BRPI1010582B1

BRPI1010582B1 - processo de separação de componentes de um caldo de fermentação

Info

Publication number: BRPI1010582B1
Application number: BRPI1010582A
Authority: BR
Inventors: J Burk Mark; Japs Michael; Clark Warren
Original assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2018-11-06
Also published as: AU2010256520A1; LT2438036T; SG176654A1; JP6133599B2; EP2438036A4; KR20120038433A; JP2012528885A; JP2017031170A; CN105237352A; TW201739496A; EP2438036B1; KR20170080709A; CN102459138A; US20190112247A1; TW201816106A; EP3199511B1; US20140322777A1; JP2018127474A; TWI528990B; JP2016026141A

Description

(54) Título: PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES DE UM CALDO DE FERMENTAÇÃO (73) Titular: GENOMATICA, INC.. Endereço: 10520 Wateridge Circle, San Diego CA 92121, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: WARREN CLARK; MICHAEL JAPS; MARK J. BURK.

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 03/06/2010, observadas as condições legais

Expedida em: 06/11/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES DE UM CALDO DE FERMENTAÇÃO [0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório sob o número de série Pedido Provisório Número de Série U.S. 61/184.292, depositado em 4 de junho de 2009, a totalidade do conteúdo os quais são incorporados no presente documento por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Esta invenção se refere geralmente à separação de componentes de um caldo de fermentação e, mais especificamente ao isolamento de compostos miscíveis com água que têm pontos de ebulição maiores do que a água dos outros componentes de caldo de fermentação.

Incentivos de redução de custos e ambientais existem para projetar esquemas de processo que tem a capacidade de separar e opcionalmente reciclar componentes em uma fermentação incluindo sais do meio, meio residual e massa da célula, substrato residual tal como sacarose e/ou glicose e água. Esforços foram também feitos para reciclar a massa da célula como meio de melhorar a produtividade de fermentação. Menos esforço tem sido feito na área de recuperação dos sais do meio e meio residual para reuso na fermentação. A este respeito, a maioria dos esforços tem focalizado na redução dos custos do meio iniciais, em lugar de recuperação a jusante. O meio de baixo custo resultante é frequentemente não ótimo para o crescimento da célula e a produção de produto. Mediante o desenvolvimento de métodos eficazes para a recuperação de componentes do meio, uma receita do meio mais otimizada pode ser utilizada com menos restrições nos custos iniciais de matéria-prima.

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2/91 [0003] O isolamento de compostos em grande escala com pureza útil é um desfio complexo na guímica do processo. As diferenças em escala isolada podem tornar os procedimentos de isolamento desenvolvidos em escala de bancada de laboratório impraticáveis ou ainda não viáveis em escalas comerciais ou piloto. O isolamento de compostos de misturas complexas depende de inúmeros fatores incluindo se o composto é um sólido ou líguido em temperaturas ambiente, o ponto de ebulição, a densidade, polaridade dos compostos, a presença ou ausência de grupos funcionais sensíveis ao pH, e solubilidade em solventes orgânicos versus água. Estes fatores também se aplicam a todos os outros componentes da mistura da gual o composto de interesse deve ser isolado. Outra propriedade gue realiza a fatoração para isolamento de um composto, compostos orgânicos em particular, é como a mesma particiona entre duas imiscíveis, tais como entre a água e um solvente orgânico. Os compostos gue são particularmente polares são freguentemente mais solúveis em água do gue em solventes orgânicos comuns utilizados em processos de extração. Alguns compostos são particularmente desafiadores de se isolar da água por métodos extrativos devido ao seu caráter anfifílico. Os anfifilos são compostos gue possuem tanto uma porção polar guanto uma porção lipofílica. Estes compostos podem complicar o isolamento por extração ao causarem emulsões intratáveis.

[0004] Além do mais, guando um composto é preparado a partir de uma fermentação, a guantidade de água pode ser substancialmente maior do gue o composto de interesse, o gue exigem isolamento de um componente menor a partir de uma mistura complexa. O isolamento de compostos gue entram em ebulição a uma temperatura maior do gue o da água ainda adiciona à complexidade e custo da separação uma

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3/91 vez que o composto não pode ser destilado diretamente do caldo de fermentação como é o caso, por exemplo, em um processo de fermentação de etanol. A este respeito, as interações entre o composto de interesse e água podem fazer com que as duas entidades destilem ao mesmo tempo como um azeótropo em um ponto de ebulição diferentes dos dois componentes purificados. 0 azeótropo não é prontamente previsível. Isto pode diminuir a recuperação do composto de interesse quando se tenta separar o mesmo da água. Quando um composto tem grupos funcionais polares, outra preocupação é como o mesmo pode interagir com outros compostos presentes na fase de água, incluindo quaisquer sais e íons de metal, por exemplo.

[0005] A natureza dos grupos funcionais presentes em um composto de interesse pode complicar a separação de sais. Por exemplo, um ou mais grupos funcionais de um composto podem interagir com ou ânions ou cátions todos de quelato. A quelação ocorre de uma maneira dependente do tamanho em relação ao cátion ou ânion e é também dependente da disposição dos grupos funcionais sobre o composto de interesse. A quelação e outras interações podem tornar alguns sais solúveis em um composto de líquido ainda que na ausência de água, enquanto outros sais podem ser insolúveis na ausência de água apesar da presença de um composto com grupos funcionais capazes de interagir com sais. Estes tipos de efeitos sobre a solubilidade do sal são difíceis de prever. Ainda em adição à complexidade da interação entre um composto e sais, é a natureza de quaisquer cossolventes. Por exemplo, durante o isolamento de um composto de interesse que é miscível com água, ligação de hidrogênio e outras interações com água podem interromper a interação entre os sais e o composto de interesse. Assim, em alguns casos um sal pode ser separado mais rapidamente a

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4/91 partir de um composto na presença de alguma quantidade de água. Entretanto, é difícil de se prever a quantidade de água que equilibra a supersaturação de sal que permite a separação de sal por cristalização, por exemplo, enquanto mantém a capacidade da água de interromper a quelação e outras interações entre um composto de interesse e quaisquer sais.

[0006]

Ainda um desafio adicional no desenvolvimento de métodos de isolamento é a reatividade potencial de subprodutos biossintéticos tais como ácidos orgânicos, substrato em excesso e similares. Em condições de aquecimento, substrato em excesso pode degradar e causar coloração indesejável do produto. Adicionalmente, alguns subprodutos podem reagir com o produto de interesse, abaixando de modo eficaz os rendimentos de isolamento. Estes subprodutos podem incluir aqueles formados durante a fermentação assim como subprodutos formados durante etapas do próprio procedimento de isolamento, por exemplo, devido aos processos de degradação em temperaturas elevadas durante a destilação, evaporação da água e similares.

[0007] Assim, existe uma necessidade de se desenvolver processos que permitem que o isolamento de compostos miscíveis com água que têm pontos de ebulição maiores do que a água de fermentações microbianas, enquanto tem em mente a relação custo e benefício e a questão ambiental da reciclagem de outros componentes de fermentação. A presente invenção satisfaz esta necessidade e fornece também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0008] Em alguns aspectos, as modalidades reveladas no presente documento se referem ao processo de isolamento de 4-butanodiol (1,4-BDO) de um caldo de fermentação que inclui a separação uma fração líquida

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5/91 enriquecida em 1,4-BDO de uma fração sólida que compreende células, a remoção da água da dita fração líquida, a remoção de sais da dita fração líquida e a purificação de

1,4-BDO.

[0009] Em outros aspectos, as modalidades reveladas no presente documento se referem a um processo de isolamento de 1,4-BDO de um caldo de fermentação que inclui a remoção de uma porção de sólidos através da centrifugação de disco empilhado para fornecer a fração líquida, a remoção de uma porção adicional de sólidos da fração líquida através de ultrafiltração, a remoção de uma porção de sais da fração líquida por cristalização evaporativa, a remoção de uma porção adicional de sais da fração líquida através da troca de íon, e a destilação de 1,4-BDO.

[0010] Em ainda outros aspectos, as modalidades reveladas no presente documento se referem a um processo de isolamento de 1,4-BDO de um caldo de fermentação que inclui a remoção de uma porção de sólidos através da centrifugação de disco empilhado para fornecer a fração líquida, a remoção de uma porção adicional de sólidos da fração líquida através de ultrafiltração, a remoção de uma porção de sais da fração líquida através de nanofiltração, a remoção de uma porção adicional de sais da fração líquida através da troca de íon, a evaporação de uma porção de água, e a destilação de 1,4-BDO.

[0011] Em ainda outros aspectos adicionais, as modalidades reveladas no presente documento se referem a um processo para produção de 1,4- BDO que inclui a cultura de um micro-organismo produtor de 1,4-BDO em um fermentador por um período de tempo suficiente para produzir 1,4-BDO. O micro-organismo produtor de 1,4-BDO inclui um microorganismo que tem uma trajetória de 1,4-BDO incluindo um ou mais genes exógenos que codificam uma enzima de trajetória

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6/91 de 1,4-BDO e/ou uma ou mais rupturas de gene. 0 processo ainda inclui o isolamento de 1,4-BDO de acordo com os processos de isolamento descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0012] A Figura 1 mostra um diagrama de blocos de etapas no processo de purificação de 1,4-BDO de um caldo de fermentação.

[0013] A Figura 2 mostra uma seção transversal da centrífuga de disco empilhado.

[0014] A Figura 3 mostra uma seção transversal de uma centrifugação decantadora.

[0015] A Figura 4 mostra um diagrama de um cristalizador de circulação forçada.

[0016] A Figura 5 mostra um diagrama de um cristalizador de circulação forçada com um trocador de calor horizontal e defletores no volume ativo.

[0017]	A Figura	6 mostra	um	diagrama	de	um
cristalizador de	defletor e	tubo de arrasto	•
[0018]	A Figura	7 mostra	um	diagrama	de	um
cristalizador de	circulação	induzida.
[0019]	A Figura	8 mostra	um	diagrama	de	um
cristalizador Oslo do tipo	fechado.
[0020]	A Figura	9 mostra	um	diagrama	de	um
cristalizador Oslo do tipo	aberto.
[0021]	A Figura	10 mostra	uma	vista em	seção

transversal parcial de um evaporador de filme descendente.

[0022] A Figura 11 mostra uma vista em seção transversal parcial de um evaporador de circulação forçada.

[0023] A Figura 12 mostra uma vista em seção transversal parcial de um evaporador de placa.

[0024] A Figura 13 mostra um diagrama de um evaporador de circulação.

