JP6800908B2 - 発酵ブロスの成分を分離する方法 - Google Patents
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Description
張し、その内容全体を引用により本明細書に組み込む。
本発明は、全般的に発酵ブロスの成分の分離に関し、より詳細には、水より高い沸点を
有する水混和性成分の、他の発酵ブロス成分からの単離に関する。
並びに水を含む発酵物の成分を分離し、任意に再生利用する能力を持つプロセススキーム
を設計する環境面での動機及びコスト低減の動機が存在する。発酵の生産性を向上させる
手段として細胞集団を再利用する努力もなされてきた。発酵に再使用するために残存培地
及び培地の塩を回収する分野でなされた努力は少ない。この点で、努力のほとんどは、下
流の回収よりも初期の培地コストを低減することに集中してきた。得られた「低コスト」
培地は、細胞成長及び産物産生にとって最適でないことが多い。培地成分の回収に有効な
方法を開発することにより、より最適な培地処方が、初期の原材料コストに対する制限を
少なくしながら利用可能である。
規模が違うだけで、実験室のベンチトップ規模で開発された単離手順は、パイロットスケ
ール又は商業スケールでは非現実的又は実行不可能にすらなる。複雑な混合物からの化合
物の単離は、化合物が周囲温度で固体と液体のどちらであるか、化合物の沸点、密度、極
性、pHに敏感な官能基の有無、水対有機溶媒への溶解度を含む多くの因子に依存する。こ
れらの因子は、目的とする化合物が単離される混合物の他の成分全てにも当てはまる。化
合物、特に有機化合物の単離に含まれる他の性質は、水と有機溶媒との間など、2種の非
混和性相の間でどのように分配するかである。特に極性の高い化合物は、抽出過程に使用
される通常の有機溶媒よりも水に溶けやすいことが多い。いくつかの化合物は、その両親
媒的な性質のため、抽出法により水から単離するのが特に困難である。両親媒性物質は、
極性部分と親油性部分とを両方有する化合物である。これらの化合物は、処理しづらいエ
マルションを生み出すことにより、抽出による単離を複雑にすることがある。
く多いことがあり、複雑な混合物からの少量成分の単離を必要とする。水よりも高温で沸
騰する化合物の単離は、例えばエタノール発酵プロセスのようには発酵ブロスから化合物
を直接蒸留できないので、分離の複雑さ及びコストをさらに増す。この点で、目的とする
化合物と水との間の相互作用は、2つの物質を、2つの純粋な成分とは異なる沸点で共沸混
合物として共蒸留させることがある。共沸混合物の形成は容易に予測できない。このこと
は、目的の化合物を水から分離しようとするときにその回収を低下させ得る。化合物が極
性官能基を有する場合、例えば塩及び金属イオンなどの水相に存在する他の化合物とどの
ように相互作用するのかも、別な関心事である。
ば、化合物の1つ以上の官能基は、カチオン又はアニオンと相互作用し、又はキレート化
し得る。キレート化は、カチオン又はアニオンに対して大きさに依存して起こり、目的と
する化合物の官能基の配置にも依存する。キレート化及び他の相互作用は、水の非存在下
ですら、ある塩を液体化合物に可溶性にすることがある一方で、他の塩は、塩と相互作用
できる官能基を持つ化合物が存在するにも関わらず水の非存在下で不溶性になり得る。塩
の溶解度に対するこの種の作用は予測が難しい。補助溶媒の性質も、化合物と塩との間の
相互作用の複雑さをさらに増す。例えば、水混和性である目的とする化合物の単離の間に
、水素結合及び水との他の相互作用は、塩と目的とする化合物との間の相互作用を乱すこ
とがある。そのため、いくつかの場合において、ある量の水の存在下で、化合物からより
容易に塩を分離できる。しかし、目的とする化合物と塩との間のキレート化及び他の相互
作用を乱す水の能力を維持しながら、例えば結晶化による塩の分離を可能にする塩の過飽
和の釣り合いをとる水の量は、予測するのが困難である。
産物の潜在的な反応性である。加熱条件下で、過剰な基質は分解し、産物の望ましくない
着色を起こすことがある。さらに、いくつかの副産物は目的とする産物と反応し、実際上
単離収率を下げることがある。これらの副産物には、発酵の間に形成されるもの並びに、
例えば蒸留、水分蒸発などの間の高温での劣化プロセスによる単離手順自体の工程の間に
形成される副生成物があり得る。
、水よりも沸点が高い水混和性化合物の微生物発酵物からの単離を可能にする方法を開発
する必要がある。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
ンジオール(1,4-BDO)を単離する方法であって、細胞を含む固体分画から1,4-BDOに富む液
体分画を分離すること、該液体分画から水を除去すること、該液体分画から塩を除去する
こと、及び1,4-BDOを精製することを含む方法に関する。
する方法であって、ディスクスタック遠心分離により固体の一部を除去して液体分画を与
えること、限外濾過により該液体分画から固体のさらなる部分を除去すること、蒸発晶析
により該液体分画から塩の一部を除去すること、イオン交換により該液体分画から塩のさ
らなる部分を除去すること、及び1,4-BDOを蒸留することを含む方法に関する。
を単離する方法であって、ディスクスタック遠心分離により固体の一部を除去して液体分
画を与えること、限外濾過により該液体分画から固体のさらなる部分を除去すること、ナ
ノ濾過により該液体分画から塩の一部を除去すること、イオン交換により該液体分画から
塩のさらなる部分を除去すること、水の一部を蒸発させること、及び1,4-BDOを蒸留する
ことを含む方法に関する。
方法であって、1,4-BDO産生微生物を発酵装置中で1,4-BDOを産生するのに十分な時間培養
することを含む方法に関する。該1,4-BDO産生微生物には、1,4-BDO経路酵素をコードする
1つ以上の外因性遺伝子及び/又は1つ以上の遺伝子破壊を含む1,4-BDO経路を有する微生
物がある。該方法は、記載される単離方法により1,4-BDOを単離することをさらに含む。
コモディティケミカルの発酵産生は、再生不能な化石燃料フィードストックを利用する
従来の製造に代わる有用な代替法である。再生利用されたバイオマスなどの再生可能なフ
ィードストックを利用する能力を持っているので、該方法は、化石燃料に基づく製造より
も経済的及び環境的に健全になり得る。発酵から生じた産物は多くの用途に有用なことが
ある。特定の実施態様において、本発明は、1,4-BDOの産生の方法を提供する。1,4-ブタ
ンジオール(BDO)はポリマー中間体及び工業的な溶剤である。下流で、ブタンジオールは
さらに変換されることがあり、例えば、酸化によりγブチロラクトンになり、さらにピロ
リドン及びN-メチル-ピロリドンに転化され、或いは水素化分解を受けてテトラヒドロフ
ランになることがある。これらの化合物は、ポリマー中間体、溶剤、及び添加剤として種
々の用途を有する。
沸点を有する水混和性化合物を発酵物から単離する方法を部分的に対象とする。該方法は
細胞集団を分離できるが、これは、遺伝子挿入、遺伝子破壊、又は挿入と破壊との組み合
わせにより遺伝子操作されて好適なフィードストックから有用な収率で化合物を産生する
微生物を含み得る。
。これは、発酵ブロスから水の一部分又は実質的に全てを除去する前又は後にいくつかの
方法により実施可能である。上述のとおり、発酵法において塩が再生利用のために回収さ
れることは多くない。通常、塩の回収は、培地塩などではなく、乳酸塩、クエン酸塩、又
は他のカルボン酸塩産物などの所望の生合成産物の塩又はアミン含有産物のアンモニウム
塩の形態を含む。本明細書に記載される方法は、培地塩の回収及び発酵へ戻す任意の再生
利用を可能にする。単離方法は水の除去も含み、水は発酵系に再導入することができる。
最終的な精製において、発酵により産生される化合物は、細胞、塩、及び水の除去後に残
存する液体分画から蒸留、又は固体の場合再結晶化することができる。液体の場合、最終
的な精製は、例えば分別蒸留により実施できる。
混和性の目的とする化合物を単離する方法を対象とする。該方法は、(1)細胞を含む固体
分画から、化合物に富む液体分画を分離すること;(2)該液体分画から水を除去すること
;(3)該液体分画から塩を除去すること;及び(4)蒸留又は再結晶化により、目的とする化
合物を精製することを含む。上記の工程(2)及び(3)は、どちらの順序でも、又はともに実
施してもよい。
を全て含んで、水よりも10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100
℃、150℃、200℃、及び300℃高い沸点及びより高い沸点を有することがある。水より高
い沸点を有する目的とする化合物は、例えば、1,4-BDO、1,3-BDO、2,3-BDO、1,3-PDO、1,
2-PDO(メチルエチルグリコール)、1,2-エタンジオール(エチレングリコール)、γブチロ
ラクトン(GBL)、1,5-ペンタンジオール、1,6-ヘキサンジオールを含み得る。さらに、目
的とする化合物には、水混和性であるものがある。いくつかの実施態様において、そのよ
うな水混和性化合物は従来の抽出手順では処理しづらいことがある。さらに、目的とする
化合物には中性のものがある。本明細書では、中性の化合物は、アミン、カルボン酸、ス
ルホン酸、ボロン酸などの、電荷を帯びることが可能な官能基を有さない化合物を意味す
る。最後に、目的とする化合物は、以下にさらに記載されるように、ナノ濾過膜を透過す
るほど十分に小さいことがある。例示的な化合物の種類には、アルコール、ジオール、グ
リセリンなどのトリオール、テトラオール、ポリオールなどがある。
230℃であり、水と完全に混和する。さらに、水から1,4-BDOを経済的に抽出できる特定さ
れた溶媒はない。中性の分子なので、塩形態の結晶化による単離は除外される。1,4-BDO
は、以下の実施例IIIに記載されるとおり、ナノ濾過膜を通過するほど十分に分子量が低
い。さらに、以下の実施例VIに記載されるとおり、純粋な1,4-BDOに対する種々の発酵培
地塩の溶解度は比較的低い。
)を単離する方法であって、(1)細胞を含む固体分画から1,4-BDOに富む液体分画を分離す
ること;(2)該液体分画から水を除去すること;(3)該液体分画から塩を除去すること;及
び(4)1,4-BDOを精製することを含む方法を提供する。
すれば、水より高い沸点を有する他の水混和性の目的とする化合物も同じ手順を利用して
単離できることを認識するだろう。例えば、本明細書に開示される方法は、1,3-ブタンジ
オールの単離が可能になるように容易に変更できる。したがって、多くの実施態様が1,4-
BDOにより例示されているが、該方法は、水より高い沸点を有する他の水混和性の目的と
する化合物に容易に適応できることが理解される。
)を単離する方法を対象とする。該方法は、細胞を含む固体分画から1,4-BDOに富む液体分
画を分離することを含む。液体分画から塩を分離する前又は後に、液体分画から水が蒸発
させられる。いくつかの実施態様において、1,4-BDOは、以下でさらに記載されるとおり
水の除去後に結晶化された塩から分離される。分離された1,4-BDOが約98%塩を含まない
ように、塩は1,4-BDOに対する溶解度が低い。いくつかの実施態様において、塩は、以下
にさらに記載されるとおり、特殊な濾過方法及び/又はイオン交換、又はクロマトグラフ
ィー法により水の除去の前に分離される。
む方法を意味する。特別な実施態様において、目的とする化合物は1,4-BDOを含む。実質
的に精製された化合物には、いくつかの実施態様において少なくとも98%塩を含まないも
の、他の実施態様において少なくとも99%塩を含まないもの、及びさらに他の実施態様に
おいて少なくとも99.5%塩を含まないものがある。実質的に精製された化合物は、目的と
する化合物が、いくつかの実施態様において少なくとも純度98%、他の実施態様において
少なくとも純度99%、なおさらなる実施態様において少なくとも純度99.5%であるように
塩に加えて他の不純物も含まないものを含む。
る遠心分離液又は上清液を意味する。固形物除去は、固形物の一部、実質的に全て、又は
全てを含む。例えば、遠心分離において、液体分画は、固体から分離される遠心分離液又
は上清である。液体分画は、膜による濾過後に得られる透過液又は上清である部分でもあ
る。液体分画は、1つ以上の濾過方法が適用された後に得られる濾液又は上清である部分
でもある。
する。そのような不溶性物質には、例えば、細胞、細胞片、沈殿したタンパク質、微粉な
どがある。微粉とは、小さく、通常アモルファスの固体を意味する。微粉は、結晶化の間
、又は発酵ブロスからの水の除去の間に作られ得る。微粉は、溶解して再結晶化し得る、
目的とする化合物でできていることがある。微粉は、膜濾過で捕捉するには小さすぎる固
体分画の一部を含み得る。
酵ブロスに使用される溶解したイオン化合物を意味する。発酵ブロス中の塩は、例えば、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム
、硫酸アンモニウム、及び緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、及びホウ酸のナト
リウム及び/又はカリウム及び/又はアンモニウム塩を含み得る。
語は、少なくとも95%の水又は塩の除去を意味する。「実質的に全て」は、少なくとも96%
、97%、98%、99%、又は99.9%の除去又はその中間の任意の値も意味し得る。
子産物を不活性にする遺伝子変化を意味するものとする。遺伝子変化は、例えば、遺伝子
全体の欠失、転写又は翻訳に必要な調節配列の欠失、トランケート型遺伝子産物を伴う遺
伝子の部分の欠失であるか、コードされた遺伝子産物を不活性化する種々の突然変異戦略
のいずれかによるものであり得る。遺伝子破壊の特に有用な方法は完全な遺伝子欠失であ
り、その理由は本発明の非天然微生物における遺伝子復帰の発生を低減又は排除するから
である。
生物を意味するものとする。該用語は、全ての種の細菌並びに酵母及び真菌などの真核生
物を含むものとする。該用語は、生化学品の産生のために培養できる任意の種の細胞培養
