CN113025667B - 一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用 - Google Patents

一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氨基酸发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：将分离氨基酸晶体后所收集的氨基酸结晶母液加水稀释1‑5倍，加入新鲜培养基，混合均匀，再加入葡萄糖溶液，制得氨基酸发酵培养基，其中，每立方米氨基酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为：酵母膏2‑7kg、蛋白胨1‑6kg、硫酸铵10‑25kg、柠檬酸0.1‑2kg、氯化钾0.1‑2kg、硫酸镁0.5‑5kg。本发明的发酵方法提高了氨基酸产量和糖酸转化率，并具有发酵周期短、利于三废循环利用、绿色环保、节约生产成本等优点。

Description

一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用。
背景技术
缬氨酸为机体必需氨基酸和营养物质，被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域，用作食品添加剂、饲料添加剂、营养增补剂、风味剂、化妆品添加剂、药物（如抗生素、除草剂等）的制备前体等，市场需求巨大。
微生物发酵法制备L-缬氨酸的方法具有采用生物基原料、高效率转化、反应温和、环保经济等优点，而被行业广泛运用。该方法以葡萄糖为原料，经微生物发酵获得L-缬氨酸发酵液。L-缬氨酸发酵液经除菌、脱色、浓缩、结晶、分离等处理，得到L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液。L-缬氨酸结晶母液中含有L-缬氨酸、菌体、色素、破碎菌体、氨基杂酸、蛋白质、核酸、未利用的培养基等物质，具有高化学需氧量（COD）和氨氮属性。已有研究将L-缬氨酸结晶母液浓缩干燥后，用于制备氮磷钾肥料、生物有机肥或饲料添加剂，但存在利用价值低、产品附加值不高等缺陷。为此，如何实现L-缬氨酸结晶母液的综合利用成为急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基酸发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：将分离氨基酸晶体后所收集的氨基酸结晶母液加水稀释1-5倍，加入新鲜培养基，混合均匀，再加入葡萄糖溶液，制得氨基酸发酵培养基，其中，每立方米氨基酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为：酵母膏2-7kg、蛋白胨1-6kg、硫酸铵10-25kg、柠檬酸0.1-2kg、氯化钾0.1-2kg、硫酸镁0.5-5kg。
本发明的优选技术方案中，每立方米氨基酸结晶母液加入新鲜培养基的组成为：酵母膏4-5kg、蛋白胨2-5kg、硫酸铵13-20kg、柠檬酸0.5-1kg、氯化钾0.5-1kg、硫酸镁2-3kg。
本发明优选的技术方案，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸中的任一种或其异构体。
本发明的优选技术方案中，氨基酸结晶母液加水稀释后体积：葡萄糖溶液体积为1:0.8-1.2，优选为1:0.9-1.1，更优选为1:1。
本发明的优选技术方案中，所述葡萄糖溶液的浓度为200-400g/L，优选为240~340g/L，更优选为260~300g/L。
本发明优选的技术方案，所述氨基酸为缬氨酸，优选为L-缬氨酸。
本发明的优选技术方案中，所述L缬氨酸结晶母液的制备方法包括下述步骤，将L-缬氨酸发酵液经灭菌、分离一、脱色、分离二、浓缩、结晶、分离三的处理后，收集L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液。
本发明的优选技术方案中，所述灭菌温度为80-135℃，优选为90-125℃。
本发明的优选技术方案中，所述灭菌时间为5-35分钟，优选为10-20分钟。
本发明优选的技术方案中，所述L-缬氨酸发酵液灭菌处理为低温加压灭菌。
本发明优选的技术方案中，所述低温加压灭菌将氨基酸发酵液在0.1-0.4MPa和不高于80℃条件下进行灭菌处理，制得氨基酸发酵灭菌液。
本发明优选的技术方案中，所述低温加压处理的灭菌压力为0.2-0.3MPa。
本发明优选的技术方案中，所述低温加压处理的灭菌温度为50-65℃，优选为53-57℃。
本发明优选的技术方案中，所述低温加压处理的灭菌时间≥20分钟，优选为25-30分钟。
本发明优选的技术方案中，所述低温灭菌处理后的活菌数为0。
本发明的优选技术方案中，所述分离一选自树脂过滤、膜过滤、离心过滤中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述膜过滤选自陶瓷膜过滤、纳滤膜过滤的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述陶瓷膜的孔径为30-50nm。
本发明优选的技术方案中，所述纳滤膜的截留分子量为800-3000道尔顿。
本发明优选的技术方案中，所述L-缬氨酸发酵液先经陶瓷膜过滤，再经纳滤膜过滤，制得过滤清液。
本发明优选的技术方案中，所述脱色方法包括如下步骤：在收集的过滤清液中加入活性炭，任选加入双氧水，搅拌、过滤，制得脱色清液。
本发明优选的技术方案中，以发酵液体积为当量，所述活性炭的加入量为0.1%-10%，优选为0.2%-5%。
本发明优选的技术方案中，以发酵液体积为当量，加入双氧水至其在反应体系中浓度≥50ppm，优选为100-1000ppm。
本发明优选的技术方案中，所述脱色温度≥30℃，优选为50-70℃。
本发明优选的技术方案中，所述搅拌速度为10-1000r/min，优选为10-100r/min，更优选为20-70r/min。
本发明优选的技术方案中，所述脱色清液的透光率≥95%，优选≥99%。
本发明的优选技术方案中，所述脱色为向L-缬氨酸发酵液中加入0.1-10%的活性炭，在40-70℃下搅拌，脱色20-60分钟，过滤，即得。
本发明的优选技术方案中，所述脱色为向L-缬氨酸发酵液中加入0.1-10%的活性炭，加入双氧水至其在反应体系中浓度≥50ppm，在40-70℃下搅拌，脱色20-60分钟，过滤，即得。
