CN102154387B - 利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明通过在同一大肠杆菌中构建同时利用甘油和脂肪酸(C8-C18)的途径，实现了对生物柴油产业中的副产物甘油和脂肪酸的发酵利用，获得了高附加值的化工原料琥珀酸和生物材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)；实验表明：本方法在积累25.3g/L～26.1g/L的琥珀酸的同时，PHA积累达到了细胞干重的3.42％～4.13％，为降低生物柴油产业的污染和成本，实现生物柴油产业中琥珀酸和PHA的低成本、高效率的联产开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物发酵及生物炼制领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物（甘油和以及残留在甘油中的脂肪酸）生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯（聚羟基脂肪酸酯）的方法。
背景技术
琥珀酸，学名丁二酸，是一种具有重要应用价值的四碳二羧酸。琥珀酸作为30多种重要工业产品如1，4-丁二醇、四氢呋喃等的前体物质，被广泛应用于食品、医药、树脂聚合体、印染、化妆品等方面。目前琥珀酸的生产方法主要是化学法。由于环境问题，许多研究已经转向于微生物发酵来生产琥珀酸，以可再生资源为原料的琥珀酸发酵法将逐步取代传统的化学合成法。通过代谢工程构建以多种可再生碳源为底物的、易培养的、高转化效率、高产量的琥珀酸发酵菌株，提高微生物琥珀酸的产量、降低琥珀酸发酵成本具有巨大的应用潜力。。目前，研究较多的产琥珀酸微生物菌株有：产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniproducens),产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等菌种。
聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，聚羟基脂肪酸酯）是细菌体内一种酯类的累积物,主要被用来作为碳源和能源的储备物。同时它是一类新型的天然高分子材料,具有良好的生物降解性、生物相容性、压电效应、光学活性等特点，已经应用于环保、医药等领域。同时，聚羟基脂肪酸酯有良好的生物可降解性,其分解产物可全部为生物利用,对环境无任何污染。聚羟基脂肪酸酯的熔融温度为175～180℃,是一种可完全分解的热塑性塑料。自然界中积累聚羟基脂肪酸酯的菌株主要是假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)等。其中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)研究的最多。铜绿假单胞菌中存在功能相似的II型聚羟基脂肪酸酯聚合酶phaC1和phaC2。在不良条件下生长时，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)积累中长链的聚羟基脂肪酸酯。
大肠杆菌作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养及可利用多种碳源，而受到越来越多的重视。正是基于这些原因，大肠杆菌已经被广泛应用于发酵工程中，已知的通过代谢工程改造的大肠杆菌可成功地以葡萄糖等可再生的、廉价的碳源为底物发酵生产琥珀酸、乳酸以及乙醇等。大肠杆菌本身也不存在聚羟基脂肪酸酯合成和降解途径，通过基因工程可以将聚羟基脂肪酸酯合成途径构建在大肠杆菌内，从而实现利用大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯。
由于石油价格的上涨和环境污染的日益严重。生物柴油作为一个产业得到了各国的重视并迅速发展。而在生产生物柴油的过程中，特别是酶法合成生物柴油的过程中，甘油和甘油中的部分脂肪酸以副产物的形式而积累下来。如何变废为宝？如何同时有效利用甘油和剩余的脂肪酸转化为高附加值的生物材料或化工原料是一个重要问题。
发明内容
为了解决目前生物柴油生产过程中副产物甘油和甘油中的脂肪酸的回收和利用问题，本发明通过构建重组大肠杆菌，提供了一种利用重组大肠杆菌同时利用生物柴油生产过程中的副产物甘油和甘油中的脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯（聚羟基脂肪酸酯）的方法。
本发明的技术方案是：利用基因工程改造大肠杆菌，在同一大肠杆菌菌株内构建同时利用甘油和脂肪酸发酵生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的合成途径（见图1）。
琥珀酸是三羧酸循环中间产物之一。以代谢流分析，本发明采用大肠杆菌缺失中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR）、短链脂肪酸代谢阻遏物基因（atoC）、碳源代谢途径中的磷酸转移酶系统II（ptsG）、琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)及乙酸生成途径（Pta-ackA）缺陷型菌株发酵生产琥珀酸。fadR和atoC基因的敲除解除了对大肠杆菌利用脂肪酸包括短链脂肪酸的抑制作用，ptsG基因的敲除解除了分解代谢物的阻遏效应，同时减少了乙酸的生成；sdhA基因的敲除，使得琥珀酸不被氧化利用，从而在大肠杆菌细胞内积累下来；pta基因的敲除减少了乙酸的生成，增加了乙酰-CoA流向TCA循环，从而生成更多的琥珀酸。
聚羟基脂肪酸酯合成基于脂肪酸氧化中的中间产物3-羟基-脂酰-CoA，通过人为表达来自铜绿假单胞菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因(phaC1)催化3-羟基-脂酰-CoA生成聚羟基脂肪酸酯。
本发明在同一大肠杆菌内构建了琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯合成代谢途径，以生物柴油生产中的副产物甘油和甘油中的脂肪酸为底物发酵生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。
具体的，本发明所述利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法如下所述：
(1)琥珀酸代谢途径的构建
通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli中敲除中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR）、短链脂肪酸代谢阻遏物基因（atoC），葡萄糖磷酸转移酶系统II基因（ptsG）、琥珀酸脱氢酶基因（sdhA）和磷酸转乙酰基酶基因（pta），构建含琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌菌株E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta。
利用Red重组系统，根据Genbank公布的大肠杆菌基因组序列，设计引物对fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta基因进行敲除。以pKD3或pKD4为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增带有氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的同源重组片断。培养带有pKD46质粒的大肠杆菌并制备电转化感受态细胞，将50～100μl的感受态细胞与8～12ng的同源重组片断混合加入电击杯中(购买于Bio-Rad公司)，通过电穿孔仪(购买于Bio-Rad公司)电击，电压设置为1800～2500v。将电击液用900μL的SOC培养基稀释，然后通过氯霉素抗性或卡那霉素抗性平板筛选重组子，然后设计引物PCR验证敲除的正确性。然后培养重组大肠杆菌并制备感受态细胞，转化pCP20质粒，通过温度诱导表达FLP内切酶将抗性基因从基因组上切除掉。
