CN113025667B - 一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用 - Google Patents

一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氨基酸发酵培养基的制备方法,包括如下步骤:将分离氨基酸晶体后所收集的氨基酸结晶母液加水稀释1‑5倍,加入新鲜培养基,混合均匀,再加入葡萄糖溶液,制得氨基酸发酵培养基,其中,每立方米氨基酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为:酵母膏2‑7kg、蛋白胨1‑6kg、硫酸铵10‑25kg、柠檬酸0.1‑2kg、氯化钾0.1‑2kg、硫酸镁0.5‑5kg。本发明的发酵方法提高了氨基酸产量和糖酸转化率,并具有发酵周期短、利于三废循环利用、绿色环保、节约生产成本等优点。

Description

一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种氨基酸发酵培养基的制备方法及其应用。
背景技术
缬氨酸为机体必需氨基酸和营养物质,被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域,用作食品添加剂、饲料添加剂、营养增补剂、风味剂、化妆品添加剂、药物(如抗生素、除草剂等)的制备前体等,市场需求巨大。
微生物发酵法制备L-缬氨酸的方法具有采用生物基原料、高效率转化、反应温和、环保经济等优点,而被行业广泛运用。该方法以葡萄糖为原料,经微生物发酵获得L-缬氨酸发酵液。L-缬氨酸发酵液经除菌、脱色、浓缩、结晶、分离等处理,得到L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液。L-缬氨酸结晶母液中含有L-缬氨酸、菌体、色素、破碎菌体、氨基杂酸、蛋白质、核酸、未利用的培养基等物质,具有高化学需氧量(COD)和氨氮属性。已有研究将L-缬氨酸结晶母液浓缩干燥后,用于制备氮磷钾肥料、生物有机肥或饲料添加剂,但存在利用价值低、产品附加值不高等缺陷。为此,如何实现L-缬氨酸结晶母液的综合利用成为急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基酸发酵培养基的制备方法,包括如下步骤:将分离氨基酸晶体后所收集的氨基酸结晶母液加水稀释1-5倍,加入新鲜培养基,混合均匀,再加入葡萄糖溶液,制得氨基酸发酵培养基,其中,每立方米氨基酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为:酵母膏2-7kg、蛋白胨1-6kg、硫酸铵10-25kg、柠檬酸0.1-2kg、氯化钾0.1-2kg、硫酸镁0.5-5kg。
本发明的优选技术方案中,每立方米氨基酸结晶母液加入新鲜培养基的组成为:酵母膏4-5kg、蛋白胨2-5kg、硫酸铵13-20kg、柠檬酸0.5-1kg、氯化钾0.5-1kg、硫酸镁2-3kg。
本发明优选的技术方案,所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸中的任一种或其异构体。
本发明的优选技术方案中,氨基酸结晶母液加水稀释后体积:葡萄糖溶液体积为1:0.8-1.2,优选为1:0.9-1.1,更优选为1:1。
本发明的优选技术方案中,所述葡萄糖溶液的浓度为200-400g/L,优选为240~340g/L,更优选为260~300g/L。
本发明优选的技术方案,所述氨基酸为缬氨酸,优选为L-缬氨酸。
本发明的优选技术方案中,所述L缬氨酸结晶母液的制备方法包括下述步骤,将L-缬氨酸发酵液经灭菌、分离一、脱色、分离二、浓缩、结晶、分离三的处理后,收集L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液。
本发明的优选技术方案中,所述灭菌温度为80-135℃,优选为90-125℃。
本发明的优选技术方案中,所述灭菌时间为5-35分钟,优选为10-20分钟。
本发明优选的技术方案中,所述L-缬氨酸发酵液灭菌处理为低温加压灭菌。
本发明优选的技术方案中,所述低温加压灭菌将氨基酸发酵液在0.1-0.4MPa和不高于80℃条件下进行灭菌处理,制得氨基酸发酵灭菌液。
本发明优选的技术方案中,所述低温加压处理的灭菌压力为0.2-0.3MPa。
本发明优选的技术方案中,所述低温加压处理的灭菌温度为50-65℃,优选为53-57℃。
本发明优选的技术方案中,所述低温加压处理的灭菌时间≥20分钟,优选为25-30分钟。
本发明优选的技术方案中,所述低温灭菌处理后的活菌数为0。
本发明的优选技术方案中,所述分离一选自树脂过滤、膜过滤、离心过滤中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中,所述膜过滤选自陶瓷膜过滤、纳滤膜过滤的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中,所述陶瓷膜的孔径为30-50nm。
本发明优选的技术方案中,所述纳滤膜的截留分子量为800-3000道尔顿。
本发明优选的技术方案中,所述L-缬氨酸发酵液先经陶瓷膜过滤,再经纳滤膜过滤,制得过滤清液。
本发明优选的技术方案中,所述脱色方法包括如下步骤:在收集的过滤清液中加入活性炭,任选加入双氧水,搅拌、过滤,制得脱色清液。