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7/91 [0025] A Figura 14 mostra um diagrama de um evaporador de leito fluidizado.

[0026] A Figura 15 mostra um fluxograma de um esquema completo para a produção e isolamento de 1,4-BDO.

[0027] A Figura 16 mostra um fluxograma de outro esquema completo para a produção e isolamento de 1,4-BDO.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0028] A produção de fermentação de produtos químicos básicos (commodity) é uma alternativa útil para a produção tradicional com a utilização de matérias-primas de combustíveis fósseis não renováveis. Com a capacidade de utilizar matérias-primas renováveis tais como biomassa reciclada e similares, o processo pode provar ser mais sólido econômica e ambientalmente do que a produção com base em combustíveis fósseis. Os produtos gerados de fermentação podem ser úteis em muitas aplicações. Em modalidades específicas, a presente invenção fornece métodos para a produção de 1,4-BDO. O 1,4-butanodiol (BDO) é um solvente industrial e intermediário de polímero. A jusante, o butanodiol pode ainda ser transformado; por exemplo, por oxidação a gama-butirolactona, que pode ainda ser convertido em pirrolidona e N-metil-pirrolidona, ou pode ainda ser submetido à hidrogenólise para tetrahidrofurano. Estes compostos têm usos variados como aditivos, solventes e intermediários de polímero.

[0029] Esta invenção é direcionada, em parte, a processos para isolamento de compostos miscíveis com água que têm pontos de ebulição maiores do que a água de uma fermentação enquanto opcionalmente permite a reciclagem de outros componentes do caldo de fermentação. O processo separa a massa da célula, a qual pode incluir organismos microbianos que foram modificados com inserções de gene, ruptura de gene ou uma combinação de inserções e

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8/91 interrupções para produzir compostos em rendimentos úteis a partir de uma matéria-prima adequada.

[0030] O caldo sem a célula, ou fração líquida, pode ser ainda processado pela remoção de sais. Isto pode ser alcançado por diversos métodos antes ou depois da remoção de uma parte ou substancialmente toda a água do caldo de fermentação. Como descrito acima, os sais não são frequentemente recuperados para reciclagem em um processo de fermentação. Usualmente qualquer recuperação de sal envolve uma forma de sal de um produto biossintético desejado tal como lactato, citrato ou outro produto de carboxilato ou sais de amônio de produtos que contêm amina, em lugar de sais do meio e similares. O processo descrito no presente documento permite a recuperação de sais do meio e reciclagem opcional de volta à fermentação. O processo de isolamento também envolve a remoção da água, que pode ser introduzida novamente ao sistema de fermentação. Na purificação final, o composto produzido pela fermentação pode ser destilado, ou cristalizado novamente se sólido, a partir da fração líquida que permanece após a remoção de células, sais, e água. No caso de um líquido, a purificação final pode ser alcançada por destilação fracional, por exemplo.

[0031] Em algumas modalidades, a invenção é direcionada para um processo de isolamento de um composto miscível com água de interesse que tem um ponto de ebulição maior do que o da água de um caldo de fermentação. O processo inclui (1) a separação de uma fração líquida enriquecida no composto de uma fração sólida que inclui células; (2) a remoção água da fração líquida; (3) a remoção de sais da fração líquida, e (4) a purificação do composto de interesse por destilação ou recristalização. As

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9/91 etapas (2) e (3) acima podem ser realizadas seja em ordem, ou juntas.

[0032] Os compostos de interesse com pontos de ebulição maiores do que o da água que são acessíveis por meio de fermentação podem ter pontos de ebulição 10 °C, 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C, 100 °C, 150 °C, 200 °C e 300 °C maiores do que o da água e mais, incluindo todos os valores no meio. Os compostos de interesse que têm pontos de ebulição maiores do que o da água podem incluir, por exemplo, 1,4-BDO, 1,3-BDO, 2,3-BDO, 1,3-PDO, 1,2-PDO (metil etil glicol), 1,2-etanodiol (etileno glicol), gama-butirolactona (GBL), 1,5pentanodiol, 1,6-hexanodiol. Além do mais, os compostos de interesse incluem aqueles que são miscíveis com água. Em algumas modalidades, tais compostos miscíveis com água podem ser recalcitrantes para procedimentos de extração convencionais. Adicionaimente, os compostos de interesse incluem aqueles que são neutros. Como utilizado no presente documento, um composto neutro refere-se a um composto que não possui grupos funcionais capazes de portar carga, tais como aminas, ácidos carboxílicos, ácidos sulfônicos, ácidos borônicos e similares. Finalmente, os compostos de interesse podem ser suficientemente pequenos de forma a serem permeáveis a uma membrana de nanofiltração, como descrito adicionaimente abaixo. As classes de compostos exemplificadoras incluem áleoois, dióis, trióis, tais como glicerina, tetraóis, polióis e similares.

[0033] Em uma modalidade específica, o composto de interesse é o 1,4-BDO. O 1,4-BDO tem um ponto de ebulição de cerca de 230 °C e é completamente miscível com água. Além do mais, não há nenhum solvente que tenha sido identificado que possa extrair economicamente o 1,4-BDO da água. Como uma molécula neutra, o isolamento por

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10/91 cristalização de uma forma de sal é impedido. O 1,4-BDO tem um peso molecular suficientemente baixo para passar através de uma membrana de nanofiltração como descrito no Exemplo III abaixo. Além do mais, a solubilidade de vários sais do meio de fermentação em puro 1,4-BDO é relativamente baixa, como descrito no Exemplo VI abaixo.

[0034] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um processo de isolamento de 1,4butanodiol (1,4-BDO) de um caldo de fermentação que inclui (1) a separação de uma fração líquida enriquecida em 1,4BDO de uma fração sólida que inclui células; (2) a remoção água da fração líquida; (3) a remoção sais da fração líquida, e (4) a purificação 1,4-BDO.

[0035] Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que dada a orientação dos ensinamentos revelados no presente documento em relação ao composto exemplificador 1,4-BDO, outros compostos miscíveis com água de interesse que têm pontos de ebulição maiores do que o da água podem ser isolados com a utilização dos mesmos procedimentos. Por exemplo, os métodos revelados no presente documento são prontamente modificados para habilitar o isolamento do 1,3butanodiol. Portanto, embora muitas modalidades sejam exemplificadas por 1,4-BDO, é entendido que os métodos são prontamente adaptáveis a outros compostos miscíveis com água de interesse que têm pontos de ebulição maiores do que o da água.

[0036] Em algumas modalidades, a invenção é direcionada a um processo de isolamento de 4-butanodiol (1,4- BDO) de um caldo de fermentação. O processo inclui a separação de uma fração líquida enriquecida em 1,4-BDO de uma fração sólida que inclui células. A água é evaporada da fração líquida antes ou depois da separação dos sais da fração líquida. Em algumas modalidades, o 1,4-BDO é

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11/91 purificação para obter substancialmente purificado, separado dos sais que se cristalizaram após a remoção de água como descrito adicionalmente abaixo. Os sais têm uma baixa solubilidade em 1,4-BDO de tal forma que o 1,4-BDO separado é cerca de 98% sem sal. Em algumas modalidades, os sais são separados por métodos de filtração especial e/ou troca de íon, ou métodos cromatográficos antes da remoção da água como descrito adicionalmente abaixo.

[0037] Como utilizado no presente documento, isolamento refere-se a um processo que inclui etapas de um composto de interesse

Em modalidades particulares, um composto de interesse inclui 1,4-BDO. Um composto substancialmente purificado inclui aqueles que são pelo menos 98% sem sal, em algumas modalidades, pelo menos 99% sem sal em outras modalidades, e pelo menos 99,5% sem sal em ainda outras modalidades. Um composto substancialmente purificado também inclui aqueles que são também sem outras impurezas além dos sais de tal forma que o composto de interesse é pelo menos 98% puro em algumas modalidades, pelo menos 99% puro em outras modalidades, e pelo menos 99,5% puro em ainda modalidades adicionais.

[0038] Como utilizado no presente documento, o termo fração líquida refere-se a um líquido sobrenadante ou centrifugado obtido mediante a remoção da massa sólida do caldo de fermentação. A remoção de massa sólida inclui alguma, substancialmente toda, ou toda a massa sólida. Por exemplo, na centrifugação, a fração líquida é a centrifugada ou a sobrenadante que é separada dos sólidos. A fração líquida é também a porção que é o permeado ou o sobrenadante obtido após a filtração através de uma membrana. A fração líquida é também a porção que é o filtrado ou sobrenadante obtido após um ou mais métodos de filtração foram aplicados.

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12/91 [0039] Como utilizado no presente documento, o termo fração sólida refere-se a uma porção do caldo de fermentação que contém materiais insolúveis. Tais materiais insolúveis incluem, por exemplo, células, detritos de célula, proteínas de precipitado, sólidos finos e similares. Os sólidos finos se referem a sólidos pequenos, usualmente amorfos. Os sólidos finos podem também ser criados durante cristalização ou durante remoção de água do caldo de fermentação. Os sólidos finos podem ser feitos de um composto de interesse o qual pode ser dissolvido e cristalizado novamente. Os sólidos finos podem incluir porções da fração sólida que são pequenos demais para serem capturados em uma filtração de membrana.

[0040] Como utilizado no presente documento, o termo sais, utilizado de maneira intercambiável com sais do meio e sais do meio de fermentação, refere-se aos compostos iônicos dissolvidos utilizados em um caldo de fermentação. Os sais em um caldo de fermentação podem incluir, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de amônio, sulfato de magnésio, sulfato de amônio, e tampões tais como sódio e/ou potássio e/ou sais de amônio de fosfato, citrato, acetato e borato.

[0041] Como utilizado no presente documento, o termo substancialmente toda quando utilizado em referência à remoção de água ou sais refere-se à remoção de pelo menos 95% de água ou sais. Substancialmente toda pode também incluir pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de remoção ou qualquer valor no meio.

[0042] Como utilizado no presente documento, o termo interrupção de gene ou equivalentes gramaticais do mesmo, é para significar uma alteração genética que torna o produto de gene codificado inativo. A alteração genética

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13/91 pode ser, por exemplo, a deleção de todo o gene, a deleção de uma sequência regulatória exigida para transcrição ou tradução, a deleção de uma porção do gene com resultados em um produto de gene truncado ou por qualquer dentre várias estratégias de mutação que tornam inativo o produto de gene codificado. Um método particularmente útil de interrupção de gene é a deleção completa do gene pelo fato de que a mesma reduz ou elimina a ocorrência de reversões genéticas nos micro-organismos que ocorrem de modo não natural da invenção.