上述敲除基因fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta所用的引物分别为：pKD-fadR primer1:
5′-GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-fadR-primer2:
5′-ACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-fadR-test1:5′-ACGGTCAGGCAGGAGTGAG-3′
pKD-fadR-test2:5′-AGCATCGAGTTGCTGGAACG-3′
pKD-atoC primer 1:
5′-GCTTATTTTACCGATCAACCCGCAGGGAAATCAGACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-atoC primer2:
5′-TTGCGCACTGTGCAAATTTCTGCATAGCAAGTTTTGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-atoC test1:5′-ATCAGGGTGATATTCGCGTCG-3′
pKD-atoC tes2:5′-AACTAATTGAATATGAAGGGA-3′
pKD-ptsG primer 1:
5′-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-ptsG primer2:
5′-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-ptsG test1:5′-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3′
pKD-ptsG test2:5′-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3′
pKD-sdhA primer 1:
5′-TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-sdhA primer2:
5′-ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-sdhA test1:5′-GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3′
pKD-sdhA test2:5′-GAGCATCATCAACATCCGGG-3′
pKD-pta primer 1:
5′-GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-pta primer2:
5′-TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-pta test 1:5′-TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3′
pKD-pta test 2:5′-ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3′
上述质粒pKD46(oriR101repA101ts ParaB-gam-bet-exo Amp)是温度敏感型，能在阿拉伯糖的诱导下表达同源重组需要的三个λ噬菌体重组酶Gam，Bet和Exo，提高重组效率。
上述质粒pKD3含有两边为FRT位点的氯霉素抗性基因；质粒pKD4含有两边为FRT位点的卡那霉素抗性基因。
上述质粒pCP20为温度敏感型，热诱导后表达FLP重组酶，能识别FRT位点并促进重组的发生。所述质粒pKD46、pKD4、pKD3及pCP20的构建及应用见（1.Datsenko KA,WannerBL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli using PCR products.Proc NatlAcad Sci USA2000,97:6640～6645;2.Red重组技术研究进展，中国生物工程杂志，2006，26（1）：81～86；3.Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用,遗传，2003，25（5）：628～632；
4.利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除,中国生物化学与分子生物学报,2005,21（1）：35～38）。
（2）phaC基因表达质粒的构建
基本方法是将来源于假单胞菌属(Pseudomonas)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因（phaC）克隆至质粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒p-phaC。
（3）构建能同时发酵生物柴油副产物（甘油和甘油中的脂肪酸）生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌
将phaC基因表达载体p-phaC转化所构建的琥珀酸发酵大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta，从而获得生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p-phaC。
或者：
在已构建有聚羟基脂肪酸酯发酵途径的大肠杆菌E.coli/p-phaC中，利用Red重组系统敲除中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR）、短链脂肪酸代谢阻遏物基因（atoC），葡萄糖磷酸转移酶系统II基因（ptsG）、琥珀酸脱氢酶基因（sdhA）和磷酸转乙酰基酶基因（pta），从而获得生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p-phaC。
上述大肠杆菌E.coli属于大肠杆菌E.coli k-12系列。优选k-12系列中的E.coli MG1655。
上述聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC来源于能合成中长链聚羟基脂肪酸酯的假单胞菌属。优选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
上述聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC优选来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中phaC1和phaC2中的phaC1。
上述聚羟基脂肪酸酯合成酶phaC1表达载体优选为pUC19。
上述联产聚羟基脂肪酸酯和琥珀酸的重组大肠杆菌E.coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p-phaC选择E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。
（4）利用步骤（3）所获得的重组大肠杆菌首先以甘油和癸酸（C10脂肪酸）为底物进行发酵，生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯，以验证本发明的可行性