本发明优选的技术方案中,以发酵液体积为当量,所述活性炭的加入量为0.1%-10%,优选为0.2%-5%。
本发明优选的技术方案中,以发酵液体积为当量,加入双氧水至其在反应体系中浓度≥50ppm,优选为100-1000ppm。
本发明优选的技术方案中,所述脱色温度≥30℃,优选为50-70℃。
本发明优选的技术方案中,所述搅拌速度为10-1000r/min,优选为10-100r/min,更优选为20-70r/min。
本发明优选的技术方案中,所述脱色清液的透光率≥95%,优选≥99%。
本发明的优选技术方案中,所述脱色为向L-缬氨酸发酵液中加入0.1-10%的活性炭,在40-70℃下搅拌,脱色20-60分钟,过滤,即得。
本发明的优选技术方案中,所述脱色为向L-缬氨酸发酵液中加入0.1-10%的活性炭,加入双氧水至其在反应体系中浓度≥50ppm,在40-70℃下搅拌,脱色20-60分钟,过滤,即得。
本发明的优选技术方案中,所述分离二为板框压滤、抽滤的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中,所述浓缩选自减压浓缩或真空浓缩的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中,所述浓缩的温度为50-65℃。
本发明的优选技术方案中,所述分离三选自离心分离、膜分离、树脂分离中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中,所述L-缬氨酸结晶母液中L-缬氨酸含量≥40g/L。
本发明的优选技术方案中,所述加入新鲜培养基后的L-缬氨酸结晶母液和葡萄糖溶液,分别灭菌后再混合。
本发明的优选技术方案中,所述新鲜培养基的pH6-8,优选pH调节剂选自氢氧化钠、氨水、氢氧化钾的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种氨基酸的发酵方法,包括下述步骤,将氨基酸生产菌种子培养液按照0.5-10%的接种量接种到氨基酸结晶母液制得的发酵培养基中,在35-37℃条件下发酵,至残糖量小于0.05 g/L,获得氨基酸发酵液。
本发明优选的技术方案,所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸中的任一种或其异构体。
本发明优选的技术方案,所述氨基酸为缬氨酸,优选为L-缬氨酸。
本发明的优选技术方案中,所述L-缬氨酸种子培养液的接种量为1-8%,优选为2-5%。
本发明的优选技术方案中,发酵过程中的环境压力为0.1-0.5Mpa,优选为0.15-0.4Mpa。
本发明的优选技术方案中,发酵过程中的转速为20-50r/min,优选为30-40r/min。
本发明的优选技术方案中,发酵过程中的空气流量为100-400 m3/h,优选为200-300 m3/h。
本发明的优选技术方案中,发酵过程流加氢氧化钠溶液或氨水溶液控制发酵液pH6.5-7.0,优选为10 mol/L氢氧化钠溶液或25%氨水溶液。
本发明的优选技术方案中,所述L-缬氨酸生产菌选自黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M 2019496)、Sval031菌株(保藏编号:CGMCC No.19456)、Sval049菌株(保藏编号:CGMCC No.19457)、Sval065(保藏编号:CGMCC No.19458)菌株中的任一种。
本发明优选的技术方案中,所述黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M 2019496)于2019年7月1日提交保藏,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
本发明的优选技术方案中,所述Sval031菌株(保藏编号:CGMCC No.19456)于2020年3月6日提交保藏,分类命名:大肠埃希氏菌(Escherichia coli),保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中,所述Sval049菌株(保藏编号:CGMCC No.19457)于2020年3月6日提交保藏,分类命名:大肠埃希氏菌(Escherichia coli),保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中,所述Sval065菌株(保藏编号:CGMCC No. 19458)于2020年3月6日提交保藏,分类命名:大肠埃希氏菌(Escherichia coli),保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的优选技术方案中,所述L-缬氨酸生产菌种子培养液的培养方法,包括下述步骤:将L-缬氨酸生产菌按照接种量为0.5-5%接种到LB培养基中,将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值2-4,得到LB种子液;将LB种子液按照0.5-5%接种量转接至合成培养基中,将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值3-4,即得。
本发明的优选技术方案中,所述LB培养基的组成为:10g/L蛋白胨,5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