物も含む。
ように遺伝子操作された微生物を意味するものとする。遺伝子操作された生物は、プラス
ミド挿入及び/又は染色体挿入を含む遺伝子挿入を含み得る。遺伝子操作された生物は、
1,4-BDO産生のための所望の経路を通る炭素フラックスをさらに最適化する遺伝子破壊も
含むことがある。1,4-BDO産生生物は挿入と欠失との組みあわせを含み得る。
に導入されることを意味するものとする。該分子は、例えば、宿主染色体への組み込みに
より、又はプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、コードする核酸を宿主遺伝物質へ
導入することによって導入され得る。したがって、コードする核酸の発現に関して使用さ
れる該用語は、発現可能な形態のコードする核酸の微生物への導入を意味する。生合成活
性に関して使用される場合、該用語は、宿主指標生物に導入される活性を意味する。源は
、例えば、宿主微生物への導入後に言及される活性を発現する相同又は非相同のコードす
る核酸であり得る。したがって、「内因性」という用語は、宿主に存在する言及される分
子又は活性を意味する。同様に、コードする核酸の発現に関連して使用される場合の該用
語は、微生物内に含まれるコードする核酸の発現を意味する。「非相同」という用語は、
言及される種以外の源から誘導される分子又は活性を意味し、「相同」は宿主微生物から
誘導される分子又は活性を意味する。したがって、本発明のコードする核酸の外因性発現
は、非相同又は相同のコードする遺伝子のいずれか又は両方を利用できる。
方法を提供する。適用できる化合物には、水より沸点が高く塩溶解度が低いものがある。
目的とする化合物には、水混和性のものもある。目的とする例示的な化合物は1,4-BDOで
ある。該方法は、細胞集団を含む固体分画から、目的とする産物を含む液体分画を分離す
ることを含む。目的とする産物は、水よりも沸点が高い任意の化合物でよい。細胞集団は
、目的とする化合物の産生に利用される微生物を含む。固体分画は、細胞片、微粉、タン
パク質、及び発酵物由来の他の不溶性物質も含む。
重要でない。いくつかの実施態様において、塩の部分的な除去、それに次ぐ実質的に全て
の水の除去、次いで残りの塩の除去があり得る。他の実施態様において、水の部分的な除
去、それに次ぐ実質的に全ての塩の除去、次いで残りの水の除去があり得る。他の実施態
様において、水は、発酵ブロスからの固体分画の分離前に部分的に除去されることがある
。さらに他の実施態様において、実質的に全ての水の最終的な除去は、例えば蒸留により
精製工程の一部として実施できる。以下の実施例VIに開示されるとおり、ニートの1,4-BD
Oは、典型的な発酵培地塩を感知できるほどには可溶化しない。そのため、1,4-BDOは、液
体分画からの水の蒸発により塩から分離され得る。以下の実施例Vに記載されるとおり、1
,4-BDO濃度が約30重量%のとき塩が晶析し始める。いくつかの実施態様において、水の除
去により結晶化又は沈殿した塩からの1,4-BDOの分離時に、1,4-BDOは少なくとも98%塩を
含まない。実施例VIからわかるように、密接に関連する同族体エタンジオール及びプロパ
ンジオールはなお感知できるほど発酵塩を可溶化する。そのため、他の方法を利用して、
実質的に全ての水の除去後にすら塩を除去できる。
できる。目的とする産物が液体である場合、精製は、例えば分別蒸留又は複式蒸留を含む
蒸留により実施できる。目的とする産物が固体である場合、精製は再結晶化により実施で
きる。
方法は、図1のブロックフローダイアグラムにまとめられている。工程100は、スクロース
などの炭素フィードストックを利用する発酵による、目的とする化合物の産生である。工
程110は、発酵ブロスからの細胞の分離及び液体分画の提供であり、工程115は細胞の任意
の再生利用である。工程110は実施例I及びIIで例示されるが、細胞及び固体は遠心分離及
び限外濾過により発酵ブロスから分離される。工程120において、塩は液体分画から分離
され、工程125は塩の任意の再生利用である。工程120は実施例III-Vに例示されたが、ナ
ノ濾過(実施例III)及びイオン交換(実施例IV)を説明し、水は液体分画にまだ存在し
ている。実施例Vは、水の蒸発の間の結晶化による塩の分離を示す。工程130は蒸発による
水の除去であり、工程135は水の任意の再生利用である。工程130は実施例Vにより例示さ
れており、沈殿による塩の分離を促進する水の蒸発を示す。工程120及び130の順序は、以
下にさらに記載されるとおり交換可能である。最後に工程140において、目的とする化合
物は最終的な精製を受ける。
する方法は、目的とする化合物に富む液体分画を、細胞を含む固体分画から分離すること
を含む。目的とする化合物に富む液体分画を分離する際に、発酵ブロスの体積の全体まで
及び中間の全ての値を含む、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%を
含み、さらに発酵ブロスの総体積の1%未満の体積を含む任意の量の発酵ブロスを処理で
きる。当業者は、処理される発酵ブロスの量が、以下に詳述されるとおり回分、供給回分
、又は連続などの発酵プロセスの種類に依存し得ることを認識するだろう。細胞及び他の
固体副産物及び不純物を含む固体の発酵ブロスからの分離は、遠心分離、濾過、又はこれ
らの方法の組み合わせにより実施できる。
まない、1,4-BDOなどの目的とする化合物を含む液体分画を提供できる。遠心分離機の構
成及び大きさにより、操作速度は500から12,000 rpmに変わることがあり、最大で重力の1
5,000倍の遠心力を生み出す。発酵ブロスから細胞及び固体を分離するための多くの遠心
分離機構成が当分野に知られている。そのような構成の一つは、例えば、図2に示される
ディスクスタック遠心分離機200である。
、据え付けの入口管220により上部から回転ボウルに導入され、ディスクスタック240に入
る前に、分配器230中で加速される。分配器は、液体供給材料を加速するように設計され
ている。
などの二相系において、油相はディスクスタックを通って中心に動き、パイプ250を通っ
て排出され、回収フレーム中に噴霧され得る。油から分離された水及び固体は外周部に動
き、水はトップディスク260中の水管を通ってパーリングチャンバー(paring chamber)に
導かれ、そこで内蔵型パーリングディスク(paring disc)270により、ポンプでローターか
ら吸い出される。
体の排出は、事前設定された好適な間隔でスライディングボウル底部280を押し下げ、ボ
ウル外周部の固体ポートを開ける油圧系により実施される。
液相を互いに分離する。密度の高い固体は遠心力により外側に押し付けられるが、密度の
低い液相は内部の同心円状の層を形成する。特殊な板(ディスクスタック)を挿入するこ
とにより、分離効率が向上する。固体は、手動で、間欠的に、又は連続的に除去できる。
いくつかの実施態様によると、細胞集団は、発酵物に戻して導入することができる。典型
的なディスクスタック遠心分離装置では、液相はボウル上部の出口領域で別なチャンバー
に流出する。
放射羽根アセンブリにより加速されて、密に並べられた多数の円錐状ディスクを通って流
れる。ディスクの間隔は、流体から沈殿する粒子を分離するのに要する距離を減らすため
に、多くの場合0.5から3mmである。ディスクの角度は多くの場合40から50度であり、ディ
スク表面を通って固体収容スペースに落ちる固体の輸送を促進する。
る固体収容スペースへの落下に基づいている。同時に、清澄化された液体はディスク間の
水路を上がり、求心ポンプにより遠心分離機を離れる。沈降した固体は、ノズルを通って
連続的に、又はボウル外周部にあるポートを通って断続的に排出される。
。ディスクスタック遠心分離機は、細胞及び他の固形物が、わずか約0.2%から約3重量%の
発酵ブロスを含む場合に使用できる。ディスクスタック遠心分離機は、細胞及び他の固形
物が、約0.2重量%未満、例えば中間の値全てを含み0.01%、0.05%、及び0.1重量%である場
合に使用できる。ディスクスタック遠心分離機は、細胞及び他の固形物が3重量%を超え、
例えば、中間の値全てを含み4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、及び15重量%である場合にも
使用できる。細胞集団及び他の固体が合わせて約3%から約15重量%より多い場合、デカン
タ型遠心分離機などの他の遠心分離構成を使用できる。
い他の固体粒子が、一般的にはディスク遠心分離に好適である。約0.5ミクロン未満の粒
子状物質には、限外濾過が有用である。同様に、約500ミクロンを超えると、デカンタ型
遠心分離機が有用になることがある。1,4-BDOを含む目的とする化合物を産生するために
培養され得る典型的な原核細胞は、その大きさが約0.5ミクロンから約10ミクロンになり
得るので、ディスクスタック遠心分離が好適な方法である。
スタック遠心分離機により発酵ブロスから除去可能である。ディスクスタック遠心分離機
から出てくるものは澄んだ(細胞のない)遠心分離液及び約5%から約50%の固体を含む
アンダーフロー流である。ディスクスタック遠心分離機から出てくるアンダーフロー固体
流は、回収可能な相当量の目的とする産物を含み得る。固体から追加の目的とする化合物
を回収する一方法は、遠心分離工程をさらに含むことである。目的とする化合物をより多
く回収することに加え、多段遠心分離は細胞及び固体をさらに濃縮する役割も果たす。濃
縮された細胞は発酵に戻して再生利用できる。細胞の再生利用は、遺伝子操作された貴重
な生物が使用される場合、特に有用である。
できる。デカンタ型遠心分離機による良好な性能は、約10ミクロンに近づく下限を有する
粒径の固体で通常実現されるが、より小さい粒子も以下にさらに記載されるとおりその沈
降速度によっては処理できる。培養物の細胞が典型的な原核生物の大きなサイズ範囲にあ
る場合、この遠心分離機構成を利用できる。当業者は、真核細胞が原核細胞よりはるかに
大きいことが多く、平均的な真核細胞の大きさが約10ミクロンから約100ミクロン又はそ
れ以上の範囲であることを認識するだろう。ディスクスタック遠心分離機はこのサイズの
範囲で良好に操作できるが、デカンタ型遠心分離機は、より多量の固体を取扱いできるの
で有用である。そのため、細胞集団と他の固体の合計が塊の約3から約50重量%である場合
、デカンタ型遠心分離機を使用できる。この濃縮は上述のディスクスタック遠心分離機の
アンダーフローに適用されるので、デカンタ型遠心分離機は、細胞集団をさらに濃縮し追
加の産物を回収するのに好適な方法である。
は米国特許第4,228,949号及び同第4,240,578号に記載されており、その全体を引用により
本明細書に組み込む。図3に示されるそのような装置300において、機械の中心部分は回転
ドラム310であり、独立に回転するスクリュー320を含む。ディスクスタック遠心分離機か
ら出たアンダーフローなどの、発酵ブロス又は固体含有供給材料は、入口管330により、
スクリューの第1部分の中心にある混合チャンバー340へと供給される。次いで、ブロスは
、混合チャンバー中のポートを通って、ドラムの外側の壁に向かって出る。脱水されたブ
ロスは、スクリューにより機械を通って外に輸送される。遠心分離液350、又は上清は、
遠心分離液管を通ってポンド(pond)の内表面からデカンテーションされる。ドラム内の水
位は、処理すべき材料の特性に合わせて調整できる。
の速度で回転する。利用される脱水の原理は、当業界に「並流」又は「向流」法として知
られている。並流法は非常に低い差速を可能とする。差速は、ドラムの速度とスクリュー
の速度との間の差である。低い差速は、遠心分離機中のより長い滞留時間を意味し、より
乾燥したスラッジ及び著しく少ない摩耗をもたらす。向流の原理は、脱水が容易な供給材
料及び高容量が望ましい場合により好適になり得る。
ウル遠心分離機で分離され得る。沈降速度に影響する因子には、例えば、粒径、形状、細
胞/固体と発酵ブロス液相との間の密度の差、及び粘度がある。ボウルの幾何学的形状、
特に、長さ及びと直径の間の関連は、特定の条件に合わせるように適合可能である。いく
つかの実施態様において、良好な結果は、長さ直径比が約2:1から約3:1で得られる。
lindrical bowl)中で分離が起こる。発酵ブロスは、据え付けの入口管を通ってボウルに
供給され、入口分配器により加速される。遠心力は、ボウルの壁に固体が沈降する手段を
与える。コンベヤーは、差速でボウルと同じ方向に回転し、固体を円錐端部に運ぶ。次い
で、固体は液相を取り除かれ、回収水路に排出される前に遠心分離で脱水される。次いで
、残った液相は、ボウルの円筒端部の開口部を通ってハウジングに流れる。
離収率を上げることができる。多段遠心分離は、例えば、2回、3回、4回、及び5回の遠心
分離を含み得る。中間のアンダーフロー流は水で希釈されて、液体産物の回収をさらに増
すことができる。上述のディスクスタックとデカンタ型の遠心分離の組み合わせなど、遠
心分離構成の任意の組み合わせを使用して多段遠心分離を実施できる。遠心分離により分
離されないさらなる固体は、限外濾過などの濾過プロセスにより除去できる。
スである。有用な構成には、スパイラル型、中空繊維型、又は平板型(カートリッジ)限
外濾過要素を利用するクロスフロー濾過がある。これらの要素は、約200,000ダルトン未
満の分画分子量を持つポリマー膜又はセラミック膜からなり、例えば以下の実施例Iで使
用されるHydranautics 5K PES膜がある。セラミック限外濾過膜は、最長10年又は10年を
超える長い動作寿命を持つので、やはり有用である。セラミックは、ポリマー膜よりもは
るかに高価であるという欠点を有する。限外濾過は、約1,000ダルトンを超える分子量の
懸濁している固体及び溶質を濃縮する。限外濾過は、約1,000ダルトンから約200,000ダル
トンの名目上の分子量カットオフ(MWCO)を有する膜(約0.005から0.1ミクロンの細孔径
)を通す濾過を含む。分子量カットオフという用語は、膜によりおよそ90%留められるタ
ンパク質の大きさを定義するように使用される。限外濾過を利用すると、透過液は、1,4-
