WO2011087062A1 - 含窒素組成物およびその製造方法 - Google Patents

含窒素組成物およびその製造方法 Download PDF

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WO2011087062A1
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mother liquor
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ammonium salt
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森　義昭
豪 ▲高▼橋
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三菱化学株式会社
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/20—Fertilizers of biological origin, e.g. guano or fertilizers made from animal corpses

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering an aliphatic carboxylic acid by adding sulfuric acid to an aqueous solution containing an ammonium ammonium carboxylate obtained by microbial conversion from glucose, glucose, cellulose, etc., which are biological materials, and by-produced ammonium salt of sulfuric acid and
  • the present invention relates to a method for recovering a nitrogen-containing composition containing a fermentation byproduct.
  • Aliphatic carboxylic acids such as succinic acid and adipic acid are widely used as synthetic raw materials for foods, pharmaceuticals and other chemicals. These aliphatic carboxylic acids have conventionally been industrially produced from petroleum-derived raw materials. However, in recent years, various aliphatic carboxylic acids can be produced from a wide range of biological raw materials with a high carbon yield by fermentation using microorganisms. For example, succinic acid and adipic acid can be produced by fermentation.
  • the raw materials are generally sugars, such as glucose, glucose and cellulose.
  • the raw material saccharide may not be completely assimilated by the microorganism, and the saccharide may be mixed into the aliphatic carboxylic acid.
  • ammonia is used as a neutralizing agent in fermentation using microorganisms. In this case, amino acids are also by-produced.
  • the aliphatic carboxylic acid in the fermentation broth exists as an ammonium salt, but in order to recover the aliphatic carboxylic acid, it is necessary to exchange the salt with an acid.
  • sulfuric acid is used as the acid, an ammonium salt of sulfuric acid is by-produced together with the aliphatic carboxylic acid.
  • a crystallization method As a method for recovering the ammonium salt of sulfuric acid from an aqueous solution containing the ammonium salt of sulfuric acid, a crystallization method is generally used, and usually involves a recycling of the crystallization mother liquor in order to obtain a sufficient recovery rate of the ammonium salt of sulfuric acid. There are many cases.
  • the ammonium salt of sulfuric acid is recovered by crystallization from an aqueous solution containing the ammonium salt of sulfuric acid containing fermentation by-products and the mother liquor is recycled, the fermentation by-products accumulate in the recycling system and increase the liquid viscosity. Adversely affects the subsequent solid-liquid separation.
  • the aqueous solution is directly dried.
  • the dryer is limited, but also the capacity is limited. there were.
  • the present invention relates to ammonium sulfate produced as a by-product in a method of recovering aliphatic carboxylic acid by adding sulfuric acid to an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid ammonium salt obtained by microbial conversion from glucose, glucose, cellulose, etc., which are biological materials. It is an object of the present invention to provide a method for stably and efficiently recovering a nitrogen-containing composition containing a salt and a fermentation byproduct.
  • the gist of the present invention is the following [1] to [12].
  • [1] At least one selected from an aliphatic carboxylic acid, an aliphatic carboxylate, and an ammonium salt of sulfuric acid is recovered from an aqueous solution containing an ammonium salt of an aliphatic carboxylic acid obtained from a biological material.
  • a method for producing a composition comprising the following steps (1) to (3): (1) Crystallization step for concentrating and crystallizing ammonium salt of sulfuric acid from aqueous solution containing sulfuric acid ammonium salt (2) Solid-liquid separation step for solid-liquid separation of ammonium salt of sulfuric acid obtained in crystallization step (3) Solid The crystallization mother liquor obtained in the liquid separation step is recycled to at least one step selected from the crystallization step and the step before the crystallization step, and the amount of the mother liquor to be recycled is not the total amount of the mother liquor.
  • Crystallization mother liquor recycling step [2] The method comprises a crystallization mother liquor drying step in which the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step is evaporated to dryness in a dryer and the ammonium salt of sulfuric acid is recovered. ] The manufacturing method of the nitrogen-containing composition of description. [3] A contact process in which sulfuric acid is added to an aqueous solution containing an ammonium salt of an aliphatic carboxylic acid obtained from a biological raw material, and then the aqueous solution and a phase-separable solvent are mixed and contacted; The method for producing a nitrogen-containing composition according to [1] or [2], comprising a phase separation step for phase separation.
  • the method for producing a nitrogen-containing composition according to any one of [1] to [9], wherein the content is 15% by weight or less.
  • the total amount of organic acids contained in the mother liquor recycled in the crystallization mother liquor recycling step is 0.1 wt% or more and 10 wt% or less with respect to the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step. It exists, The manufacturing method of the nitrogen-containing composition as described in [10] characterized by the above-mentioned.
  • the amount of the mother liquor recycled in the crystallization mother liquor recycling step is 10% by weight or more and less than 80% by weight with respect to the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step.
  • a nitrogen-containing product containing an ammonium salt of by-product sulfuric acid and a fermentation byproduct in a method for recovering a fatty acid carboxylic acid from an aqueous solution containing an ammonium salt of an aliphatic carboxylic acid obtained from a biological material, a nitrogen-containing product containing an ammonium salt of by-product sulfuric acid and a fermentation byproduct.
  • An aliphatic carboxylic acid can be produced efficiently and stably from the composition.
  • FIG. 1 is a drawing showing an embodiment of a method for producing a nitrogen-containing composition.
  • FIG. 2 is a diagram showing the procedure for constructing plasmid pMJPC17.2, and the underlined numbers indicate the primers consisting of the sequence number.
  • the method for producing a nitrogen-containing composition of the present invention is selected from an aqueous solution containing an ammonium salt of an aliphatic carboxylic acid obtained from a biological material, from an aliphatic carboxylic acid, an aliphatic carboxylate, and an ammonium salt of sulfuric acid.
  • a method for recovering at least one and producing a nitrogen-containing composition comprising the following steps (1) to (3).
  • Crystallization step for concentrating and crystallizing ammonium salt of sulfuric acid from aqueous solution containing sulfuric acid ammonium salt (2) Solid-liquid separation step for solid-liquid separation of ammonium salt of sulfuric acid obtained in crystallization step (3) Solid A crystallization mother liquor recycling step, wherein the crystallization mother liquor obtained in the liquid separation step is recycled to at least one step selected from a crystallization step and a step prior to the crystallization step.
  • ⁇ Crystal crystallization process> the ammonium salt of sulfuric acid is concentrated and crystallized from an aqueous solution containing the ammonium salt of sulfuric acid.
  • concentrated crystallization water is evaporated from an aqueous solution containing an ammonium salt of sulfuric acid, and the ammonium salt of sulfuric acid is precipitated by concentrating the ammonium salt of sulfuric acid to a saturation solubility or higher.
  • Crystallization may be carried out at normal pressure or under reduced pressure, but if it is carried out at reduced pressure, the aqueous solution containing the ammonium salt of sulfuric acid is cooled by the heat of vaporization of water, and the temperature dependence of the saturation solubility of the ammonium salt of sulfuric acid Precipitation due to property can be expected, which is preferable from the viewpoint of yield.
  • the crystallization pressure is preferably 1 to 50 kPa, more preferably 2 to 20 kPa.
  • the crystallization temperature is determined by the operating pressure, preferably 5 to 80 ° C, more preferably 10 to 60 ° C.
  • the equipment for decompression can be reduced, and the condensed water can be easily collected and recovered.
  • the crystallization pressure to 50 kPa or less, it is possible to prevent the crystallization temperature from becoming high and to improve the yield of ammonium sulfate.
  • the decompression generator is not particularly limited, but water or a steam ejector is preferable from the viewpoint of maintenance and management.
  • a barometric condenser is widely used for condensing evaporating water.
  • the crystallization operation may be a batch operation or a continuous operation.
  • the ammonium salt of sulfuric acid can be efficiently crystallized, and the energy required for crystallization can be reduced, and the crystal size can be varied.
  • the continuous operation is preferable because it can be reduced.
  • the crystallization apparatus does not need to be a special crystallization tank, and a known stirring tank can be used.
  • the ammonium salt slurry of sulfuric acid obtained by crystallization separates the ammonium salt crystals of sulfuric acid and the mother liquor by solid-liquid separation operation.
  • the separation method is not particularly limited, and examples thereof include filtration separation and sedimentation separation.
  • the operation may be batch or continuous.
  • Examples of efficient solid-liquid separators include a continuous centrifugal filter and a centrifugal sedimentator such as a decanter. Further, the wet cake recovered by the solid-liquid separation operation can be rinsed with cold water or the like depending on the required purity of the ammonium salt of sulfuric acid.
  • the recovered ammonium salt crystals of sulfuric acid are usually dried.
  • the drying method is not particularly limited, and examples thereof include a band dryer, a rotary dryer, and a fluidized bed dryer. Further, in consideration of mixing with an ammonium salt of sulfuric acid obtained in the crystallization mother liquor drying step, which will be described later, in a dryer, a rotary dryer, a fluidized bed dryer, and the like are preferable.
  • ⁇ Crystallization mother liquor recycling process> At least a part of the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step can be recycled to at least one step selected from the crystallization step and the step before the crystallization step. However, in the production method of the present invention, the amount recycled is not the total amount of the crystallization mother liquor.
  • the recycling amount of the crystallization mother liquor is not generally determined because it depends on the composition and properties of the crystallization mother liquor, but is preferably 10% by weight or more of the crystallization mother liquor, more preferably 20% by weight or more, It is more preferably 30% by weight or more, and particularly preferably 40% by weight or more. Further, it is preferably less than 99% by weight, more preferably less than 90% by weight, still more preferably less than 80% by weight, and particularly preferably less than 75% by weight.
  • the crystallization mother liquor contains not only ammonium sulfate but also various coexisting substances derived from fermentation, for example, organic acids such as malic acid, amino acids such as alanine and valine, proteins and saccharides.
  • organic acids such as malic acid
  • amino acids such as alanine and valine
  • proteins and saccharides When the entire amount of the crystallization mother liquor is recycled, these coexisting substances accumulate in the recycling system, and the viscosity of the liquid in the recycling system increases, which hinders the crystallization process and the solid-liquid separation process.
  • the total amount of organic acid, saccharide, amino acid and protein contained in the mother liquor recycled in the crystallization mother liquor recycling step is 0. 0% throughout the entire recycling step with respect to the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step. It is preferably 1% by weight or more and 15% by weight or less, and more preferably 10% by weight or less.
  • the total amount of organic acids contained in the mother liquor recycled in the crystallization mother liquor recycling step is 0.1 wt% or more and 10 wt% throughout the entire recycle step with respect to the crystallization mother liquor obtained in the solid-liquid separation step. Or less, more preferably 8% by weight or less.