利用构建的重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵甘油和癸酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。
发酵过程：将重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1从固体平板上挑取1～2环接入装有LB培养基的试管中，30～40℃下，培养12～20h；然后以体积比计，按照1～10%的接种量转入装有50ml发酵培养基的300ml的三角瓶中，培养12-16h后，再以体积比计，按照5-10%的接种量转入1L～5L的发酵罐中，30～40℃，溶氧控制在50%以上，pH 6.5～7.5，发酵72h～150h。
发酵培养基配方为：20-30g/L的甘油和1-5g/L的癸酸，(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L，氨苄青霉素，100mg/L。
发酵结果显示：E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1菌株可以有效利用甘油和癸酸，在积累21g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的5.62%。
（5）利用重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物甘油和脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯以步骤(4)为基础，利用重组的大肠杆菌E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵来自植物油脂生产生物柴油的副产物或来自动物油脂生产生物柴油的副产物。
发酵过程：将重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1从固体平板上挑取1～2环接入装有LB培养基的试管中，30～40℃下，培养12～20h；然后以体积比计，按照1～10%的接种量转入装有50ml发酵培养基的300ml的三角瓶中，培养12-16h后，再以体积比计，按照5-10%的接种量转入1L～5L的发酵罐中发酵。
发酵培养基配方为：含10-60g/L的甘油和1-10g/L脂肪酸（棕榈酸或硬脂酸）的生物柴油副产物，(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L，氨苄青霉素,100mg/L。
发酵条件是：摇瓶：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐：温度设为30～40℃，溶氧控制在50%以上，pH 6.5～7.5，发酵时间72h～150h。
进一步优选的发酵条件是：摇瓶：温度设为37℃，摇床转速设为250转/分，发酵时间48h～60h；发酵罐：温度设为37℃，溶氧控制在50%以上，pH 7.0，发酵时间100h～120h。
琥珀酸检测：每间隔2～4h取样，将取的发酵液以4,000～12,000的转速离心2～20分钟，上清液用于分析检测琥珀酸。用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRad Labs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
聚羟基脂肪酸酯检测：每间隔2～4h取样，将所取的发酵液样品在12,000转/分钟的转速下离心2分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干重。将上述制得的5mg干菌体，加入850μl的甲醇，150μl的98%硫酸和1mL的氯仿。沸水浴中加热60分钟，然后利用1毫升的双蒸水，剧烈混匀后，静置分层，然后吸取下层溶液于管中，经微孔滤膜过滤后，利用气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯。
发酵结果表明，重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1可以同时利用生物柴油副产物甘油和脂肪酸。同时利用来自植物油脂的生物柴油副产物条件下，在积累25.3g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的4.13%；而利用来自动物油脂的生物柴油副产物的条件下，在积累26.1g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的3.42%。
本发明针对生物柴油过程中副产物甘油和甘油中的脂肪酸回收和利用的问题，提出了利用生物柴油副产物甘油和脂肪酸发酵生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法。即在同一大肠杆菌中构建同时利用甘油和脂肪酸（C8-C24）的途径，通过发酵生物柴油的副产物同时发酵生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。发酵结果表明：生物柴油副产物甘油和脂肪酸得到了很好的利用，同时琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯得到了有效积累。
本发明方法应用到生物柴油产业中，可以实现对副产物甘油和甘油中的脂肪酸的有效利用，从而降低生物柴油产业的成本，实现生物柴油产业的琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的低成本、高效率的联产，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明发酵生物柴油副产物甘油和脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的途径。
图2为本发明构建菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG，E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA及E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta利用葡萄糖积累琥珀酸产量比较。
图3为本发明构建菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta甘油发酵结果。
图4为本发明工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵甘油和癸酸（C10）的结果。
图5为本发明工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵来自植物油脂生产生物柴的油副产物的结果。
图6为本发明工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵来自动物油脂生产生物柴油的副产物的结果。
具体实施方式
一般性说明：
本发明所用大肠杆菌初始菌株E.coli MG1655购自ATCC (美国菌种保藏中心)。所述质粒pKD3、pKD4、pKD46和pCP20质粒购买于ATCC(美国菌种保藏中心)。所述质粒pBluescriptSK-、pUC19、pUC18购买于fermentas公司。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，质粒pCL1920和pTrc99-A购买于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)。大肠杆菌E.coli DH5α购买于北京全式金生物技术有限公司。
实施例1、琥珀酸发酵途径的构建(敲除fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta)初始菌种：大肠杆菌E.coli MG1655。
