CN106497988B - 一种布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法 - Google Patents

一种布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种通过生物转化制备甘露醇的方法，尤其是通过布氏乳杆菌发酵‑转化‑分离三者偶联制备甘露醇的新方法。本发明针对所用菌种，优化底物中果糖葡萄糖的比例，使得发酵‑转化‑分离偶联制备甘露醇时，能够实现果糖葡萄糖的同比例消耗，从而保证连续操作时葡萄糖和果糖含量保持在极低的水平，转化产物中主要含有甘露醇、乳酸和乙酸，只需经脱酸树脂吸附乳酸和乙酸，即可以实现甘露醇和乳酸的高效快速分离，因此分离步骤变得简单易用实现，同时成本相对也大大降低。

Description

一种布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种通过生物转化制备甘露醇的方法，尤其是通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离三者偶联制备甘露醇的新方法。
背景技术：
甘露醇(mannitol)，又称D-甘露糖醇，在自然界生物体内广泛存在，具有多种功能，被广泛用于食品、医药、轻工和化工等领域。由于甘露醇在人体内代谢与体内胰岛素无关，可以作为低热值食品和低糖食品的甜味剂，适用于糖尿病患者、肝功能障者。甘露醇的主要生产工艺有天然提取法和化学催化法，目前我国主要采用海带提取法生产甘露醇，但其生产流程长，提取率低，纯化成本较高，加上受限于海带资源，价格上涨，产品缺乏市场竞争力。与天然提取法相比，化学催化加氢法，具有无热源、澄清度高、好过滤等优点，产品市场竞争能力强，但该方法催化氢化的条件要求较高，并产生大量副产物山梨醇，转化率较低，且山梨醇与甘露醇分离相对困难，依赖精细的分离装置，分离成本较高。另外，该方法生产甘露醇的经济效益还容易受到山梨醇市场需求的影响。
目前微生物发酵制备甘露醇的方法，多见诸研究报道，因为技术成熟度不足和成本较高的问题尚无产业化应用。许多微生物被发现可以合成甘露醇，其中异性发酵的乳酸菌是重点研究的对象。目前的研究集中在菌种的筛选和改造方面，发酵转化方法主要采用菌体发酵和底物转化一体同时进行的方式，且分批操作。该方法具有诸多缺陷：首先，培养基和多种产物混合，杂质较多，造成分离困难和成本较高；其次，菌体细胞只利用一次，造成菌体培养成本较高。也有少部分研究采用菌体发酵和底物转化分开进行的方法，减少了由培养基带来的杂质的种类和含量，有利于后续分离，但是所采用的分批转化方式，没有实现甘露醇的连续制备，且产物中由于含有甘露醇、葡萄糖、果糖、乳酸和乙酸五种以上成分，故仍然需要精细的多组分色谱分离单元，成本较高。
针对以上问题，本发明在前期授权发明(ZL201310111633.5)筛选获得的布氏乳杆菌菌株的基础上，开发了发酵-转化-分离三者偶联制备甘露醇的方法，该法首先采纳了菌体发酵和底物转化分开进行的方式；其次创新性地将发酵、转化和分离三者偶联在一起，既可以实现分批操作，又可以实现连续操作，保证了菌种细胞的连续多次使用，提高了转化效率，降低了转化成本；第三，创新性地提出一种策略：针对所用菌种，优化底物中果糖葡萄糖的比例，使得发酵-转化-分离偶联制备甘露醇时，能够实现果糖葡萄糖的同比例消耗，从而保证连续操作时葡萄糖和果糖含量保持在极低的水平，进而可以大大降低下底物中的葡萄糖和果糖同步耗尽，转化产物中主要含有甘露醇、乳酸和乙酸，只需经脱酸树脂吸附乳酸和乙酸，即可以实现甘露醇和乳酸的高效快速分离，因此分离步骤变得简单易用实现，同时成本相对也大大降低。
市场上的甘露醇产品大多是通过结晶法纯化获得，不是经喷雾干燥获得，而喷雾干燥级的甘露醇，相比非喷干产品，具有良好的流动性以及可压缩性，可应用于直压压片、口崩片、分散片等领域。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的新方法，以提高果糖转化率和甘露醇的生产率，同时简化分离纯化工艺，降低生产成本。