  • the viscosity of the crystallization mother liquor is preferably controlled to be 0.5 to 100 cP at the crystallization temperature by controlling the recycle amount, more preferably 1 to 50 cP, and more preferably 1 to 20 cP. More preferably.
  • the viscosity of the crystallization mother liquor 100 cP or less it is possible to prevent adverse effects on the solid-liquid separation process.
  • a continuous centrifugal sedimentator such as a decanter
  • the viscosity of the crystallization mother liquor is prevented from becoming too high, the decrease in crystal sedimentation rate is suppressed, and solid-liquid separation cannot be prevented.
  • the separated mother liquor drying process contains various impurities derived from fermentation in addition to ammonium sulfate, such as organic acids, amino acids, proteins and sugars, and is effective as liquid fertilizer or its raw material, but is directly dried and recovered as a powder. You can also.
  • the drying method is not particularly limited, but as a method for recovering the powder from the liquid material, for example, a dryer such as a spray dryer or a disk dryer is preferable. Moreover, the composition containing the recovered ammonium salt of sulfuric acid can be mixed with the ammonium salt of sulfuric acid obtained in the crystallization step.
  • ⁇ Contact process and phase separation process> In the method for producing an aliphatic carboxylic acid according to the present invention, an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid is contacted with a solvent capable of phase separation with the aqueous solution, and the liquid is phase-separated after the contacting step. A phase separation step.
  • a solvent phase hereinafter sometimes referred to as an extraction phase
  • a phase containing a solid content generated at a phase interface hereinafter sometimes referred to as an intermediate phase
  • an aqueous phase hereinafter referred to as an extraction residue
  • the contact step is carried out by batch operation, for example, after adding a solvent capable of phase separation with the aqueous solution to an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid, bringing them into contact and mixing well,
  • the extraction phase, the intermediate phase, and the extracted residual phase can be separated and recovered by a method of taking out from the vicinity of each phase through a discharge port, a method of taking out from the bottom of the container that has been contacted, and the like.
  • the intermediate phase containing a large amount of solids can be taken out together with the extraction phase, or can be taken out together with the extracted residual phase.
  • a mixer unit having a mixer for contacting and mixing an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid and a solvent capable of phase separation with the aqueous solution;
  • a contact device (hereinafter referred to as a mixer) comprising a settler portion having a settler applied to a step (hereinafter sometimes referred to as a phase separation step) in which a mixed liquid obtained by mixing is phase-separated by standing.
  • a phase separation step in which a mixed liquid obtained by mixing is phase-separated by standing.
  • the contact device may be any device that can contact an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid with a solvent, recover the solvent phase and aqueous solution phase, and remove solids.
  • the mixer-settler type extraction device described above is preferable because it is simple and easy to operate.
  • the mixer may be of any type as long as an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid and a solvent that can be phase-separated with the aqueous solution are sufficiently mixed.
  • examples thereof include a container having a stirrer and a static mixer. .
  • the mixer is preferably a static mixer from the viewpoint of wide operating tolerance and equipment cost.
  • the settler can be any system as long as it can phase-separate an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid and a solvent that can be phase-separated with the aqueous solution. Also good. For example, one that collects the extraction phase, intermediate phase, and extracted residual phase in a single tank, one that collects the extracted phase, intermediate phase, and extracted residual phase in a multi-tank system, and each phase recovered by centrifugation using a rotating device And what to do.
  • the intermediate phase containing a large amount of solid usually contains at least one liquid selected from the liquid of the extraction phase and the liquid of the extraction residual phase
  • the intermediate phase is subjected to solid-liquid separation, and the liquid of the extraction phase and the liquid of the extraction residual phase are separated. At least one liquid selected from the liquids can be separated and recovered.
  • the recovered liquid can be reused for the process after the phase separation process or can be reused for the process before the contact process. Recycling is preferable because the production efficiency of the aliphatic carboxylic acid and / or ammonium salt of sulfuric acid can be increased.
  • the solid-liquid separation method is not particularly limited, and methods such as sedimentation separation and filtration separation can be used.
  • sedimentation separation the solid content may be separated by sedimentation in a gravitational field, or the solid content may be separated by sedimentation in a centrifugal field. Centrifugal sedimentation is desirable to increase the sedimentation rate.
  • the operation method of solid-liquid separation may be batch operation or continuous operation.
  • Examples of the continuous centrifugal sedimentator include a screw decanter and a separation plate centrifugal sedimentator.
  • filtration separation the method is classified according to filter medium, filtration pressure, continuous operation / batch operation, etc., but any method is not particularly limited as long as the solid content can be separated from the extraction phase and / or the extraction residual phase.
  • the aperture of the filter medium is preferably 0.1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less. If it is 0.1 ⁇ m or less, the permeation flux becomes too small, and it may take too much time for filtration. On the other hand, if it is 10 ⁇ m or more, the solid content may be insufficiently separated.
  • the material of the filter medium needs to be insoluble in a solvent, and it is preferable to use a material made of a fluororesin such as tetrafluoroethylene.
  • a vacuum type, a pressure type, and a centrifugal type can be used.
  • the method may be either a continuous type or a batch type.
  • the solvent used in the contacting step is not particularly limited as long as it is phase-separated from an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid, but the ratio of inorganic value / organic value (hereinafter referred to as I / O).
  • O value may be abbreviated to 0.2 or more and 2.3 or less, and I / O value is more preferably 0.3 or more and 2.0 or less.
  • the boiling point of the solvent at normal pressure (1 atm) is preferably 40 ° C. or higher, and more preferably 60 ° C. or higher. Moreover, it is preferable that it is 120 degrees C or less, It is more preferable that it is 100 degrees C or less, It is especially preferable that it is 90 degrees C or less.
  • Inorganic values and organic values have been proposed by an organic conceptual diagram [“systematic organic qualitative analysis” by Satoshi Fujita, Kazama Shobo (1974)], and have been set in advance for functional groups constituting organic compounds.
  • the organic value and the inorganic value are calculated based on the numerical values, and the ratio is obtained.
  • Examples of the solvent having an I / O value of 0.2 or more and 2.3 or less and a boiling point of 40 ° C. or more at normal pressure include ketone solvents such as methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone and acetone, and ethers such as tetrahydrofuran and dioxane.
  • Examples thereof include system solvents, ester solvents such as ethyl acetate, nitrile solvents such as acetonitrile, and alcohols having 3 or more carbon chains such as propanol, butanol and octanol.
  • aliphatic carboxylic acid is selectively extracted into a solvent, and saccharides, amino acids and inorganic salts are mainly distributed to the aqueous solution phase, whereby both can be efficiently separated. Almost all the ammonium salt of sulfuric acid is recovered in the aqueous phase.
  • the ammonium salt of sulfuric acid can be recovered as an ammonium salt of sulfuric acid containing an organic component by a treatment such as concentration, crystallization, and drying together with the amino acid and saccharide recovered in the aqueous solution phase.
  • the ammonium salt of sulfuric acid is useful as a fertilizer because it contains an organic substance in an appropriate amount.
  • the operation of bringing the aqueous solution containing the aliphatic carboxylic acid and the ammonium salt of sulfuric acid into contact with the solvent that can be phase-separated with the aqueous solution may be performed in one stage or in multiple stages, but is performed in multiple stages. It is preferable. Further, the solvent may be flowed in parallel or countercurrent with respect to the aqueous solution containing the aliphatic carboxylic acid and the ammonium salt of sulfuric acid.
  • the contact process may be performed continuously or batchwise.
  • a particularly preferred form is shown in FIG.
  • an aqueous solution containing an aliphatic carboxylic acid and an ammonium salt of sulfuric acid and a solvent are mixed with a mixer settler and then separated into liquids, and an extraction phase, an intermediate phase, and a residual extraction phase are separated and recovered,
  • a mode in which the phases are separated into solid and liquid, and the separated and recovered liquid is phase-separated as necessary, and then returned to the steps after the phase separation step is preferable.
  • the aliphatic carboxylic acid is extracted into the solvent by a contact step in which the solvent as described above is brought into contact with an aqueous solution containing the aliphatic carboxylic acid and the ammonium salt of sulfuric acid.
  • the solvent is preferably added in a volume of 0.5 to 5 with respect to volume 1 at the temperature at the time of contact with the aqueous solution containing the aliphatic carboxylic acid, and is added in a volume of 1 to 3 with respect to volume 1. More preferred.
  • the temperature at which the solvent is brought into contact with the aqueous solution containing the aliphatic carboxylic acid and the ammonium salt of sulfuric acid is not particularly limited as long as the aliphatic carboxylic acid is extracted, but is preferably 30 to 60 ° C.
  • the contact temperature is set to 30 ° C. or higher, the increase in the viscosity of the solvent is suppressed, the time required for sedimentation of the generated solid content is shortened, the solid content is prevented from floating in the solvent phase, and the solvent phase is solid. It is possible to prevent the minute mixture.
  • the contact temperature is 60 ° C. or lower, the migration rate of the aliphatic carboxylic acid to the solvent phase is increased, the extraction rate is high, and the efficiency is good.
  • the time for contacting is not particularly limited as long as the aliphatic carboxylic acid is sufficiently extracted, and it is usually preferably about 1 second to 5 hours depending on the contact apparatus and the contact conditions. By setting the contact time to 1 second or longer, extraction of the aliphatic carboxylic acid into the solvent phase is sufficient. In addition, by reducing the contact time to 5 hours or less, the contact device is prevented from becoming unnecessarily large and efficient, while suppressing the denaturation of proteins coexisting with aliphatic carboxylic acids due to the solvent and reducing the solid content. can do.
  • the pressure at the time of contact is not particularly limited as long as the aliphatic carboxylic acid is sufficiently extracted, but it is usually preferable to operate at atmospheric pressure when continuously performed.
  • phase separation operation The phase separation operation in the phase separation step can be performed by standing in a tank for a certain period of time or can be performed by a centrifugal separator.
  • the mixer-settler type extractor as described above has a settler part that causes phase separation by allowing a mixed solution obtained by contact mixing to stand. In the settler part, the liquid can be phase-separated by standing for a certain time.
  • the phase separation step may be performed continuously or batchwise.
  • the temperature at the time of phase separation is not particularly limited as long as each phase can be separated, but it is preferably 30 to 60 ° C. and is preferably treated at the same temperature as the contact operation.
  • the phase separation temperature is set to 30 ° C. or higher, it is possible to prevent the liquid viscosity from becoming high and to easily separate the solid content, to prevent the solid content from being mixed into the solvent phase, and to reduce the amount of the solvent mixed into the solid content. be able to.
  • the phase separation temperature to 60 ° C. or lower, it is possible to prevent the aliphatic carboxylic acid from being back-extracted into the aqueous solution during the phase separation process.
  • the time for phase separation is not particularly limited as long as each phase is phase-separated. Usually, about 1 minute to 5 hours is preferable although it depends on the contact apparatus, contact conditions, and phase separation method.