本发明的优选技术方案中，所述分离二为板框压滤、抽滤的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩选自减压浓缩或真空浓缩的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩的温度为50-65℃。
本发明的优选技术方案中，所述分离三选自离心分离、膜分离、树脂分离中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述L-缬氨酸结晶母液中L-缬氨酸含量≥40g/L。
本发明的优选技术方案中，所述加入新鲜培养基后的L-缬氨酸结晶母液和葡萄糖溶液，分别灭菌后再混合。
本发明的优选技术方案中，所述新鲜培养基的pH6-8，优选pH调节剂选自氢氧化钠、氨水、氢氧化钾的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种氨基酸的发酵方法，包括下述步骤，将氨基酸生产菌种子培养液按照0.5-10%的接种量接种到氨基酸结晶母液制得的发酵培养基中，在35-37℃条件下发酵，至残糖量小于0.05 g/L，获得氨基酸发酵液。
本发明优选的技术方案，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸中的任一种或其异构体。
本发明优选的技术方案，所述氨基酸为缬氨酸，优选为L-缬氨酸。
本发明的优选技术方案中，所述L-缬氨酸种子培养液的接种量为1-8%，优选为2-5%。
本发明的优选技术方案中，发酵过程中的环境压力为0.1-0.5Mpa，优选为0.15-0.4Mpa。
本发明的优选技术方案中，发酵过程中的转速为20-50r/min，优选为30-40r/min。
本发明的优选技术方案中，发酵过程中的空气流量为100-400 m3/h，优选为200-300 m3/h。
本发明的优选技术方案中，发酵过程流加氢氧化钠溶液或氨水溶液控制发酵液pH6.5-7.0，优选为10 mol/L氢氧化钠溶液或25%氨水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述L-缬氨酸生产菌选自黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M 2019496）、Sval031菌株（保藏编号：CGMCC No.19456）、Sval049菌株（保藏编号：CGMCC No.19457）、Sval065（保藏编号：CGMCC No.19458）菌株中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M 2019496）于2019年7月1日提交保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
本发明的优选技术方案中，所述Sval031菌株（保藏编号：CGMCC No.19456）于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中，所述Sval049菌株（保藏编号：CGMCC No.19457）于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中，所述Sval065菌株（保藏编号：CGMCC No. 19458）于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中，所述L-缬氨酸生产菌种子培养液的培养方法，包括下述步骤：将L-缬氨酸生产菌按照接种量为0.5-5%接种到LB培养基中，将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值2-4，得到LB种子液；将LB种子液按照0.5-5%接种量转接至合成培养基中，将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值3-4，即得。
本发明的优选技术方案中，所述LB培养基的组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
本发明的优选技术方案中，所述合成培养基的组成为：甘油10g/L，磷酸二氢钾18g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉1.2g/L，维生素B1为0.004g/L，灭菌前用氨水调pH7.3-7.5。
本发明的优选技术方案中，所得L-缬氨酸生产菌种子培养液可重复加入合成培养基中，进行多次培养。
本发明的优选技术方案中，所述多次为≥2次。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明采用如下检测方法：
1.OD值
仪器以及试剂：紫外可见光分光光度计，玻璃比色皿，纯水
实验步骤：分光光度计使用前提前15分钟开机进行预热，将波长调到600nm，再在比色皿中加入纯水，放入分光光度计中进行校零，取出比色皿，将纯水倒掉，加入待测样品，放入分光光度计中读取样品吸光度值（OD值）。
2.杂酸量和产酸量
仪器以及试剂：岛津LC-16液相色谱仪，C18色谱柱，衍生剂为5%的邻苯二甲醛乙醇水溶液、30%甲醇流动相，缬氨酸标准品为西格玛分析标准品，杂酸为市售的含量99%的其它氨基酸。
实验步骤：发酵液稀释100倍后，过滤，加衍生剂衍生2分钟，衍生后进样，波长234nm，进样量10ul，通过标准品峰面积计算样品中氨基酸浓度。
杂酸量=杂酸峰面积/杂酸标准品峰面积*杂酸标准品浓度。
产酸量=缬氨酸峰面积/缬氨酸标准品峰面积*缬氨酸标准品浓度。
3.残糖量
使用山东科学院生物研究所的SBA-40D生物传感器检测发酵产物中的葡萄糖含量。
4.糖酸转化率
糖酸转化率的计算方法=产酸量/（发酵培养基中的总一水葡萄糖质量*0.9）。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明的L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法将L-缬氨酸结晶母液循环利用于制备L-缬氨酸发酵培养基，实现了资源的综合利用，减少三废的产生及回收处理，并充分利用结晶母液中的营养成分提升发酵效率，缩短了发酵周期，显著提高了L-缬氨酸的产量和糖酸转化率，降低了生产成本。
附图说明
图1 分别使用实施例1-4和对比例1-2的发酵培养基发酵的发酵周期对比
图2 分别使用实施例1-4和对比例1-2的的发酵培养基发酵的L-缬氨酸产量对比
图3 分别使用实施例1-4和对比例1-2的发酵培养基发酵的糖酸转化率对比
具体实施方式
通过以下实施例和实验例进一步详细说明本发明。这些实施例和实验例仅用于说明性目的，而并非用于限制本发明的范围。