[0043] Como utilizado no presente documento, o termo micro-organismo é para significar um organismo ou célula procariótica ou eucariótica que tenha um tamanho microscópico. O termo deve incluir bactérias de todas as espécies e organismos eucarióticos tais como levedura e fungos. O termo também inclui culturas de célula de quaisquer espécies que possam ser cultivadas para a produção de um produto bioquimico.

[0044] Como utilizado no presente documento, o termo micro-organismo produtor de 1,4-BDO é para significar um micro-organismo modificado para biossintetizar o 1,4-BDO em quantidades úteis. O organismo modificado pode incluir inserções de gene, que inclui insertos de plasmídeo e/ou inserções cromossômicas. O organismo modificado pode também incluir rupturas de gene para otimizar ainda o fluxo de carbono através das trajetórias desejadas para produção do 1,4-BDO. Os organismos que produzem o 1,4-BDO podem incluir a combinação de inserções e deleções.

[0045] Exógena como é utilizada no presente documento é para significar que a molécula referenciada ou a atividade referenciada é introduzida ao organismo microbiano hospedeiro. A molécula pode ser introduzida, por

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14/91 exemplo, pela introdução de um ácido nucléico que codifica para o material genético hospedeiro tal como por integração para um cromossomo hospedeiro ou como um material genético não cromossômico tal como um plasmídeo. Portanto, o termo assim como é utilizado em referência à expressão de um ácido nucléico de codificação refere-se à introdução do ácido nucléico de codificação em uma forma exprimível para o organismo microbiano. Quando utilizado em referência a uma atividade biossintética, termo refere-se uma atividade que é introduzida no organismo de referência hospedeiro. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucléico de codificação homólogo ou heterólogo que expressa a atividade referenciada seguindo a introdução para o organismo microbiano endógeno refere-se hospedeiro. Portanto, o termo a uma atividade ou molécula referenciada que está presente no hospedeiro. De modo semelhante, o termo quando utilizado em referência à expressão de um ácido nucléico de codificação refere-se à expressão de um ácido nucléico de codificação contido dentro do organismo microbiano. 0 termo heterólogo refere-se a uma molécula ou atividade derivada de uma fonte que não a espécie referenciada, enquanto que homólogo refere-se a uma molécula ou atividade derivada do organismo microbiano hospedeiro. Consequentemente, a expressão exógeno de um ácido nucléico de codificação da invenção pode utilizar um ou ambos os ácidos nucléicos de codificação heterólogo ou homólogo.

[0046] Em algumas modalidades, a invenção fornece um processo de purificação um composto de interesse de um caldo de fermentação. Os compostos aplicáveis incluem aqueles que têm um ponto de ebulição maior do que o da água e uma baixa solubilidade de sal. Os compostos de interesse também incluem aqueles que são miscíveis com água. Um

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15/91 composto exemplificador de interesse é o 1,4-BDO. 0 processo inclui a separação de uma fração líquida a qual contém o produto de interesse, de uma fração sólida a qual inclui a massa das células. 0 produto de interesse pode ser qualquer composto que tem um ponto de ebulição maior do que o da água. A massa da célula inclui os organismos microbianos utilizados na produção do composto de interesse. A fração sólida também inclui detritos de célula, sólidos finos, proteínas e outros materiais insolúveis da fermentação.

[0047] O processo de isolamento também inclui a remoção dos sais e água da fração líquida. A ordem na qual os mesmos são removidos é irrelevante. Em algumas modalidades, pode existir remoção parcial de sais, seguida por remoção de substancialmente toda a água, e depois os sais que permanecerem. Em outras modalidades, pode existir remoção parcial de água, seguida por remoção de substancialmente todos os sais, e depois a água que permanecer. Em outras modalidades, a água pode ser parcialmente removida antes da separação da fração sólida do caldo de fermentação. Em ainda outras modalidades, a remoção final de substancialmente toda a água pode ser feita como parte das etapas purificação, por exemplo, por destilação. Como revelado abaixo no Exemplo VI, o 1,4-BDO puro não solubiliza de modo apreciável os sais do meio típicos da fermentação. Assim, o 1,4-BDO pode ser separado dos sais por evaporação da água da fração líquida. Como mostrado no Exemplo V abaixo, os sais começam a se cristalizar quando as concentrações de 1,4-BDO estão em cerca de 30%, em peso. Em algumas modalidades, o 1,4-BDO é pelo menos 98% sem sal mediante a separação do 1,4-BDO dos sais cristalizados ou precipitados por remoção da água. Como pode ser visto a partir do Exemplo VI, propanodiol e

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16/91 etanodiol homólogos intimamente relacionados ainda solubilizam de modo apreciável os sais da fermentação. Assim, outros métodos podem ser empregados para remover sais mesmo após a remoção de substancialmente toda a água.

[0048] Eventualmente quando os sais e água foram removidos, o sólido ou liquido restante pode passar pela final purificação. Quando o produto de interesse é um liquido, a purificação pode ser realizada por destilação incluindo por destilação fracionária ou destilação múltipla, por exemplo. Quando o produto de interesse é um sólido, a purificação pode ser realizada por recristalização.

[0049] O processo inteiro para produção e isolamento de um composto de interesse e reciclagem de vários componentes do caldo de fermentação é resumido no diagrama de fluxo de bloco da Figura 1. A Etapa 100 é fermentação que utiliza matéria prima de carbono, tal como para produzir o composto de interesse. Etapa 110 é a separação das células do caldo de fermentação fornecendo uma fração liquida, com a Etapa 115 como uma reciclagem opcional das células. A Etapa 110 foi exemplificada nos Exemplos I e II em que as células e sólidos são separados do caldo de fermentação por centrifugação e ultrafiltração. Na Etapa 120, os sais são separados da fração liquida, com a Etapa 125 como uma reciclagem opcional dos sais. A Etapa 120 foi exemplificada nos Exemplos III a V, que descrevem a nanofiltração (Exemplo III) e troca de ion (Exemplo IV), em que a água ainda é presente na fração liquida. O Exemplo V mostra a separação dos sais através da cristalização durante a evaporação da água. A Etapa 130 é a remoção da água através de evaporação, com a Etapa 135 como uma reciclagem opcional da água. A Etapa 130 é exemplificada

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17/91 pelo Exemplo V, que mostra a evaporação da água que facilita a separação de sal por precipitação. A ordem das Etapas 120 e 130 é intercalada conforme descrito adicionalmente abaixo. Finalmente, na etapa 140 o composto de interesse passa pela final purificação.

[0050] Em algumas modalidades, um processo de isolamento de um composto de interesse, incluindo 1,4-BDO, de um caldo de fermentação envolve a separação de uma fração líquida enriquecida no composto de interesse de uma fração sólida que inclui células. Na separação de uma fração líquida enriquecida no composto de interesse, qualquer quantidade do caldo de fermentação pode ser processada incluindo 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, incluindo até a totalidade do volume do caldo de fermentação e todos os valores entre esses e incluindo adicionalmente volumes menos que 1% do volume total do caldo de fermentação. Um versado na técnica reconhecerá que a quantidade de caldo de fermentação processada pode depender do tipo de processo de fermentação, tal como batelada, batelada alimentada ou contínua, conforme detalhado abaixo. A separação de sólidos que inclui células e outros subprodutos sólidos e impurezas do caldo de fermentação pode ser realizada por centrifugação, filtração ou uma combinação desses métodos.

[0051] Em algumas modalidades, a centrifugação pode ser usada para fornecer uma fração líquida que compreende o composto de interesse, tal como 1,4-BDO, substancialmente livre de sólidos incluindo a massa celular. Dependendo do tamanho e configuração de centrífuga, as velocidades de operação podem variar entre 500 a 12.000 rpm que produzem uma força centrífuga de até 15.000 vezes a força da gravidade. Muitas configurações de

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18/91 centrífuga para a remoção de células e sólidos de um caldo de fermentação são conhecidas na técnica. Uma dentre as tais configurações, por exemplo, é a centrífuga de disco empilhado 200 mostrada na Figura 2.

[0052] A separação em uma centrífuga de disco empilhado ocorre dentro de um recipiente rotativo 210. 0 alimento é introduzido ao recipiente rotativo a partir do topo através de um tubo de entrada estacionário 220 e é acelerado no distribuidor 230, antes de entrar na pilha de disco 240. 0 distribuidor é projetado para acelerar o líquido de alimentação.

[0053] A separação de líquido-sólidos ou líquidolíquido-sólidos ocorre entre os discos. Em um sistema bifásico, tal como com a fase de óleo e água imiscíveis, a fase de óleo que se move através da pilha de disco para o centro e pode ser descarregada através dos tubos 250 e aspergida em um quadro de coleta. A água e os sólidos separados do óleo se movem para a periferia, a água é levada através de canais no disco de topo 260 para a câmara de emparelhamento, onde é bombeada para fora do rotor com meio de um disco de emparelhamento embutido 270.

[0054] Os sólidos são coletados na periferia, a partir de onde podem ser descarregados intermitentemente através de um ciclone centrífugo. A descarga de sólidos pode ser alcançada por um sistema hidráulico que em intervalos adequados pré-estabelecidos força o fundo de recipiente deslizante 280 para suspender a abertura da porta de sólidos na periferia do recipiente.

[0055] Uma centrífuga de disco empilhado separa sólidos e uma ou duas fases líquidas um dos outro, tipicamente em um processo contínuo. Os sólidos mais densos

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19/91 são forçados para fora pelas forças centrífugas enguanto gue as fases líguidas menos densas forma camadas concêntricas internas. Inserindo-se placas especiais (pilha de disco) a eficácia de separação é aumentada. Os sólidos podem se removidos manualmente, intermitentemente ou continuamente. Em concordância com algumas modalidades, a massa celular pode ser introduzida de volta na fermentação. Em um aparelho de centrífuga de disco empilhado típico, a fase líguida transborda em uma área de saída no topo de um recipiente em uma câmara separada.

[0056] Durante a operação de uma centrífuga de disco empilhado, o alimento é introduzido no eixo geométrico do recipiente, acelerada a velocidade, freguentemente por uma montagem de ventoinha radial e flui através de uma pilha de discos cônicos separados de maneira próxima. O espaçamento de disco é freguentemente entre 0,5 a 3 mm a fim de reduzir a distância necessária para separar as partículas de assentamento do fluido. O ângulo de disco é freguentemente entre 40 e 50 graus para facilitar o transporte de sólidos para baixo da superfície de disco no espaço de sustentação de sólidos.