  • phase separation time By setting the phase separation time to 1 minute or longer, phase separation is sufficient, and mixing of the aqueous solution or solid content into the solvent phase is prevented, and mixing of the solvent or solid content into the aqueous solution phase is prevented.
  • the separation time is prevented from becoming unnecessarily large and efficient.
  • the pressure at the time of phase separation is not particularly limited as long as the aliphatic carboxylic acid is sufficiently extracted, but in the case of continuous operation, it is usually preferable to operate at atmospheric pressure.
  • the recovered extracted residual phase contains several percent of solvent, it must be removed. That is, the solvent is removed from the extracted residual phase obtained in the extraction step by distillation.
  • the distillation method and operating conditions are not particularly limited, but the solvent in the final liquid after distillation is preferably 1% by weight or less, more preferably 0.1% by weight or less. More preferably, the content is 0.01% by weight or less.
  • the solvent may be distilled off by simple distillation depending on the solvent to be used, or may be distilled off while carrying out a return distillation in a distillation column.
  • the operation may be performed at normal pressure or at reduced pressure. Further, the operation may be continuous or batch.
  • the recovered solvent can be reused as the extraction solvent.
  • the concentration of the ammonium salt of sulfuric acid in the aqueous solution after the organic solvent removal step is generally low, so it is desirable to concentrate it to near the saturation solubility of the crystallization step. Concentration may be performed together with the removal of the organic solvent or after the removal of the organic solvent. However, if the concentration is carried out together with the removal of the organic solvent, the distillation apparatus becomes large. Therefore, a method of concentrating the organic solvent after distilling off with a distillation column is preferable.
  • Concentration method and apparatus are not particularly limited.
  • the operating conditions may be normal pressure or reduced pressure.
  • the operation may be continuous or batch.
  • the apparatus include a heating can type and a thin film evaporation type.
  • multiple effect cans and heat pumps can be used.
  • Neutralization may be performed in any step, but in the step of handling the acidic extracted residual phase at a high temperature, there is a concern about the corrosion of the apparatus, and therefore it is preferable to neutralize in a quick step as much as possible.
  • the neutralization treatment is performed before the solvent removal step, the recovered solvent is colored, so that the neutralization is more preferably performed after the solvent removal.
  • the reason why the recovered solvent is colored when the solvent is removed after neutralization is unknown.
  • Aliphatic carboxylic acids are present in the fermentation broth in the form of ammonium salts of aliphatic carboxylic acids.
  • the nitrogen-containing composition produced in the present invention contains not only ammonium sulfate but also various compounds inevitably coexisting from fermentation, such as organic acids, amino acids, proteins and saccharides, such as fertilizers. Useful as a raw material. In addition, it is also effective to mix these ammonium sulfates with a dried microorganism product used in fermentation.
  • aliphatic carboxylic acid of the present invention examples include oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, sebacic acid, malic acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, 2-oxoglutaric acid, and cis-aconitic acid.
  • adipic acid and succinic acid are preferred.
  • these aliphatic carboxylic acids are derived from biological materials.
  • biological raw materials include wood, rice straw, rice husk, rice bran, old rice, corn, sugar cane, cassava, sago palm, okara, corn cob, tapioca cass, bagasse, vegetable oil residue, persimmon, buckwheat, soybean, fat, waste paper, papermaking Residue, marine product residue, livestock excrement, sewage sludge, food waste and the like.
  • plant resources such as wood, rice straw, rice husk, rice bran, old rice, corn, sugar cane, cassava, sago palm, okara, corn cob, tapioca cass, bagasse, vegetable oil residue, persimmon, buckwheat, soybean, oil, waste paper and paper residue Is preferred.
  • These biological raw materials generally contain many alkali metals and alkaline earth metals such as elemental nitrogen, Na, K, Mg, and Ca. *
  • bio-derived materials are not particularly limited.
  • carbon materials are obtained through known pretreatment and saccharification processes such as chemical treatment with acid or alkali, biological treatment with microorganisms, and physical treatment. Guided to the source.
  • the process is not particularly limited, but includes, for example, a miniaturization process by pretreatment such as chipping, scraping, and crushing a biological material. If necessary, a grinding step with a grinder or a mill is further included.
  • the biological raw material thus refined is further guided to a carbon source through pretreatment and saccharification processes.
  • Specific methods include chemical methods such as acid treatment with strong acids such as sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid, alkali treatment, ammonia freeze steaming explosion method, solvent extraction, supercritical fluid treatment and oxidant treatment.
  • physical methods such as fine pulverization, steam blasting, microwave treatment and electron beam irradiation, and biological treatments such as hydrolysis by microorganisms or enzyme treatment.
  • hexose such as glucose, mannose, galactose, fructose, sorbose and tagatose
  • pentose such as arabinose, xylose, ribose, xylulose and ribulose
  • maltose sucrose, lactose
  • Disaccharides and polysaccharides such as trehalose, starch and cellulose, butyric acid, caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, monoctinic acid
  • Fatty acids such as arachidic acid, eicosenoic acid, arachidonic acid, behenic acid, erucic acid, docosapentaenoic acid, docosahex
  • an aliphatic carboxylic acid is derived from a carbon source derived from these biological materials.
  • fermentation methods by microbial conversion, and chemical conversion methods including reaction steps such as hydrolysis, dehydration reaction, hydration reaction, oxidation reaction, reduction reaction, and these fermentations
  • the carboxylic acid is synthesized by a combination of the method and the chemical conversion method.
  • a fermentation method by microbial conversion using a microorganism having an ability to produce an aliphatic carboxylic acid is preferable.
  • the microorganism having an aliphatic carboxylic acid-producing ability is not particularly limited as long as it is a microorganism having an aliphatic carboxylic acid-producing ability, and examples thereof include enterobacteria such as Escherichia coli, Bacillus bacteria, and coryneform bacteria. It is preferred to use aerobic microorganisms, facultative anaerobic microorganisms or microaerobic microorganisms.
  • Examples of the aerobic microorganism include Coryneform Bacterium, Bacillus genus bacteria, Rhizobium genus bacteria, Arthrobacter genus bacteria, Mycobacterium genus bacteria, Rhodococcus genus bacteria, and Rhodococcus genus bacteria.
  • Examples include Rhodococcus bacteria, Nocardia bacteria, and Streptomyces bacteria. Of these, coryneform bacteria are more preferred.
  • Coryneform bacteria are not particularly limited as long as they are classified as such, and examples include bacteria belonging to the genus Corynebacterium, bacteria belonging to the genus Brevibacterium, and bacteria belonging to the genus Arthrobacter. Among these, those belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium are preferable, such as Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium ammoniagenes or Brevibacterium amnigene. Bacteria classified as Bacterium lactofermentum are more preferred.
  • succinic acid-producing bacterium As an aliphatic carboxylic acid-producing bacterium, it is preferable to use a strain in which pyruvate carboxylase activity is enhanced and lactate dehydrogenase activity is reduced, as described in Examples below.
  • Reaction conditions such as reaction temperature and pressure in microbial conversion will depend on the activity of microorganisms such as selected cells and fungi, but suitable conditions for obtaining carboxylic acid should be selected in each case. That's fine.
  • neutralizing agents are usually used because the metabolic activity of microorganisms decreases or the activity of microorganisms stops when the pH is lowered, and the production yield deteriorates or the microorganisms die. It is preferable. Usually, it is preferable to measure the pH in the reaction system with a pH sensor and adjust the pH by adding a neutralizing agent so as to be in a predetermined pH range.
  • the pH value is preferably adjusted in a range where the activity is most effectively exhibited according to the type of microorganisms such as fungus bodies and molds to be used.
  • examples of the neutralizing agent include ammonia and ammonium carbonate.
  • the fermentation broth after microbial conversion may be appropriately concentrated in consideration of operability and efficiency in the subsequent purification step.
  • concentration method For example, the method of distribute
  • the fermented liquid when using a fermented liquid in the method of this invention, it is preferable to use the fermented liquid after removing microorganisms.
  • the method for removing the microorganisms is not particularly limited, and sedimentation separation, centrifugation and filtration separation, a method combining them, and the like are used.
  • centrifugation it is preferable to carry out by methods such as centrifugation and membrane filtration separation.
  • centrifugation centrifugal sedimentation, centrifugal filtration, or the like can be used.
  • the operating conditions are not particularly limited, but it is usually preferable to perform the separation with a centrifugal force of 100 G to 100,000 G.
  • the operation can be performed continuously or batchwise.
  • microfiltration and / or ultrafiltration can be used.
  • the material of the film is not particularly limited, and for example, an organic film such as polyolefin, polysulfine, polyacrylonitrile, and polyvinylidene fluoride, or a film made of an inorganic material such as ceramic can be used.
  • an operation method either a dead end type or a cross flow type can be used.
  • membrane filtration separation since microorganisms often clog the membrane, a method of performing membrane filtration after roughly removing the microorganisms by centrifugation or the like is also used.
  • the separated microorganisms can be used as fertilizers alone or mixed with a nitrogen-containing composition defined in this method.
  • LC high-performance liquid chromatography
  • amino acid quantitative analysis was performed using an amino acid analyzer under the following conditions.
  • protein quantification the sample was hydrolyzed with hydrochloric acid, and the increment of the total amino acid content before and after hydrolysis was regarded as the protein amount.
  • a medium [urea 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 6 mg, MnSO 4. 4-5H 2 O 6 mg, biotin 200 ⁇ g, thiamine 200 ⁇ g, yeast extract 1 g, casamino acid 1 g, glucose 20 g, dissolved in 1 L of distilled water] In 10 ml, Brevibacterium flavum MJ-233 strain until the late logarithmic growth phase The cells were cultured, and the cells were collected by centrifugation (10000 g, 5 minutes).
  • the obtained cells were suspended in 0.15 ml of a 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer (pH 8.0) / 1 mM EDTA ⁇ 2Na solution containing lysozyme at a concentration of 10 mg / ml.
  • proteinase K was added to the above suspension so that the final concentration was 100 ⁇ g / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis.
  • (B) Construction of a plasmid for PC promoter substitution The DNA fragment of the N-terminal region of the pyruvate carboxylase gene derived from Brevibacterium flavum MJ233 strain was obtained using the DNA prepared in (A) above as a template and the entire genome sequence was reported. This was performed by PCR using synthetic DNA (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) designed based on the sequence of the gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain (Cgl0689 of GenBank Database Accession No. BA00000036). The DNA of SEQ ID NO: 1 used was phosphorylated at the 5 ′ end.
  • composition of reaction solution Template DNA 1 ⁇ L, PfxDNA polymerase (manufactured by Invitrogen) 0.2 ⁇ L, 1 ⁇ concentration attached buffer, 0.3 ⁇ M each primer, 1 mM MgSO 4 , 0.25 ⁇ M dNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ L.
