CN103642745A

CN103642745A - 一种以蔗糖为原料生物转化生产甘露醇的方法

Info

Publication number: CN103642745A
Application number: CN201310643082.7A
Authority: CN
Inventors: 李玉; 路福平; 陈艳; 王正祥; 田康明
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-12-02
Also published as: CN103642745B

Abstract

本发明公开了一种表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶的重组菌株pET28a-sacA-mdh/BL21及其利用该菌株进行发酵生产甘露醇的方法。该方法包括：（1）在含蔗糖的发酵培养基中对该菌株进行发酵条件优化；（2）利用不同浓度的蔗糖进行批式发酵，考察该菌株产甘露醇的生产水平及对蔗糖的转化率，确定了最适的底物浓度;（3）利用不同方式进行补料发酵生产甘露醇，可提高生产效率和甘露醇的产量。该方法不仅没有副产物山梨醇产生，而且生产成本低，周期短，原料来源广泛，工艺简单，为甘露醇的工业化制备提供了新的方法。

Description

一种以蔗糖为原料生物转化生产甘露醇的方法

技术领域

本发明涉及一种表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶的重组菌株pET28a-sacA-mdh/BL21及其利用该菌株发酵生产甘露醇的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘露醇（Mannitol）学名己六醇、木蜜醇，是一种六元糖醇，为山梨醇的同分异构体。分子式为C₆H₁₄O₆，分子量为182.17。甘露醇为无色、白色针状或柱状结晶性粉末，无臭，具有清凉甜味。熔点166℃，密度1.489g/cm³（20℃），易溶于水，溶于吡啶、苯胺和热的乙醇，几乎不溶于大多数常见的有机溶剂。与其他多元醇不同，甘露醇是唯一的具有不吸湿性的晶体。

甘露醇被广泛应用于食品、医药、轻工和化工等领域。甘露醇的生产方法主要有天然提取法和化学催化法。自然界中还发现很多微生物菌株可以合成甘露醇，已报道的微生物类型有霉菌、酵母菌和细菌，具有甘露醇产率高且不产生山梨醇。对发酵法生产甘露醇的研究较多，从目前的研究来看，乳酸菌是最具有潜力的甘露醇生产菌，它能发酵产生高含量的甘露醇，尤其是异型乳酸菌的甘露醇脱氢酶更易于转化果糖生成甘露醇，但果糖作为底物相对昂贵，蔗糖相对便宜，能够利用蔗糖产生甘露醇，更具有生产前景。

蔗糖水解酶[EC3.2.1.26(Sucrase)]能可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，由于果糖的甜度高，约为蔗糖甜度的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，因此人们对蔗糖水解酶的研究越来越多。甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase）是异型发酵乳酸细菌中合成甘露醇的唯一酶，一种依赖于NADH（EC1.1.1.67），另一种依赖于NADH（EC1.1.1.138），催化果糖与甘露醇的相互转化。在发酵中，蔗糖在蔗糖水解酶作用下生成等量的葡萄糖和果糖，葡萄糖用于能量代谢，而果糖可以在代谢中更多的转化为甘露醇，从而提高了甘露醇的转化率。且利用大肠杆菌发酵生产甘露醇，具有发酵周期短、稳定性高等优点。

2010年，金红星等人以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇，但是甘露醇产量仅有7.31g/L。Korakli,Niklas von Weymarn等人分离或筛选出可高产甘露醇的乳酸菌，采用的碳源多为果糖-葡萄糖混合物或糖蜜-果糖浆混合液，产量较高，但均含有果糖的参与，且发酵周期较长，导致生产成本较高，不利于工业化生产。2009年，王芳等人将甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中克隆及表达，以果糖为底物，果糖既用于能量代谢又用于甘露醇的转化，转化率为26.67%，转化率较低。最近，Badal C.Saha等通过实验，开发出一种成本更低的培养基用于培养Lactobacillus intermedius NRRLB-3693生产甘露醇，以糖蜜和果葡糖浆混合液为碳源发酵生产甘露醇。因此，寻找廉价的底物进行生物转化生产甘露醇，是当今面临的主要问题。蔗糖是质优价廉的原料，分解后主要产生果糖基，对于那些经由果糖转化得到目的产物的生产工艺来说是优选的底物。因此，有效利用蔗糖中的聚合果糖和大肠杆菌的细胞工厂生物转化生产甘露醇，无疑是比较可行的路线之一。