为了实现上述目的，本发明首先提供一种发酵-转化-分离偶联装置，所述装置包括发酵装置、微滤膜组件、脱酸层析柱和产物收集罐；所述发酵装置包括发酵罐、培养基补料容器和底物补料容器；所述培养基补料容器和底物补料容器分别通过恒流泵与发酵罐相连接；所述发酵罐、微滤膜组件和脱酸层析柱依次通过恒流泵连接；所述脱酸层析柱和产物收集罐通过管道连接。
本发明还提供一种采用上述装置以布氏乳杆菌发酵生产甘露醇的方法：
(1)测定转化菌种对葡萄糖和果糖的同步消耗比例；
所述测定的方法为采用基于氨基柱的HPLC方法测定不同转化时间点的葡萄糖和果糖含量；
(2)将种子液按10％-20％的接种量接入5L发酵培养基，在温度37℃，100r/min条件下于发酵罐中培养菌株至最大浓度，启动微滤膜组件收集菌体，浓缩5-6倍后停止微滤；
(3)将3L底物溶液泵至发酵罐中，转化10-12h至甘露醇浓度最大，且果糖和葡糖糖耗尽，然后再次启动微滤过滤发酵液；
所述的底物溶液是在果葡糖浆底物中添加葡萄糖或者果糖，使果糖葡萄糖含量比例达到步骤(1)所述的同步消耗比例；
进一步地所述转化的条件为：温度为30℃，pH为6.2，转速为100r/min。
(4)将微滤流出的含有甘露醇、乳酸和醋酸的滤过液，经过脱酸柱吸附乳酸和醋酸之后，流出的即为较高纯度的甘露醇溶液；
脱酸柱饱和之后，滤过液切换到其他的脱酸柱继续脱酸，而饱和的脱酸柱经过4％NaOH溶液和水冲洗实现再生；
(5)发酵液经微滤浓缩5倍后停止微滤，再将等量的比例调整后的果葡糖浆底物泵至发酵罐中，重复步骤(3)和(4)8-12次实现发酵分离偶联分批制备甘露醇，果糖转化率能达到95％以上，甘露醇的提取收率能达到95％以上；
进一步地，在转化10-12h至甘露醇浓度最大，且果糖和葡糖糖浓度同时耗尽后，再次启动微滤，同时以0.09-0.12/h的稀释率连续补加比例调整后的果葡糖浆底物溶液至发酵罐中，控制膜组件滤过液的流速与果葡糖浆底物溶液流速一致，葡萄糖和果糖实时耗尽，流出的含有甘露醇和乳酸的滤过液，经过脱酸柱吸附乳酸之后，流出的即为较高纯度的甘露醇溶液。脱酸柱饱和之后，滤过液切换到其他的脱酸柱继续脱酸，而饱和的脱酸柱经过4％NaOH溶液和水冲洗实现再生；随着时间的延长，菌体的转化能力下降，连续转化96-120小时后，无法维持0.09/h的稀释率(无法使葡萄糖和果糖实时耗尽)，停止连续转化。
进一步地，所述的生产菌种为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，保藏编号CGMCC 7300；所述葡萄糖和果糖的同步消耗比例为1.2-1.3；
进一步地，所述微滤膜组件为中空纤维滤膜，过滤孔径为0.1-0.4μm；
进一步地，所述脱酸层析柱为离子交换树脂柱，填充树脂为Amberlite FPA阴离子交换树脂；
有益效果：
本发明所述的发酵-转化-分离三者偶联制备甘露醇的新工艺，提高了布氏乳杆菌的转化效率，提高了底物的转化率和产品收率，简化了提取工艺，果糖转化率能达到95％以上，甘露醇的提取收率能达到95％以上；产品质量稳定，生产成本低，该工艺可进一步推广至工业化大规模生产。
附图说明：
图1本发明发酵-转化-分离偶联装置示意图
其中:1-培养基补料容器；2-底物补料容器；3-发酵装置；4-中空纤维滤膜组件(用于过滤菌体，使其回流至发酵罐)；5-离子交换柱；6-甘露醇收集器；箭头为液体流向。
具体实施方式：
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。
实施例1布氏乳杆菌(CGMCC 7300)对葡萄糖果糖同步消耗比例的测定
(1)将斜面培养的布氏乳杆菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 7300)，接入到种子培养基中，37℃，200r/min培养36h，然后以1.5％的接种量转入二级种子培养基，37℃，200r/min培养36h；
(2)将培养好的二级种子培养液按照20％(v/v)的接种量，接种至装有已灭菌的5L发酵培养基的7L发酵罐中，发酵温度37℃，100r/min培养48h；将发酵罐连接中空纤维微滤膜组件，开启循环泵收集菌体，浓缩5倍；