  • DNA thermal cycler PTC-200 manufactured by MJ Research was used, and a cycle of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 4 minutes.
  • Confirmation of the amplification product was performed by separating by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis and then visualized by ethidium bromide staining to detect a fragment of about 0.9 kb. Recovery of the target DNA fragment from the gel was performed using QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), and this was used as the PC gene N-terminal fragment.
  • agarose SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts
  • the TZ4 promoter fragment derived from Brevibacterium flavum MJ233 strain is constitutively highly expressed using plasmid pMJPC1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-95169) as a template, and the synthetic DNAs described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 It was prepared by PCR using The DNA of SEQ ID NO: 4 used was phosphorylated at the 5 'end.
  • composition of reaction solution 1 ⁇ L of template DNA, 0.2 ⁇ L of Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), 1 ⁇ concentrated buffer, 0.3 ⁇ M each primer, 1 mM MgSO 4 , 0.25 ⁇ M dNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ L.
  • DNA thermal cycler PTC-200 manufactured by MJ Research
  • a cycle of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 25 times.
  • the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds
  • the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 3 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by 1.0% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis and visualization by ethidium bromide staining to detect a fragment of about 0.5 kb. Recovery of the target DNA fragment from the gel was performed using QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), and this was used as the TZ4 promoter fragment.
  • the PC gene N-terminal fragment prepared above and the TZ4 promoter fragment were mixed, and ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo), cleaved with the restriction enzyme PstI, separated by 1.0% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.0 kb was extracted with QIAQuick Gel Extraction Kit (Manufactured by QIAGEN) was used as a TZ4 promoter: PC gene N-terminal fragment. Further, this DNA fragment and E. coli plasmid pHSG299 (Takara Shuzo) were mixed with DNA prepared by cutting with PstI, and ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) were used for connection.
  • ligation kit ver. 2 manufactured by Takara Shuzo
  • Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) was transformed with the obtained plasmid DNA.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kana machine and 50 ⁇ g / ml X-Gal. Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified.
  • the obtained plasmid DNA was cleaved with the restriction enzyme PstI, whereby an inserted fragment of about 1.0 kb was recognized, and this was named pMJPC17.1.
  • the DNA fragment of the 5 ′ upstream region of the pyruvate carboxylase gene derived from Brevibacterium flavum MJ233 strain was obtained from Corynebacterium glutamicum ATCC13032, in which the entire genome sequence has been reported using the DNA prepared in (A) as a template. It was carried out by PCR using synthetic DNA (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) designed based on the sequence of the gene of the strain (GenBank Database Accession No. BA000036).
  • composition of reaction solution Template DNA 1 ⁇ L, PfxDNA polymerase (manufactured by Invitrogen) 0.2 ⁇ L, 1 ⁇ concentration attached buffer, 0.3 ⁇ M each primer, 1 mM MgSO 4 , 0.25 ⁇ M dNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ L.
  • DNA thermal cycler PTC-200 manufactured by MJ Research
  • a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 35 times.
  • the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds
  • the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by 1.0% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis and visualization by ethidium bromide staining, and a fragment of about 0.7 kb was detected. Recovery of the target DNA fragment from the gel was performed using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4 Polynucleotide Kinase: Takara Shuzo), and then ligated kit ver. 2 (Takara Shuzo) was used to bind to the SmaI site of E. coli vector pUC119 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) was transformed with the resulting plasmid DNA.
  • T4 Polynucleotide Kinase Takara Shuzo
  • ligated kit ver. 2 (Takara Shuzo) was used to bind to the SmaI site of E. coli vector pUC119 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) was transformed with the resulting plasmid DNA.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and 50 ⁇ g / ml X-Gal. Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. The obtained plasmid DNA was subjected to a PCR reaction using the synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 6 as primers.
  • Reaction solution composition 1 ng of the above plasmid, Ex-Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.2 ⁇ L, 1 ⁇ concentration attached buffer, 0.2 ⁇ M each primer, 0.25 ⁇ M dNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ L.
  • DNA thermal cycler PTC-200 manufactured by MJ Research
  • a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds and 72 ° C. for 50 seconds was repeated 20 times.
  • the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute 20 seconds
  • the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 5 minutes.
  • pMJPC5.1 a plasmid that recognizes an amplification product of about 0.7 kb was selected and named pMJPC5.1.
  • pMJPC17.1 and pMJPC5.1 were cut with restriction enzyme XbaI and mixed, and ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) were used for connection.
  • the DNA fragment cleaved with restriction enzyme SacI and restriction enzyme SphI was separated by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMCBioProducts) gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.75 kb was manufactured by QIAQUICK Gel Extraction Kit (QIAGEN Kit) ).
  • a DNA fragment in which the TZ4 promoter was inserted between the 5 ′ upstream region and the N-terminal region of this PC gene was cleaved with SacI and SphI from plasmid pKMB1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-95169) containing the sacB gene.
  • SacI and SphI from plasmid pKMB1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-95169) containing the sacB gene.
  • plasmid pKMB1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-95169
  • Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) was transformed with the obtained plasmid DNA.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kana machine and 50 ⁇ g / ml X-Gal. Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. By cutting the obtained plasmid DNA with restriction enzymes SacI and SphI, an insert fragment of about 1.75 kb was observed, which was named pMJPC17.2 (FIG. 2).
  • Plasmid DNA used for transformation of Brevibacterium flavum MJ233 / ⁇ LDH (strain with reduced LDH activity: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-95169) is the plasmid DNA of pMJPC17.2. From Escherichia coli JM110 transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970).
  • the Brevibacterium flavum MJ233 / ⁇ LDH strain was transformed by the electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p.181-185, 1993), and the resulting transformant contained 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • LBG agar medium [tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g, glucose 20 g, and agar 15 g dissolved in 1 L of distilled water] was smeared.
  • the strain grown on this medium is a plasmid in which pMJPC17.2 is a plasmid that cannot be replicated in Brevibacterium flavum MJ233 strain, so the PC gene of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibacterium flavum MJ233 strain As a result of homologous recombination with the kanamycin, the kanamycin resistance gene and sacB gene derived from the plasmid should be inserted on the genome.
  • the above homologous recombinant strain was subjected to liquid culture in an LBG medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin. A portion equivalent to about 1 million cells of this culture was smeared on a 10% sucrose-containing LBG medium. As a result, sacB gene was removed by the second homologous recombination and sucrose-insensitive sucrose strains were obtained.
  • the strains thus obtained include those in which the TZ4 promoter derived from pMJPC17.2 is inserted upstream of the PC gene and those that have returned to the wild type. Confirmation of whether the PC gene is promoter-substituted type or wild type can be easily confirmed by subjecting the cells obtained by liquid culture in LBG medium to direct PCR reaction and detecting the PC gene. .
  • the pH was kept at 7.2% or lower using 28% aqueous ammonia, the main culture was started at aeration of 3.0 L / min, back pressure of 0.05 MPa, and stirring at 750 rpm. After the dissolved oxygen concentration dropped to almost 0, when it started to rise again and reached 1 ppm, about 5.3 g of a 72% sucrose aqueous solution sterilized in advance was added. Each time the dissolved oxygen concentration increased again, the addition of aqueous sucrose solution was repeated by the above method, and continued for 19 hours after the start of culture.
  • Reaction temperature is 40 ° C.
  • stirring speed is 150 per minute
  • pH is adjusted to 7.35 by sequential addition of neutralizing agent (ammonium bicarbonate: 171 g, 28% ammonia water: 354 g, distilled water: 529 g).
  • neutralizing agent ammonium bicarbonate: 171 g, 28% ammonia water: 354 g, distilled water: 529 g. The process was terminated when the residual sucrose in the reaction solution became 0.1 g / L or less.
  • succinic acid fermented liquid The supernatant obtained by centrifuging (15,000 G, 5 minutes) the succinic acid fermentation broth prepared as described above was obtained (hereinafter sometimes referred to as succinic acid fermented liquid).
  • Table 2 below shows the composition analysis results of the supernatant.
  • Example 1 ⁇ Protonation> 98% sulfuric acid was added to 1500 g of the above succinic acid fermentation broth to adjust the pH to 2.5.
  • the addition amount of 98% sulfuric acid was 150 g.
  • the aqueous succinic acid solution after the addition of sulfuric acid is composed of a jacketed static mixer (Noritake 1/4 (1) -N40-174-0 (inner diameter ⁇ 5 mm, number of elements 24)) and three tanks with jackets of 600 ml, 400 ml and 300 ml.
  • Succinic acid was continuously extracted by mixing and liquid-separating with methyl ethyl ketone (hereinafter sometimes abbreviated as MEK) using a settling formula.
  • the extraction phase overflowed the weir between the first tank and the second tank and was supplied to the second tank.
  • insoluble components that could not be separated in the first tank were allowed to settle to the bottom, and only the clear extraction phase was allowed to overflow the weir between the second tank and the third tank and supplied to the third tank.
  • the clear extraction phase was overflowed from the liquid interface vicinity, and the extraction phase was collect
  • the extraction phase remaining in each tank, the extracted residual phase, and the insoluble components remaining in the first tank intermediate phase and the second tank bottom were recovered.
  • the recovered extracted phase, extracted residual phase, and intermediate phase were 688 g, extracted residual phase 1613 g, and intermediate phase 173 g, respectively.
  • 1613 g of the collected residual phase was continuously extracted using a jacketed continuous extraction tower (10 theoretical plates) with an inner diameter of ⁇ 20 mm and a height of 2 m to recover succinic acid.
  • the extracted residual phase was supplied from the top of the tower at 200 g / hour, and a MEK solution adjusted to a water content of 10% by weight in advance from the bottom of the tower was supplied at 200 g / hour and continuously extracted.
  • the continuous phase was the extracted residual phase, and the dispersed phase was the MEK phase (light liquid dispersion).
  • the temperature of the extraction tower was controlled at 30 ° C. by passing warm water through the jacket. Finally, 1777 g of the extraction phase and 1449 g of the extracted residual phase were recovered.
  • the recovered distillate was an azeotropic composition (MEK 89 wt%, water 11 wt%) consisting of MEK and water slightly colored yellow.
  • ⁇ Crystal> The concentrated solution was transferred to a jacketed 1000 ml stirring tank. While flowing warm water of 45 ° C through the jacket, the pressure in the crystallization tank was gradually reduced to 7 kPa under stirring, and 95 g of water was distilled while controlling the pressure after reaching 7 KPa (internal temperature of about 40 ° C) ( Ammonium sulfate was precipitated by 20% by weight with respect to the charged solution. After a predetermined amount of water was distilled off, the pressure in the crystallization tank was returned to atmospheric pressure, and the temperature of warm water flowing through the jacket was set to 40 ° C. and aged for about 1 hour.