本发明的优选技术方案中,所述合成培养基的组成为:甘油10g/L,磷酸二氢钾18g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁2g/L,酵母粉1.2g/L,维生素B1为0.004g/L,灭菌前用氨水调pH7.3-7.5。
本发明的优选技术方案中,所得L-缬氨酸生产菌种子培养液可重复加入合成培养基中,进行多次培养。
本发明的优选技术方案中,所述多次为≥2次。
除非另有说明,本发明涉及液体与液体之间的百分比时,所述的百分比为体积/体积百分比;本发明涉及液体与固体之间的百分比时,所述百分比为体积/重量百分比;本发明涉及固体与液体之间的百分比时,所述百分比为重量/体积百分比;其余为重量/重量百分比。
除非另有说明,本发明采用如下检测方法:
1.OD值
仪器以及试剂:紫外可见光分光光度计,玻璃比色皿,纯水
实验步骤:分光光度计使用前提前15分钟开机进行预热,将波长调到600nm,再在比色皿中加入纯水,放入分光光度计中进行校零,取出比色皿,将纯水倒掉,加入待测样品,放入分光光度计中读取样品吸光度值(OD值)。
2.杂酸量和产酸量
仪器以及试剂:岛津LC-16液相色谱仪,C18色谱柱,衍生剂为5%的邻苯二甲醛乙醇水溶液、30%甲醇流动相,缬氨酸标准品为西格玛分析标准品,杂酸为市售的含量99%的其它氨基酸。
实验步骤:发酵液稀释100倍后,过滤,加衍生剂衍生2分钟,衍生后进样,波长234nm,进样量10ul,通过标准品峰面积计算样品中氨基酸浓度。
杂酸量=杂酸峰面积/杂酸标准品峰面积*杂酸标准品浓度。
产酸量=缬氨酸峰面积/缬氨酸标准品峰面积*缬氨酸标准品浓度。
3.残糖量
使用山东科学院生物研究所的SBA-40D生物传感器检测发酵产物中的葡萄糖含量。
4.糖酸转化率
糖酸转化率的计算方法=产酸量/(发酵培养基中的总一水葡萄糖质量*0.9)。
与现有技术相比,本发明具有下述有益技术效果:
1、本发明的L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法将L-缬氨酸结晶母液循环利用于制备L-缬氨酸发酵培养基,实现了资源的综合利用,减少三废的产生及回收处理,并充分利用结晶母液中的营养成分提升发酵效率,缩短了发酵周期,显著提高了L-缬氨酸的产量和糖酸转化率,降低了生产成本。
附图说明
图1 分别使用实施例1-4和对比例1-2的发酵培养基发酵的发酵周期对比
图2 分别使用实施例1-4和对比例1-2的的发酵培养基发酵的L-缬氨酸产量对比
图3 分别使用实施例1-4和对比例1-2的发酵培养基发酵的糖酸转化率对比
具体实施方式
通过以下实施例和实验例进一步详细说明本发明。这些实施例和实验例仅用于说明性目的,而并非用于限制本发明的范围。
具体实施方式使用菌种为中国专利申请(CN201911084280.8、CN202010401422.5、CN202010466347.0、CN202010460035.9)中的黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M2019496)、Sval065菌株(保藏编号为CGMCC NO. 19458)、Sval031菌株(保藏编号:CGMCCNo.19456)、Sval049菌株(保藏编号:CGMCC No.19457)。
LB培养基的组成为:10g/L蛋白胨,5g/L酵母粉和10g/L氯化钠,121℃灭菌30min。
合成培养基(包含一级种子培养基、二级种子培养基)的组成为:甘油10g/L,磷酸二氢钾18g/L,硫酸铵5g/L,硫酸镁2g/L,酵母粉1.2g/L,维生素B1为0.004g/L,灭菌前用氨水调pH 7.3-7.5,121℃灭菌30min。
发酵培养基的组成为:葡萄糖150 g/L,七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L和酵母粉1g/L,氨水调节pH为7.0,121℃灭菌30min。
制备例1 L-缬氨酸结晶母液的制备
L-缬氨酸结晶母液的制备,包括下述步骤:
(1)1mL甘油管保藏的黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M 2019496)接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为3-4,获得LB培养液;
(2)取2mL的LB培养液,将其接种到200mL合成培养基中,再将其置于37℃、210r/min条件下摇床培养,至pH6.4-6.6、OD值为3-4,制得L-缬氨酸种子培养液;
(3)将L-缬氨酸种子培养液按接种量0.5%接种到一级种子培养基中,在35℃、pH6-7条件下发酵培养至OD≥3.0,得到一级种子液40 L;
(4)一级种子培养液以2%的接种量,接种到二级种子培养基中,按照(3)培养条件,得到二级种子液2 m3
(5)二级种子液以8%的接种量,接种到发酵培养基中,在35℃、pH6-7条件下发酵培养至残糖量不高于0.5g/L,得到L-缬氨酸发酵液25 m3
(6)L-缬氨酸发酵液25 m3,在90℃下灭菌20min,经孔径为40nm的陶瓷膜过滤,收集过滤清液;
(7)向收集的过滤清液中加入0.5%活性炭(体积重量百分比),在60℃下搅拌脱色30min,板框压滤机进行压滤处理,收集第二次过滤清液(脱色清液);