BDOなどの低分子量有機溶質、培地塩、及び水を含むだろう。捕捉された固体は、例えば
、残存する細胞片、DNA、及びタンパク質を含み得る。
。精密濾過は、遠心分離に代わる、細胞を分離する手段を与える。精密濾過は、通常、0.
05-10ミクロンの範囲のコロイド状及び懸濁した粒子を分離する低圧クロスフロー膜プロ
セスを含む。精密濾過は、細孔径が約0.05ミクロンから約5.0ミクロンである膜を通す濾
過を含む。ポリマー性、セラミック、又はスチールの精密濾過膜を使用して細胞を分離で
きる。セラミック又はスチールの精密濾過膜は、最長10年又は10年を超える長い動作寿命
を持つ。精密濾過は、発酵ブロスの清澄化に利用できる。限外濾過とは異なり、精密濾過
は一般的に、残存する細胞片、DNA、及びタンパク質を捕捉しないだろう。しかし、濾過
膜の汚損を避けるために、段階的に細孔径が小さくなる一連の濾過工程を利用することが
有用である。これは濾過膜の再使用を最適化するために有用である。いくつかの実施態様
において、単一の限外濾過工程が利用され、細胞集団(遠心分離又は精密濾過の代わりに
)及び残存する細胞片、DNA、タンパク質などの両方を除去できる。セラミック限外濾過
要素は、この操作様式に利用される頻繁な洗浄サイクルに耐える能力のために、この用途
に有用である。
塩を分離できる。この処理工程は、例えば、事前に水を蒸発させずに特定の培地塩の回収
を可能にする。ナノ濾過は、塩を分離し、色を除き、脱塩を与えることができる。ナノ濾
過において、透過液は一般的に一価のイオン及び1,4-BDOにより例示される低分子量有機
化合物を含む。ナノ濾過は、約100ダルトンから約2,000ダルトンの名目上の分子量カット
オフ(MWCO)を有する膜(約0.0005から0.005ミクロンの細孔径)を通す濾過を含む。ナノ
濾過の一方法は、スパイラル型要素を利用するクロスフロー濾過である。利用可能なナノ
濾過膜が数種類あり、例えば、以下の実施例IIIで使用される薄膜複合ナノ濾過膜GE DKが
ある。ナノ濾過における物質移動機構は拡散である。ナノ濾過膜は、特定のイオン性溶質
(ナトリウム及び塩化物など)、主に一価のイオン、並びに水の部分的な拡散を可能にす
る。二価及び多価のイオンを含む、より大きなイオン種及びより複雑な分子は実質的に留
められる。
間の浸透圧の差はそれほど大きくなく、このため通常、例えば逆浸透と比べてナノ濾過で
の幾分低い操作圧力を生み出す。
物の除去は単離プロセスで重要になり得るが、その理由は、そのような酸が目的とする産
物との望ましくない副反応を触媒し、又は反応物として作用することがあるからである。
1,4-BDOの単離に関連する具体的な実施態様の状況において、例えば、下流の蒸発又は蒸
留工程の高温の間ヒドロキシル基のエステル化などの反応を防止できるので、有機酸の除
去は特に有用である。このようなエステル副産物は、典型的にはBDOより沸点が高く、蒸
留中の重質流(heavies stream)にとって収率低下をもたらす。
蒸留の間の分解反応を防止する。これらの分解反応は、目的とする化合物の着色をもたら
すことがある。塩及び基質に富むナノ濾過濃縮水は、蒸発晶析から回収された塩流に比べ
て、発酵への再生利用により適していることがある。例えば、加熱を伴う方法の代わりに
濾過法を使用すると、分解産物が少なくなることがある。そのような分解産物は、発酵生
物にとって毒性を持つことがある。
れは、目的とするいくつかの化合物の状況では有用になることがある。例えば、ポリマー
グレードの1,4-BDOの産生において色の除去は有用である。
きる。これは、膜の汚損を低減し、再生利用のために発酵ブロスの個別の成分の回収を助
けるのに有用になり得る。例えば、一連の濾過は、精密濾過、それに次いで限外濾過、そ
れに次いでナノ濾過を利用することがある。このように、精密濾過は細胞集団の回収を助
け、限外濾過は細胞片、DNA、及びタンパク質などの大きな成分を除去し、ナノ濾過は塩
の回収の助けになる。
すれば、種々の発酵バイオリアクター構成の状況内に組み込めることを認識するだろう。
いくつかの実施態様において、濾過はバイオリアクターの外部で起こる。この様式におい
て、任意の量の発酵ブロスがバイオリアクターから除去され、別々に濾過される。真空法
の利用により、又は陽圧の利用により、濾過を促進することができる。いくつかの実施態
様において、細胞の濾過は、バイオリアクター内部の濾過要素により実施できる。そのよ
うな構成には、膜細胞再生利用バイオリアクター(membrane cell-recycle bioreactor) (
MCRB)に見いだされるものがある。Changらの文献米国特許第6,596,521号は、2段階細胞再
生利用連続リアクターを記載している。
7:357-361(2002))に記載される音響細胞沈降器(acoustic cell settler)により分離し、
発酵混合物中に再生利用できる。音響細胞沈降は超音波を利用して、発酵ブロス中の細胞
の懸濁液を濃縮する。この方法によりバイオリアクターに細胞を容易に戻すことができ、
濾過タイプの細胞再生利用系を複雑にすることのある膜の汚損の問題を回避する。
セスと組み合わせて利用できる。そのような他の方法には、例えば、イオン交換がある。
例えば、Gongら(Desalination 191:1-3, 193-199 (2006))は、電気透析による1,3-プロパ
ンジオール発酵ブロスの脱塩に対する、イオン交換膜の輸送特性の影響を記載している。
ーズの形態で投じられる。樹脂は、電荷を帯びた部位の形態の活性基を有する架橋ポリマ
ーでよい。これらの部位において、反対の電荷を持つイオンが引きつけられるが、その相
対濃度及び該部位に対する親和性によって他のイオンにより置換され得る。イオン交換器
は、例えば、カチオン性にもアニオン性にもなり得る。あるイオン交換樹脂の効率を決め
る因子には、あるイオンの優先度(favorability)及び利用可能な活性部位の数がある。活
性部位を最大にするには、一般的に、大きな表面積が有用である。よって、小さい粒子は
、その大きな表面積のために有用である。
びpHもイオン交換の効率に影響する。例えば、pHは交換に利用できるイオンの数に影響を
与えることがあり、温度はプロセスの反応速度に影響を与える。いくつかの実施態様にお
いて、イオン交換による塩の除去は、有機酸及び有機酸の塩の除去を含む。アニオン形態
の有機酸は、アニオン交換活性部位に結合できる。いくつかの実施態様において、有機酸
を結合するためのpHはその酸のpKa未満である。例えば、乳酸のpKaは約3.1である。有機
酸の塩を除去する効果的な方法は、カチオン交換とそれに次ぐアニオン交換である。最初
に、カチオン樹脂は、有機酸対イオン(カルシウム、ナトリウム、アンモニウムなど)を
除去し、溶液のpHを下げる。次いで、アニオン樹脂が遊離の酸に結合する。
れたイオンを除き、それに代わる望ましいイオンの溶液に接触させることができる。再生
により、同じ樹脂ビーズが何回も使用でき、単離されたイオンは廃液に濃縮できる。多く
の濾過方法と同様に、実施例IVに例示されるとおり連続的なイオン交換が実施可能である
。そのため、供給材料を、任意の数のアニオン交換及びカチオン交換器の両方又は混合床
交換器に任意の順序で通すことができる。
いくつかの実施態様において、塩は、水の除去の前に除去されている。いずれにしても、
蒸発した水は、補給水として発酵に再生利用でき、プロセスの水要求量全体を最低限にす
る。塩が除去されていない場合、1,4-BDOに富む液相に対するその溶解度は十分に低いの
で、それらは水の除去後に結晶化し得る。いくつかの実施態様において、塩は1,4-BDOに
対する溶解度が十分に低いので、分離される1,4-BDOは約98%塩を含まない。
手段により除去できる。1,4-BDO単離の状況において、蒸発晶析器は、発酵ブロスから水
を除去して、発酵培地塩の過飽和及び残存液相又は母液におけるその後の結晶化を起こす
ほど十分な水を除去した液相をつくるように機能する。以下の実施例Vに示されるとおり
、塩の結晶化は、1,4-BDOの濃度が約30重量%で始まる。
解する異なる能力を有する溶媒の組み合わせであることが多い。例えば、発酵ブロスから
の1,4-BDOの精製の状況において、母液は、細胞除去後に得られた液体分画及び発酵ブロ
ス由来の他の固体を含む。発酵ブロスから目的とする化合物を単離する状況において、主
な溶質には発酵培地塩及び有機酸がある。
媒中で溶質が濃縮されている状態を意味する。発酵ブロスのバルク溶媒は、例えば比較的
少量の1,4-BDO並びに溶解した塩及び他の培地を含む水である。
、例えば、引用により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第3,976,430号に記載され
ている。FC晶析器は水を蒸発させ、化合物に富む(1,4-BDOなど)液体分画中の塩の過飽
和を増大させ、それにより塩を結晶化する。FC晶析器は高い蒸発速度を得るのに有用であ
る。FC晶析器は、4つの基本要素、円錐底部部分を持つ晶析器容器、循環ポンプ、熱交換
器、及び晶析器中で発生する蒸気を扱う真空装置からなる。晶析器容器からでるスラリー
は熱交換器を通って循環し、再び晶析器容器に戻り、そこでスラリー中に存在する結晶へ
の塩の堆積により過飽和が軽減される。蒸発した水は真空系に導かれ、そこで凝縮されて
必要に応じて発酵ブロスに再生利用される。いくつかの実施態様において低真空があるが
、FC晶析器をおよそ大気圧でも使用することが可能である。いくつかの実施態様において
、FC晶析器は断熱蒸発冷却を利用して、塩の過飽和を発生させる。そのような実施態様に
おいて、FC晶析器は熱交換器を備える必要がない。
に備えて、液相の流出を処理し、結晶成長を阻害し得る微粉を低減できる。FC晶析器中で
生成した塩は、任意のエルトリエーションレッグ(elutriation leg)によりサイズ選択す
ることもできる。FC晶析器のこの部分は、晶析器容器の円錐部分の底部に見える。サイズ
選択は、レッグを上る発酵流体の流れを与え、特定の沈降速度を有する粒子のみをこの流
れに逆らって動かすことにより達成される。この沈降速度は、結晶の大きさ及び形状並び
に流体の粘度に関連している。さらなる実施態様において、FC晶析器は産物の損失を減ら
す内部スクラバーを備えることもある。これは揮発性産物の回収の助けになる。
種の放出流を与えるが、1つは結晶を含むスラリーであり、もう1つは少量の微粉を含む液
相である。DTB晶析器の構成は、結晶成長を促進し、FC晶析器で得られるものより大きい
平均サイズの結晶を生成できるようなものである。いくつかの実施態様において、DTB晶
析器は、真空下又はわずかに過圧下で運転する。いくつかの実施態様において、DTB晶析
器は冷却に真空を利用する。
晶がこの枠組みで得られることを認識するだろう。このシステムは、任意に、微粉を溶解
して結晶の大きさをさらに増すように構成され得る。DTB晶析器が発酵培地塩の回収に利
用される場合、結晶の大きさは必ずしも優先事項ではない。
化された液相が別な領域にあるので、速度パラメーターの定義が容易であり、そのため成
長速度及び核化速度が容易に計算できる。これらの特徴により、DTB晶析器は数学的記述
に好適であり、良好な操作制御を受ける。DTB晶析器は、FC晶析器と同様に、混合懸濁液
混合生成物除去(MSMPR)デザインの一例である。
この領域は、液相及び微粉をさらに処理するために使用される。いくつかの実施態様にお
いて、微粉のさらなる処理があまり重要でない場合のように、調節領域は存在しない。そ
のような構成はドラフトチューブ晶析器として当分野に知られている。DTB晶析器は、通
常供給溶液の入口の近傍の装置の底部に攪拌器を備えていることがある。FC晶析器のよう
に、DTB晶析器は、任意にエルトリエーションレッグを備えている。いくつかの実施態様
において、任意の外部加熱ループを使用して、蒸発速度を増すことができる。
体積のための追加の攪拌手段を提供する。この装置はドラフトチューブの使用に関してDT
B晶析器と類似である。DTB装置とは違い、内部の攪拌器はない。代わりに、容器の円錐部
分にある誘導器が、加熱された液体を再循環ポンプから導入する。他の晶析装置構成と同
様に、誘導循環型晶析器は、任意にエルトリエーションレッグを備える。このタイプの晶
析器に、任意にバッフルも利用できる。
よい。このタイプの晶析器は、「成長」、「流動床」、又「クリスタル」型晶析器とも呼
ばれる。オスロ型晶析器は、流動床内で結晶の成長を可能にし、機械的循環を受けない。
オスロユニット内の結晶は、流動床中の滞留時間に比例する大きさに成長する。その結果
として、オスロ型晶析器は他のほとんどの晶析器タイプより結晶を大きく成長させること
ができる。スラリーは、晶析器の流動床から除去されて、例えば遠心分離セクションに送
られ得る。1,4-BDOを含む透明な液相は、晶析器の清澄化領域から除くことができる。
が起こる液体蒸気分離領域である。わずかに過飽和の液相が中央のパイプを通って流れ落
ち、結晶の流動床との接触により過飽和が軽減される。チャンバーの上部に回収される前
に、循環する液相が分級床を通って上方に移動するにつれ段々に脱過飽和が起こる。残存
する液体は循環パイプを通って離れ、新しい供給材料が添加された後、それは熱の補充が
行われる熱交換器を通る。次いで、それは上部に再生利用される。
エーションレッグ、及びスクラバーを備えていてよい。成長している結晶は攪拌装置と全
く接触しないので、破壊される微粉の量は一般的に少ない。オスロ型晶析器は、結晶除去
期間の間の長い産生サイクルを可能にする。
用である。一実施態様において、オスロ型晶析ユニットは、図9に示されるとおり「閉鎖
型」である。他の実施態様において、オスロ型晶析器は、図10に示されるとおり「開放型
」である。後者の構成は、例えば広い沈降面積が必要である場合に有用である。
部分からの発酵培地塩の回収において、正確な結晶形態、大きさなどは一般的に重要でな
い。実際に、アモルファスな培地塩の回収が、1,4-BDOを含む目的とする化合物の精製に
おいて十分なことがある。そのため、いくつかの実施態様において、結晶成長自体を制御
しない他の蒸発法を利用できる。