  • ammonium sulfate slurry was filtered under reduced pressure and separated into a wet cake and a mother liquor.
  • the obtained wet cake was further dried with an 80 ° C. hot air dryer for about 7 hours to recover 87 g of ammonium sulfate and 288 g of the mother liquor.
  • Example 2 ⁇ Protonation / Extraction / Neutralization / Concentration>
  • the succinic acid fermentation broth was protonated by the same method except that 1500 g of the succinic acid fermentation broth used in Example 1 was changed to 1000 g, and the protonated liquid was subsequently extracted with the MEK solution.
  • the extracted residual phase was distilled and neutralized, further concentrated to an ammonium sulfate concentration of 40% by weight, and 329 g of the concentrated liquid was recovered.
  • Table 7 shows the analysis result of the composition of the obtained ammonium sulfate
  • Table 8 shows the analysis result of the composition of the obtained mother liquor.
  • Half of the recovered mother liquor was used for recycling.
  • the other half was dried on a hot plate heated to 150 ° C. to recover 65 g of brown ammonium sulfate powder.
  • Example 3 The extraction to crystallization operation was further repeated 5 times while recycling half of the crystallization mother liquor in the same procedure as in Example 2.
  • Table 10 shows the analysis results of ammonium sulfate obtained by crystallization, ammonium sulfate obtained by drying the mother liquor, and the composition of each mother liquor.
  • the nitrogen-containing composition mixed with all the collected ammonium sulfate When the test was carried out, no abnormal symptoms were observed in the growth of the plant due to harmful substances.
  • Table 11 shows the composition analysis results of the nitrogen-containing composition mixed as a fertilizer.
  • Example 4 In the method of Example 1, ammonium sulfate was recovered according to the same method except that the order of distillation and neutralization was changed. The handling property in each operation and the recovered ammonium sulfate were both substantially the same as in Example 1. However, the distillate obtained by distillation (azeotropic composition comprising MEK and water) was colored yellow.
  • Comparative Example 1 According to the same method as in Example 1, except that the entire amount of the crystallization mother liquor was recycled, the extraction to crystallization operations were repeated 5 times while the crystallization mother liquor was recycled to recover ammonium sulfate. The results are shown in Table 12 below. Each time recycling is repeated, the time required for the vacuum filtration [filter paper (5C)] of the ammonium sulfate slurry becomes longer. In the fifth recycling, solid-liquid separation cannot be achieved by vacuum filtration, and a tabletop centrifugal filter (filter cloth) is used. Solid-liquid separation was performed at 3000G.
  • Table 12 shows the results of analysis of the ammonium sulfate obtained by crystallization, the ammonium sulfate obtained by drying the mother liquor, and the composition of each mother liquor.

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Abstract

　生物由来原料から得られる脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および含窒素組成物を安定的かつ効率的に回収する方法を提供することを課題とする。　生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程、晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程、および固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする晶析母液の量は晶析母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。

Description

含窒素組成物およびその製造方法
　本発明は生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖およびセルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族カルボン酸アンモニウムを含む水溶液に硫酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物の回収方法に関する。
　コハク酸およびアジピン酸などの脂肪族カルボン酸は、食品、医薬品およびその他化学品の合成原料として広く用いられている。これらの脂肪族カルボン酸は、従来、石油由来の原料より、工業的に製造されてきた。しかし、近年では、微生物を用いた発酵操作により、広い生物由来原料から高い炭素収率で、種々の脂肪族カルボン酸を製造することができる。例えば、コハク酸およびアジピン酸などは、発酵により製造することができる。
　発酵による脂肪族カルボン酸の製造において、原料となるのは、一般に糖類であり、グルコース、ブドウ糖およびセルロースなどである。しかし、多糖類が不純物として含まれる場合や、原料の糖類が微生物に完全に資化されずに残り、脂肪族カルボン酸に糖類が混入することがある。また、微生物を用いた発酵で、アンモニアを中和剤として用いることが広く知られているが、その場合、アミノ酸も副生する。
　アンモニアを中和剤として用いた場合、発酵液中の脂肪族カルボン酸はアンモニウム塩として存在するが、脂肪族カルボン酸を回収するには、酸で塩交換する必要がある。ここで酸として硫酸を用いると脂肪族カルボン酸とともに硫酸のアンモニウム塩が副生する。
　脂肪族カルボン酸の回収方法は多くの報告がある。一方、副生する硫酸のアンモニウム塩は、発酵副生物も多く含み、肥料として有用であるにもかかわらず、その回収方法について報告されたものはほとんどない。
　硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液からの硫酸のアンモニウム塩の回収方法としては晶析法が一般的であり、通常は充分な硫酸のアンモニウム塩の回収率を得るために、晶析母液のリサイクルを伴うことが多い。
　ただし、発酵副産物を含む硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から晶析により硫酸のアンモニウム塩を回収し、その母液をリサイクルすると、発酵副産物がリサイクル系内に蓄積し、液粘性を増加させるなど、晶析、後に続く固液分離において悪影響をおよぼす。
　一方、母液をリサイクルせずに硫酸のアンモニウム塩を回収しようとすると、その水溶液を直接乾燥することになるが、水溶液を直接乾燥するには乾燥機が限定されるばかりか、能力的に限界もあった。
　本発明は、生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖およびセルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族カルボン酸アンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物を安定的かつ効率的に回収する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に記載する本発明の製造方法により上記課題を解決できることを見出した。さらに本発明の製造方法で得られた含窒素組成物が含窒素肥料として有用なことを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の要旨は以下の［１］から［１２］にある。
［１］生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩、および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）～（３）を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。
（１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
（２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
（３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする母液の量は母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程
［２］固液分離工程で得られた晶析母液を乾燥機で蒸発乾固し、硫酸のアンモニウム塩を回収する晶析母液乾燥工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［３］生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加えた後、該水溶液と相分離可能な溶剤とを混合し接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程を含むことを特徴とする、［１］または［２］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［４］相分離工程後の水溶液を蒸留し、水溶液から溶剤を除去する有機溶剤除去工程を含むことを特徴とする、［３］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［５］有機溶剤除去後の水溶液を濃縮し、水溶液中の硫酸のアンモニウム塩の濃度を増加させる濃縮工程を含むことを特徴とする、［４］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［６］相分離工程後の水溶液にアルカリを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含むことを特徴とする、［３］から［５］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［７］抽残相中和工程で用いるアルカリが、アンモニアであることを特徴とする［６］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［８］抽残相中和工程が、有機溶剤除去工程の後に行われることを特徴とする、［６］または［７］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［９］抽残相中和工程が、濃縮工程の前に行われることを特徴とする、［６］から［８］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。　
［１０］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１５重量％以下であることを特徴とする、［１］から［９］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［１１］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、［１０］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［１２］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液の量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、１０％重量以上８０重量％未満であることを特徴とする、［１］から［９］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［１３］［１］から［１２］いずれか１に記載の製造方法で製造された含窒素組成物であって、該含窒素組成物に含まれる全窒素が、１５重量％以上２１重量％未満で、かつ全窒素の９０重量％以上がアンモニウム性窒素であることを特徴とする含窒素組成物。
［１４］［１３］に記載の含窒素組成物を含む肥料原料。
［１５］［１３］に記載の含窒素組成物を含む肥料。
　本発明の方法によれば、生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪酸カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物を効率的かつ安定的に脂肪族カルボン酸を製造することができる。
図１は、含窒素組成物の製造方法の一形態を示す図面である。 図２は、プラスミドｐＭＪＰＣ１７．２の構築手順を示す図であって、下線の数字は当該配列番号の配列からなるプライマーを示す。
　以下、本発明の実施の形態につき詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は本発明の実施形態の代表例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変形して実施することができる。
　本発明の含窒素組成物の製造方法は、生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩、および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）～（３）を含むものである。
（１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
（２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
（３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルすることを特徴とする晶析母液リサイクル工程
　＜晶析工程＞
　晶析工程では、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する。濃縮晶析では、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から水を蒸発させ、硫酸のアンモニウム塩を飽和溶解度以上に濃縮することで、硫酸のアンモニウム塩を析出させる。
　晶析は常圧で行っても、減圧で行ってもよいが、減圧で行えば、水の気化熱による硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液の冷却を伴い、硫酸のアンモニウム塩の飽和溶解度の温度依存性による析出も期待でき、収率の観点から好ましい。
　特に、晶析圧力は１～５０ｋＰａとすることが好ましく、２～２０ｋＰａとすることがより好ましい。また、晶析温度は操作圧力で決まり、５～８０℃とすることが好ましく、１０～６０℃とすることがより好ましい。