具体实施方式使用菌种为中国专利申请（CN201911084280.8、CN202010401422.5、CN202010466347.0、CN202010460035.9）中的黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M2019496）、Sval065菌株（保藏编号为CGMCC NO. 19458）、Sval031菌株（保藏编号：CGMCCNo.19456）、Sval049菌株（保藏编号：CGMCC No.19457）。
LB培养基的组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉和10g/L氯化钠，121℃灭菌30min。
合成培养基（包含一级种子培养基、二级种子培养基）的组成为：甘油10g/L，磷酸二氢钾18g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉1.2g/L，维生素B1为0.004g/L，灭菌前用氨水调pH 7.3-7.5，121℃灭菌30min。
发酵培养基的组成为：葡萄糖150 g/L，七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L和酵母粉1g/L，氨水调节pH为7.0，121℃灭菌30min。
制备例1 L-缬氨酸结晶母液的制备
L-缬氨酸结晶母液的制备，包括下述步骤：
（1）1mL甘油管保藏的黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M 2019496）接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为3-4，获得LB培养液；
（2）取2mL的LB培养液，将其接种到200mL合成培养基中，再将其置于37℃、210r/min条件下摇床培养，至pH6.4-6.6、OD值为3-4，制得L-缬氨酸种子培养液；
（3）将L-缬氨酸种子培养液按接种量0.5%接种到一级种子培养基中，在35℃、pH6-7条件下发酵培养至OD≥3.0，得到一级种子液40 L；
（4）一级种子培养液以2%的接种量，接种到二级种子培养基中，按照（3）培养条件，得到二级种子液2 m3；
（5）二级种子液以8%的接种量，接种到发酵培养基中，在35℃、pH6-7条件下发酵培养至残糖量不高于0.5g/L，得到L-缬氨酸发酵液25 m3；
（6）L-缬氨酸发酵液25 m3，在90℃下灭菌20min，经孔径为40nm的陶瓷膜过滤，收集过滤清液；
（7）向收集的过滤清液中加入0.5%活性炭（体积重量百分比），在60℃下搅拌脱色30min，板框压滤机进行压滤处理，收集第二次过滤清液（脱色清液）；
（8）将收集的第二次过滤清液泵入浓缩罐中，在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下真空浓缩，至晶体析出，静置，析晶，分离，收集L-缬氨酸结晶母液，将其用于实施例1-4和对比例1-2。制备例2 L-缬氨酸结晶母液的制备
L-缬氨酸结晶母液的制备，包括下述步骤：
（1）1mL甘油管保藏的黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M 2019496）接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为3-4，获得LB种子液；
（2）取2mLLB种子液，将其接种到100mL合成培养基中，再将其置于37℃、210r/min条件下摇床培养，至pH6.4-6.6、OD值为3-4，制得L-缬氨酸种子培养液；
（3）将L-缬氨酸种子培养液按接种量为2%接种到发酵培养基中，在35℃、pH6-7条件下发酵培养至残糖量不高于0.5g/L，收集5 L的L-缬氨酸发酵液；
（4）在0.23MPa和53℃条件下，将L-缬氨酸发酵液灭菌处理25分钟，制得发酵灭菌液，
经检测，缬氨酸发酵灭菌液中的活菌数为0；
（5）将制得的发酵灭菌液经孔径为40nm的陶瓷膜过滤，所得滤液再经截留分子量为1000道尔顿的纳滤膜过滤，收集过滤清液，经检测，过滤清液中L-缬氨酸含量为48.6g/L，透光率68.3%；
（6）1L过滤清液中加入5g活性炭和100ppm双氧水（加双氧水至其在反应体系中浓度），于60℃水浴和40r/min搅拌条件下将过滤清液脱色40min，板框压滤过滤，制得脱色清液。
经检测，脱色清液中L-缬氨酸含量为47.8g/L，透光率99.3%，溶液为无色。
（7）将收集的脱色清液泵入浓缩罐中，在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下真空浓缩，至晶体析出，静置，析晶，分离，收集L-缬氨酸结晶母液。
参考例1 黄色短杆菌种子培养液的制备
黄色短杆菌种子培养液的制备方法，包括下述步骤：
1、取1mL甘油管保藏的黄色短杆菌（保藏编号：CCTCC NO: M 2019496），将其接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为2-3，获得LB种子液；
2、取2mL一级种子液，将其接种到100mL合成培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养至pH6.4-6.6、OD值为3-4，即得。
参考例2 Sval065菌株种子培养液的制备
Sval065菌株种子培养液的制备方法，包括下述步骤：
1、取1mL甘油管保藏的Sval065菌株（保藏编号为CGMCC NO. 19458），将其接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5，OD值为2-3，获得LB种子液；
2、取2mL一级种子液，将其接种到100mL合成培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.4-6.6，OD值为3-4，即得。
参考例3 Sval031菌株种子培养液的制备
Sval031菌株种子培养液的制备方法，包括下述步骤：
1、取1mL甘油管保藏的Sval031菌株（保藏编号为CGMCC NO. 19456），将其接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.2-6.5，OD值为2-3，获得LB种子液；
2、取2mL一级种子液，将其接种到100mL合成培养基中，37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.4-6.6，OD值为3-4，即得。
参考例4 Sval049菌株种子培养液的制备