て、蒸発の前に水の一部を除去できる。水はRO膜を浸透するが、1,4-BDOは留まる。いく
つかの実施態様において、RO膜は、1,4-BDOなどの産物を約20%に濃縮できる。当業者は、
産物1,4-BDOからの浸透圧が、RO膜を使用するさらなる濃縮がもはや実行可能でない点ま
で増すことを認識するだろう。それでもなお、RO膜の使用は、よりエネルギー集約的な水
蒸発法の前に、目的とする産物を濃縮する有用な低エネルギー入力法である。そのため、
大きい規模では、RO膜の利用は特に有用である。
実施態様において、実質的に全ての塩が、水の一部の除去前に除去される。除去される水
の一部は、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、及び中間の
全値を含む任意の量でよい。いくつかの実施態様において、実質的に全ての水の除去後に
塩が除去される。実質的に全ての水は、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%及び中間の全値
及び全ての水を含む。
の検討事項の1つは、エネルギー必要量を最低限にすることである。多重効用又は機械的
蒸気再圧縮などの蒸発器構成は、エネルギー消費量の低減を可能にする。いくつかの実施
態様において、水の除去は、1つ以上の効用を含む蒸発器系による蒸発により実施される
。いくつかの実施態様において、二重又は三重効用蒸発器系を使用して、1,4-BDOなどの
目的とする産物から水を分離できる。任意の数の多重効用蒸発器系を水の除去に利用でき
る。これらの装置は、水より沸点が高い任意の発酵産物にも適用できる。三重効用蒸発器
、又は他の蒸発装置構成は、塩の回収のための蒸発晶析器である専用の効用、例えば、三
重効用構成の最後の効用を含むことがある。
この蒸気を、他の「効用」と呼ばれる他の蒸発器においてさらなる加熱に使用できる。そ
のため、例えば、2つの蒸発器を、一方からでる蒸気ラインを他の蒸気室に接続して2つ又
は二重効用蒸発器を与えるように接続できる。この構成を第3の蒸発器に広げて、例えば
三重効用蒸発器を作ることができる。
は気化のためのエネルギーを与え、蒸気生成物は凝縮して系から除去される。二重効用蒸
発器では、最初の効用を出た蒸気生成物は第2の気化ユニットのためのエネルギーを与え
るために使用される。効用のカスケーディングは任意の数の段階に続けることができる。
多重効用蒸発器は、単効用蒸発器に比べて、大量の溶媒をより効率的に除去できる。
使用される。効用は、蒸気により加熱されるもの、効用Iから数えられる。第1の効用は最
も高い圧力で作用する。効用Iから出た蒸気は、効用IIを加熱するために使用されるが、
その結果としてより低い圧力で作用する。これはそれぞれの追加効用を通して続き、その
ため圧力は一連の間に低下し、熱い蒸気は1つの効用から次の効用に移動する。
積において物理的に類似になり得る。熱損失が著しくない限り、それらは同じ容量を持つ
こともある。一連の蒸発器、直列に結合した効用は、いくつかの異なる方法で供給材料を
受け取ることができる。前向き供給配列(forward feed arrangement)は、パターンI、II
、及びIIIとなる。これらは単一の供給ポンプを使用する。この構成において、供給材料
は効用Iで使用される最高操作温度に加熱される。最低操作温度は最後の効用中であり、
そこで産物は最も濃縮されている。したがって、この構成は熱に敏感な産物に有用である
か、副反応の低減に有用である。
を利用できる。そのような構成において、多くのポンプが系の圧力低下に反して働くよう
使用されるが、供給材料は徐々に加熱されるので、前向き供給構成よりも効率よくなり得
る。この配列は系の中の粘度の違いも低減するので、粘性の発酵ブロスに有用である。い
くつかの実施態様において、混合供給配列(mixed feed arrangement)が利用でき、供給材
料は系の真ん中に、又は効用II、III、及びIに入る。最後の蒸発は最高温度で実施される
。さらに、後ろ向き供給配列よりも必要なポンプが少ない。なおさらなる実施態様におい
て、平行供給系(parallel feed system)が利用されて、供給材料流を分けて、各効用に一
部が供給される。この構成は、産物がスラリーであると予測される晶析蒸発器において通
常みられる。
ある蒸発器の設計は、流下液膜式蒸発器である。この装置は、垂直管形熱交換器を含み、
図11に示されるとおり側方又は同心円状に配置された遠心分離機を持つ。
形成し、蒸気により加えられる熱のためにそこから蒸発が起こる。蒸気は凝縮し、管の外
部表面を流れ落ちる。多くの管がともに並んで組み立てられている。各端部で管は管板に
固定されており、最終的に管の束はジャケット内に密閉されている。
。管の内面は沸騰セクションと呼ばれる。それらは一緒にカランドリアを形成する。濃縮
された液体及び蒸気は底部でカランドリアを離れ、そこから濃縮された液体の主な部分は
排出される。残りの部分は蒸気に接して共に次の分離器に入る。分離された濃縮物は、通
常カランドリアから出る濃縮物の大部分のためのポンプと同じポンプにより排出され、蒸
気は上部から分離器を離れる。加熱する蒸気は、管の外部表面で凝縮し、加熱セクション
の底部で凝縮液として回収され、そこから排出される。
典型的には1パスあたり数秒ほどの非常に短い生成物接触時間を有する。これらの特性に
より、流下液膜式蒸発器は熱に敏感な生成物に特に好適である。小さい温度差による流下
液膜式蒸発器の運転は、多重効用構成における使用又は機械的蒸気圧縮系と組み合わせた
使用を促進する。
及び水垢の回避を助ける。いくつかの実施態様において、湿潤速度は、蒸発器効用を拡張
又は分割することにより上昇し得る。流下液膜式蒸発器は、例えば、エネルギー供給、真
空、供給速度、及び濃度などのパラメーターの変化に非常に敏感である。いくつかの実施
態様において、単効率、二重効率、三重効率、又は他の多重効用流下液膜式蒸発器構成は
、先に詳述されたナノ濾過プロセスにより既に濾過された発酵ブロスを利用できる。水の
蒸発の前の塩の低減は、カランドリアの管の中の水垢の防止をさらに助けることができる
。
転時、液体分画は、分布系によりカランドリアの加熱管に均一に分布する。液体分画は、
従来の流下液膜式蒸発器と同様に、内壁を薄膜となって流れ落ちる。カランドリア管中で
形成された蒸気は、凝縮管の外部壁で蒸留物として凝固し、下方に流れる。水蒸留物及び
富化された液体分画は別々に蒸発器の下部から排出される。
又は分離器が、図12に示されるとおりカランドリア及び循環ポンプの上に配置されている
。運転時、液体分画は循環ポンプによりカランドリアを通って循環する。液体は、カラン
ドリア内で、通常の沸騰圧力より上の高沸騰圧力で過熱される。分離器に入ると、圧力は
急激に低下し、液体の瞬間蒸発又は迅速な沸騰を起こす。循環ポンプで制御されている流
速及び温度を利用して、水の除去プロセスを制御できる。この構成は、カランドリア管の
汚損を回避するのに有用である。
。例えば、単効用強制循環式蒸発器の他に、二重、三重、及び多重効用強制循環式蒸発器
を、発酵液の液体分画からの水の分離に利用できる。いくつかの実施態様において、1つ
以上の強制循環式蒸発器を、1つ以上の流下液膜式蒸発器と組み合わせて利用できる。
よい。この蒸発器はプレート熱交換器及び1つ以上の分離器を利用する。プレート及びフ
レーム構成は、加熱媒体及び発酵ブロスの液体分画を運ぶ交互の水路を持つプレートを使
用する。運転時、液相及び加熱媒体はそのそれぞれの水路を向流で通過する。規定された
プレートの距離及び形状は乱流を発生させ、効率よい熱伝導を起こす。液体分画のある水
路への熱伝導が水を沸騰させる。そのように形成された蒸気は、残りの液体をプレートア
センブリーの蒸気ダクトへ上昇する膜として駆り立てる。残りの液体及び蒸気は、下流の
遠心分離器で分離される。広い流入ダクト及び上方への動きは熱交換器の断面にわたる良
好な分布を助ける。プレート式蒸発器は、ナノ濾過膜を通る予備濾過とともに有用に運転
して汚損を回避できる。このように、水垢に関して流下液膜式蒸発器と類似な考察事項が
保障される。
式蒸発器に関して上述されたのとほぼ同様に利用できる。多重効用構成で使用される場合
、当業者は、液体分画がプレート式蒸発器に導入される前に強制循環式蒸発器及び/又は
ナノ濾過工程を利用する利点を認識するだろう。このように分離スキームは、例えば、ナ
ノ濾過、それに次いで1つ以上の強制循環式蒸発器の多重効用蒸発構成、それに次いで1つ
以上のプレート及び/又は流下液膜式蒸発器を含み得る。なおさらなる実施態様において
、上述の蒸発晶析器のいずれも、多重効用構成と組み合わせて利用できる。
画から水を除去できる。循環式蒸発器は、管の長さの短い垂直のカランドリアを、熱交換
器の上に配置された側面の分離器とともに利用する。運転時、液体分画はカランドリアの
底部に供給され、上部に上がる。カランドリアの管の中での加熱の間、水は沸騰し始めて
蒸気を放出する。液体は、上方に動く蒸気に同伴されてカランドリアの上部に運ばれる。
分離器に入ると、液体は蒸気から分離される。液体は、循環パイプにより蒸発器に戻り、
引き続き循環する。カランドリアの加熱要素と分離器チャンバーの温度差が大きいと、液
体分画からの水の蒸発の程度が大きくなる。液体部分が十分に1,4-BDOに富む場合、塩が
液体分画から沈殿し始めるだろう。
ぞれ備えたいくつかの分離室に区切ることができる。これにより、液体分画から水を除去
するのに必要な加熱表面を減らすことができる。
な系は、図15に示されているが、垂直の流動床交換器を備えている。熱交換器の管の面に
は、ガラスもしくはセラミックのビーズ、又はスチールワイヤー粒子などの固体粒子があ
る。
を同伴し、洗い流し(scouring)又は洗浄作用を与える。液体分画と共に、それらはカラン
ドリア管を通って移動する。カランドリアの上部で、固体粒子は液体から分離され、カラ
ンドリア入口室に再生利用される。過熱された流体は分離器中で沸点に瞬間蒸発し、蒸発
による水の除去を可能にする。カランドリアの管中の固体の洗い流し作用は、運転時間を
延ばし、管の汚損をさらに防止する。汚損する固体の形成が従来の強制循環式蒸発器系の
使用を限定する場合に、これは有用になり得る。
の種類の蒸発器である。この系の構成は、垂直な管形熱交換器(カランドリア)の上に据
え付けた蒸気分離器を有する。運転時、カランドリアの底部の液体分画は、蒸気分離器の
上部に上がる。外部加熱により、液体分画中の水は、カランドリア管の内壁で沸騰する。
蒸気の上向きの動きは液体分画をカランドリアの上部へと運ぶ。管を通る上昇の間に、さ
らに蒸気が形成される。分離器に入ると、蒸気と液相は分離される。上昇液膜式蒸発器は
、粘性の液体と共に使用される場合、及び/又は多量の汚損する固体が予測される場合に
特に有用である。
利用できる、さらに他の蒸発器である。この装置は、カランドリアの下部が上昇液膜式蒸
発器のものより大きい、管形熱交換器(カランドリア)を有する。カランドリアの上には
、上昇液膜式蒸発器と同様に、分離器が配置されている。この蒸発器では、分離器には液
体分配系がさらに備えられている。
器の管にわたって分布するが、蒸気は液体に向流して上部に流れる。いくつかの実施態様
において、このプロセスは、例えば、同伴を高めるために、不活性ガスの流れを含むこと
がある。このガスは、カランドリアの下部に導入することができる。
の蒸発器である。この装置は、攪拌機を備えた外部のジャケット加熱容器を含む。運転時
、液体分画は、任意に回分式に、容器中に置かれる。水は、連続的な撹拌と共に沸騰する
ことにより、所望の濃度まで蒸発する。この装置は、任意の浸漬加熱コイルを使用して加
熱表面を増やすことにより、その蒸発速度を増すことができる。この種類の蒸発器は、発
酵物が非常に粘性である場合に特に有用である。
類の蒸発器である。この設計は、螺旋型加熱管を備えた熱交換器及び底部据え付け遠心分
離器を含む。運転時、液体分画は、蒸気の流れと平行に流れて、上部から底部に沸騰膜で
流れる。膨張する蒸気は、剪断、又は液膜を押す作用を生み出す。流れの通路の曲りは、
管の軸に沿った動きと干渉する二次的な流れを誘導する。この乱流は熱伝導を向上させ、
粘性の液体に特に有用である。加熱管の螺旋構造は、非螺旋型の直管設計に比べて、高い
加熱表面積対高さ比を通常与える。この装置は、単路運転を可能にする大きな蒸発速度を
与える。
を使用すると、蒸発の効率を高めることができる。運転の効率を高める他の方法には、例
えば、熱及び機械的蒸気再圧縮がある。いくつかの実施態様において、多重効用構成、熱
再圧縮、及び機械的再圧縮の任意の組み合わせを利用して、蒸発効率を高めることができ
る。
熱室圧力に相当する飽和蒸気温度はより高いので、蒸気は加熱に再使用できる。これは、
スチームジェットポンプ原理に基づいて運転するスチームジェット蒸気再圧縮機により達
成される。簡単に言うと、スチームジェット原理は蒸気のエネルギーを利用して、真空を
つくりプロセスガスを取り扱う。圧力のかかっている蒸気がノズルに入り、高速のジェッ
トをつくる。このジェットの作用が、ガスを引き込み同伴する真空をつくりだす。蒸気と
ガスとの混合物は、大気圧で排出される。駆動蒸気と呼ばれる、ある量の蒸気が、熱再圧
縮機の運転に使用される。駆動蒸気は、次の効用又は凝縮器に移動する。過剰な蒸気のエ
ネルギーは、およそ使用された量の駆動蒸気のエネルギーである。
、蒸気エジェクターによってより高い温度レベルに圧縮された、関連する効用の1つから
出た生成物蒸気である。その後の効用における加熱媒体は、その前のカランドリアで発生
した蒸気である。最後の効用から出た蒸気は、必要に応じて任意に冷却水を補われて、入
ってくる生成物とともに凝縮する。回収された全ての水は、発酵ブロスに容易に再生利用
される。
する加熱蒸気温度の圧力に再圧縮される。運転原理はヒートポンプに類似している。蒸気
凝縮物のエネルギーは、発酵ブロスの液体分画のさらなる部分を予備加熱するのに任意に
使用できる。機械的再圧縮は、高圧ファン又はターボコンプレッサーの使用により供給さ
れる。これらのファンは高速で運転し、蒸気圧縮比約1:1.2から約1:2で大きな流量に適し