(8)将收集的第二次过滤清液泵入浓缩罐中,在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下真空浓缩,至晶体析出,静置,析晶,分离,收集L-缬氨酸结晶母液,将其用于实施例1-4和对比例1-2。制备例2 L-缬氨酸结晶母液的制备
L-缬氨酸结晶母液的制备,包括下述步骤:
(1)1mL甘油管保藏的黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M 2019496)接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为3-4,获得LB种子液;
(2)取2mLLB种子液,将其接种到100mL合成培养基中,再将其置于37℃、210r/min条件下摇床培养,至pH6.4-6.6、OD值为3-4,制得L-缬氨酸种子培养液;
(3)将L-缬氨酸种子培养液按接种量为2%接种到发酵培养基中,在35℃、pH6-7条件下发酵培养至残糖量不高于0.5g/L,收集5 L的L-缬氨酸发酵液;
(4)在0.23MPa和53℃条件下,将L-缬氨酸发酵液灭菌处理25分钟,制得发酵灭菌液,
经检测,缬氨酸发酵灭菌液中的活菌数为0;
(5)将制得的发酵灭菌液经孔径为40nm的陶瓷膜过滤,所得滤液再经截留分子量为1000道尔顿的纳滤膜过滤,收集过滤清液,经检测,过滤清液中L-缬氨酸含量为48.6g/L,透光率68.3%;
(6)1L过滤清液中加入5g活性炭和100ppm双氧水(加双氧水至其在反应体系中浓度),于60℃水浴和40r/min搅拌条件下将过滤清液脱色40min,板框压滤过滤,制得脱色清液。
经检测,脱色清液中L-缬氨酸含量为47.8g/L,透光率99.3%,溶液为无色。
(7)将收集的脱色清液泵入浓缩罐中,在65℃、20r/min和-0.1Mpa条件下真空浓缩,至晶体析出,静置,析晶,分离,收集L-缬氨酸结晶母液。
参考例1 黄色短杆菌种子培养液的制备
黄色短杆菌种子培养液的制备方法,包括下述步骤:
1、取1mL甘油管保藏的黄色短杆菌(保藏编号:CCTCC NO: M 2019496),将其接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5、OD值为2-3,获得LB种子液;
2、取2mL一级种子液,将其接种到100mL合成培养基中,在37℃、210r/min下摇床培养至pH6.4-6.6、OD值为3-4,即得。
参考例2 Sval065菌株种子培养液的制备
Sval065菌株种子培养液的制备方法,包括下述步骤:
1、取1mL甘油管保藏的Sval065菌株(保藏编号为CGMCC NO. 19458),将其接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.2-6.5,OD值为2-3,获得LB种子液;
2、取2mL一级种子液,将其接种到100mL合成培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH6.4-6.6,OD值为3-4,即得。
参考例3 Sval031菌株种子培养液的制备
Sval031菌株种子培养液的制备方法,包括下述步骤:
1、取1mL甘油管保藏的Sval031菌株(保藏编号为CGMCC NO. 19456),将其接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.2-6.5,OD值为2-3,获得LB种子液;
2、取2mL一级种子液,将其接种到100mL合成培养基中,37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.4-6.6,OD值为3-4,即得。
参考例4 Sval049菌株种子培养液的制备
Sval049菌株种子培养液的制备方法,包括下述步骤:
1、取1mL甘油管保藏的Sval049菌株(保藏编号为CGMCC NO. 19457),将其接种到50mL的LB培养基中,在37℃、210r/min条件下摇床培养至pH为6.2-6.5,OD值为2-3,获得LB种子液;
2、取2mL一级种子液,将其接种至100mL合成培养基中,37℃、210r/min下摇床培养至pH为6.4-6.6,OD值为3-4,即得。
实施例1 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法,包括下述步骤:
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64 m3,加纯水至2.5 m3,加入组成为酵母膏5kg、大豆蛋白胨2kg、硫酸铵15kg、柠檬酸1kg、氯化钾0.9kg和硫酸镁3kg、pH6-8的新鲜培养基,搅拌,混合均匀,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例1 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至实施例1制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养,发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h,并在发酵中流加10mol/L氢氧化钠溶液调节发酵液pH6.5,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例2 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法,包括下述步骤:
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64m3,加纯水至2.5m3,加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵15kg、柠檬酸1kg、氯化钾0.9kg、硫酸镁3kg、pH6-8的新鲜培养基,搅拌,混合均匀,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30分钟;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例2 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval065菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval065菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例2所得Sval065菌种子培养液按照2.5%的接种量接种至实施例2制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.18MPa条件下培养,发酵罐转速为35r/min、空气流量为280m3/h,并在发酵中流加10mol/L氢氧化钠溶液调节发酵液pH6.5,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例3 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法,包括下述步骤:
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64m3,加纯水至2.5m3,加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵13kg、柠檬酸0.5kg、氯化钾1kg、硫酸镁2.5kg、pH6-8的新鲜培养基,搅拌,混合均匀,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例3 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval031菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval031菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例3所得Sval031菌种子培养液按照2%的接种量接种至实施例3制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.15MPa条件下培养,发酵罐转速为45r/min、空气流量为200m3/h,发酵过程用流加25%浓度的氨水的方式控制发酵液pH6.6,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
实施例4 L-缬氨酸结晶母液用于制备发酵培养基
L-缬氨酸结晶母液的综合利用方法,包括下述步骤:
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64m3,加纯水至2.5m3,加入组成为酵母膏4.5kg、大豆蛋白胨2.1kg、硫酸铵13kg、柠檬酸0.5kg、氯化钾1kg、硫酸镁2.5kg、pH6-8的新鲜培养基,搅拌,混合均匀,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例4 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval049菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于Sval049菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例4所得Sval049菌种子培养液按照2%的接种量接种至实施例4制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.15MPa条件下培养,发酵罐转速为45r/min、空气流量为200m3/h,发酵过程用流加25%浓度的氨水溶液的方式控制发酵液pH6.6,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
对比例1
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64m3,加纯水至2.5m3,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例5 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至对比例1制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养,发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h,发酵过程用流加10mol/L氢氧化钠溶液的方式控制发酵pH6.5,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