　晶析圧力を１ｋＰａ以上とすることにより、減圧のための設備を小さくすることができ、蒸発した水を凝縮回収が容易となる。また、晶析圧力を５０ｋＰａ以下とすることにより、晶析温度が高くなるのを防ぎ、硫酸のアンモニウム塩の収率を向上することができる。
　減圧の発生装置は特に限定するものではないが、保守および管理の面から、水またはスチームエゼクターが好ましい。また、蒸発水の凝縮にはバロメトリックコンデンサーが広く用いられる。
　晶析操作はバッチ操作であっても連続操作であっても構わないが、硫酸のアンモニウム塩を効率的に晶析するとともに晶析のために要するエネルギーを小さく生産でき、且つ結晶サイズのばらつきを小さくできるなどの理由により、連続操作が好ましい。また晶析装置は特殊な晶析槽である必要は無く、公知の攪拌槽を用いることができる。
　＜固液分離工程＞
　晶析で得られた硫酸のアンモニウム塩スラリーは固液分離操作により硫酸のアンモニウム塩結晶および母液を分離する。分離方法は特に限定するものではなく、例えば、ろ過分離および沈降分離などが挙げられる。また操作はバッチでも連続でもよい。
　効率の良い固液分離機として、例えば、連続式の遠心ろ過機およびデカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。また、求められる硫酸のアンモニウム塩の純度により、固液分離操作で回収したウェットケーキは、冷水等でリンスすることができる。
　さらに、回収した硫酸のアンモニウム塩結晶は通常乾燥する。乾燥方法は特に限定するものではないが、例えば、バンド式乾燥機、回転式乾燥機および流動層式乾燥機などが挙げられる。また、後述する晶析母液乾燥工程で得られる硫酸のアンモニウム塩と乾燥機内で混合することを考えると、回転式乾燥機および流動層式乾燥機などが好ましい。
　＜晶析母液リサイクル工程＞
　固液分離工程で得られた晶析母液の少なくとも一部は、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルすることができる。ただし本発明の製造方法においては、リサイクル量は晶析母液全量ではない。
　晶析母液のリサイクル量は晶析母液の組成、性状によるので一概に決められるものではないが、晶析母液の１０重量％以上であることが好ましく、２０重量％以上であることがより好ましく、３０重量％以上であることが更に好ましく、４０重量％以上であることが特に好ましい。また、９９重量％未満であることが好ましく、９０重量％未満であることがより好ましく、８０重量％未満であることが更に好ましく、７５重量％未満であることが特に好ましい。
　晶析母液中には、硫酸のアンモニウム塩だけでなく発酵由来の種々共存物、例えば、リンゴ酸などの有機酸、アラニンおよびバリンなどのアミノ酸、タンパク質並びに糖類などを含んでいる。晶析母液全量をリサイクルすると、これら共存物がリサイクル系内に蓄積し、リサイクル系内の液粘性が増加していき、晶析工程、固液分離工程に支障をきたす。
　また、共存物を除去するために活性炭で処理したり、母液のリサイクル量を少なくすると、製造する含窒素組成物の量が少なくなったり、処理工程が増えたりすることにより、製造効率が低下して好ましくない。
　このため、晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、全リサイクル工程を通して０．１重量％以上１５重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましい。
　更に、晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、全リサイクル工程を通して０．１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、８重量％以下であることがより好ましい。
　晶析母液の粘度は、リサイクル量を制御することにより、晶析する際の温度において、０．５～１００ｃＰとなるよう制御することが好ましく、１～５０ｃＰであることがより好ましく、１～２０ｃＰであることがさらに好ましい。
　晶析母液の粘度を１００ｃＰ以下とすることにより、特に固液分離工程に悪影響がおよぶのを防ぐ。例えばデカンターのような連続式遠心沈降機で固液分離を行う場合に、晶析母液の粘度が高くなりすぎるのを防ぎ、結晶沈降速度の低下を抑制し、固液分離ができなくなるのを防ぐ。晶析母液の粘度の上昇を抑えるには、晶析母液中の硫酸のアンモニウム塩以外の非揮発性成分濃度を３０重量％以下に制御することが好ましい。
　＜晶析母液乾燥工程＞
　分離した母液は硫酸のアンモニウム塩の他発酵由来の種々不純物、例えば、有機酸、アミノ酸、タンパク質および糖類などを含んでおり液肥もしくはその原料として有効であるが、直接乾燥して粉体として回収することもできる。
　乾燥方法は特に限定するものではないが、液状物から粉体を回収する方法として、例えば、スプレードライヤーおよびディスクドライヤーなどの乾燥機が好ましい。また、回収した硫酸のアンモニウム塩を含む組成物は、晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩と混合することもできる。
　＜接触工程と相分離工程＞
　本発明の脂肪族カルボン酸の製造方法では、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程を有する。
　相分離工程において、溶剤相（以下、抽出相と記載することがある）、相界面に生成する固形分を含む相（以下、中間相と記載することがある）、水溶液相（以下、抽残相という記載することがある）は、以下のように回収することができる。
　接触工程をバッチ操作により行う場合には、例えば、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液に該水溶液と相分離可能な溶剤を加え、接触させて充分混合した後に、相分離工程において、抽出相、中間相および抽残相を、各相付近から排出口により取出す方法、および前記接触を行った容器の底部から順次取り出す方法等により、それぞれ分離回収することができる。固形分を多く含む中間相は抽出相とともに取り出すことも可能であるし、抽残相とともに取り出すことも可能である。
　また、例えば、接触工程を連続操作により行う場合には、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触混合するミキサーを有するミキサー部と、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させる工程（以下、相分離工程と記載することがある）に適用するセトラーを有するセトラー部とからなる、接触装置（以下、ミキサーセトラー型抽出機と記載することがある）を用いた相分離工程において、セトラー部で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収することができる。
　（接触装置）
　接触装置は脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と溶剤との接触、溶剤相および水溶液相の回収、並びに固形分の除去ができればどのような装置であってもかまわないが、装置が簡単で操作も容易な、上記のミキサーセトラー型抽出装置が好ましい。
　ミキサーは、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とが充分混合すれば如何なる方式でもよく、例えば、攪拌装置を有する容器およびスタティックミキサーなどが挙げられる。
　ただし攪拌装置を有する容器を用いるケースにおいては、攪拌により容器内に巻き込まれた空気などの気泡が発生した固形分に付着し、後続のセトラー部における固形分の相分離を著しく阻害するので、空気などを巻き込まない条件で攪拌することが好ましい。操作許容範囲の広さおよび設備費用の観点から、ミキサーはスタティックミキサーとするのが好ましい。
　（相分離装置）
　セトラーは、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させた後の液を相分離することが可能なものであれば如何なる方式であってもよい。例えば、一槽で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、並びに多槽式で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、回転装置による遠心分離により各相を回収するもの、などが挙げられる。
　固形物を多く含む中間相は、通常、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を含むため、中間相を固液分離し、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を分離し、回収することができる。
　回収した液は、相分離工程以降の工程に再利用することもできるし、接触工程以前の工程に再利用することもできる。再利用することで脂肪族カルボン酸および／または硫酸のアンモニウム塩の製造効率を高めることができるので好ましい。
　固液分離方法は特に限定されるものではなく、沈降分離、ろ過分離などの方法を用いることができる。沈降分離においては、重力場で固形分を沈降分離しても、また遠心力場において固形分を沈降分離してもよい。沈降速度を高めるため、遠心沈降分離が望ましい。
　固液分離の操作の方式は、バッチ操作でも連続操作でも構わない。連続式の遠心沈降機としては、例えば、スクリューデカンターおよび分離板式遠心沈降機が挙げられる。ろ過分離において、その方法は、ろ材、ろ過圧力、連続操作・バッチ操作などで分類されるが、いずれも固形分を抽出相および／または抽残相と分離できれば特に限定するものではない。
　ただし、ろ材の目開きは０．１μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。０．１μｍ以下では、透過流束が小さくなりすぎるため、ろ過に時間がかかりすぎる虞がある、一方１０μｍ以上では、固形分の分離が不十分となる虞がある。
　また、ろ材の材質は溶剤に不溶である必要があり、テトラフルオロエチレンなどのフッ素系樹脂からなるものを用いることが好ましい。ろ過は、真空式、加圧式および遠心式のいずれも用いることができる。さらに、その方式は、連続式およびバッチ式のいずれでも構わない。
　（溶剤）
　接触工程において使用される溶剤は、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液と相分離するものであれば特に制限は無いが、無機性値／有機性値の比（以下、Ｉ／Ｏ値と略記することがある）が０．２以上２．３以下であることが好ましく、Ｉ／Ｏ値が０．３以上２．０以下であることがより好ましい。溶剤のＩ／Ｏ値を当該範囲とすることにより、脂肪族カルボン酸を選択的に抽出して、効率よく夾雑不純物および硫酸のアンモニウム塩と分離できる。
　また、常圧（１気圧）における溶剤の沸点は、４０℃以上であることが好ましく、６０℃以上であることがより好ましい。また、１２０℃以下であることが好ましく、１００℃以下であることがより好ましく、９０℃以下であることが特に好ましい。
　溶剤の沸点を前記範囲とすることにより、溶剤が気化して引火する危険性、溶剤が気化して脂肪族カルボン酸の抽出効率が低下するという問題、および溶剤のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。また、使用後の溶剤を蒸留などの方法により分離したり、精製して再利用したりする際の必要熱量が少なくてすむという利点がある。
　無機性値及び有機性値は、有機概念図論［「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４）］により提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値及び無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
　Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の溶剤としては、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンおよびアセトン等のケトン系溶媒、テトラヒドロフランおよびジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、並びにプロパノール、ブタノールおよびオクタノール等の炭素鎖３以上のアルコールが挙げられる。
　各溶剤のＩ／Ｏ値および沸点を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本接触工程により、脂肪族カルボン酸を選択的に溶剤中に抽出し、糖類、アミノ酸類および無機塩類を主に水溶液相に分配することで、両者を効率的に分離することができる。硫酸のアンモニウム塩は、ほぼ全てが水溶液相に回収される。
　硫酸のアンモニウム塩は、水溶液相に回収されたアミノ酸および糖類とともに、濃縮、晶析および乾燥等の処理により、アミノ酸および糖類を、有機分を含む硫酸のアンモニウム塩として回収することができる。該硫酸のアンモニウム塩は、有機物を適度に含むことから肥料として有用である。
　（接触操作）
　接触工程における、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる操作は、一段で行っても、多段で行ってもよいが、多段で行うことが好ましい。また、溶剤は、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液に対して並流で流しても、向流で流しても構わない。
　接触工程は連続的に行ってもよいし、回分的に行っても構わない。特に好ましい形態を、図１に示す。図１に示すように、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と溶剤とをミキサーセトラーで混合した後に液々分離し、抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ分離回収し、中間相を固液分離し、分離回収した液を必要に応じて相分離した後に、相分離工程以後の工程に戻す形態が好ましい。
　上記のような溶剤と、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液とを接触させる接触工程により、脂肪族カルボン酸を溶剤に抽出する。ここで、溶剤は、脂肪族カルボン酸を含有する水溶液の接触時の温度における容積１に対し０．５～５の容積で加えることが好ましく、容積１に対し１～３の容積で加えることがより好ましい。
　溶剤と脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液とを接触させる際の温度は、脂肪族カルボン酸が抽出される温度であれば特に限定されないが、３０～６０℃が好ましい。接触温度を３０℃以上とすることにより、溶剤の粘度が上昇するのを抑え、生成した固形分の沈降に要する時間が短くなり、固形分が溶剤相に浮遊するのを防ぎ、溶剤相に固形分が混入するのを防ぐことができる。一方、接触温度を６０℃以下とすることにより、脂肪族カルボン酸の溶剤相への移行率が高くなり、抽出率が高く、効率が良い。
　接触する際の時間は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件にもよるが通常１秒～５時間程度が好ましい。接触時間を１秒以上とすることにより、脂肪族カルボン酸の溶剤相への抽出が十分となる。また、接触時間を５時間以下とすることにより、接触装置が無用に大きくなるのを防ぎ、効率的であるとともに、脂肪族カルボン酸に共存するタンパク質類の溶剤による変性を抑え、固形分量を低減することができる。
　接触する際の圧力は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作することが好ましい。
　（相分離操作）
　相分離工程における相分離操作は、槽で一定時間静置することでも可能であるし、遠心分離装置により行うこともできる。上記のようなミキサーセトラー型抽出機では、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させるセトラー部を有している。該セトラー部において、液を一定時間静置することにより相分離することができる。相分離工程は連続的に行ってもよいし、回分的に行ってもよい。
　相分離する際の温度は、各相が分離可能な温度であれば特に限定されないが、３０～６０℃が好ましく、かつ接触操作と同程度の温度で処理することが好ましい。相分離温度を３０℃以上することにより、液粘性が高くなるのを防ぎ固形分の分離が容易となるとともに、溶剤相に固形分が混入するのを防ぎ、固形分に混入する溶剤量が抑えることができる。また、相分離温度を６０℃以下とすることにより、相分離の過程で脂肪族カルボン酸が水溶液中に逆抽出されるのを防ぐことができる。
　相分離する際の時間は、各相が相分離される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件、相分離方法にもよるが通常１分～５時間程度が好ましい。相分離時間を１分以上とすることにより、相分離が十分となり、溶剤相への水溶液または固形分の混入を防ぐとともに、水溶液相への溶剤または固形分の混入を防ぐ。一方、分離時間を５時間以下とすることにより、相分離装置が無用に大きくなるを防ぎ、効率的である。
　また相分離する際の圧力は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作することが好ましい。
　＜有機溶剤除去工程＞
　回収された抽残相には数％の溶剤が含まれるため、除去する必要がある。すなわち抽出工程で得られた抽残相は蒸留操作により溶剤を除去する。蒸留方法、操作条件は特に限定されるものではないが、最終的に蒸留後の釜残液中の溶剤が１重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがより好ましく、０．０１重量％以下であることがさらに好ましい。
　すなわち、用いる溶剤により単蒸留で溶剤を留去してもいいし、蒸留塔で還留をかけながら留去してもいい。またその操作は常圧で行っても、減圧で行ってもいい。さらにその操作は連続でも、バッチでも構わない。回収した溶剤は抽出溶剤として再利用できる。
　＜濃縮工程＞
　有機溶剤除去工程後の水溶液において硫酸のアンモニウム塩の濃度は、一般にその濃度が低いので晶析工程飽和溶解度近くまで濃縮することが望ましい。濃縮は有機溶剤除去と共に行っても良いし、有機溶剤除去後に行っても良い。ただし濃縮を有機溶剤の除去と共に行なうと蒸留装置が大きくなるため、有機溶剤を蒸留塔で留去した後に濃縮する方法が好ましい。