[0057] O mecanismo de separação é baseado no assentamento de sólidos sob a influência da força centrífuga contra o lado de baixo dos discos e o deslizamento do disco no espaço de sustentação de sólidos. Concomitantemente, o fluido clarificado move-se para cima do canal entre os discos e deixa a centrífuga através de uma bomba centrípeta. Os sólidos assentados são descarregados ou continuamente através de bocais ou intermitentemente através de portas na periferia do recipiente.

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20/91 [0058] A centrífuga de disco empilhado pode ser usada em concentração baixa e tamanho de partícula das células em um caldo de fermentação. Uma centrífuga de disco empilhado pode ser empregada quando a massa celular ou de outro sólido inclui tão pouco quanto cerca de 0,2% a cerca de 3% em peso do caldo de fermentação. A centrífuga de disco empilhado pode também ser usada quando massa celular ou de outro sólido é menos que cerca de 0,2% em peso, por exemplo, 0,01%, 0,05% e 0,1% em peso, incluindo todos os valores entre esses. A centrífuga de disco empilhado pode também ser usada quando massa celular ou de outro sólido é mais que 3% em peso, por exemplo, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, e 15% em peso, incluindo todos os valores entre esses. Quando a massa celular combinada e outros sólidos é maior que 3% a cerca de 15% em peso outra configurações de centrifugação podem ser usadas, tal como uma centrifugação decantadora.

[0059] Células e outras partículas de solo que são macias, plásticas e não abrasivas, que variam de cerca de 0,5 mícron a cerca de 500 mícron são geralmente bem adequadas para centrifugação de disco. No caso das partículas menos que cerca de 0,5 mícron, a ultrafiltração é útil. Igualmente, acima de cerca de 500 mícron, uma centrífuga do tipo decantadora pode ser útil. O tamanho de uma célula procariótica típica que pode ser cultivada para produzir um composto de interesse, incluindo 1,4-BDO, pode variar em tamanho de cerca de 0,5 mícron a cerca de 10 mícron, tornando a centrifugação de disco empilhado um método bem adequado.

[0060] Após a batelada, ou durante a batelada alimentada ou fermentação continua, as células e sólidos insolúveis podem ser removidos do caldo de fermentação por

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21/91 uma centrífuga de disco empilhado. As saídas de uma centrífuga de disco empilhado são um centrado clarificado (livre de célula) e uma corrente de subfluxo contém cerca de 5% a cerca de 50% de sólidos. A corrente de sólidos de subfluxo da centrífuga de disco empilhado pode conter uma quantidade significante do produto de interesse que pode ser recuperado. Um modo de recuperar o composto de interesse adicional dos sólidos é incluir etapas de centrifugação adicionais. Adicionalmente a fornecer melhor recuperação do composto de interesse, a centrifugação múltipla também serve para concentrar adicionalmente as células e sólidos. As células concentradas podem ser recicladas de volta para a fermentação. A reciclagem de célula é particularmente útil quando organismos projetados valiosos estão sendo usados.

[0061] Em algumas modalidades, uma centrifugação decantadora pode ser empregada para separar as células e os sólidos. O bom desempenho com uma centrifugação decantadora é normalmente realizado com sólidos que têm tamanhos de partícula com um limite inferior chegando a cerca de 10 mícron, embora partículas menores possam ser processadas dependendo de sua velocidade de assentamento conforme descrito adicionalmente abaixo. Essa configuração de centrífuga pode ser usada quando as células de uma cultura estão na maior faixa de tamanho de um organismo procariótico típico. Um versado na técnica apreciará que as células eucarióticas são frequentemente muito maiores que as células procarióticas, com uma célula eucariótica média variando em um tamanho de cerca de 10 mícron a cerca de 100 mícron ou maior. Embora uma centrífuga de disco empilhado possa operar bem nessa faixa de tamanho, uma centrifugação decantadora é útil porque é capaz de lidar com quantidades

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22/91 maiores de sólidos. Dessa forma, quando a massa celular mais outros sólidos é mais que cerca de 3 a cerca de 50% da massa em peso, uma centrifugação decantadora pode ser usada. Essa concentração aplica o subfluxo da centrífuga de disco empilhado descrito acima, tornando uma centrifugação bem adequado para concentrar decantadora um método adicionalmente a massa celular e recuperar adicional.

produto [0062] A centrífuga de recipiente sólido ou decantadora opera no principio de sedimentação. Os aparelhos exemplificativos são descritos na Patente n° U.S. 4.228.949 e 4.240.578, que são incorporadas na presente invenção por titulo de referência em suas totalidades. Em tal aparelho 300, conforme mostrado na Figura 3, a parte central da máquina é um tambor rotativo 310, que contém um parafuso independentemente rotativo 320. 0 caldo de fermentação ou alimento que contém sólidos, tal como o subfluxo da centrífuga de disco empilhado, é alimentado através do tubo de entrada 330 para a câmara de mistura 340 no centro da primeira parte do parafuso. 0 caldo, então, passa através das portas na câmara de mistura para fora em direção das paredes externas do tambor. 0 caldo desaguado é transportado através da máquina pelo parafuso. 0 centrado 350 ou sobrenadante é decantado a partir da superfície interna do reservatório de água através de tubos de centrado. 0 nível de água no tambor pode ser ajustado em concordância com as características do material a ser processado.

[0063] 0 tambor e o parafuso giram independentemente um do outro a velocidades de até cerca de 3.600 rpm, dependendo do tipo e tamanho da máquina. Os princípios de desaguamento usados são conhecidos na técnica

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23/91 como o método concorrente ou contracorrente. 0 método concorrente permite velocidades diferenciais muito baixas. A velocidade diferencial é a diferença entre a velocidade do tambor e a velocidade do parafuso. Velocidades diferenciais baixas significam tempos de residência mais longos na centrifuga, que resultam em lodo mais seco e consideravelmente menos desgaste. 0 principio contracorrente pode ser mais adequado para um alimento que é fácil de desaguar quando uma capacidade alta é desejada.

[0064] Os sólidos podem ser separados em centrífugas de recipiente sólido desde que sua velocidade de sedimentação na porção de fase líquida do alimento seja suficiente. Os fatores que influenciam a velocidade de sedimentação incluem, por exemplo, tamanho de partícula, forma, diferenças na densidade entre as células/sólidos e a fase líquida de caldo de fermentação e viscosidade. A geometria do recipiente, especialmente a relação entre o comprimento e diâmetro, são adaptáveis para satisfazer as condições em particular. Em algumas modalidades, bons resultados podem ser obtidos na razão de diâmetro e comprimento que varia de cerca de 2: 1 a cerca de 3:1.

[0065] Em operação, a separação ocorre em um recipiente cilíndrico cônico horizontal equipado com um transportador helicoidal. O caldo de fermentação é alimentado no recipiente através de um tubo de entrada estacionário e acelerado por um distribuidor de entrada. A força centrífuga fornece o meio para a sedimentação dos sólidos na parede do recipiente. Um transportador, girando na mesma direção que o recipiente com velocidade diferencial, transporta os sólidos para a extremidade cônica. Os sólidos são, então, levantados claros da fase líquida e desaguados de forma centrífuga antes de serem

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24/91 descarregados em um canal de coleta. A fase líquida restante flui para uma armação através de uma abertura na extremidade cilíndrica do recipiente.

[0066] Conforme descrito acima, as células e os sólidos podem ser separados por centrifugação múltipla para aumentar o rendimento isolado do composto de interesse. A centrifugação múltipla pode inclui centrifugação duas vezes, três vezes, quatro vezes e cinco vezes, por exemplo. As correntes de subfluxo intermediárias podem ser diluídas com água para aumentar adicionalmente a recuperação do produto líquido. Qualquer combinação das configurações de centrifugação podem também ser usadas para executar centrifugações múltiplas, tais como combinações das centrifugações decantadora e de disco empilhado. Os sólidos adicionais que não são separáveis por centrifugação podem ser removidos através de um processo de filtração, tal como ultrafiltração.

[0067] A ultrafiltração é um processo de separação seletiva através de uma membrana com uso de pressões de até cerca de 145 psi (10 bar). As configurações úteis incluem filtração de fluxo cruzado com uso de elementos de ultrafiltração de enrolamento espiral, fibra oca ou folha plana (cartucho). Esses elementos consistem de membranas poliméricas ou de cerâmica com um corte de peso molecular de menos que cerca de 200.000 Daltons, por exemplo, membrana Hydranautics 5K PES conforme usada no Exemplo I abaixo. As membranas de ultrafiltração de cerâmica são também úteis desde que essas tenham tempo de vida útil de operação longa de até ou mais de 10 anos. As cerâmicas têm a desvantagem de serem muito mais custosas que as membranas poliméricas. Os solutos e sólidos suspensos de concentrados de ultrafiltração de peso

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25/91 molecular maiores que cerca de 1.000 Daltons. A ultrafiltração inclui a filtragem através de uma membrana que tem cortes de peso molecular nominal (MWCO) de cerca de 1.000 Daltons a cerca de 200.000 Daltons (tamanhos de poro de cerca de 0,005 a 0,1 míeron) . O termo corte de peso molecular é usado para definir o tamanho de proteína que será aproximadamente 90% retido pela membrana. Com uso da ultrafiltração o líquido permeável irá conter solutos orgânicos de peso molecular baixo, tais como 1,4-BDO, sais do meio e água. Os sólidos capturados podem incluir, por exemplo, fragmentos de célula residual, DNA e proteínas.

[0068] Adicionalmente ao uso da ultrafiltração a jusante da centrifugação, a ultrafiltração pode também ser usada à jusante da microfiltração. A microfiltração fornece um meio alternativo para centrifugação para separar as células. A microfiltração usualmente envolve um processo de membrana de fluxo cruzado de baixa pressão para separar as partículas suspensa e coloidais na faixa de cerca de 0,05 a 10 míeron. A Microfiltração inclui filtragem através de uma membrana que tem tamanhos de poro de cerca de 0,05 míeron a cerca de 5.0 míeron. Membranas de microfiltração poliméricas, de cerâmica ou de aço podem ser usadas para separar as células. As membranas de microfiltração de cerâmica ou de aço têm tempos de vida útil de operação longos incluindo até ou mais de 10 anos. A microfiltração pode ser usada na clarificação do caldo de fermentação. Ao contrario da ultrafiltração, a microfiltração geralmente não irá capturar os fragmentos de célula residuais, DNA e proteínas. Entretanto, é útil para o uso em uma série de etapas de filtração com tamanho de poro que diminui gradualmente a fim de evitar a obstrução das membranas de filtro. Isso é útil para otimizar o reuso da membrana de

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26/91 filtro. Em algumas modalidades, uma única etapa de ultrafiltração pode ser usada para remover ambos os fragmentos de célula residuais e massa celular (no lugar da centrifugação ou microfiltração) e DNA, proteínas, etc. Os elementos de ultrafiltração cerâmica são úteis para essa aplicação devido a sua habilidade de tolerar os ciclos de limpeza frequentes usados nesse modo de operação.