对比例2
(1)取L-缬氨酸结晶母液0.64m3,加纯水至2.5m3,加入组成为酵母膏12.5kg、大豆蛋白胨5kg、硫酸铵37.5kg、柠檬酸2.5kg、氯化钾2.25kg、硫酸镁7.5kg、pH6-8的新鲜培养基,搅拌,混合均匀,制得的混合液在121℃下灭菌30min;
(2)将750kg一水葡萄糖加水溶解并定容至2.5m3,制得的葡萄糖溶液在121℃下灭菌30min;
(3)将灭菌后的葡萄糖溶液加入到灭菌后的混合液中,搅拌,均匀混合后,得到发酵培养基。
试验例6 L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养
L-缬氨酸结晶母液制备的发酵培养基用于黄色短杆菌的发酵培养,包括下述步骤:
将参考例1所得黄色短杆菌种子培养液按照3%的接种量接种至对比例2制得的发酵培养基中,在37℃、环境压力为0.2MPa条件下培养,发酵罐转速为30r/min、空气流量为300m3/h,发酵过程用流加10mol/L氢氧化钠溶液的方式控制发酵pH6.5,至残糖量小于0.05g/L终止,获得发酵液。
经检测,发酵周期、发酵液中L-缬氨酸含量、糖酸转化率见图1-图3。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (12)

1.一种L-缬氨酸发酵培养基的制备方法,包括如下步骤:将分离L-缬氨酸晶体后所收集的L-缬氨酸结晶母液加水稀释1-5倍,加入新鲜培养基,混合均匀,再加入葡萄糖溶液,制得L-缬氨酸发酵培养基,其中,每立方米L-缬氨酸结晶母液中所加入的新鲜培养基的组成为:酵母膏2-7kg、蛋白胨1-6kg、硫酸铵10-25kg、柠檬酸0.1-2kg、氯化钾0.1-2kg、硫酸镁0.5-5kg;
所述L-缬氨酸结晶母液的制备方法包括下述步骤,将L-缬氨酸发酵液经灭菌、分离一、脱色、分离二、浓缩、结晶、分离三的处理后,收集L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液;
所述L-缬氨酸发酵液由L-缬氨酸生产菌经发酵培养得到;所述L-缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中任一种;所述Sval031菌株保藏编号为CGMCCNo.19456;所述Sval049菌株保藏编号为CGMCC No.19457;所述Sval065菌株保藏编号为CGMCC No. 19458。
2.根据权利要求1所述的制备方法,L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积:葡萄糖溶液体积为1:0.8-1.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法,L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积:葡萄糖溶液体积为1:0.9-1.1。
4.根据权利要求1所述的制备方法,L-缬氨酸结晶母液加水稀释后体积:葡萄糖溶液体积为1:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法,所述葡萄糖溶液的浓度为200-400g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法,所述葡萄糖溶液的浓度为240~340g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法,所述葡萄糖溶液的浓度为260~300g/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法,所述加入新鲜培养基后的L-缬氨酸结晶母液和葡萄糖溶液,分别灭菌后再混合。
9.一种L-缬氨酸的发酵方法,包括下述步骤,将L-缬氨酸生产菌种子培养液按照0.5-10%的接种量接种到L-缬氨酸结晶母液制得的发酵培养基中,在35-37℃条件下发酵,至残糖量小于0.05g/L,获得L-缬氨酸发酵液;
所述L-缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中任一种;所述Sval031菌株保藏编号为CGMCC No.19456;所述Sval049菌株保藏编号为CGMCC No.19457;所述Sval065菌株保藏编号为CGMCC No. 19458;
所述发酵培养基通过权利要求1-8任一项所述L-缬氨酸发酵培养基的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的发酵方法,所述L-缬氨酸生产菌种子培养液的培养方法,包括下述步骤:将L-缬氨酸生产菌按照接种量为0.5-5%接种到LB培养基中,将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值2-4,得到LB种子液;将LB种子液按照0.5-5%接种量转接至合成培养基中,将其置于35-37℃、180-220r/min、pH6-7条件下培养至OD值3-4,即得。
11.根据权利要求9-10任一项所述的发酵方法,所得L-缬氨酸生产菌种子培养液可重复加入合成培养基中,进行多次培养。
12.根据权利要求11所述的发酵方法,所述多次为≥2次。
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