所述LB培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。
所述卡那霉素抗性平板为含有50mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。
所述氯霉素平板为含有30mg/L的氯霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。
所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl2 0.203g，MgSO4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
(1)同源重组片断的克隆
利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genebank公布的fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta基因序列设计引物：
pKD-fadR primer 1:
5′-GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-fadR-primer2:
5′-ACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-atoC primer 1:
5′-GCTTATTTTACCGATCAACCCGCAGGGAAATCAGACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-atoC primer2:
5′-TTGCGCACTGTGCAAATTTCTGCATAGCAAGTTTTGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-ptsG primer 1:
5′-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-ptsG primer2:
5′-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-sdhA primer1:
5′-TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-sdhA primer2:
5′-ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-pta primer 1:
5′-GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-pta primer2:
5′-TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
fadR和sdhA引物以pKD4为模板，ptsG、atoC和pta引物以pKD3为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断和氯霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
10×缓冲液 5μl；
25mmol/LMgCl2 4μl；
10mmol/L四种dNTP混合液1μl；
上下游引物各1μl；
TaqDNA聚合酶0.5μl；
模板DNA1μl，加水补至50μl；
PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。
(2)电转化感受态细胞的制备
(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655，转入LB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，培养OD600至0.5；
(Ⅱ)冰浴15分钟，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；
(Ⅲ)加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。
(3)电转化，筛选重组子
(Ⅰ)吸取7～10μg/l的同源重组片断，加入100μl的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；
(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150转/分钟，培养1h；
(Ⅲ)(fadR、sdhA敲除）涂布卡那霉素抗性平板，（ptsG和pta敲除）涂布氯霉素抗性平板，调取重组子。
分别利用
pKD-fadR-test1:5′-ACGGTCAGGCAGGAGTGAG-3′
pKD-fadR-test2:5′-AGCATCGAGTTGCTGGAACG-3′
检测fadR基因的敲除；
利用
pKD-atoC test1:5′-ATCAGGGTGATATTCGCGTCG-3′
pKD-atoC tes2:5′-AACTAATTGAATATGAAGGGA-3′
检测atoC基因的敲除；
pKD-ptsG test1:5′-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3′
pKD-ptsG test2:5′-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3′
检测ptsG基因的敲除；
利用
pKD-sdhA test1:5′-GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3′
pKD-sdhA test2:5′-GAGCATCATCAACATCCGGG-3′
检测sdhA基因的敲除；
利用
pKD-pta test 1:5′-TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3′
pKD-pta test 2:5′-ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3′
检测pta基因的敲除。
(Ⅳ)PLP位点专一重组
将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。
(Ⅴ)在敲除fadR基因后获得菌株E.coli MG1655ΔfadR,继续敲除atoC基因获得菌株E.coliMG1655ΔfadRΔatoC,继续敲除ptsG基因，从而获得E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG，继续敲除sdhA基因，从而获得E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA菌株；在E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA菌株中继续敲除pta基因，最终获得工程菌株E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta。
实施例2、大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG，E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA及E.coli MG1655MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株发酵葡萄糖生产琥珀酸产量的比较菌种：大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG、E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA及E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta。