[0069] Em algumas modalidades, um método de filtração adicional chamado nanofiltração pode ser usado para separar certos sais. Essa etapa de processo pode permitir a recuperação de certos sais de meio sem a evaporação da água anterior, por exemplo. A nanofiltração pode separar sais, remover a cor e fornecer dessalinização. Na nanofiltração, o liquido permeável contém geralmente íons monovalentes e compostos orgânicos de peso molecular baixo conforme exemplificados por 1,4-BDO. A Nanofiltração inclui a filtragem através de uma membrana que tem cortes de peso molecular nominal (MWCO) de cerca de 100 Daltons a cerca de 2.000 Daltons (tamanhos de poro de cerca de 0,0005 a 0,005 mícron). Um método para a nanofiltração é a filtração de fluxo cruzado com uso de um elemento enrolado em espiral. Há diversas membranas nanofiltração disponíveis, por exemplo, a membrana de nanofiltração composta de filme fino GE DK usada no Exemplo III abaixo. O mecanismo de transferência de massa na nanofiltração é difusão. A membrana de nanofiltração permite a difusão parcial de certos solutos iônicos (tal como sódio e cloreto), predominantemente íons monovalentes, assim como água. As espécies iônicas maiores, incluído íons bivalentes e moléculas mais complexas são substancialmente retidos.

[0070] Como os íons monovalentes estão difundindo parcialmente através da membrana de nanofiltração junto com

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27/91 a água, a diferença de pressão osmótica entre as soluções em cada lado da membrana não é tão grande e isso tipicamente resulta de algum modo na pressão de operação mais baixa com nanofiltração em comparação com, por exemplo, osmose reversa.

[0071] A nanofiltração não somente remove uma porção dos sais inorgânicos, mas pode também remover sais de ácidos orgânicos. A remoção de subprodutos de ácido orgânico pode ser importante no processo de isolamento porque tais ácidos podem catalisar ou servir como um reagente em reações laterais indesejadas com um produto de interesse. No contexto das modalidades específicas relacionadas ao isolamento de 1,4-BDO, por exemplo, a remoção de ácidos orgânicos é particularmente útil porque pode prevenir reações tais como a esterificação dos grupos hidroxila durante as temperaturas elevadas de quaisquer etapas de evaporação ou destilação a jusante. Esses subprodutos de éster têm tipicamente pontos de ebulição mais altos BDO resultando em perdas de rendimento para correntes pesadas na destilação.

[0072] A nanofiltração pode também separar o substrato de glucose ou sucrose do produto de interesse, prevenindo as reações de degradação durante a evaporação e destilação. Essas reações de degradação podem produzir a coloração do composto de interesse. O retentado de nanof iltração rico em sal e substrato pode ser melhor adaptado para a reciclagem para a fermentação em comparação a uma corrente de sal recuperado da cristalização evaporativa. Por exemplo, o uso de métodos de filtração em vez de métodos que envolvem a aplicação de calor pode resultar em menos produtos de degradação. Tais produtos de degradação podem ser tóxicos ao organismo de fermentação.

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28/91 [0073] Ambas a nanofiltração e a troca de íon podem remover compostos de formação de cor e compostos de absorção de UV. Isso pode ser útil no contexto de alguns compostos de interesse. Por exemplo, a remoção de cor é útil na produção do grau de polímero 1,4-BDO.

[0074] As membranas de filtração múltipla podem ser usadas serialmente com refinamento que aumenta gradualmente do tamanho dos sólidos que são retidos. Isso pode ser útil para reduzir a obstrução das membranas e ajudar na recuperação de componentes individuais do caldo de fermentação para reciclagem. Por exemplo, uma série de filtrações pode utilizar microfiltração, seguida por ultrafiltração, seguida por nanofiltração. Dessa forma, a microfiltração ajuda na recuperação da massa celular, a ultrafiltração remove componentes grandes tais como fragmentos de célula, DNA, e proteínas e a nanofiltração ajuda na recuperação dos sais.

integrado dentro configurações de de uma variedade fermentação dados de os [0075] Os versados na técnica reconhecerão que qualquer um dos vários tipos de filtração pode ser do contexto bioreator de ensinamentos e guia fornecidos na presente invenção. Em algumas modalidades a filtração ocorre externa ao bioreator. Nesse modo, qualquer quantidade do caldo de fermentação pode ser removida do bioreator e filtrada separadamente. A filtração pode ser ajudada com uso de métodos de vácuo ou com o uso de pressão positiva. Em algumas modalidades, a filtração de célula pode ser realizada por meio de um elemento de filtração interno ao bioreator. Tais configurações incluem aquelas encontradas em bioreatores de reciclagem de célula de membrana (MCRBs).

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Chang et al. Patente n° U.S. 6.596.521 descreveram um reator continuo de reciclagem de dois estágios.

[0076] Em algumas modalidades, as células podem ser separadas e recicladas na mistura de fermentação por meio de um assentador de célula acústico conforme descrito por Yang et al. (Biotechnol. Bioprocess. Eng., 7:357 a 361(2002)). O assentamento de célula acústico utiliza ultrasom para concentrar a suspensão de células em um caldo de fermentação. Esse método permite o retorno fácil das células ao bioreator e evita o problema da obstrução de membrana que algumas vezes complica os sistemas de reciclagem de célula do tipo filtração.

[0077] Com respeito ao isolamento de sais antes da evaporação de água, outros métodos podem ser usados sozinhos ou em combinação com os processos de filtragem exemplificativos acima. Tais outros métodos incluem, por exemplo, troca de íon. Por exemplo, Gong et al. (Desalination 191:1 a 3, 193 a 199 (2006)) descreveu os efeitos de propriedade de transporte de membranas de troca de íon em dessalinização de caldo de fermentação de 1,3propanodiol por eletrodiálise.

[0078] Os elementos de troca de íon podem tomar a forma de leitos de resina assim como membranas. Frequentemente, as resinas são fundidas na forma de leitos porosos. As resinas podem ser polímeros reticulados que têm grupos ativos na forma de locais carregados eletricamente. Nesses locais, os íons de carga oposta são atraídos, mas podem ser substituídos por outros íons dependendo de suas concentrações relativas e afinidades pelos locais. Os trocadores de íon podem ser catiônicos ou aniônicos, por exemplo. Os fatores que determinam que a eficiência de uma

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30/91 dada resina de troca de íon incluem a favorabilidade por um dado íon, e o número de locais ativos disponíveis. Para maximizar os locais ativos, grandes áreas de superfície são de forma geral úteis. Dessa forma, partículas pequenas são úteis devido à sua grande área de superfície.

[0079] O polímero de resina pode incluir reticulação na ordem de cerca de 0,5 a cerca de 15 por cento, por exemplo. A temperatura e pH também afetam a eficiência de troca de íon. Por exemplo, o pH pode afetar o número de íons disponíveis para troca, e a temperatura afeta a cinética do processo. Em algumas modalidades, a remoção de sal através da troca de íon inclui a remoção de ácidos orgânicos e sais de ácidos orgânicos. A forma aniônica de ácidos orgânicos pode se aglutinar a um local ativo de troca de ânion. Em algumas modalidades, o pH para aglutinação de um ácido orgânico é abaixo do pKa para aquele ácido. O pKa de ácido láctico, por exemplo, é cerca de 3,1. Um método efetivo para remover sais de ácidos orgânicos é troca de cátion seguida por troca de ânion. A resina de cátion primeiro remove o contra íon de ácido orgânico (cálcio, sódio, amônio, e similares), abaixando o pH da solução. A resina de ânion então se aglutina ao ácido livre.

[0080] Um aspecto útil da troca de íon é a facilidade com que a resina pode ser regenerada. A resina pode ser livrada dos íons trocados e colocada em contato com uma solução de íons desejáveis para substituí-los. Com regeneração, os mesmos leitos de resina podem ser usados várias vezes, e os íons isolados podem ser concentrados em um efluente de resíduo. Como com os muitos métodos de filtragem, a troca de íon em série pode ser realizada, conforme exemplificado no Exemplo IV. Dessa forma, uma

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31/91 alimentação pode ser passada através de ambos qualquer número de trocadores aniônicos e catiônicos, ou trocadores de leito misturado, e em qualquer ordem.

[0081] Em algumas modalidades, a remoção de água por meio de evaporação é usada para facilitar a recuperação de sal. Em algumas modalidades, os sais foram removidos antes da remoção de água. Em qualquer um dos casos, a água evaporada pode ser reciclada como água de reposição para a fermentação, minimizando as necessidades gerais de água para o processo. No caso em que os sais não foram removidos, sua solubilidade na fase líquida enriquecida por

1,4-BDO é suficientemente baixa para que possam cristalizar após a remoção de água. Em algumas modalidades os sais têm uma solubilidade suficientemente baixa em 1,4-BDO que o

1,4-BDO separado é cerca de 98% livre de sal.

[0082] Um cristalizador evaporativo pode ser usado para gerar sais precipitados que podem ser removidos por centrifugação, filtragem ou outros meios mecânicos. No contexto de isolamento de 1,4-BDO, um cristalizador evaporativo serve para remover água do caldo de fermentação criando uma fase líquida que tem água suficiente removida para causar supersaturação de sais do meio de fermentação e subsequente cristalização na fase líquida remanescente ou licor mãe. Conforme demonstrado no Exemplo V abaixo, a cristalização de sais começa em uma concentração de 1,4-BDO de cerca de 30% em peso.

[0083] O licor mãe se refere ao solvente bruto em uma cristalização. Frequentemente, o licor mãe é uma combinação de solventes com capacidade diferente para solubilizar ou dissolver vários solutos. No contexto da purificação de 1,4-BDO de um caldo de fermentação, por

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32/91 exemplo, o licor mãe inclui a fração líquida obtida após remover as células e outros sólidos do caldo de fermentação. No contexto de isolamento de um composto de interesse de um caldo de fermentação, o soluto primário inclui sais do meio de fermentação e ácidos orgânicos.