ている。合理的な速度は、約3,000から約18,000rpmである。いくつかの実施態様において
、特に高い圧力が有用な場合、多段圧縮機が利用できる。
ァンにより高温に圧縮された、同じ効用中で発生した蒸気である。高熱セクションから出
た過剰の蒸気は任意に凝縮されるか、又は高濃縮器で使用できる。
を含む種々のエネルギー効率の良い構成に配置できる、可能な蒸発の種類が多くある。最
適な構成は多くの因子に依存し、例えば、培地塩が蒸発の前に除去されるか、又は蒸発の
間の結晶化により除去されるかがある。蒸発の前に塩が除去される場合では、低コストの
構成が有用である。例示的な構成には、流下液膜式三重効用蒸発器系又は機械的蒸気再圧
縮系がある。蒸発の間に塩が結晶化する場合は、塩の沈殿による熱交換器表面のスケール
発生の可能性のためにより複雑である。この場合の例示的な構成は、例えば、最初の2つ
の効用が流下液膜式蒸発器であり(結晶化の開始前)最後の段階が強制循環式蒸発晶析器
である三重効用を含む。
用できる。第1の塔は1,4-BDOから水及び他の軽質成分を分離するために使用され、第2の
塔は、残存重質成分から1,4-BDOを蒸留するために使用される。蒸留塔を真空下で運転し
て、要求される温度を下げ、望ましくない反応、産物の分解、及び色の形成を低減できる
。塔の間の圧力低下を最低限にして、底部再沸器中の低温を維持できる。例えば流下液膜
式再沸器を利用することにより、再沸器中の滞留時間を最低限にして、望ましくない反応
、産物の分解、及び色の形成も防止できる。
置の種々の構成が、1,4-BDOを含む目的とする化合物の精製に有用であることを認識する
だろう。例示的な構成の1つには、例えば、図16のフロースキームダイアグラムに示され
るディスクスタック遠心分離、限外濾過、蒸発晶析、イオン交換、及び蒸留がある。この
ように、いくつかの実施態様において、本発明は、1,4-BDOを発酵ブロスから単離する方
法であって、固体の一部をディスクスタック遠心分離により除去して液体分画を与えるこ
と、固体のさらなる部分を限外濾過により該液体分画から除去すること、塩の一部を蒸発
晶析により該液体分画から除去すること、塩のさらなる部分をイオン交換により該液体分
画から除去すること、及び1,4-BDOを蒸留することを含む方法を提供する。
される。細胞は、任意に発酵に戻して再生利用される。限外濾過は、細胞片、DNA、及び
沈殿したタンパク質を除く。蒸発晶析は、培地塩の一部及び水を除くが、そのどちらも任
意に発酵に戻して再生利用できる。蒸発晶析の後、残った液相はイオン交換カラムに通さ
れて、さらなる塩が除去される。イオン交換後、水の一部を、上述のとおり蒸発器系で蒸
発できる。軽質分画の蒸留に次いで1,4-BDOの蒸留が実施されて、実質的に純粋な1,4-BDO
を与える。
濾過、ナノ濾過、イオン交換、蒸発、及び蒸留を含む。このように、いくつかの実施態様
において、本発明は、1,4-BDOを発酵ブロスから単離する方法であって、固体の一部をデ
ィスクスタック遠心分離により除去して液体分画を与えること、固体のさらなる部分を限
外濾過により該液体分画から除去すること、塩の一部をナノ濾過により該液体分画から除
去すること、塩のさらなる部分をイオン交換により該液体分画から除去すること、水の一
部を蒸発させること、及び1,4-BDOを蒸留することを含む方法を提供する。
れる。細胞は、任意に発酵に戻して再生利用できる。限外濾過は、細胞片、DNA、及び沈
殿したタンパク質を除去する。ナノ濾過は培地塩の一部を除去するが、これは任意に発酵
に戻して再生利用できる。ナノ濾過の後、透過液はイオン交換カラムに通されて、さらな
る塩が除去される。イオン交換後、上述のとおり、水の一部を蒸発器系中で蒸発できる。
軽質分画の蒸留に次いで1,4-BDOの蒸留が実施され、実質的に純粋な1,4-BDOを与える。
化合物でよい。本明細書に開示される方法は、沸点が水より高い目的とする化合物に適用
可能である。具体的には、目的とする化合物は、約120℃から400℃の沸点を有することが
ある。他の性質には、水に対する高い溶解度又は混和性、及び感知できるほど塩を可溶化
できないこと(蒸発晶析を利用する場合)、及び分子量が約100-150ダルトンより低い中
性化合物(ナノ濾過による好適性)であることがある。
場合、発酵ブロスからの目的とする化合物の単離に適用できる。そのような方法は、目的
とする化合物に富む液体分画を、細胞集団を含む固体分画から分離し、それに次いで水及
び塩の除去、それに次いで精製を含む。
する。発酵ブロスは、1,4-BDO又は沸点が水よりも高い目的とする化合物、1,4-BDO又は目
的とする化合物を産生できる細胞、培地塩、及び水を含み得る。該方法は、1,4-BDO又は
目的とする化合物に富む液体分画を、細胞を含む固体分画から分離することを含む。次い
で、細胞は発酵ブロスに再生利用される。水は、液体分画からの塩の分離の前又は後に除
去できる。液体分画から蒸発された水は、発酵ブロスに再生利用される。液体分画から出
た塩は、液体分画からの水の除去により塩を結晶化させることによるか、又はナノ濾過及
び/或いはイオン交換のいずれかにより、除去されて発酵ブロスに再生利用することがで
きる。次いで、ナノ濾過から分離された塩は、発酵ブロスに再生利用される。該方法は、
例えば蒸留によりさらに精製できる1,4-BDO又は他の目的とする化合物を提供する。
合物を産生する微生物を発酵装置中で目的とする化合物を産生するのに十分な時間培養す
ることを含む。該生物には、化合物経路酵素をコードする1つ以上の外因性遺伝子及び/
又は1つ以上の遺伝子破壊を含む化合物経路を有する微生物がある。また、化合物を産生
する方法は、目的とする化合物に富む液体分画を、細胞を含む固体分画から分離すること
、該液体分画から水を除去すること、該液体分画から塩を除去すること、及び目的とする
化合物を精製することを含む方法により化合物を単離する方法を含む。目的とする化合物
は、水より高い沸点を有する。
中で1,4-BDOを産生するのに十分な時間培養することを含む。該生物には、化合物経路酵
素をコードする1つ以上の外因性遺伝子及び/又は1つ以上の遺伝子破壊を含む1,4-BDO経
路を有する微生物がある。また、1,4-BDOを産生する方法は、目的とする化合物に富む液
体分画を、細胞を含む固体分画から分離すること、該液体分画から水を除去すること、該
液体分画から塩を除去すること、及び目的とする化合物を精製することを含む方法により
化合物を単離することを含む。
により1,4-BDOを産生できる微生物の培養で産生が始まる。例示的な微生物には、両方と
も引用によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開特許第2009/0075351号及び米国
公開特許第2009/0047719号に記載されているものがあるが、限定はされない。
得る。そのような生物には、例えば、完全な1,4-BDO生合成経路を持つように遺伝子操作
された非天然の微生物がある。そのような経路は、内因性核酸及び外因性核酸の両方によ
りコードされた酵素を含み得る。微生物宿主に通常存在しない酵素を、例えば、1つ以上
の外因性核酸を含むことにより経路を完全にするために機能性に含むことができる。その
ような1,4-BDO経路の1つは、4-ヒドロキシブタノアートデヒドロゲナーゼ、スクシニル-C
oAシンセターゼ、CoA-依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブ
チラート:CoAトランスフェラーゼ、4-ブチラートキナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ
、α-ケトグルタラートデカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコール
デヒドロゲナーゼ、又はアルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素を含
む。
ロラーゼ、4-アミノブチラート-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAオキシドレダクター
ゼ(脱アミノ化)、4-アミノブチリル-CoAトランスアミナーゼ、又は4-ヒドロキシブチリ
ル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする1つ以上の外因性核酸を含むことがある。そのよう
な経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性)、4-ヒドロキシ
ブチリル-CoAレダクターゼ、又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むこと
がある。
Aヒドロラーゼ、4-アミノブチラート-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ
(アルコール形成性)、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ、4-アミノブタン-1-オール
デヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、又
は4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼをコードする1つ以上の外因性核酸を含む
ことがある。そのような経路は、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むこと
がある。
ナーゼ(リン酸化)、4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オ
ールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブタン-1-オールトランスアミナー
ゼ、[(4-アミノブタノリル)オキシ]ホスホン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、[(
4-アミノブタノリル)オキシ]ホスホン酸トランスアミナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-ホ
スファートデヒドロゲナーゼ、又は4-ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リ
ン酸化)をコードする1つ以上の外因性核酸を含むことがある。そのような経路は、1,4-
ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むことがある。
ミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、2,5-ジオキソペンタン酸レダクターゼ、α
-ケトグルタラートCoAトランスフェラーゼ、α-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ、α-ケ
トグルタリル-CoAリガーゼ、α-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ、5-ヒドロキシ-2-オキ
ソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成
性)、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、又は5-ヒドロキシ-2-オキ
ソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱炭酸)をコードする1つ以上の外因性核酸を含むこと
がある。そのような経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性
)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ
をさらに含むことがある。
ラーゼ、グルタミル-CoAリガーゼ、グルタマート5-キナーゼ、グルタマート-5-セミアル
デヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、グルタミル-CoAレダクターゼ、グルタマート-5-
セミアルデヒドレダクターゼ、グルタミル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性)、2-ア
ミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、2-アミノ-5-ヒドロ
キシペンタン酸トランスアミナーゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラ
ーゼ、又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱炭酸)をコードする1
つ以上の外因性核酸を含むことがある。そのような経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAレ
ダクターゼ(アルコール形成性)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、又は1,4-ブ
タンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むことがある。
チリル-CoAデヒドラターゼ、ビニルアセチル-CoAΔ-イソメラーゼ、又は4-ヒドロキシブ
チリル-CoAデヒドラターゼをコードする1つ以上の外因性核酸を含むことがある。そのよ
うな経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性)、4-ヒドロキ
シブチリル-CoAレダクターゼ、又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むこ
とがある。
、ホモセリン-CoAヒドロラーゼ、ホモセリン-CoAリガーゼ、ホモセリン-CoAデアミナーゼ
、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル
-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAリガーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エ
ノアートレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブ
チリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ、又は4-ヒドロキシブタ-2
-エノイル-CoAレダクターゼをコードする1つ以上の外因性核酸を含むことがある。そのよ
うな経路は、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性)、4-ヒドロキ
シブチリル-CoAレダクターゼ、又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むこ
とがある。
キシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ、又は4-ヒドロキシ
ブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)をコードする1つ以上の外因性核酸を含むこと
がある。そのような経路は、スクシニル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチラートデヒ
ドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチラート
キナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダ
クターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成性)、又は1,4-ブタ
ンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むことがある。
レダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブチラートトランスアミナーゼ、グルタマートデ
カルボキシラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoA
リガーゼ、又は4-ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)をコードする1つ
以上の外因性核酸を含むことがある。そのような経路は、α-ケトグルタラートデカルボ
キシラーゼ、4-ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトラ
ンスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチラートキナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチ
リラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクタ
ーゼ(アルコール形成性)、又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含むこと
がある。
方向に向ける遺伝子破壊を含み得る。そのような生物は、例えば、1,4-ブタンジオール産
生を成長に結びつける1セットの代謝改変を有する非天然の微生物を含む。いくつかの実
施態様において、1,4-ブタンジオール産生は成長に結びついていない。該セットの代謝改
変は、1つ以上の遺伝子又はそのオルソログの破壊を含み得る。破壊は、いくつかの実施
態様において、完全な遺伝子欠失を含み得る。破壊は、プロモーター配列などの除去によ
る変更を含むこともある。1,4-BDO産生では、1セットの代謝改変は、例えば、adhE及びld
hAの破壊を含み得る。他の破壊は遺伝子mdhを含み得る。さらに他の破壊は、mqo、aspA、
sfcA、maeB、pntAB、及びgdhAを含む遺伝子のセットから選択される1つ以上の遺伝子を含
むことがある。さらに他の破壊は、pykA、pykF、dhaKLM、deoC、edd、yiaE、ycdW、prpC
、及びgskを含む遺伝子のセットから選択される1つ以上の遺伝子を含むことがある。さら
に他の破壊は、pflABの破壊を含むことがある。破壊の例示的なセットは、遺伝子adhE、l
dhA、pflAB、mdh、及びaspAのそれぞれの破壊を含む、adhE、ldhA、pflAB、mdh、及びasp
Aを含む遺伝子のセットから選択される1つ以上の遺伝子を含むことがある。
1つの外因性核酸の遺伝子挿入も含むことがある。上述の遺伝子挿入経路のいずれも、遺
伝子破壊と一体化され得る。例えば、遺伝子adhE、ldhA、pflAB、mdh、及びaspAの破壊を
含む経路は、4-ヒドロキシブタノアートデヒドロゲナーゼ、CoA-非依存性コハク酸セミア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、スクシニル-CoAシンセターゼ、CoA-依存性コハク酸セミアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチラート:CoAトランスフェラーゼ、グルタマー
ト:コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタマートデカルボキシラーゼ、CoA
-非依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、CoA-依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又は
アルコールデヒドロゲナーゼの挿入を含むことがある。以下の表2は、遺伝子破壊と遺伝
子挿入との組み合わせを組み込んだ1,4-BDO産生用の例示的な遺伝子操作された生物をま
とめる。遺伝子挿入が、染色体挿入又はプラスミドの提供の形態であり得ることに留意さ
れたい。
li) MG1655の単一欠失誘導体;大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス(P. ging
ivalis) sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス Cat2, クロストリジウム・アセトブチリカム(C. acetobutylicum) AdhE2のプラスミド
発現。株2:宿主株AB3、スクシナート産生株、内因性 adhE ldhA pflBを欠失した大腸菌
MG1655の誘導体;大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモ
ナス・ジンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・
アセトブチリカム AdhE2のプラスミド発現。
でのGlu354Lys突然変異を持つクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) lpd
Aの染色体挿入;大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナ
ス・ジンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・ア
セトブチリカム AdhE2のプラスミド発現;株は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼフラックス
を増加させるlpdAの改良を与える。株4:宿主株ECKh-138、内因性adhE、ldhA、pflB、及
びlpdAの欠失、Glu354Lys突然変異を持つクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入
;プラスミド発現大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモ
ナス・ジンジバリス 4hbd, クロストリジウム・アセトブチリカム buk1, クロストリジウ
ム・アセトブチリカム ptb, クロストリジウム・アセトブチリカム AdhE2。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失;大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロ
モナス・ジンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム
・アセトブチリカム AdhE2のプラスミド発現;株は、フラックスを酸化的TCA回路に向け
るmdh及びarcAに欠失を有する。株6:宿主株ECKh-401、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、
内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニ
エ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失;マイコバクテリウム・ボビス(M. bovi
s) sucA, 大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・アセトブ
チリカム AdhE2のプラスミド発現。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換;大腸菌 sucCD,
ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbd, ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・アセトブチリカム AdhE2のプラス
ミド発現;株は、クエン酸シンターゼに突然変異を有し、嫌気性活性が向上している。株
8:株ECKh-422、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu35
4Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びar
cAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換;マイコバクテリウム・ボビ
スsucA, 大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・アセトブ
チリカム AdhE2のプラスミド発現。株9:宿主株ECKh-422、内因性adhE、ldhA、pflBの欠
失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニュー
モニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異に
よる染色体置換;マイコバクテリウム・ボビス sucA, 大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス
・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbd, ポルフィロモナス・ジン
ジバリス Cat2, クロストリジウム・ベイジェリンキ(C. beijerinckii) Aldのプラスミド
発現。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換;fimD座での大腸
菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4h
bdの染色体挿入;ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・ベイジェ
リンキ Aldのプラスミド発現;株は、fimD座でECKh-422株に組み込まれた上流経路のコハ
ク酸分岐を有する。株11:宿主株ECKh-432、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、内因性lpdA
の欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染
色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換
、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス
・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロ
ストリジウム・クルイベリ(C. kluyveri) 4hbdの染色体挿入;ポルフィロモナス・ジンジ
バリス Cat2, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現;株は、ECKh-42
2に組み込まれたコハク酸及びα-ケトグルタル酸上流経路分岐を有する。株12:宿主株EC
Kh-432、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突
然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠
失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、
fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・クルイベリ 4hbdの染
色体挿入;クロストリジウム・アセトブチリカム buk1, クロストリジウム・アセトブチ
リカム ptb, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換;内因性ackAの欠
失、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナ
ス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, ク