发明内容

本发明的目的是提供一株利用蔗糖生长并产甘露醇的重组菌菌株。构建得到的菌株发酵方法可行，易于控制，能将蔗糖中的聚合果糖有效地转化为甘露醇。并且利用该重组菌株进行发酵，甘露醇产量和产率高，缩短了发酵周期。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述大肠杆菌重组菌株生产甘露醇的方法。

利用本发明所述的大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21发酵生产甘露醇的方法，具体步骤为：

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按1%-2%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD₆₀₀达到0.5-0.8时，添加诱导剂IPTG0.05-0.2mmol/L后至少一次添加底物蔗糖，于22-25℃发酵培养8-12h，底物蔗糖的总量控制在110-180g/L。

优选的按照如下几种方法进行发酵培养：

先加入70-80g/L的底物蔗糖，22-25℃诱导培养5h后再添加35-45g/L蔗糖，培养5h。

先加入35-45g/L的底物蔗糖22-25℃诱导培养3h后再添加35-45g/L的蔗糖，培养4h后补加35-45%的蔗糖，继续培养3h。

发酵过程中控制pH=5.5-7.0，转速200r/min。

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按1.5%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD₆₀₀达到0.7时，添加诱导剂IPTG0.1mmol/L和不同方式添加底物蔗糖，蔗糖总浓度均为120g/L。培养温度23℃，pH=6.0，转速200r/min。高效液相测定结果。

发酵结束时甘露醇的含量达到45.19g/L，转化率为37.66%。

大肠杆菌重组菌pET28a-sacA-mdh/BL21，由以下方法制得，将来源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的蔗糖水解酶基因（sacA）全序列和布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri中甘露醇脱氢酶基因（mdh）全序列酶切片段连接到载体pET28a（+）上生成共表达质粒pET28a-sacA-mdh，转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，将重组质粒pET28a-sacA-mdh转化入表达宿主菌E.coli BL21中获得。

有益效果：

1）传统的甘露醇生产方法，依赖于以葡萄糖出发的化学催化，或以果糖出发的生物转化。随着对产物纯度和工业流程洁净无污染要求的提高，生物转化法生产甘露醇逐渐显现出优势。然而，对工业化应用来说，廉价的初级物质原料是降低发酵成本的有效途径之一。在微生物生产甘露醇过程中，用葡萄糖作为辅助因子的能源，加入的果糖被严格的转化成甘露醇，因此，果糖成为乳酸菌发酵生产甘露醇的必需品，但是果糖价格较贵，而蔗糖相对便宜，蔗糖替代果糖进行发酵生产，无需添加其他碳源，其转化的果糖可被大肠杆菌重组菌株直接利用，通过其甘露醇脱氢酶转化为甘露醇。因此，以蔗糖为底物生产甘露醇更有经济效益，大大降低了生物转化法生产甘露醇的成本，有望实现工业化生产。

以往的发酵法生产过程中，大家更多的集中在研究利用乳酸菌来发酵生产甘露醇，很少认为大肠杆菌也可生产甘露醇，更鲜有人想到采用蔗糖为底物生产甘露醇，本发明突破了常规思路，采用以往很少用到的大肠杆菌利用蔗糖为底物生产甘露醇，且转化率和产量有较大提高。

2）该方法不仅没有副产物山梨醇产生，而且生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟。此外，乳酸菌所用的培养基成分较复杂，成本较贵，而大肠杆菌所用的培养基成分简单、便宜易得，适合于工业化生产。利用乳酸菌发酵生产甘露醇发酵周期需要60小时，而大肠杆菌发酵周期仅为12小时，大大地缩短了发酵周期。乳酸菌高密度培养过程中产生大量的乙酸和乳酸副产物，酸的产生明显减缓菌体的生长速度，而采用本发明构建的大肠杆菌容易实现细胞的高密度培养。

因此，利用大肠杆菌作为蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶表达的生物反应器为工业化大规模、低成本发酵生产甘露醇奠定了基础。

附图说明：

图1大肠杆菌重组菌株利用不同浓度蔗糖转化生产甘露醇的产量及残糖量（总糖浓度范围为30-180g/L）

图2大肠杆菌重组菌株利用不同浓度蔗糖转化生产甘露醇相对总糖的转化率

图3不同补料方式发酵生产甘露醇的产量及残糖量（总糖浓度约为120g/L）

图4不同补料方式发酵生产甘露醇相对总糖的转化率

图5原核表达载体pET28a-sacA-mdh的构建示意图

具体实施方式

以下结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。应指出，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1重组大肠杆菌诱导表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中， 37℃培养过夜，然后按1%-2%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD600达到0.5-0.8时，添加诱导剂IPTG（0.05-0.2mmol/L），诱导时间为6-10h。