[0084] A supersaturação em cristalização se refere a uma condição em que um soluto é mais concentrado em um solvente bruto que é normalmente possível sob dadas condições de temperatura e pressão. O solvente bruto do e caldo de fermentação é água que contém quantidades relativamente pequenas de 1,4-BDO, por exemplo, e sais dissolvidos e outros meios.

[0085] Um cristalizador evaporativo exemplificativo é o cristalizador de circulação forçada (FC) conforme mostrado nas Figuras 5 e 6. Um cristalizador FC foi descrito, por exemplo, no Documento de Patente n° 3.976.430 o qual é incorporado por referência no presente documento em usa integridade. O cristalizador FC evapora a água o que resulta em uma supersaturação intensificada dos sais na fração líquida enriquecida com composto (como 1,4BDO) o que faz com que os sais cristalizem. O cristalizador FC é útil para atingir taxas de evaporação altas. O cristalizador FC consiste em quatro componentes básicos: um vaso cristalizador com uma porção de fundo cônico, uma bomba de circulação, um trocador de calor e equipamento a vácuo o qual manipula os vapores gerados no cristalizador. A pasta aquosa do vaso cristalizador é circulada através do trocador de calor e retornada ao vaso cristalizador novamente, onde a supersaturação é aliviada pela deposição de sais nos cristais presentes na pasta aquosa. A água evaporada é conduzida ao sistema a vácuo, onde a mesma é condensada e reciclada ao caldo de fermentação conforme

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33/91 desejado. Apesar de em algumas modalidades, há um baixo vácuo, é possível também usar o cristalizador FC próximo à pressão atmosférica. Em algumas modalidades, o cristalizador FC utiliza resfriamento adiabático evaporativo para gerar supersaturação de sal. Em tais modalidades, o cristalizador FC não precisa ser equipado com um trocador de calor.

[0086] Em algumas modalidades, o cristalizador FC pode ser equipado ainda com defletores internos, como mostrado na Figura 6, para manipular o excedente da fase líquida e para reduzir resíduos finos os quais podem inibir o crescimento do cristal. Os sais gerados no cristalizador FC podem ser também selecionados pelo tamanho com o auxílio de uma perna de elutriação opcional. Essa porção do cristalizador FC aparece ao fundo da seção cônica do vaso cristalizador. A seleção por tamanho é alcançada ao fornecer um fluxo de fluido de fermentação de modo ascendente pela perna o que permite que apenas partículas com uma taxa de deposição particular se movam contra esse fluxo. A velocidade de deposição está relacionada ao tamanho e formato dos cristais assim como a viscosidade do fluido. Em outras modalidades, o cristalizador FC pode ser também equipado com um purificador interno para reduzir perdas de produto. Isso pode auxiliar na recuperação de produtos voláteis.

[0087] O tubo de arrasto ou de turbulência e o cristalizador DTB de deflexão, mostrados na Figura 7, fornecem duas correntes de descarga, uma pasta aquosa que contém cristais e outra que é a fase líquida com uma pequena quantidade de resíduos finos. A configuração do cristalizador DTB é uma que promove o crescimento do cristal e pode gerar cristais de variedade mais ampla de tamanhos em comparação àqueles obtidos com o cristalizador

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FC. Em algumas modalidades, o cristalizador DTB opera a vácuo ou em baixa pressão superatmosférica. Em algumas modalidades, o cristalizador DTB usa vácuo para resfriar.

[0088] Em algumas modalidades, um cristalizador DTB opera em uma baixa supersaturação. Uma pessoa versada na técnica observará que cristais grandes podem ser obtidos dessa maneira. 0 sistema pode ser opcionalmente configurado para dissolver resíduos finos para aumentar mais o tamanho do cristal. Quando o cristalizador DTB é usado na recuperação do sal de meio de fermentação, o tamanho do cristal não é necessariamente uma prioridade.

[0089] O cristalizador DTB foi estudado amplamente em cristalização e pode ser modelado com precisão. Suas zonas distintas de crescimento e fase líquida clarificada facilita a definição de parâmetros cinéticos e assim, as taxas de crescimento e nucleação podem ser calculadas prontamente. Esses recursos fazem o cristalizador DTB adequado à descrição matemática, e assim, sujeitos ao bom controle operacional. O cristalizador DTB é um exemplo de uma estrutura de remoção de produto misturado de suspensão misturada (MSMPR), como o cristalizador FC.

[0090] O cristalizador DTB inclui uma área defletida, que serve como uma zona de assentamento, a qual é periférica ao volume ativo. Essa zona é usada para processo adicional da fase líquida e de resíduos finos. Em algumas modalidades, a área defletida não está presente, como pode ser o caso onde processamento adicional de resíduos finos é menos importante. Tal configuração é conhecida na técnica como um cristalizador de tubo de arrasto. Um cristalizador DTB pode ser equipado com um agitador, em geral, ao fundo do aparelho nas proximidades da entrada da solução de alimentação. Assim como o cristalizador FC, o cristalizador DTB é equipado,

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35/91 opcionalmente, com uma perna de elutriação. Em algumas modalidades, uma espiral de aquecimento externo opcional pode ser usado para aumentar as taxas de evaporação.

[0091] Ainda outra configuração de cristalizador é a do cristalizador de circulação induzida, como mostrado na Figura 8. Essa configuração fornece meios de agitação adicionais para o volume ativo. O aparelho é similar ao cristalizador DTB com relação ao uso de um tubo de arrasto. Diferente do aparelho DTB, não há agitador interno. Em vez disso, um indutor na porção cônica do vaso introduz solução em cadeia a partir de uma bomba de recirculação. Como em outras configurações de aparelho de cristalização, o cristalizador de circulação induzida é equipado, opcionalmente, com uma perna de elutriação. Os defletores podem ser em pregados também opcionalmente com esse tipo de cristalizador.

referido também crescimento, de do tipo de de Kristal. O [0092] Em ainda outras modalidades, o cristalizador pode ser um cristalizador do tipo Oslo, como mostrado na Figura 9 e 10. Esse tipo de cristalizador é como cristalizador leito fluido ou cristalizador Oslo permite o crescimento de cristais em um leito fluidizado, o qual não é submetido à circulação mecânica. Um cristal em uma unidade Oslo crescerá até um tamanho proporcional ao seu tempo de permanência no leito fluido. O resultado é que um cristalizador Oslo pode crescer cristais maiores do que a maioria dos tipos de cristalizador. A pasta aquosa pode ser removido do leito fluidizado do cristalizador e enviada a, por exemplo, uma seção de centrifugação. A fase líquida clara que contém

1,4-BDO pode ser purgada da zona de clarificação do cristalizador.

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36/91 [0093] A câmara de classificação de cristalização é a parte mais inferior da unidade. A parte superior é a área de separação licor-vapor onde a supersaturação é desenvolvida pela remoção de água. A fase líguida levemente supersaturada flui de maneira descendente através de um tubo central e a supersaturação é aliviada pelo contato com o leito fluidizado de cristais. A desupersaturação ocorre progressivamente conforme a fase líguida circulante se move à montante através do leito de classificação antes de ser coletada na parte de topo da câmara. O líguido restante sai através de um tubo de circulação e após a adição da alimentação fresca, o mesmo passa através do trocador de calor onde o acúmulo de calor é fornecido. O mesmo é, então, reciclado para a parte superior.

[0094] Em algumas modalidades, o cristalizador do tipo Oslo pode ser eguipado também, opcionalmente, com defletores, uma perna de elutriação e um purificador conforme descrito acima. Uma vez gue os cristais em crescimento não estão em contato com gualguer dispositivo de agitação, a guantidade de resíduos finos a serem destruídos é, em geral, mais baixa. O cristalizador do tipo Oslo permite ciclos mais longos de produção entre períodos de remoção de cristal.

[0095] O cristalizador do tipo Oslo é útil para a cristalização de separação de diversas espécies guímicas como são encontradas em sais de meio de fermentação. Em uma modalidade, a unidade de cristalização do tipo Oslo é do tipo fechada, como mostrado na Figura 9. Em outras modalidades, o cristalizador do tipo Oslo é do tipo aberto, como mostrado na Figura 10. Essa última configuração é útil guando grandes áreas de deposição são necessárias, por exemplo.

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37/91 [0096] Muitos dos aparelhos de cristalização evaporativa precedente permitem o crescimento do cristal controlado. Na recuperação de sais de meio de fermentação da porção líquida após a remoção de célula, a morfologia, tamanho e similar exatos são, em geral, inconsequenciais. De fato, a recuperação de sais de meio amorfo pode ser suficiente na purificação de qualquer composto de interesse, o que inclui 1,4-BDO. Assim, em algumas modalidades, outros métodos de evaporação podem ser utilizados que não controlam o crescimento do cristal em si.

[0097] Quando sais são removidos através de nanofiltração e/ou troca de íon, uma filtração por membrana chamada osmose reversa (RO) pode ser usada para remover uma porção da água antes da evaporação. A água permeia a membrana de RO enquanto o 1,4-BDO é retido. Em algumas modalidades, uma membrana de RO pode concentrar um produto, como 1,4-BDO até cerca de 20%. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que a pressão osmótica do produto 1,4BDO aumenta até o ponto onde concentração adicional com o uso de uma membrana de RO não é mais viável. Todavia, o uso de uma membrana de RO é um método de entrada de energia útil para concentrar o produto de interesse antes do processo de evaporação de água mais intensivo. Assim, em larga escala, empregar a membrana de RO é particularmente útil.

[0098] Em algumas modalidades, substancialmente todos os sais são removidos antes da remoção de água. Em outras modalidades, substancialmente todos os sais são removidos após a remoção de uma porção de água. A porção de água removida pode ser qualquer quantidade o que inclui 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, e todos os valores entre eles. Em algumas modalidades, sais

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38/91 são removidos após a remoção de, substancialmente, toda a água. Substancialmente toda a água inclui 95%, 96%, 97%,

98%, 99%, 99.9% e todos os valores entre esses e o inclui toda a água.

[0099] Há muitos tipos e configurações de evaporadores disponíveis para a remoção de água. Uma consideração para projetar um sistema de evaporação é minimizar as exigências energéticas. As configurações de evaporação como efeitos múltiplos ou recompressão mecânica de vapor permitem um reduzido consumo de energia. Em algumas modalidades, a remoção da água é realizada por evaporação com um sistema evaporador o qual inclui um ou mais efeitos. Em algumas modalidades, um sistema evaporador de efeito duplo ou triplo pode ser usado para separar a água de um produto de interesse, como 1,4-BDO. Qualquer número de sistemas evaporadores de múltiplos efeitos pode ser usado na remoção de água. Esse aparelho pode ser aplicado também a qualquer produto de fermentação que tem um ponto de ebulição maior do que o da água. Um evaporador de efeito triplo ou outro configuração de aparelho evaporativo, pode incluir efeitos dedicados que são cristalizadores evaporativos para a recuperação de sal, por exemplo, o efeito final de uma configuração de efeito triplo.