发酵培养基：葡萄糖18.5g/L,(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,酵母粉3g/L,氨苄青霉素100mg/L。
(1)发酵过程
用接种环分别调取平板上的E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG、E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA及E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株，然后分别接入装有10ml的发酵培养基的50ml的三角瓶中，于250转/分钟的摇床上培养12h，培养温度设为37℃，然后以体积比计，分别按照1%的接种量接入装有50ml的发酵培养基的300ml的三角瓶中，培养温度设为37℃，以转速为250转/分钟进行发酵。每间隔4h取样，发酵时间为72h。
(2)琥珀酸的检测
将所取发酵液样品在12，000转/分钟，离心2分钟。取上清液，用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRad Labs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
（3）发酵结果：通过检测显示（发酵结果见附图2），E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsG积累少量的琥珀酸0.37g/L的同时积累乙酸5.05g/L；在敲除了sdhA基因后，菌株E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhA琥珀酸产量提高了6倍多，为2.43g/L，乙酸产量仍然较高，为5.91g/L；在敲除pta基因后，E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株琥珀酸产量达到了4.94g/L，而乙酸产量降至为1.56g/L。
通过上述发酵结果可以看出，大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta分泌乙酸大大降低，而琥珀酸产量得到了很大提高。
实施例3、E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株发酵甘油检测菌种：E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株
发酵培养基配方为：甘油20g/L,(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L,氨苄青霉素100mg/L
(1)发酵过程
用接种环调取平板上的大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株，接入装有10ml的发酵培养基的50ml的三角瓶中，于250转/分钟的摇床上培养12h，培养温度设为37℃，然后以体积比计，按照1%的接种量接入装有50ml的发酵培养基的300ml的三角瓶中，培养温度设为37℃，以转速为250转/分钟进行发酵。每间隔4h取样，发酵时间为72h。
(2)琥珀酸的检测
将所取发酵液样品在12，000转/分钟，离心2分钟。取上清液，用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRad Labs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
(3)发酵结果：如附图3所示，大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta菌株有效利用甘油发酵琥珀酸，琥珀酸产量达到了7.44g/L,琥珀酸/甘油转化率达到了0.37g琥珀酸/g甘油。而乙酸仅仅为1.1g/L。
实施例4、phaC1基因表达质粒pUC-phaC1的构建
培养基LB:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC1来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
载体优选质粒pUC19。
氨苄霉素抗性平板：含有1.5%的琼脂和100mg/L的氨苄霉青霉素的LB培养基。
(1)phaC1基因的克隆
(I)将铜绿假单胞菌接种于LB培养基中，30℃培养12h,然后室温下12，000转/分钟，离心2分钟收集菌体。然后利用利用通用细菌基因组提取试剂盒提取铜绿假单胞菌基因组（基因组提取试剂盒购于天根公司）。
(II)根据Genbank公布的铜绿假单胞菌的基因组序列，设计引物：
phaC1 primer 1:
5′-CCCAAGCTTAAAGGAGGAAAATCATGAGTCAGAAGAACAATAACGAGC-3′
phaC1 primer 2:
5′-AATCTCGAGTCATCGTTCATGCACGTAGGTTCCG-3′
下划线标出为内切酶酶切位点：AAGCTT：HindIII内切酶；CTCGAG：PstI内切酶
(III)克隆聚羟基脂肪酸酯合成酶基因
以铜铝假单胞菌基因组为模板，PCR扩增phaC1基因。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
10×缓冲液 5μl；
25mmol/LMgCl2 4μl；
10mmol/L四种dNTP混合液1μl；
上下游引物各1μl；
TaqDNA聚合酶0.5μl；
模板DNA1μl，加水补至50μl；
PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸2.0分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(IV)聚羟基脂肪酸酯合成酶表达载体的构建
将pUC19和PCR产物通过HindIII和XhoI双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，反应为16℃，16h。从而获得聚羟基脂肪酸酯合成酶表达载体pUC-phaC1。
(2)大肠杆菌感受态的制备；
(Ⅰ)调取LB平板中的大肠杆菌E.coli DH5α，培养过夜；
(Ⅱ)将培养过夜的大肠杆菌E.coli DH5α以体积比计，按照1%的接种量转入装有50ml LB的300ml的三角瓶中培养，OD600至0.4左右，停止培养，置冰上20分钟，4℃，4000g，离心10分钟。弃上清，加入冰冷的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓缩。获得感受态细胞。放于-70℃保存。
(3)聚羟基脂肪酸酯表达载体的转化
(Ⅰ)将8μg/l的聚羟基脂肪酸酯表达载体pUC-phaC1转入100μl的感受态细胞中，混匀；
(Ⅱ)置冰上30分钟；
(Ⅲ)42℃热激，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1h。
(Ⅳ)涂布氨苄霉素抗性平板，培养过夜，调取验证，筛选克隆正确的转化子E.coli DH5α/pUC-phaC1。
实施例5、联产发酵琥珀酸与聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1的构建
(1)大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta感受态细胞的制备
(Ⅰ)将大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta在LB培养基中培养过夜；