ロストリジウム・クルイベリ 4hbdの染色体挿入;ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2
, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現;株は、ECKh-432株において
酢酸キナーゼ欠失を有する。株14:宿主株ECKh-453、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、内
因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ
lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染
色体置換、内因性ackAの欠失、内因性ppcの欠失及びppc座でのヘモフィラス・インフルエ
ンザ(Haemophilus influenza) ppckの挿入、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス
・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、fimD座での
マイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・クルイベリ 4hbdの染色体挿入;
ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラ
スミド発現;株は、ECKh-432株において酢酸キナーゼ欠失及びPPC/PEPCK置換を有する。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換、fimD座での大腸
菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4h
bdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・ク
ルイベリ 4hbdの染色体挿入、lpdAプロモーターのfnr結合部位、pflB-p6プロモーター、
及びpflBのRBSによる置換;ポルフィロモナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・
ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現;株は、ECKh-432株においてlpdAプロモーターの嫌
気性プロモーターによる置換を有する。株16:宿主株ECKh-455、内因性adhE、ldhA、pflB
の欠失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニ
ューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変
異による染色体置換、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD,
ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、fimD座のマイコバクテリウム・ボ
ビス sucA, クロストリジウム・クルイベリ 4hbdIの染色体挿入、pdhR及びace EFプロモ
ーターのfnr結合部位、pflB-p6プロモーター、及びpflBのRBSによる置換;ポルフィロモ
ナス・ジンジバリス Cat2, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現;
株は、ECKh-432においてpdhR及びaceEFプロモーターの嫌気性プロモーターによる置換を
有する。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換、fimD座での大腸
菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4h
bdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・ク
ルイベリ 4hbdの染色体挿入、fimD座でのクロストリジウム・アセトブチリカム buk1, ク
ロストリジウム・アセトブチリカム ptbの染色体挿入;クロストリジウム・ベイジェリン
キ Aldのプラスミド発現;株は、ECKh-432株へのBK/PTBの組み込みを有する。株18:宿主
株ECKh-459、内因性adhE、ldhA、pflBの欠失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Ly
s突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcA
の欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換、fimD座での大腸菌 sucCD, ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿
入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・クルイベリ 4hbd
の染色体挿入、fimD座でのクロストリジウム・アセトブチリカム buk1, クロストリジウ
ム・アセトブチリカム ptbの染色体挿入;クロストリジウム・ベイジェリンキ Ald, ゲオ
バチルス・サーモグルコシダシウス(G. thermoglucosidasius) adh1のプラスミド発現。
でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性
mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然変異による染色体置換、fimD座での大腸
菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4h
bdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・ク
ルイベリ 4hbdの染色体挿入、rrnC座での非-PTSスクロースオペロン遺伝子スクロースパ
ーミアーゼ(cscB)、D-フルクトキナーゼ(cscK)、スクロースヒドロラーゼ(cscA)、及びLa
cI-関連スクロース特異的リプレッサー(cscR)の挿入;ポルフィロモナス・ジンジバリス
Cat2, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現;株は、ECKh-432株に挿
入された非-PTSスクロース遺伝子を有する。株20:宿主株ECKh-463内因性adhE、ldhA、pf
lBの欠失、内因性lpdAの欠失及びlpdA座でのGlu354Lys突然変異を有するクレブシエラ・
ニューモニエ lpdAの染色体挿入、内因性mdh及びarcAの欠失、gltAのgltA Arg163Leu突然
変異による染色体置換、fimD座での大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス suc
D, ポルフィロモナス・ジンジバリス 4hbdの染色体挿入、fimD座でのマイコバクテリウム
・ボビス sucA, クロストリジウム・クルイベリ 4hbdの染色体挿入、rrnC座での非-PTSス
クロースオペロンの挿入;クロストリジウム・アセトブチリカム buk1, クロストリジウ
ム・アセトブチリカム ptb, クロストリジウム・ベイジェリンキ Aldのプラスミド発現。
た株は、多量のピルビン酸塩を副産物として生み出す。したがって、非-PTSスクロース系
を使用してピルビン酸塩の形成を低減できるが、その理由はスクロースの移入がホスホエ
ノールピルビン酸塩(PEP)のピルビン酸塩への転化を伴わないだろうからである。これは
、PEPプール及びPPC又はPEPCKによるオキザロ酢酸へのフラックスを増大させるだろう。
両側に持つ非-PTSスクロース遺伝子を含むPCR産物を生成するには、2つのオリゴを使用し
て、Mach1(商標)(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)由来のcsc遺伝子を
PCR増幅する。この株は、スクロースを異化できると知られている大腸菌株であるW株の子
孫である(Orencio-Trejoらの文献Biotechnology Biofuels 1:8 (2008))。配列は、大腸菌
W株KO11(受託番号AY314757)(Shuklaらの文献Biotechnol. Lett. 26:689-693 (2004))か
ら誘導され、スクロースパーミアーゼ(cscB)、D-フルクトキナーゼ(cscK)、スクロースヒ
ドロラーゼ(cscA)、及びLacI-関連スクロース-特異的リプレッサー(cscR)をコードする遺
伝子を含む。cscRの最初の53のアミノ酸は、プライマーの置換により有効に除去された。
精製後、PCR産物は、pRedET (tet)により形質転換され製造業者の説明(www.genebridges.
com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modification%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)に
従って調製されたMG1655エレクトロコンピテントセルに電気穿孔される。PCR産物は、ゲ
ノム中に、染色体のrrnC領域に組み込まれるように設計されている。それは、rrlC(23S r
RNA)の上流の191のヌクレオチド、rrlC rRNA遺伝子の全て及びrrlCの下流の3ヌクレオチ
ドを有効に除去し、スクロースオペロンにより置換する。rrnC::crcAKB領域全体は、P1ト
ランスダクションによりBDO宿主株ECKh-432に移され(Sambrookらの文献Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual,第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)、EC
Kh-463を生み出す(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L
fimD:: 大腸菌 sucCD, ポルフィロモナス・ジンジバリス sucD, ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス 4hbd fimD:: マイコバクテリウム・ボビス sucA, クロストリジウム・クルイ
ベリ 4hbd rrnC::cscAKB)。リコンビナントは、スクロースでの成長により選択され、診
断PCRにより確認される。
分などの原材料フィードストックを、製造バイオリアクターに加える前に、例えば加熱滅
菌により処理して、生物学的な汚染物質を除くことができる。いくつかの実施態様による
と、フィードストックは、例えば、BDOの発酵用にスクロース又はグルコースを含むこと
がある。いくつかの実施態様において、フィードストックは合成ガスを含むことがある。
微生物の成長を助けるのに使用される追加の培地成分には、例えば、塩、窒素源、緩衝剤
、微量金属、及びpH制御のための塩基がある。発酵ブロスのg/Lで表された、例示的な培
地パッケージの主な成分を以下の表3に示す。
クロース、マルトデキストリン、スターチ、イヌリン、グリセロール、大豆油などの植物
油、炭化水素、メタノール及びエタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸、合成ガ
ス、CO、CO2、及びH2の類似の組み合わせを含み得る。「グルコース」という用語は、グ
ルコースシロップ、すなわちグルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を含む。植物
及び植物から誘導されるバイオマス材料は、低コストのフィードストックの源になり得る
。そのようなフィードストックには、例えば、コーン、大豆、綿、亜麻仁、菜種、サトウ
キビ、及びパーム油があり得る。バイオマスは、酵素媒介又は化学物質媒介の加水分解を
受けて基質を遊離させ、それがさらに生体触媒作用により処理されて目的とする化学生成
物を生み出すことができる。これらの基質には、炭水化物の混合物、並びに芳香族化合物
及びバイオマスのセルロース性、ヘミセルロース性、及びリグニン性部分からまとめて誘
導される他の産物がある。バイオマスから生じる炭水化物は、例えば、スクロース、グル
コース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、及びフルクトースを含
む、5炭糖及び6炭糖の豊富な混合物である。
剰による細胞に対するストレスを避けるため、制御された方法で加えることができる。こ
の点で、供給回分及び連続培養は、以下でさらに議論されるとおり有用な培養様式である
。
ム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、
他の硝酸塩、グルタミン酸塩及びリジンなどのアミノ酸、酵母エキス、酵母自己消化物、
酵母窒素原基礎培地、タンパク加水分解物(ペプトン、トリプトン及びカザミノ酸などの
カゼイン加水分解物を含むが、これらに限定されない)、大豆油かす、Hy-Soy、トリプチ
ックソイブロス、綿実油かす、麦芽エキス、コーンスティープリカー、及び糖蜜があり得
る。
で、必要に応じてアルカリを加えることができる。好適なアルカリの例にはNaOH及びNH4O
Hがある。
発酵、回分分離のある供給回分発酵;連続分離のある供給回分発酵、連続分離のある連続
発酵がある。これらの方法は全て当分野に周知である。生物設計によって、発酵は、好気
性又は嫌気性の条件下で実施できる。いくつかの実施態様において、培地の温度は、約30
から約45℃、例えば31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、及び44℃に
保たれる。
満たされている。微生物発酵の温度及びpHは適切に調整され、追加の補給物が加えられる