[0100] Um evaporador é um trocador de calor no qual um líquido é fervido para gerar um vapor que é também um gerador de névoa de baixa pressão. Esse vapor d'água pode ser usado para aquecer adicionalmente em outro evaporador chamado outro efeito. Assim, por exemplo, dois evaporadores podem ser conectados de maneira que a linha de vapor de um seja conectada a caixa de vapor do outro fornecendo um evaporador de efeito duplo ou triplo. Essa

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39/91 configuração pode ser propagada a um terceiro evaporador para criar um evaporador de efeito triplo, por exemplo.

[0101] Os evaporadores podem, portanto ser classificados pelo número de efeitos. Em um evaporador de efeito único, o vapor d'água fornece energia para a vaporização e o produto de vapor é condensado e removido do sistema. Em um evaporador de efeito duplo, o produto de vapor de primeiro efeito é usado para fornecer energia para uma segunda unidade de vaporização. Os efeitos em cascata podem continuar por qualquer número de estágios. Os evaporadores de efeito múltiplo podem remover grandes quantidades de solvente de maneira mais eficaz em relação a um evaporador de efeito único.

[0102] Em uma disposição de efeitos múltiplos, o calor latente do produto de vapor produzido por um efeito é usado para aquecer o efeito seguinte. Os efeitos são numerados começando por aquele aquecido por vapor d'água, Efeito I. O primeiro efeito opera sobre a pressão mais alta. O vapor do Efeito I é usado para aquecer o Efeito II, o qual consequentemente opera em baixa pressão. Isso continua através de cada efeito de adição, de maneira que a pressão cai ao longo da sequência e o vapor quente percorrera o caminho de um efeito ao próximo.

[0103] Em algumas modalidades, todos os efeitos em um evaporador podem ser fisicamente similares em tamanho, construção e área de transferência de calor. A menos que perdas térmicas sejam significativas, os mesmos podem ter também a mesma capacidade. Os mecanismos evaporadores, os efeitos conectados em série, pode receber alimentação de diversas maneiras diferentes. Disposições de alimentação avante seguem o padrão I, II, e III. Esses usam uma única bomba de alimentação. Nessa configuração a alimentação é elevada à temperatura operacional mais alta conforme usado

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40/91 no Efeito I. A temperatura operacional mais baixa está no efeito final, onde o produto é também mais concentrado. Portanto, essa configuração é útil para produtos que são sensíveis ao calor ou para reduzir efeitos colaterais.

[0104] Em outras modalidades, disposições de Alimentação Retroativa, III, II, I podem ser usadas. Em tal configuração bombas múltiplas são usadas para trabalhar contra a queda de pressão do sistema, contudo, uma vez que a alimentação é gradualmente aquecida às mesmas podem ser mais eficientes do que uma configuração de alimentação avante. Essa disposição reduz também as diferenças de viscosidade no sistema e é assim útil para os caldos de fermentação viscosos. Em algumas modalidades, disposições de Alimentação Mista podem ser utilizadas, com a alimentação entrando no meio do sistema, ou efeitos II, III, e I. A evaporação final é executada na temperatura mais alta. Adicionalmente, menos bombas são exigidas em comparação com uma disposição de alimentação retroativa. Em ainda outras modalidades, um sistema de Alimentação Paralela é usado para dividir a corrente de alimentação e alimentar uma porção para cada efeito. Essa configuração é comum em evaporadores de cristalização nos quais se espera que o produto seja uma pasta aquosa.

[0105] Há numerosos projetos de evaporador. Qualquer combinação de projetos pode ser usada como um efeito, conforme descrito acima. Um projeto de evaporador é o evaporador de filme descendente. Esse aparelho inclui um trocador de calor de tubo e carcaça vertical, com um separador centrífugo lateralmente ou concentricamente disposto, como mostrado na Figura 11.

[0106] O líquido a ser evaporado é distribuído de maneira uniforme na superfície interna de um tubo. O líquido flui e à jusante e forma um filme fino, a partir do

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41/91 qual a evaporação ocorre por causa do calor aplicado pelo vapor d'água. 0 vapor d'água condensa e fluis à jusante na superfície externa do tubo. Um número de tubos são construídos juntos lado a lado. Em cada extremidade os tubos são fixados às placas de tubo e finalmente o lote de tubo é encerrado por uma jaqueta.

[0107] O vapor d'água é introduzido através da jaqueta. O espaço entre os tubos forma a seção de aquecimento. O lado interno dos tubos é chamado de seção de ebulição. Juntos eles formam a calandria. O líquido concentrado e o vapor deixam a calandria na parte de fundo, a partir de onde a proporção principal do líquido concentrado é descarregada. A parte restante entra no separador subsequente tangencialmente junto com o vapor. O concentrado separado é descarregado, em geral, por meio da mesma bomba que a parte principal do concentrado da calandria, e o vapor deixa o separador a partir do topo. O vapor d'água de aquecimento, o qual condensa na superfície externa dos tubos, é coletado como condensado na parte de fundo da seção de aquecimento, de onde o mesmo é descarregado.

[0108] Os evaporadores de filme descendente podem ser operados com diferenças de temperatura muito pequenas entre o meio de aquecimento e o líquido em ebulição e os mesmos têm também tempos de contato de produto muito curtos, geralmente, apenas alguns segundos por passagem. Essas características fazem o evaporador de filme descendente particularmente adequado pra produtos sensíveis ao calor. A operação de evaporadores de filme descendentes com diferenças de temperatura pequena facilita o uso dos mesmos em configurações de efeito múltiplo ou em conjunto com sistemas de compressão de vapor mecânico.

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42/91 [0109] Umidade suficiente da superfície de aquecimento em tubos da calandria ajuda a evitar pedaços secos e incrustações os quais podem entupir os tubos. Em algumas modalidades, a taxa de umidade pode ser elevada pela extensão ou divisão dos efeitos de evaporador. Os evaporadores de filme descendentes são altamente responsivos à alteração de parâmetros como fornecimento de energia, vácuo, taxa de alimentação e concentrações, por exemplo. Em algumas modalidades, uma configuração de evaporador de filme de efeito único, duplo, triplo ou outros efeitos múltiplos descendentes pode utilizar alimentação de fermentação que foi filtrada através de um processo de nano filtração, como detalhado acima. Reduzir os sais antes da evaporação da água pode ajudar ainda a evitar incrustação nos tubos da calandria.

[0110] Em algumas modalidades, o evaporador de filme descendente é um evaporador de trajetória curta. Em operação, a fração líquida é distribuída de maneira uniforme nos tubos de aquecimento da calandria por meio de um sistema de distribuição. A fração líquida flui de maneira descendente em um filme fino nas paredes laterais de uma maneira similar ao evaporador de filme descendente convencional. Os vapores formados nos tubos da calandria são condensados como um destilado em paredes externas dos tubos condensados e depois fluem de maneira descendente. O destilado de água e a fração líquida enriquecida são descarregados separadamente a partir da parte inferior do evaporador.

[0111] Outra configuração de evaporador é o evaporador de circulação forçada. Nesse projeto um vaso de flash ou separador é disposto acima de uma calandria e a bomba de circulação, como mostrado na Figura 12. Em operação, a fração líquida é circulada através da calandria

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43/91 por meio de uma bomba de circulação. 0 líquido é superaquecido dentro da calandria em uma pressão elevada maior do que a pressão de ebulição normal. Ao entrar no separador, a pressão é rapidamente reduzida o que resulta no flash ou rápida ebulição do líquido. A velocidade de fluxo, controlada pela bomba de circulação, e temperaturas podem ser usadas para controlar o processo de remoção da água. Essa configuração é útil para evitar sujeira nos tubos de calandria.

[0112] Em algumas modalidades, efeitos múltiplos de evaporador de circulação forçada podem ser usados conforme descrito acima. Por exemplo, adicionalmente a um evaporador de circulação forçada de efeito único, duplo, triplo e múltiplo pode ser usado na separação da água da fração líquida do líquido de fermentação. Em algumas modalidades, um ou mais evaporadores de circulação forçada podem ser usados em conjunto com um ou mais evaporadores de filme descendentes.

[0113] Em ainda outras modalidades, o evaporador pode ser a evaporador de placa, como mostrado na Figura 13. Esse evaporador usa um trocador de calor de placa e um ou mais separadores. Uma configuração placa-e-quadro usa placas com canais alternativos para carregar meio de aquecimento e a fração líquida do caldo de fermentação. Em operação, a fase líquida e meio de aquecimento são passados através de seus respectivos canais em contra fluxo. Formatos e distâncias de placa definidas geram turbulência que resulta em transferência de calor eficiente. A transferência de calor aos canais com a fração líquida faz com que a água ferva. O vapor formado assim direciona o líquido residual como um filme ascendente em um duto de vapor da montagem de placa. Os líquidos e vapores residuais são separados em no separador centrífugo à jusante. O amplo

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44/91 duto de admissão e o movimento à montante auxiliam na boa distribuição pela seção transversal do trocador de calor. Um evaporador de placa pode ser operado, de maneira útil, com uma pré-filtração através de uma membrana de nanofiltração para evitar a odor desagradável. Assim, considerações similares as do evaporador de filme descendente com relação à incrustação são garantidas.

[0114] Em algumas modalidades, a evaporação de placa de efeito múltiplo pode ser utilizada de modo bastante similar à maneira conforme descrito acima para filme descendente e evaporadores de circulação forçada. Quando configurações de efeito múltiplo são usadas, uma pessoa versada na técnica reconhece o benefício de usar um evaporador de circulação forçada e/ou de uma etapa de nanofiltração antes da introdução da fração líquida a um evaporador de placa. Assim, um esquema de separação pode incluir, por exemplo, nanofiltração, seguida de uma configuração de evaporação de efeito múltiplo de um ou mais evaporadores de circulação forçada, seguida por um ou mais de uma placa e/ou evaporador de filme descendente. Em ainda outras modalidades, qualquer dos cristalizadores evaporativos descritos acima podem ser usados também em conjunto com uma configuração de efeito múltiplo.

