06-2或P.aeruginosa PACSS01；
所述P.putida KTOY06为以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB及3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA的缺失突变株；所述3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB，其GenBank号为1044991；所述3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA，其GenBank号为1044992；
所述P.putida KTOY06-1为以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB的缺失突变株；所述3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB，其GenBank号为1044991；
所述P.putida KTOY06-2为以Pseudomonas putida KT2440为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB的缺失突变株；所述3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因fadB，其GenBank号为1044991；
所述P.aeruginosa PACSS01为以Pseudomonas aeruginosa PAO1为出发菌株，构建的敲除3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF的缺失突变株；所述3-酮酰辅酶A硫解酶基因pcaF，其GenBank号为877715。
3.一种构建权利要求1所述的用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法，包括以下步骤：
1)构建含有一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关基因的重组自杀载体；
2)将步骤1)构建的重组自杀载体导入产聚羟基脂肪酸酯细菌，得到表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中用于构建含有一个或多个与脂肪酸β氧化代谢途径相关基因的重组自杀载体的出发载体为pK18mobSacB、pGMB151、pXL275、pCVD442、pMW1823、pSUP202、pJK102或pSZ36；以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonas putida KT2442菌株的3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因及3-酮酰辅酶A硫解酶基因的重组自杀载体为pSPK11；以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonas putida KT2442或Pseudomonas putida KT2440菌株的3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因的重组自杀载体为pSPK13；以pK18mobSacB为出发载体，构建的含有来源于Pseudomonas aeruginosa PAO1菌株的3-酮酰辅酶A硫解酶基因的重组自杀载体为pSPK15。
5.根据权利要求3所示的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中将步骤1)构建的重组自杀载体通过转化有所述重组自杀载体的E.coli S17-1导入产聚羟基脂肪酸酯细菌；用于构建本发明产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的出发菌株为Pseudomonasputida KT2442、Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas putida KCTC1639、Pseudomonas sp.strain 3Y2或Aeromonashydrophila 4AK4。
6.根据权利要求5所示的构建方法，其特征在于：所述以Pseudomonas putidaKT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因及3-酮酰辅酶A硫解酶基因的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06；以Pseudomonas putidaKT2442为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putida KTOY06-1；以Pseudomonas putida KT2440为出发菌株，构建的敲除3-羟基酯酰辅酶A脱氢酶基因的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.putidaKTOY06-2；以Pseudomonas aeruginosa PAO1为出发菌株，构建的敲除3-酮酰辅酶A硫解酶基因的产聚羟基脂肪酸酯的工程菌为P.aeruginosa PACSS01。
7.一种表达聚羟基脂肪酸酯的方法，是用含有浓度5-20g/L的碳链长度为5-18的脂肪酸的发酵培养基对权利要求1或2所述的用于表达聚羟基脂肪酸酯的工程菌进行发酵，得到聚羟基脂肪酸酯。
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| Kim Tae-Kwon et al..Molecular Structure of PCR Cloned PHA Synthase Genes ofPseudomonas putida KT2440 and Its Utilization for Medium-Chain Length Polyhydroxyalkanoate Production.Journal of microbiology and biotechnology13 2.2003,13(2),1. |
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