种子及发酵培养基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐温-80 1mL,pH 6.2；
(3)控制总糖浓度为100g/L,配制果糖葡萄糖不同比例的底物溶液，果糖葡萄糖比例分别为1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.5。分别向7L发酵罐中注入不同比例的底物溶液进行转化，控制转化温度为30℃，pH为6.2，转速为100r/min。转化12h，分别在3h、6h、9h和12h取样，测定果糖和葡萄糖的含量，进而计算果糖葡萄糖的同步消耗比例；
(4)HPLC检测方法：
色谱条件：TSK-GEL Amide-80Series色谱柱(4.6mm×100mm，5.0μm)，流动相乙腈：水＝80：20，超声15min脱气；检测器为蒸发光散射检测器；流速1mL/min；柱温为80℃；进样量20μL。
标准曲线测定：精密称取甘露醇、果糖、葡萄糖各1.00mg分别置于1.5mL的EP管中，加去离子水1mL溶解，精确吸取20、40、60、80、100μL的对照品溶液到1.5mL的EP管中，并用去离子水稀释至100μL，然后吸取20μL进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在0.2～1.0mg/mL范围内，甘露醇、果糖、葡萄糖均有良好的线性关系。
取转化液样品1mL于EP管中，12000r/min离心1min，上清液经过0.22μm滤膜处理后，HPLC法检测发酵液中甘露醇、果糖、葡萄糖含量。
(4)同步消耗比例测定结果：HPLC检测发现，当果糖葡萄糖比例为1.2、1.25、1.3时，转化12小时，果糖和葡萄糖剩余量皆为0，转化3h、6h、9h时，果糖葡萄糖虽然有剩余，但是两者不同时间点的消耗比例平均值为1.25±0.52。当底物溶液果糖葡萄糖比例大于1.3时，转化12小时后果糖尚有剩余，而低于1.2时葡萄糖尚有剩余，都无法实现同步消耗。
实施例2一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法
(1)将斜面培养的布氏乳杆菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 7300)，接入到种子培养基中，37℃，200r/min培养36h，然后以1.5％的接种量转入二级种子培养基，37℃，200r/min培养36h；
(2)采用图1所示装置，将培养好的二级种子培养液按照20％(v/v)的接种量，接种至装有已灭菌的5L发酵培养基的7L发酵罐中，发酵温度37℃，100r/min培养48h；将发酵罐连接中空纤维微滤膜组件，开启循环泵收集菌体，浓缩5倍；
种子及发酵培养基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐温-80 1mL,pH 6.2；
(3)通过向F55型果葡糖浆中添加葡萄糖，调整果糖和葡萄糖含量的比例至1.25，向发酵罐中注入3L浓度为100g/L的比例调整后的的F55型果葡糖浆进行转化，控制转化温度为30℃，pH为6.2，转速为100r/min；
(4)转化12h后，测定甘露醇，果糖和葡萄糖的浓度，此时甘露醇浓度达到最大，果糖葡萄糖为0，开启微滤，菌液浓缩5倍后停止，滤出液泵入脱酸层析柱进行脱酸处理，最终获得较高纯度的甘露醇溶液，测得甘露醇浓度达到52g/L，体积产率达到4.33g/L/h，甘露醇相对果糖的转化收率达到96％；
(5)再流加相同果葡糖浆底物，重复上述步骤进行分批转化，重复5批后，甘露醇浓度保持在49g/L以上，甘露醇溶液经真空干燥机浓缩至甘露醇浓度250-300g/L后，直接喷雾干燥获得纯度98％以上的甘露醇粉末。
实施例3一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法