(Ⅱ)将培养过夜的大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta以体积比计，按照1%的接种量转入装有50ml LB的300ml的三角瓶中培养，OD600至0.4左右，停止培养，置冰上20分钟，4℃，4000g，离心10分钟。弃上清，加入冰冷的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓缩。获得感受态细胞。放于-70℃保存。
(2)聚羟基脂肪酸酯表达载体pUC-phaC1的转化
(Ⅰ)将8μg/l的聚羟基脂肪酸酯表达载体pUC-phbC1转入100μl的E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta感受态细胞中，混匀；
(Ⅱ)置冰上30分钟；
(Ⅲ)42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1h。
(Ⅳ)涂布氨苄霉素和卡那霉素双抗性平板（所述氨苄霉素抗性平板含有质量百分比为1.5%的琼脂，100mg/L的氨苄霉青霉素及50mg/L的卡那霉素），培养过夜，调取验证，筛选转化成功的转化子E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。
(Ⅴ)获得重组菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。
实施例6、重组工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵甘油与癸酸
菌种：重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。
发酵培养基配方：甘油48g/L,癸酸3g/L,(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L,氨苄青霉素100mg/L。
(1)发酵培养
用接种环调取平板上的菌种接入装有50ml的发酵培养基的300ml的三角瓶中，于250转/分钟的摇床上培养12h，培养温度设为37℃，然后以体积比计，按照1%的接种量接入装有200ml的培养基的1000ml的三角瓶中,培养过夜；再以体积比计，按照5%的接种量转入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中培养。培养温度设为37℃，溶氧控制在50%以上，利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCl控制pH在6.5-7.5。培养至12h，加入IPTG至终浓度为0.4mM。发酵96h，每间隔4h取样。
(2)琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的检测
(Ⅰ)琥珀酸的检测：将所取发酵液样品在12，000转/分钟，离心2分钟。取上清，用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRadLabs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
(Ⅱ)聚羟基脂肪酸酯的检测：
收集细胞:将所取的发酵液样品在12，000转/分钟的转速下离心2分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干重。
样品检测：将上述制得的5mg干菌体，加入850μl的甲醇，150μl的98%硫酸和1mL的氯仿。沸水浴中加热60分钟，然后利用1毫升的双蒸水，剧烈混匀后，静置分层，然后吸取下层溶液于管中，经微孔滤膜过滤后，利用气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯。
检测结果：通过图4可以看出，本发明方法构建的重组大肠杆菌E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phbC1以甘油和癸酸为底物，能有效积累琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。在积累21g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的5.62%。
实施例7、重组工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵来自植物油脂的生物柴油副产物
菌种：重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。所述发酵基本培养基：生物柴油副产物（约含20g/L的甘油和5g/L的棕榈酸），(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L，氨苄青霉素100mg/L。
(1)发酵培养
用接种环调取平板上的菌种接入装有50ml的发酵培养基的300ml的三角瓶中，于250转/分钟的摇床上培养12h，培养温度设为37℃，然后以体积比计，按照1%的接种量接入装有200ml的培养基的1000ml的三角瓶中,培养过夜，再以体积比计，按照5%的接种量转入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中培养。培养温度设为37℃，溶氧控制在50%以上，利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCl控制pH在6.5-7.5。培养至12h，加入IPTG至终浓度为0.4mM。发酵96h，每间隔4h取样。
(2)琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的检测
(Ⅰ)琥珀酸的检测：将所取发酵液样品在12，000转/分钟，离心2分钟。取上清，用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRadLabs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
(Ⅱ)聚羟基脂肪酸酯的检测：
收集细胞:将所取的发酵液样品在12，000转/分钟的转速下离心2分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干重。
样品检测：将上述制得的5mg干菌体，加入850μl的甲醇，150μl的98%硫酸和1mL的氯仿。沸水浴中加热60分钟，然后利用1mL的双蒸水，剧烈混匀后，静置分层，然后吸取下层溶液于管中，经微孔滤膜过滤后，利用气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯。
检测结果：通过图5可以看出，本发明方法中的重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phbC1能有效利用来自植物油脂的生物柴油副产物，有效积累琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。在积累25.3g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的4.13%。
实施例8、重组工程菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1发酵来自动物油脂的生物柴油副产物
菌种：重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1。所述发酵基本培养基：生物柴油副产物（约含20g/L的甘油和4g/L的硬脂酸），(NH4)2HPO4 3g/L,(NH4)H2PO4 1g/L,KCl 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,酵母粉3g/L，氨苄青霉素100mg/L。
(1)发酵培养