Sval049菌株种子培养液的制备方法，包括下述步骤：
1、取1mL甘油管保藏的Sval049菌株（保藏编号为CGMCC NO. 19457），将其接种到50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH为6.2-6.5，OD值为2-3，获得LB种子液；
2、取2mL一级种子液，将其接种至100mL合成培养基中，37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.4-6.6，OD值为3-4，即得。
实施例1 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法，包括下述步骤：
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64 m3，加纯水至2.5 m3，加入组成为酵母膏5kg、大豆蛋白胨2kg、硫酸铵15kg、柠檬酸1kg、氯化钾0.9kg和硫酸镁3kg、pH6-8的新鲜培养基，搅拌，混合均匀，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例1 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至实施例1制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养，发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h，并在发酵中流加10mol/L氢氧化钠溶液调节发酵液pH6.5，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例2 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法，包括下述步骤：
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64m3，加纯水至2.5m3，加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵15kg、柠檬酸1kg、氯化钾0.9kg、硫酸镁3kg、pH6-8的新鲜培养基，搅拌，混合均匀，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30分钟；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例2 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval065菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval065菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例2所得Sval065菌种子培养液按照2.5%的接种量接种至实施例2制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.18MPa条件下培养，发酵罐转速为35r/min、空气流量为280m3/h，并在发酵中流加10mol/L氢氧化钠溶液调节发酵液pH6.5，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例3 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法，包括下述步骤：
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64m3，加纯水至2.5m3，加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵13kg、柠檬酸0.5kg、氯化钾1kg、硫酸镁2.5kg、pH6-8的新鲜培养基，搅拌，混合均匀，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例3 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval031菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval031菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例3所得Sval031菌种子培养液按照2%的接种量接种至实施例3制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.15MPa条件下培养，发酵罐转速为45r/min、空气流量为200m3/h，发酵过程用流加25%浓度的氨水的方式控制发酵液pH6.6，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例4 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法，包括下述步骤：
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64m3，加纯水至2.5m3，加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵13kg、柠檬酸0.5kg、氯化钾1kg、硫酸镁2.5kg、pH6-8的新鲜培养基，搅拌，混合均匀，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例4 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval049菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval049菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例4所得Sval049菌种子培养液按照2%的接种量接种至实施例4制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.15MPa条件下培养，发酵罐转速为45r/min、空气流量为200m3/h，发酵过程用流加25%浓度的氨水溶液的方式控制发酵液pH6.6，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
对比例1