(1)将斜面培养的布氏乳杆菌CGMCC 7300，接入到种子培养基中，37℃，200r/min培养36h，然后以1.5％的接种量转入二级种子培养基，37℃，200r/min培养3h；
(2)采用图1所示装置，将培养好的二级种子培养液按照20％(v/v)的接种量，接种至装有已灭菌的5L发酵培养基的7L发酵罐中，发酵温度37℃，100r/min培养48h。将发酵罐连接中空纤维滤膜组件，开启循环泵收集菌体，浓缩5倍。
种子及发酵培养基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐温-80 1m L；
(3)通过向F55型果葡糖浆中添加葡萄糖，调整果糖和葡萄糖比例至1.25。向发酵罐中注入3L100g/L比例调整后的F55型果葡糖浆进行转化，控制转化温度为30℃，pH为6.2，转速为100r/min，
(4)转化到12h时，测定甘露醇，果糖和葡萄糖的浓度，此时甘露醇浓度达到52g/L，果糖、葡萄糖浓度均为0，再次启动微滤，同时以5mL/min的流量，即0.09/h稀释率连续补加果葡糖浆底物溶液至发酵罐中，控制滤过液的流量与底物补加流量一致。滤过液含有甘露醇、乳酸和乙酸，经过脱酸柱吸附乳酸和乙酸之后，获得的即为较高纯度的甘露醇溶液。连续转化96h，甘露醇的浓度维持在约48g/L以上，甘露醇相对果糖的转化收率在95％以上。甘露醇溶液经真空干燥机浓缩至甘露醇浓度250-300g/L后，直接喷雾干燥获得纯度98％以上的甘露醇粉末。

Claims (6)

1.一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)测定转化菌种对葡萄糖和果糖的同步消耗比例；
(2)将种子液按10％-20％的接种量接入发酵培养基，在温度37℃，100r/min条件下于发酵罐中培养菌株至最大浓度，启动微滤膜组件收集菌体，浓缩5-6倍后停止微滤；
(3)将按果糖和葡萄糖同步消耗比例1.2-1.3配置的果葡糖浆底物泵至发酵罐中转化12h至甘露醇浓度最大，且果糖和葡糖糖耗尽；
(4)通过微滤装置过滤发酵液，滤过液经过脱酸层析柱吸附乳酸和醋酸之后，流出的即为高纯度的甘露醇溶液；
所述方法采用的装置如下：
所述装置包括发酵装置、微滤膜组件、脱酸层析柱和产物收集罐；所述发酵装置包括发酵罐、培养基补料容器和底物补料容器；所述培养基补料容器和底物补料容器分别通过恒流泵与发酵罐相连接；所述发酵罐、微滤膜组件和脱酸层析柱依次通过恒流泵连接；所述脱酸层析柱和产物收集罐通过管道连接；
所述布氏乳杆菌编号CGMCC 7300。
2.如权利要求1所述的一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，通过微滤装置过滤发酵液，发酵液经微滤浓缩5倍后停止微滤，重复步骤(3)和(4)8-12次实现发酵分离偶联分批制备甘露醇。
3.如权利要求1所述的一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，通过微滤装置过滤发酵液，同时以0.09-0.12/h的稀释率连续补加比例调整后的果葡糖浆底物溶液至发酵罐中，控制膜组件滤过液的流速与果葡糖浆底物溶液流速一致，葡萄糖和果糖实时耗尽，连续转化96-120小时后，停止连续转化。
4.如权利要求1-3任意一项所述的一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，所述微滤膜组件为中空纤维滤膜，过滤孔径为0.1-0.4μm。
5.如权利要求1-3任意一项所述的一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，所述脱酸层析柱为离子交换树脂柱，填充树脂为Amberlite FPA阴离子交换树脂。
6.如权利要求1-3任意一项所述的一种通过布氏乳杆菌发酵-转化-分离偶联制备甘露醇的方法，其特征在于，步骤(3)所述转化的条件为温度为30℃，pH为6.2，转速为100r/min。
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