　濃縮方法、装置は特に限定されるものではない。例えば、操作条件は常圧でも、減圧でも構わない。さらに、その操作は連続でも、バッチでも構わない。また、装置としては、例えば、加熱缶タイプおよび薄膜蒸発タイプなどが挙げられる。さらに省エネルギーの観点から、多重効用缶およびヒートポンプなども利用できる。
　＜抽残相中和工程＞
　通常、抽残相は酸性であるので、回収した硫酸のアンモニウムの塩を肥料または肥料原料として用いるには、アルカリを添加することで中性付近まで中和することが好ましい。ここではアルカリとしてアンモニアを用い、ｐＨを４～８程度に調整するのが好ましい。
　中和はいずれの工程で行ってもよいが、酸性の抽残相を高温でハンドリングする工程においては装置の腐食の懸念があるため、極力はやい工程で中和するのが好ましい。ただし、中和処理を溶剤除去工程前に行うと、回収した溶剤が着色するため、中和は溶剤除去後に行うのがより好ましい。ここで、中和後に溶剤除去を行ったときに回収された溶剤が着色する原因は不明である。
　＜その他の工程＞
　（脂肪族カルボン酸アンモニウム塩の硫酸による塩交換）
　脂肪族カルボン酸は発酵液中では脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩の形で存在する。発酵液から脂肪族カルボン酸を回収するには、先ず脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を脂肪族カルボン酸へ変換することが好ましい。すなわち、脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩に硫酸を加え、塩交換することで脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩に変換することが好ましい。
　＜含窒素組成物＞
　本発明で製造する含窒素組成物は、硫酸のアンモニウム塩だけでなく、発酵由来に必然的に共存する種々の化合物、例えば、有機酸、アミノ酸、タンパク質および糖類などを含んでおり、肥料等の原料として有用である。また、これら硫酸のアンモニウム塩には、発酵で用いられた微生物の乾燥処理品なども混合することも有効である。
　＜脂肪族カルボン酸＞
　本発明の脂肪族カルボン酸としては、具体的には、例えば、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、リンゴ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、２－オキソグルタル酸、シス－アコニット酸およびドデカン二酸等の、炭素数が２以上４０以下の鎖状カルボン酸が挙げられる。これらの中では、アジピン酸およびコハク酸が好ましい。
　本発明において、これらの脂肪族カルボン酸は、生物由来原料から誘導されるものである。生物由来原料としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥および食品廃棄物等が挙げられる。
　この中でも、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙および製紙残渣等の植物資源が好ましい。
　より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙および製紙残渣であり、最も好ましくは、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバおよびサゴヤシである。
　これらの生物由来原料は、一般に、窒素元素、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａ等の多くのアルカリ金属並びにアルカリ土類金属を含有する。　
　そしてこれらの生物由来原料は、特に限定はされないが、例えば、酸またはアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、および物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。
　前記工程には、特に限定はされないが、例えば、生物由来原料をチップ化する、削るおよび擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。
　こうして微細化された生物由来原料は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その具体的な方法としては、例えば、硫酸、硝酸、塩酸および燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理および酸化剤処理等の化学的方法、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理および電子線照射等の物理的方法、並びに微生物または酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
　上記の生物由来原料から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロースおよびリブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉およびセルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸およびセラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトールおよびリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロースおよびセルロースが好ましい。
　本発明においては、これらの生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族カルボン酸が誘導される。具体的には、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法、および加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法並びにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりカルボン酸が合成される。これらの中でも脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。
　脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物は脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、例えば、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌およびコリネ型細菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
　好気性微生物としては、例えば、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられる。中でもコリネ型細菌がより好ましい。
　コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌などが挙げられる。このうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌がより好ましい。
　脂肪族カルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
　微生物変換における反応温度および圧力等の反応条件は、選択される菌体およびカビなど微生物の活性に依存することになるが、カルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
　微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、または微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、通常は中和剤を使用することが好ましい。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節することが好ましい。
　ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整することが好ましい。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
　本発明において中和剤としては、例えば、アンモニアおよび炭酸アンモニウムなどが挙げられる。
　本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性や効率性を考慮して適宜濃縮してもよい。濃縮方法としては、特に限定されないが、例えば、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法および減圧で水を留去させる方法並びにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。
　尚、本発明の方法において発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の除去方法は特に限定は無いが、沈降分離、遠心分離およびろ過分離並びにそれらを組み合わせた方法などが用いられる。
　工業的には、遠心分離および膜ろ過分離などの方法で行うことが好ましい。遠心分離においては、遠心沈降および遠心ろ過などを用いることができる。
　遠心分離において、その操作条件は特に限定されるものではないが、通常１００Ｇ～１００，０００Ｇの遠心力で分離することが好ましい。またその操作は連続式でも、バッチ式でも使用できる。
　また膜ろ過分離においては、精密ろ過および／または限外ろ過等を使用することが出来る。膜の材質は特に限定は無く、例えば、ポリオレフィン、ポリスルフィン、ポリアクリロニトリルおよびポリフッ化ビニリデン等の有機膜でも、セラミック等の無機材質の膜でも使用できる。また操作方法としては、デッドエンド型およびクロスフロー型のいずれでも用いることができる。
　膜ろ過分離では、微生物が膜に目詰まりすることが多いので、遠心分離などで微生物を粗取りを行ってから膜ろ過を行うなどの方法も用いられる。尚、分離された微生物は単独で、または本法で規定する含窒素組成物に混合し肥料とすることも可能である。
　以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。本実施例における酸類、糖類の定量分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い以下の条件で測定を行った。またタンパク質の定量は試料を塩酸により加水分解処理し、加水分解前後の総アミノ酸量の増分をタンパク質量と見なした。
　＜酸類、糖類の分析＞
　カラム；信和化工（株）製　ＵＬＴＲＯＮ　ＰＳ－８０Ｈ　８．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ
　溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ－Ｈ２Ｏ）
　温度：６０℃
　＜アミノ酸の分析＞
　装置：日立アミノ酸分析計　Ｌ－８９００
　分析条件：生体アミノ酸分離条件－ニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ，４４０ｎｍ）
　標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
　注入量：１０μｌ
　＜タンパク質定量のための加水分解処理＞
　試料１０ｍｇ或いは１００ｍｇを精秤し、純水で１ｍｌ定容としたものを、２００ｕｌ分注、乾固し、塩酸雰囲気下１５０℃、１時間加熱し、タンパク質を加水分解処理した。
これを乾固させた後純水２００ｕｌを加えて再溶解させ、０．４５ｕｍフィルターでろ過後、ろ液をアミノ酸の分析に供した。
　＜コハク酸発酵菌株の作製＞
　（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
　ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９７の受託番号で寄託されている。
　Ａ培地［尿素　２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４－５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン　２００μｇ、チアミン　２００μｇ、イーストエキストラクト　１ｇ、カザミノ酸　１ｇ、グルコース　２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ　ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。
　次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。
　前記溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００Ｇ、２０分間、１０～１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。
遠心分離（１５，０００Ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）－１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
　（Ｂ）ＰＣプロモーター置換用プラスミドの構築
　ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
　反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）　０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
　反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー　ＰＴＣ－２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分らなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。
　増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
　一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（日本国特開２００５－９５１６９号公報）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
　反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）　０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、　０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
　反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー　ＰＴＣ－２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分らなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
　増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
　上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。
　得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ　カナマシンおよび５０μｇ／ｍｌ　Ｘ－Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
　ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
　反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）　０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
　反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー　ＰＴＣ－２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
　増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
　回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４　ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
　この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ　アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ　Ｘ－Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。
　反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ－ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）　０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
　反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー　ＰＴＣ－２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
　このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
　次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。
　このＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（日本国特開２００５－９５１６９号公報）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。