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64m3，加纯水至2.5m3，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例5 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至对比例1制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养，发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h，发酵过程用流加10mol/L氢氧化钠溶液的方式控制发酵pH6.5，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
对比例2
（1）取L-缬氨酸结晶母液0.64m3，加纯水至2.5m3，加入组成为酵母膏12.5kg、大豆蛋白胨5kg、硫酸铵37.5kg、柠檬酸2.5kg、氯化钾2.25kg、硫酸镁7.5kg、pH6-8的新鲜培养基，搅拌，混合均匀，制得的混合液在121℃下灭菌30min；
（2）将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3，制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min；
（3）将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中，搅拌，均匀混合后，得到发酵培养基。
试验例6 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养，包括下述步骤：
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至对比例2制得的发酵培养基中，在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养，发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h，发酵过程用流加10mol/L氢氧化钠溶液的方式控制发酵pH6.5，至残糖量小于0.05g/L终止，获得发酵液。
经检测，发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (12)

1.一种L-缬氨酸发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：将分离L-缬氨酸晶体后所收集的L-缬氨酸结晶母液加水稀释1-5倍，加入新鲜培养基，混合均匀，再加入葡萄糖溶液，制得L-缬氨酸发酵培养基，其中，每立方米L-缬氨酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为：酵母膏2-7kg、蛋白胨1-6kg、硫酸铵10-25kg、柠檬酸0.1-2kg、氯化钾0.1-2kg、硫酸镁0.5-5kg；
所述L-缬氨酸结晶母液的制备方法包括下述步骤，将L-缬氨酸发酵液经灭菌、分离一、脱色、分离二、浓缩、结晶、分离三的处理后，收集L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液；
所述L-缬氨酸发酵液由L-缬氨酸生产菌经发酵培养得到；所述L-缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中任一种；所述Sval031菌株保藏编号为CGMCCNo.19456；所述Sval049菌株保藏编号为CGMCC No.19457；所述Sval065菌株保藏编号为CGMCC No. 19458。
2.根据权利要求1所述的制备方法，L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积：葡萄糖溶液体积为1:0.8-1.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积：葡萄糖溶液体积为1:0.9-1.1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积：葡萄糖溶液体积为1:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，所述葡萄糖溶液的浓度为200-400g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，所述葡萄糖溶液的浓度为240~340g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，所述葡萄糖溶液的浓度为260~300g/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，所述加入新鲜培养基后的L-缬氨酸结晶母液和葡萄糖溶液，分别灭菌后再混合。
9.一种L-缬氨酸的发酵方法，包括下述步骤，将L-缬氨酸生产菌种子培养液按照0.5-10%的接种量接种到L-缬氨酸结晶母液制得的发酵培养基中，在35-37℃条件下发酵，至残糖量小于0.05g/L，获得L-缬氨酸发酵液；
所述L-缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中任一种；所述Sval031菌株保藏编号为CGMCC No.19456；所述Sval049菌株保藏编号为CGMCC No.19457；所述Sval065菌株保藏编号为CGMCC No. 19458；
所述发酵培养基通过权利要求1-8任一项所述L-缬氨酸发酵培养基的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，所述L-缬氨酸生产菌种子培养液的培养方法，包括下述步骤：将L-缬氨酸生产菌按照接种量为0.5-5%接种到LB培养基中，将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值2-4，得到LB种子液；将LB种子液按照0.5-5%接种量转接至合成培养基中，将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值3-4，即得。
11.根据权利要求9-10任一项所述的发酵方法，所得L-缬氨酸生产菌种子培养液可重复加入合成培养基中，进行多次培养。
12.根据权利要求11所述的发酵方法，所述多次为≥2次。
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