用接种环调取平板上的菌种接入装有50ml的发酵培养基的300ml的三角瓶中，于250转/分钟的摇床上培养12h，培养温度设为37℃，然后以体积比计，按照1%的接种量接入装有200ml的培养基的1000ml的三角瓶中,培养过夜，再以体积比计，按照5%的接种量转入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中培养。培养温度设为37℃，溶氧控制在50%以上，利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCl控制pH在6.5-7.5。培养至12h，加入IPTG至终浓度为0.4mM。发酵96h，每间隔4h取样。
(2)琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的检测
(Ⅰ)琥珀酸的检测：将所取发酵液样品在12，000转/分钟，离心2分钟。取上清，用0.2μm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为：检测柱：HPX-87H,BioRadLabs；流动相：5mM H2SO4溶液；检测器：示差检测器。
(Ⅱ)聚羟基脂肪酸酯的检测：
收集细胞:将所取的发酵液样品在12，000转/分钟的转速下离心2分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干重。
样品检测：将上述制得的5mg干菌体，加入850μl的甲醇，150μl的98%硫酸和1ml的氯仿。沸水浴中加热60分钟，然后利用1ml的双蒸水，剧烈混匀后，静置分层，然后吸取下层溶液于管中，经微孔滤膜过滤后，利用气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯。
（III）发酵结果：
通过图6的检测结果可以看出，本发明的重组大肠杆菌E.coliMG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaC1能有效利用来自动物油脂的生物柴油副产物，有效积累琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯。在积累26.1g/L的琥珀酸的同时，聚羟基脂肪酸酯积累达到了细胞干重的3.42%。
Claims (2)
1.利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法，步骤包括：
(1)构建好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌；
(2)在构建的好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径，获得可
同时生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；
(3)利用构建的重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物甘油和脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯；
其特征是：
步骤(1)所述构建好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌的方法是：通过Red重组方法在大肠杆菌E.coli MG1655中敲除基因fadR、atoC、ptsG、sdhA以及pta，构建好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta；
步骤(2)所述在构建的好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径的方法是：将来源于铜绿假单胞菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC1克隆至质粒pUC19中获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒pUC-phaC1，并转化好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌菌株E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta中，在好氧发酵琥珀酸的大肠杆菌中构建聚羟基脂肪酸酯发酵途径，获得联产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p-phaC1；
步骤(3)所述利用构建的重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物甘油和脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的发酵条件是：摇瓶：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐：温度设为30～40℃，溶氧控制在50%以上，pH 6.5～7.5，发酵时间72h～150h。
2.根据权利要求1所述利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：所述敲除基因fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta所用的引物分别为：
pKD-fadR primer1:
5′-GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-fadR-primer2:
5′-ACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-atoC primer1:
5′-GCTTATTTTACCGATCAACCCGCAGGGAAATCAGACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-atoC primer2:
5′-TTGCGCACTGTGCAAATTTCTGCATAGCAAGTTTTGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-ptsG primer1:
5′-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-ptsG primer2:
5′-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-sdhA primer 1:
5′-TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-sdhA primer2:
5′-ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
pKD-pta primer1:
5′-GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
pKD-pta primer2:
5′-TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′。
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| CN103571787A (zh) * | 2013-10-12 | 2014-02-12 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用 |
| CN103571787B (zh) * | 2013-10-12 | 2015-07-01 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102154387A (zh) | 2011-08-17 |
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