　得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマシンおよび５０μｇ／ｍｌＸ－Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した（図２）。
　（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
　ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ＬＤＨ活性が低下した株：日本国特開２００５－９５１６９号公報）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
　ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１－１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン　２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、グルコース　２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
　この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
　次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
　この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。
　ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ－５／ΔＬＤＨと命名した。
　＜ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調製＞
　（Ａ）種培養
　尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ－ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇを蒸留水に溶解、１０００ｍｌに調整した培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍｌ添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ－５／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて振とう（１６０ｒｐｍ）培養した。
　（Ｂ）本培養
　硫酸アンモニウム：３．０ｇ、８５％リン酸：６．７ｇ、塩化カリウム：４．９ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：１２０ｍｇ、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３０．０ｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：１１．０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：２．５ｇを蒸留水に溶解して調整した培地２．０Ｌを５Ｌの発酵糟に入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やしてから２８％アンモニア水を加えてｐＨを７．０に調整した後、予めフィルター滅菌したＤ－ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：１５ｍｌ、及びあらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：１１０ｍｌを添加した。これに前述の種培養液を１００ｍｌ加えて、３０℃に保温した。
　ｐＨは２８％アンモニア水を用いて７．２以下にならないように保ち、通気は毎分３．０Ｌ、背圧は０．０５ＭＰａ、攪拌は毎分７５０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２％ショ糖水溶液を約５．３ｇ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに上記の方法にてショ糖水溶液添加を繰り返して、培養開始後１９時間まで継続した。
　（Ｃ）コハク酸生成反応
　８５％リン酸：１．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４３ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４３ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：２．８６ｇを蒸留水に溶解、４２ｍｌに調整後、１２１℃、２０分加熱滅菌処理し、反応濃縮培地を作製した。
　室温まで冷やした上記反応濃縮培地：４２ｍｌ、及び予め滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：５３０ｍｌ、滅菌水：１．２Ｌ、予めフィルター滅菌したＤ－ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：２０ｍｌ、上記本培養により得られた培養液６７５ｍｌを５Ｌのジャーファーメンターに加え反応を開始した。
　反応温度は４０℃、攪拌回転数は毎分１５０、ｐＨは中和剤（炭酸水素アンモニウム：１７１ｇ、２８％アンモニア水：３５４ｇ、蒸留水：５２９ｇ）の逐次添加によって７．３５に調整しながら反応を継続し、反応液中の残存ショ糖が０．１ｇ／Ｌ以下になったところで終了した。
　このようにして調整したコハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ、５分）処理して得られた上澄み液を得た（以下、コハク酸発酵液と記載することがある）。
　下記表２にこの上澄み液の組成分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１
　＜プロトン化＞
　上述のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加えｐＨを２．５と調整した。ここで９８％硫酸添加量は１５０ｇであった。
　＜抽出＞
　硫酸添加後のコハク酸水溶液は、ジャケット付スタティックミキサー（ノリタケ１／４（１）－Ｎ４０－１７４－０（内径Φ５ｍｍ、エレメント数２４））および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと略記することがある）と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。
　すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水ＭＥＫ溶液８２５ｇ（ＭＥＫ溶液（重量）／コハク酸水溶液（重量）＝０．５（重量／重量））を、それぞれ２０ｇ／分、１０ｇ／分の速度でジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御されたスタティックミキサーへ供給し、抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽へ供給し、液々分離され第１槽のボトムから抽残相を連続的に抜き出した。
　抽出相は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給された。第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出相のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出相をオーバーフローさせて抽出相を回収した。
　連続抽出終了後、それぞれの槽に残った抽出相および抽残相さらには第１槽中間相、第２槽ボトムに残った不溶成分を回収した。回収した抽出相、抽残相、中間相はそれぞれ６８８ｇ、抽残相１６１３ｇ、中間相１７３ｇであった。
　回収した抽残相１６１３ｇは内径Φ２０ｍｍ高さ２ｍのジャケット付攪拌型連続抽出塔（理論段１０段）を用い連続抽出しコハク酸を回収した。ここで抽残相は２００ｇ／時間で塔頂部から供給し、塔底から予め含水量１０重量％に調整したＭＥＫ溶液を２００ｇ／時間で供給し連続抽出した。
　連続相は抽残相、分散相はＭＥＫ相とした（軽液分散）。また抽出塔の温度はジャケットに温水を通液することで３０℃に制御した。最終的に抽出相は１７７７ｇ、抽残相は１４４９ｇ回収した。
　抽残相の組成を分析したところ下記表３に示すような結果であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜蒸留＞
　Φ５ｍｍのコイルパックを高さ３０ｃｍに充填した、内径Φ２０ｍｍの充填カラムと５００ｍｌの丸底フラスコ、さらには還留器を備えた常圧連続蒸留装置を用い、抽残相に微量溶解したＭＥＫを蒸留により留去した。抽残相は５００ｍｌ丸底フラスコへ約３００ｍｌ添加後、丸底フラスコをオイルバスで加熱しながら炊上げ、全還留をかけながら系内を安定させた。ここでオイルバスの温度は１１０℃とした。ここで塔頂温度は７４℃（共沸温度）、塔底温度は１０２℃であった。
　塔内が安定したのを確認後、還留比を１に設定し、留出液を連続的に抜出すとともに供給液を充填塔中段へ連続供給し、釜残液も連続的に抜出しを開始した。供給液は予熱器であらかじめ６０℃まで加熱した後、充填塔へ供給した。蒸留後の釜残液は１３７９ｇであり、ＭＥＫは４５ｐｐｍまで低下していた。
　一方、回収された留出液はわずかに黄色く着色したＭＥＫ、水からなる共沸組成物（ＭＥＫ８９重量％、水１１重量％）であった。
　＜中和＞
　ＭＥＫを蒸留除去した後の液のｐＨを測定したところ約３であったので、２６重量％アンモニア水でｐＨ６に調整した。
　＜濃縮＞
　中和液をエバポレータで濃縮し、硫酸アンモニウム濃度４１重量％の濃縮液４７６ｇを回収した。
　＜晶析＞
　濃縮液はジャケット付１０００ｍｌ攪拌槽へ移した。ジャケットに４５℃の温水を流すとともに、攪拌下晶析槽内圧力を７ｋＰａまで徐々に減圧していき、７ＫＰａ（内温約４０℃）に到達後圧力を制御しながら水を９５ｇ留出させ（仕込液に対し２０重量％）、硫酸アンモニウムを析出させた。所定量の水が留出した後、晶析槽内の圧力を大気圧に戻し、ジャケットに流す温水温度を４０℃とし約１時間熟成した。
　得られた硫酸アンモニウムスラリーを減圧濾過し、ウェットケーキおよび母液に分離した。得られたウェットケーキはさらに８０℃温風乾燥機で約７時間乾燥し、硫酸アンモニウム８７ｇ、母液２８８ｇを回収した。
　硫酸アンモニウムの組成の分析結果を下記表４に、母液の組成の分析結果を下記表５それぞれの組成を下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　回収した母液の半分は、リサイクルに用いた。また残りの半分は１５０℃に加熱したホットプレート上で乾燥させたところ茶褐色の硫酸アンモニウム粉体６７ｇを回収した。
　得られた硫酸アンモニウムの組成の分析結果を下記表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例２
　＜プロトン化・抽出・中和・濃縮＞
　実施例１で用いたコハク酸発酵液１５００ｇを１０００ｇにする以外は同じ方法で、コハク酸発酵液をプロトン化し、プロトン化した液を引き続きＭＥＫ溶液で抽出した。
　抽残相は蒸留、中和を行い、さらに硫酸アンモニウム濃度４０重量％まで濃縮を行い、濃縮液３２９ｇを回収した。
　＜晶析＞
　上記濃縮液、および実施例１の晶析工程で回収した母液の半分にあたる１４４ｇを混合し、実施例１と同様の手順で晶析、濾過、乾燥処理を行い、硫酸アンモニウム８６ｇ、母液２８８ｇを回収した。
　得られた硫酸アンモニウムの組成の分析結果を表７に、得られた母液の組成の分析結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　回収した母液の半分はリサイクルに用いた。また残りの半分は１５０℃に加熱したホットプレート上で乾燥させたところ茶褐色の硫酸アンモニウム粉体６５ｇを回収した。
　得られた硫酸アンモニウムの組成を下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例３
　実施例２と同じ手順で晶析母液の半分をリサイクルしながら、抽出～晶析操作をさらに５回繰り返した。
　晶析で得られた硫酸アンモニウム、母液の乾燥で得られた硫酸アンモニウム、およびそれぞれの母液の組成の分析結果を下記表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　回収した全ての硫酸アンモニウムを混合した含窒素組成物を、対照肥料として試薬硫酸アンモニウム（試薬特級品）を用い、こまつなの発芽および発芽後の生育への支障の有無およびその程度を検証するため、幼植物試験を実施したところ、有害物による植物の生育上の異常症状は見られなかった。
　下記表１１に混合した含窒素組成物の肥料としての組成分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例４
　実施例１の方法において、蒸留と中和の順序を入れ替える以外は同じ方法に従い、硫酸アンモニウムを回収した。各操作におけるハンドリング性、回収された硫酸アンモニウムはいずれも実施例１とほぼ同等であったが、蒸留で得られた留出物（ＭＥＫと水からなる共沸組成物）は黄色く着色していた。
　比較例１
　実施例１の方法において、晶析母液を全量リサイクルする以外は同じ方法に従い、晶析母液をリサイクルしながら抽出～晶析操作を５回繰り返し、硫酸アンモニウムを回収した。結果を下記表１２に示す。リサイクルを重ねるごとに硫酸アンモニウムスラリーの減圧ろ過［ろ紙（５Ｃ）］に要する時間が長くなり、リサイクル５回目においては減圧ろ過では固液分離できず、卓上式遠心ろ過機（ろ布）を用い、約３０００Ｇで固液分離を行った。
　晶析で得られた硫酸アンモニウム、母液の乾燥で得られた硫酸アンモニウム、およびそれぞれの母液の組成の分析結果を下記表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年１月１５日付で出願された日本特許出願（特願２０１０－００７３０６）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (15)

  1. 　生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）～（３）を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。
    （１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
    （２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
    （３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする母液の量は母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程
  2. 　固液分離工程で得られた晶析母液を乾燥機で蒸発乾固し、硫酸のアンモニウム塩を回収する晶析母液乾燥工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の含窒素組成物の製造方法。
  3. 　生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加えた後、該水溶液と相分離可能な溶剤とを混合し接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程とを含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の含窒素組成物の製造方法。
  4. 　相分離工程後の水溶液を蒸留し、水溶液から溶剤を除去する有機溶剤除去工程を含むことを特徴とする、請求項３に記載の含窒素組成物の製造方法。
  5. 　有機溶剤除去後の水溶液を濃縮し、水溶液中の硫酸のアンモニウム塩の濃度を増加させる濃縮工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の含窒素組成物の製造方法。
  6. 　相分離工程後の水溶液にアルカリを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含むことを特徴とする、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
  7. 　抽残相中和工程で用いるアルカリが、アンモニアであることを特徴とする請求項６に記載の含窒素組成物の製造方法。
  8. 　抽残相中和工程が、有機溶剤除去工程の後に行われることを特徴とする、請求項６または請求項７に記載の含窒素組成物の製造方法。
  9. 　抽残相中和工程が、濃縮工程の前に行われることを特徴とする、請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
  10. 　前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１５重量％以下であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
  11. 　前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１０に記載の含窒素組成物の製造方法。
  12. 　前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液の量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、１０％重量以上８０重量％未満であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
  13. 　請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法で製造された含窒素組成物であって、該含窒素組成物に含まれる全窒素の量が、１５重量％以上２１重量％未満で、かつ全窒素の９０重量％以上がアンモニウム性窒素であることを特徴とする含窒素組成物。
  14. 　請求項１３に記載の含窒素組成物を含む肥料原料。
  15. 　請求項１３に記載の含窒素組成物を含む肥料。
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