实施例2

粗酶液的制备：取诱导表达后的菌液于6000r/min，4℃离心10min，弃上清。沉淀用乙酸钠缓冲液（pH5.3）洗涤两次，洗涤后的沉淀重悬于裂解缓冲液中，于冰上55Hz超声破碎，超声时间3s，间隔4s；共超声30min。经超声处理后的菌液于6000r/min，4℃离心10min。取上清液即为粗酶液，测定蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活。

蔗糖水解酶酶活测定方法：以蔗糖为底物，酶反应总体积为3.0mL，其中包含2.7mL，pH值5.0，0.2mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，270μL5%蔗糖，30μL粗酶液。在42℃恒温水浴中保温30min，然后用DNS法测定形成的还原糖量，蔗糖水解酶酶活可达25.78U/mL。

甘露醇脱氢酶酶活测定方法：取两只配对的比色皿，一只加入3.0mL乙酸钠缓冲液作为空白对照，另一只比色皿中依次加入2625μL乙酸钠缓冲液、45μLβ-NADH和300μL果糖，混合均匀，30℃放置2min，检测原始NADH吸光值，待读数稳定后，马上加入30μL酶液，从加入酶液开始计时，每30s测定一次吸光值，反应结束后得到⊿A_340nm/min值，根据公式计算酶活力。酶活的定义为：在30℃、pH5.3时，每分钟将1.0μmol果糖转化成甘露醇所用的酶量为1个酶活力单位。经测定甘露醇脱氢酶酶活可达14.56U/mL。

实施例3重组大肠杆菌以蔗糖为底物批式发酵生产甘露醇

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按2%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD₆₀₀达到0.8时，添加诱导剂IPTG0.2mmol/L和不同浓度30-120g/L的底物蔗糖，培养温度23℃，pH=6，转速200r/min，发酵时间为10h。取诱导表达后的菌液于6000r/min，4℃离心10min，取上清液，用高效液相色谱法（HPLC）测定甘露醇的产量及糖的残余量。

高效液相色谱分析条件：色谱柱为TSK-GEL Amide-80，柱温维持在80℃，流动相为乙腈：水=90：10，以1mL/min的流速进行洗脱。使用示差折光检测器进行分析，通过对比保留时间进行定性和定量分析。

高效液相测定后，重组菌株发酵后，综合甘露醇产量及转化率考虑，选择蔗糖浓度为120g/L时最佳，甘露醇含量为42.66g/L，转化率为35.55%。

实施例4重组大肠杆菌以蔗糖为底物补料发酵生产甘露醇

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按1.5%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD₆₀₀达到0.7时，添加诱导剂IPTG（0.1mmol/L）和不同方式添加底物蔗糖，蔗糖总浓度均为120g/L。培养温度37℃，pH=6.0，转速200r/min。方法A：加入120g/L的底物蔗糖和诱导剂IPTG，23℃发酵培养10h，取样检测；方法B：先加入80g/L的底物蔗糖和诱导剂IPTG，23℃诱导培养5h后再添加40g/L的蔗糖，培养5h，取样检测。方法C：先加入60g/L的底物蔗糖和诱导剂IPTG，25℃诱导培养5h后再添加60g/L的蔗糖，培养5h，取样检测。方法D：先加入40g/L的底物蔗糖和IPTG，20℃诱导培养3h后再添加40g/L的蔗糖，培养4h后补加40g/L的蔗糖，继续培养3h，取样检测。高效液相测定结果如下表1：

表1不同补料方式对甘露醇产量的影响

补料方式	A	B	C	D
					甘露醇产量（g/L）	40.17	41.26	42.25	45.19
蔗糖残余量（g/L）	58.31	53.60	52.42	50.30
					相对蔗糖的转化率（%）	33.48	34.38	35.21	37.66

由表1可以看出，分三次补加蔗糖，菌体生长最旺盛和甘露醇产量最高，说明菌体的生长与甘露醇的合成呈现正相关性，若能延长对数生长期，可以提高菌体量和甘露醇产量。因此，维持发酵过程中较低的蔗糖浓度有利于甘露醇的合成，控制蔗糖浓度在40g/L左右时，产量可达45.19g/L，转化率为37.66%。