。1,4-BDO-産生生物の種菌が発酵槽に加えられる。回分発酵では、発酵は一般に決まった
期間運転し、次いで発酵の産物が単離される。このプロセスを回分方式で繰り返すことが
できる。
られる。固定容量の供給回分発酵は、培養物を希釈することなく炭素源が供給される供給
回分発酵の一種である。培養容量は、濃縮された液体又は気体として成長炭素源を供給す
ることによりほぼ一定に保つこともできる。周期的供給回分培養と呼ばれることもある、
他の種類の固定容量の供給回分培養において、培養物の一部が周期的に取り出され、さら
なる供給回分プロセスの出発点として使用される。発酵がある段階に到達すると、培養物
は除かれ、バイオマスは炭素供給基質を含む滅菌水又は培地により元の容量に希釈される
。希釈によりバイオマスの濃度は低下し、比増殖速度の上昇につながる。その後、供給が
続くにつれ、バイオマスが増加して容器内での最大持続量にもう一度近づくにつれて徐々
に増殖速度は低下し、この時点で培養物を再び希釈できる。あるいは、供給回分発酵は可
変容量であってもよい。可変容量様式では、発酵ブロスの一部を除去せずに栄養及び培地
が断続的に培養物に加えられるので、発酵ブロスの容量は発酵時間と共に変化する。
的に加えられ、消費された培地は産物が分泌されている場合1,4-BDOなどの目的とする産
物を含み得る。連続培養の特徴の1つは、微生物の挙動と環境条件との間の関係を決定で
きる時間非依存性定常状態が得られることである。この定常状態の達成は、ケモスタット
又は類似のバイオリアクターにより得られる。ケモスタットは、培養液を連続的に除去す
ると同時に新鮮な培地を断続的に添加して培養容量を一定に保つことができる。培地がケ
モスタットに加えられる速度を変えることにより、微生物の増殖速度を制御できる。
を十分な栄養及び培地中で培養して、対数期における増殖を維持及び/又はおよそ維持す
ることを含むことがある。そのような条件下での連続培養は、例えば、1日、2、3、4、5
、6、又は7日以上を含むことがある。さらに、連続培養は、1週間、2、3、4、又は5週間
以上、最大数か月を含むことがある。それに代わり、特別な用途に好適な場合には、目的
とする化合物を産生する生物を数時間培養することもできる。また、連続及び/又は近連
続培養条件が、これらの例示的な期間中の全ての時間間隔を含み得ることを理解できよう
。化合物産生微生物を培養する時間は、所望の目的のための十分な量の産物を産生するた
めに十分な期間であることもさらに理解される。
供給は制御できる。酸素は、空気として、富化された酸素として、純粋な酸素として、又
はこれらの任意の組み合わせとして供給できる。酸素濃度を監視する方法は当分野に公知
である。酸素は特定の供給速度で送ることができ、又は培養物の溶存酸素量を測定し一定
の溶存酸素量を維持する意図により供給することにより、要求に応じて送ることもできる
。他の実施態様において、培養は、実質的に嫌気性の条件下で実施できる。実質的に嫌気
性は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素の飽和の約10%未満を意味する。嫌気性条件は
、約1%未満の酸素の雰囲気により維持された液体又は固体の培地の密閉チャンバーを含
む。
器を密閉して(例えば、セプタム及びクリンプキャップによりフラスコは密閉できる)、
培養物を、実質的に酸素を含まないようにできる。微好気性条件も、限定された通気のた
めに小さな穴を与えることにより利用できる。商業的な規模では、微好気性条件は、好気
性の場合と同様だがはるかに低い速度で厳しく制御された撹拌とともに、発酵槽に空気又
は酸素を注入することにより達成される。
大腸菌を使用して嫌気性回分発酵で産生できる。発酵時に、フィードストック基質の一部
が細胞増殖のために使用され、追加の基質が他の発酵副産物に転化される。塩、緩衝剤、
窒素などの培地成分を発酵物に過剰に加えて、細胞増殖を支持できる。このため、発酵ブ
ロスは、水、目的とする化合物、副産物、残存培地、残存基質、及びフィードストック/
培地不純物の複雑な混合物である。目的とする化合物が単離及び精製されるのは、この発
酵ブロスからである。例示的な発酵ブロス組成は、以下の表4に示される。
明の定義内に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は本発明を説明する
が限定するものではない。
この実施例は、ディスクスタック遠心分離機を使用して、細胞集団及び他の固体を発酵
ブロスから除去することを示す。
遺伝子改変された大腸菌により産生された1,4-ブタンジオール発酵ブロスを遠心分離に
より清澄化した。GEA-Westfaliaディスクスタック遠心分離機をこの工程のために使用し
た。ラボスケールの遠心分離機、CTC 1型Whispefugeのボウル容量は1.0リットル、固体収
容空間は0.55リットルである。ボウルフード、分配器、ディスクスタック、プロセス水湿
潤部品(process wetted parts)の全ては、高引張強度ステンレススチールで構成されてい
る。遠心分離ユニットへの供給は、蠕動ポンプを利用して、およそ0.25リットル毎分で一
定に保たれた流速に制御した。約15psi(103kPa)の背圧を、出口濃縮液流の調整弁を絞っ
て系中に維持した。遠心分離機は12,000rpmで運転し、供給材料は室温であった。遠心分
離機は、発酵ブロスから細胞バイオマス及び不溶性物質を除く。細胞バイオマス及び不溶
性物質の濃度は、600nmでの光学濃度(OD)により測定される濁度により示される。供給発
酵ブロス及び清澄化濃縮液の濁度データを表5に示す。供給材料は見てわかるほど濁って
おり、OD測定値が13.3であった。清澄化された濃縮液は外観上はるかに澄んでいて、OD測
定値が0.18であった。全体として、濁度はおよそ99%低下し、ディスクスタック遠心分離
機による優れた清澄化を表す。
この実施例は、実施例Iにおいて実施された遠心分離による細胞集団及び他の固体の除
去の後の発酵ブロスの限外濾過を示す。
GEAラボスケール濾過ユニットModel Lを使用して、実施例1において産生された産物を
さらに清澄化した。Model L濾過ユニットは、Hydranautics 5K PES平膜を備えていた。設
置された膜総面積は0.144 m2であった。膜内外圧力は、入口流及び背圧調整弁の調整によ
りおよそ36 psi(248 kPa)に維持した。供給材料の温度は、入口熱交換器を利用しておよ
そ27℃に維持した。実験の経過全体にわたって透過液流速を測定して、流束を決定した。
表6は、体積濃度因子(VCF)の関数としてリットル/m2/hで表した透過流束を表す。
タンパク質濃度をBradfordアッセイを利用して測定した。表7は、供給材料、透過液、及
び濃縮水中のタンパク質濃度を表す。タンパク質濃度は、供給材料に比べて透過液中でお
よそ68%低下した。
この実施例は、実施例IIにおいて実施された限外濾過の後の発酵ブロスのナノ濾過を示
す。
GEAラボスケール濾過ユニットModel Lは、GE DKナノ濾過平膜を備えていた。設置され
た膜総面積は0.072m2であった。この構成を利用して、実施例2で得られたUF透過液を濾過
した。膜内外圧力は、入口流及び背圧調整弁の調整によりおよそ270 psi(1861 kPa)に維
持した。供給材料の温度は、入口熱交換器を利用しておよそ38℃に維持した。実験の経過
全体にわたって透過液流を測定し、流束を決定した。表8は、体積濃度因子(VCF)の関数と
してリットル/m2/hで表した流束を表す。
て測定し、塩イオンはクロマトグラフィー(IC)を利用して分析し、グルコースはAnalox G
6分析器で測定した。表9は、グルコース、イオン、及び有機酸の排除パーセントを示す。
供給材料のpHにおいて、有機酸はその塩形態で存在すると予測される。ナノ濾過透過液は
、供給材料における明らかな黄色から、透過液産物における非常に薄い黄色へと、外観の
色も薄くなった。
この実施例は、実施例IIIにおいて実施されたナノ濾過の後の発酵ブロスのイオン交換
クロマトグラフィー精製を示す。
実施例IIIで得られたナノ濾過透過液をイオン交換工程で処理し、残っているイオンを
除き、産物をさらに清澄化した。強酸カチオン交換樹脂であるAmberlite IR 120H及び弱
塩基アニオン交換樹脂であるAmberlite IRA 67をこの工程に使用した。高さが2フィート(
61cm)で直径が1インチ(2.5cm)である個々のカチオン及びアニオン交換カラムには、それ
ぞれ5.3×10-3立方フィート(0.15×10-3m3)のカチオン及びアニオン交換樹脂が充填され
ていた。ナノ濾過透過液は、10mL/分で40℃で、最初にカチオン交換カラムに供給され、
次いでアニオン交換カラムに供給された。イオン交換は、ICによりイオン含量について分
析した。残存イオンの全ては、0.1 mEq/L未満の濃度まで除去された。残存有機酸の全て
もこの工程で除去された。産物は、外観上黄色が全くなく非常に澄んでいた。
この実施例は、ロータリーエバポレーターによる実験室規模の蒸発晶析による、合成供
給材料からの塩の除去を示す。
蒸発は、Buchi Rotavap R-205を、水浴温度50℃で約100mmHgの真空で利用して実施した
。合成供給材料は、およそ92 mEq/Lの一価カチオン、5 mEq/Lの二価カチオン、及び125 m
Eq/Lのアニオンを含む水の中の約8%のBDOにより製造した。塩のイオンを同時に溶液から
沈殿させながら、この混合物から水を蒸発させた。イオンクロマトグラフィーによる分析
のために少量のサンプルアリコートをとることにより、蒸発の間溶液中のイオン濃度を監
視した。分析の前に、沈殿した固体は濾去した。表10は、BDOがおよそ10から95%に濃縮さ
れた時の溶解状態のイオンの濃度(供給材料試料における100%に規格化)を示す。イオ
ン濃度は、溶液における飽和点まで上昇した(およそ30%BDO)。この点の後、さらなる蒸
発が、塩の結晶化(沈殿)を推し進めた。全体として、この蒸発晶析工程は、塩イオンの
97.5%をBDO溶液から沈殿させた。
この実施例は、1,4-BDOを含む種々の小さい炭素鎖ジオールにおける塩の溶解度プロフ
ァイルを示す。
さまざまな量の1,4-ブタンジオール(BDO)、1,3-プロパンジオール(PDO)、又は1,2-エタ
ンジオール(モノエチレングリコール、MEG)を含む異なる溶液での塩の溶解度を測定し
た。塩を、溶液が飽和するまで、10mLの溶液に加えた。飽和の塩の溶解度を、イオンクロ
マトグラフィーを利用して測定した。表11は、室温(およそ20℃)での4種の異なる塩の
塩溶解度を示す。塩溶解度は、BDO濃度の上昇と共に著しく低下し、蒸発晶析を利用する
塩の除去の可能性を示している。表12は、室温での異なる濃度の1,4-BDO、PDO、又はMEG
溶液における3種の異なる塩の塩溶解度を示す。この結果は、MEGからPDOへ、1,4-BDOへと
行く塩の溶解度の低下を示し、1,4-BDOが3種の化合物の間で蒸発晶析に最も適しているこ
とを示す。
本発明が関連する技術的現状をより完全に説明するために、引用により本願に組み込まれ
る。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
(構成1)
1,4-ブタンジオール(1,4-BDO)を発酵ブロスから単離する方法であって、
濾過からなる分離工程において、1,4-BDOに富む該発酵ブロスの第一の液体分画を、細胞を含む該発酵ブロスの固体分画から分離する工程であって、該濾過が限外濾過からなり、該発酵ブロスが5重量%〜15重量%の濃度の1,4-BDOを含む、前記工程;
該第一の液体分画から塩を除去し、第二の液体分画を生成する工程であって、該塩がナノ濾過及びイオン交換により除去される、前記工程;
該第二の液体分画から水を除去し、第三の液体分画を生成する工程;及び
該第三の液体分画から1,4-BDOを蒸留によって精製する工程;からなる、前記方法。
(構成2)
限外濾過が、細孔径が0.005〜0.1ミクロンである膜を通して濾過することを含む、構成1記載の方法。
(構成3)
水を除去する工程が、1つ以上の効用を含む蒸発器系による蒸発により実施される、構成1記載の方法。
(構成4)
前記蒸発器系が、二重又は三重効用蒸発器を含む、構成3記載の方法。
(構成5)
前記蒸発器系が、熱再圧縮機をさらに含む、構成3記載の方法。
(構成6)
前記蒸発器系が、機械的再圧縮機をさらに含む、構成3記載の方法。
(構成7)
前記蒸発器系が、流下液膜式蒸発器、短路流下液膜式蒸発器、強制循環式蒸発器、プレート式蒸発器、循環式蒸発器、流動床蒸発器、上昇液膜式蒸発器、向流トリクル蒸発器、撹拌式蒸発器、及び螺旋管蒸発器からなる群から選択される蒸発器を含む、構成3記載の方法。
(構成8)
前記蒸発器系が、真空を含む、構成3記載の方法。
(構成9)
水の除去前に実質的に全ての塩が除去される、構成1記載の方法。
(構成10)
ナノ濾過が、細孔径が0.0005〜0.005ミクロンの膜を通して濾過することを含む、構成1記載の方法。
(構成11)
細胞を含む前記固体分画が、前記発酵ブロスに再生利用される、構成1記載の方法。
(構成12)
前記除去された水が、前記発酵ブロスに再生利用される、構成1記載の方法。
(構成13)
前記除去された塩が、前記発酵ブロスに再生利用される、構成1記載の方法。
(構成14)
1,4-BDOを精製する工程が、蒸留を含む、構成1記載の方法。
Claims (14)
濾過からなる分離工程において、1,4-BDOに富む液体分画を、細胞を含む該発酵ブロスの固体分画から分離する工程であって、該濾過が限外濾過からなり、該発酵ブロスが5重量%〜15重量%の1,4-BDOの濃度で1,4-BDOを含む、前記工程;
該液体分画から塩を除去する工程であって、該塩の除去がナノ濾過及びイオン交換を含む、前記工程;
該液体分画から水を除去する工程;及び
該塩及び水の除去の後に、該液体分画から蒸留によって1,4-BDOを精製し、少なくとも純度98%の1,4-BDO生成物を産生する工程からなる、前記方法。
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