综上所述，本发明所构建的大肠杆菌重组菌pET28a-sacA-mdh/BL21能够实现以蔗糖为底物，生物转化生产甘露醇，从而为甘露醇生产的工业化奠定了基础。

大肠杆菌重组菌pET28a-sacA-mdh/BL21，由以下方法制得，将蔗糖水解酶基因（sacA）全序列和Lactobacillus buchneri中甘露醇脱氢酶基因（mdh）全序列酶切片段连接到载体pET28a（+）上生成共表达质粒pET28a-sacA-mdh，转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，将重组质粒pET28a-sacA-mdh转化入表达宿主菌E.coli BL21中获得。

本发明菌株的构建方法如下：

1.PCR扩增根据GenBank报道的Lactobacillus plantarum中蔗糖水解酶基因（sacA）全序列和Lactobacillus buchneri中甘露醇脱氢酶基因（mdh）全序列进行引物设计，引物设计见表2。

表2PCR反应引物

引物	基因	序列	限制性内切酶	长度
					P1	sacA	CGCGGATCCGCATGATATGGAATCGTAAAACC	BamH Ⅰ	32
P2	sacA	CGAGCTCTCATTTAATTTTGGTTTCATTG	Sac Ⅰ	29

[0049]

P3mdh	CGAGCTCATGGAAGCACTTGTATTTACTGG	Sac Ⅰ	30
				P4mdh	CCCAAGCTTCTATTCACCTACTTTAACAACTGCC	HindⅢ	34

2.原核表达载体pET28a-sacA-mdh的构建

将酶切片段连接到载体pET28a（+）上生成共表达质粒pET28a-sacA-mdh，转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中

3.目的蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

将重组质粒pET28a-sacA-mdh转化入表达宿主菌E.coli BL21中，挑取单菌落接种到5mL LB培养基中(含有50μg/mL Kan)，37℃、200r/min振荡培养过夜，按2%接种量转接于装有100mL培养基的250mL三角瓶中继续培养至OD600达0.6-1.0，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，20℃诱导振荡培养6h后，离心收集菌体沉淀，悬浮于乙酸钠缓冲液（pH5.3）中超声处理破碎细胞。破碎后悬浮液6000r/min离心10min，收集上清液，经SDS-PAGE分析结果。pET28a-sacA-mdh/BL21菌株在55.1kDa和37.8kDa附近出现两条明显的特异蛋白带，蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活达到25.78U/mL和14.56U/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种以蔗糖为原料生物转化生产甘露醇的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatccg catgatatgg aatcgtaaaa cc 32

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagctctca tttaattttg gtttcattg 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgagctcatg gaagcacttg tatttactgg 30

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttc tattcaccta ctttaacaac tgcc 34

Claims

1.一株表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶的重组大肠杆菌，该菌株可表达来源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的蔗糖水解酶基因sacA和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的甘露醇脱氢酶基因mdh。

2.根据权利要求1所述表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶的重组大肠杆菌，由以下方法制得，将Lactobacillus plantarum中蔗糖水解酶基因和Lactobacillus buchneri中甘露醇脱氢酶基因序列酶切片段连接到载体pET28a上生成共表达质粒pET28a-sacA-mdh，转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，将重组质粒pET28a-sacA-mdh转化入表达宿主菌E.coli BL21中获得。

3.一种利用权利要求1所述的重组大肠杆菌以蔗糖为底物发酵生产甘露醇的方法，步骤为：重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL2137℃培养，OD600达到0.5-0.8时，添加诱导剂IPTG（0.05-0.2mmol/L）后至少一次添加底物蔗糖，于22-25℃发酵培养8-12h，底物蔗糖的总量控制在110-180g/L。

4.根据权利要求3所述重组大肠杆菌以蔗糖为底物发酵生产甘露醇的方法，其特征在于，先加入70-80g/L的底物蔗糖，22-25℃诱导培养5h后再添加35-45g/L蔗糖，培养5h。

5.根据权利要求3所述重组大肠杆菌以蔗糖为底物发酵生产甘露醇的方法，其特征在于，先加入35-45g/L的底物蔗糖22-25℃诱导培养3h，后再添加35-45g/L的蔗糖，培养4h后补加35-45g/L的蔗糖，继续培养3h。

6.根据权利要求3-5任一所述重组大肠杆菌以蔗糖为底物发酵生产甘露醇的方法，其特征在于，添加诱导剂IPTG0.05-0.2mmol/L。

7.根据权利要求3所述重组大肠杆菌以蔗糖为底物发酵生产甘露醇的方法，其特征在于，发酵过程中控制pH=5.5-7.0，转速200r/min。