[0115] Em algumas modalidades, um evaporador de circulação pode ser usado para remover água da fração líquida como mostrado na Figura 14. O evaporador de circulação utiliza uma calandria vertical com comprimento de tubo curto com um separador lateral disposto no topo do trocador de calor. Em operação, a fração líquida é fornecida no fundo da calandria e se eleva ao topo. Durante o aquecimento nos tubos da calandria, a água começar a entrar em ebulição liberando vapor. O líquido é carregado para o topo da calandria carregada pelos vapores que se

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45/91 movem de maneira ascendente. O líquido é separado dos vapores quando entra no separador. 0 líquido flui de volta ao evaporador através do cano de circulação para permitis circulação contínua. Quanto maior a diferença de temperatura entre os elementos de aquecimento da calandria e a câmara do separador maior o grau de evaporação da água da fração líquida. Quando a porção líquida é suficientemente enriquecida em 1,4-BDO, os sais começarão a precipitar da fração líquida.

[0116] Em algumas modalidades, o separador do evaporador de circulação pode ser particionado em várias câmaras de separação cada uma equipada com sue próprio sistema de circulação de líquido. Isso pode reduzir a superfície de aquecimento necessária para remover a água da fração líquida.

[0117] O evaporador de leito fluidizado é ainda outra configuração que pode ser usada para remoção de água da fração líquida. Tal sistema, mostrado na Figura 14, é equipado com um trocador de calor de leito fluidizado vertical. No lado do tube do trocador de calor estão partículas sólidas como vidros ou esferas de cerâmica ou partículas de fio de aço.

[0118] O evaporador de leito fluidizado opera em uma maneira similar ao evaporador de circulação forçada. O movimento ascendente do líquido carrega partículas sólidas as quais fornecem uma ação de limpeza ou lavagem. Junto com a fração líquida, os mesmos são transferidos através dos tubos de calandria. Na cabeça da calandria, as partículas sólidas são separadas do líquido e são recicladas na câmara de admissão da calandria. O fluido superaquecido é descarregado elevado rapidamente à temperatura de ebulição no separador o que permite a remoção de água através da evaporação. A ação de lavagem dos sólidos nos tubos da

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46/91 calandria permite tempos de operação prolongados e retardamento adicional da sujeira nos tubos. Isso pode ser útil quando a reação de sólidos de odor desagradável limita o uso de evaporadores de sistema de circulação forçada convencionais.

[0119] O evaporador de filme ascendente é ainda outro tipo de evaporador útil na remoção de água da fração líquida coletada do caldo de fermentação. Esse sistema configuração tem um separador de vapor montado no topo em um trocador de calor de tubo e carcaça vertical (calandria). Em operação, a fração líquida no fundo da calandria se eleva ao topo para o separador de vapor. O calor externo faz com que a água na fração líquida entre em ebulição nas paredes laterais dos tubos de calandria. O movimento ascendente do vapor d'água faz com que a fração líquida seja carregada ao topo da calandria. Durante a ascensão através do tubo mais vapor é formado. Ao entrar no separador de vapores e fases líquidas são separados. O evaporador de filme ascendente é, particularmente útil quando usado com líquidos viscosos e/ou quando grandes quantidades de sólidos de sujeira são esperadas.

[0120] O evaporador de gotejamento em contra fluxo é ainda outro evaporador que pode ser usado para remoção de água da fração líquida do caldo de fermentação. Esse aparelho tem um trocador de calor de tubo e carcaça (calandria) com a parte inferior da calandria maior do que um evaporador de filme ascendente. Disposto no topo da calandria, como o evaporador de filme ascendente é um separador. Nesse evaporador, o separador é equipado ainda com um sistema de distribuição de líquido.

[0121] Em operação, o líquido é fornecido no topo do evaporador como um evaporador de filme descendente. O líquido é distribuído nos tubos do evaporador, mas o vapor

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47/91 flui para o topo em contra fluxo ao líquido. Em algumas modalidades, o processo pode incluir também uma corrente de um gás inerte, por exemplo, para aprimorar o carregamento. Esse gás pode ser introduzido na porção inferior da calandria.

[0122] Um evaporador agitador á inda outro tipo de evaporador que pode ser usado para a remoção de água da fração líquida do caldo de fermentação. Esse aparelho inclui um vaso externo aquecido por jaqueta equipado com um misturador. Em operação, a fração líquida é colocada no vaso, opcionalmente em bateladas. A água é evaporada pela ebulição com misturação contínua até uma concentração desejada. Esse aparelho pode aumentar sua taxa de evaporação ao aumentar a superfície de aquecimento pelo uso de bobinas de aquecimento por imersão opcionais. Esse tipo de evaporador é, partieularmente, útil quando a fermentação é altamente viscosa.

[0123] Finalmente, o evaporador de tubo espiralado é outro tipo de evaporador que pode ser usado para a remoção de água da fração líquida do caldo de fermentação. O projeto inclui um trocador de calor equipado com tubos de aquecimento espiralados e um separador centrífugo montado ao fundo. Em operação, a fração líquida flui um filme em ebulição a partir do topo até fundo em paralelo ao fluxo do vapor. Os vapores de expansão produzem um efeito de cisalhamento ou impulsionamento no filme líquido. A curvatura da trajetória de fluxo induz um fluxo secundário o qual interfere com o movimento ao longo do eixo geométrico do tubo. Essa turbulência aprimora a transferência de calor e é partieularmente útil com líquidos viscosos. A configuração espiral dos tubos de aquecimento fornece de maneira útil uma grande proporção de área de superfície de aquecimento para altura em relação a

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48/91 térmico. Em algumas de configurações de

A temperatura do vapor à pressão da câmara de um projeto de tubo reto ou não espiralado. Esse aparelho fornece grandes razões de evaporação o que permite operações de passagem única.

[0124] Conforme descrito acima, o uso de múltiplos evaporadores de qualquer tipo descrito acima em configurações de duplo, triplo e multi-efeito podem aumentar a eficiência de evaporação. Outros métodos para aprimorar a eficiência de operação incluem, por exemplo, recompressão de vapor mecânico e modalidades, qualquer combinação efeitos múltiplos, recompressão térmica e recompressão mecânica pode ser usada para aumentar a eficiência de evaporação.

[0125] A recompressão de vapor térmico envolve a recomprimir o vapor de uma câmara de ebulição (ou separador) a uma pressão alta d'água saturado correspondente aquecimento é mais alta de maneira que o vapor pode ser reusado para o aquecimento. Isso é realizado com um recompressor de vapor a jato de vapor d'água o qual opera no princípio da bomba de jato de vapor d'água. De maneira breve, o princípio de jato de vapor d'água utiliza a energia de vapor d'água para criar vácuo e manipular gases do processo. A corrente sobre pressão entra em um bocal e produz um jato de alta velocidade. Esse jato cria um vácuo que direciona e carrega o gás. A mistura de vapor d'água e gás é descarregada à pressão atmosférica. Uma quantidade de vapor d'água, chamado de vapor d'água motriz, é usado para operar o recompressor térmico. O vapor d'água motriz é transferido ao próximo efeito ou a um condensador. A energia do vapor de excesso é aproximadamente a da quantidade de vapor d'água motriz usada.

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49/91 [0126] Em evaporadores de efeitos múltiplos equipados com recompressores térmicos de vapor, os meios de aquecimento na primeira calandria é o vapor de produto de um dos efeitos associados, comprimido a um nível de temperatura mais alto por meio de um ejetor de vapor d'água. Os meios de aquecimento em qualquer efeito subsequente é o vapor gerado na calandria antecedente. O vapor do efeito final é condensado com produto de entrada, opcionalmente suplementado por água de resfriamento necessária. Toda a água recuperada é reciclada prontamente a um caldo de fermentação.

[0127] Os recompressores mecânicos utilizam todo vapor deixando um evaporador. O vapor é recomprimido à pressão da temperatura do vapor d'água de aquecimento do evaporador. O princípio operacional é similar a uma bomba de aquecimento. A energia do vapor condensado pode ser opcionalmente usada para pré-aquecer porções adicionais da fração líquida do caldo de fermentação. A recompressão mecânica é fornecida pelo uso de ventiladores de pressão alta ou turbo compressores. Esses ventiladores operam em uma velocidade alta e são adequados para uma altas taxas de fluxo em razões de compressão de cerca de 1:1,2 para cerca de 1:2. Velocidades racionais podem ser entre cerca de 3.000 a cerca de 18.000 RPM. Em algumas modalidades, quando particularmente pressões altas são úteis, compressores de estágio múltiplo podem ser usados.

[0128] Em evaporadores equipados com recompressores de vapor mecânicos, o meio de aquecimento no primeiro efeito é o vapor desenvolvido no mesmo efeito, comprimido a uma temperatura maior por meio de um ventilador de alta pressão. Qualquer excesso da seção de aquecimento alto é opcionalmente condensado ou pode ser utilizado em um concentrador alto.

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50/91 [0129] Conforme descrito acima, há muitas possibilidades de tipos de evaporação que podem ser dispostos em várias configurações eficientes em energia as quais incluem efeitos múltiplos, recompressão térmica de vapor, recompressão mecânica de vapor ou combinações dessas. Configurações ideais dependem de muitos fatores, os quais incluem, por exemplo, o fato de sais de meio terem sido removidos antes da evaporação ou através da cristalização durante a evaporação. Para o caso em que os sais são removidos antes da evaporação, as configurações de baixo custo são úteis. As configurações exemplificativas incluem um sistema evaporador de efeito triplo de filme descendente ou sistema de vapor mecânico. O caso onde sais são cristalizados durante a evaporação é mais complexo devido à possibilidade de escalonar as superfícies do trocador de calor pela precipitação dos sais. Uma configuração exemplificativa para esse caso inclui o efeito triplo onde os dois primeiros efeitos são evaporadores de filme descendentes (antes do estabelecimento da cristalização) e o estágio final é um cristalizador evaporativo de circulação forçada, por exemplo.

[0130] A purificação de 1,4-BDO, em particular, pode ocorrer em uma série de duas colunas de destilação, apesar de mais poder ser usado. Uma primeira coluna é usada para separar água e outros componentes leves do 1,4-BDO, enquanto uma segunda coluna é usada para destilar o 1,4-BDO de quaisquer componentes residuais pesados. A coluna de destilação pode ser operada a vácuo para reduzir as temperaturas exigidas e reduzir reações indesejadas, degradação de produto e formação de cor. A queda de pressão pelas colunas pode ser minimizada para manter temperaturas baixas no reebulidor de fundo. O tempo de permanência no reebulidor pode ser minimizado para evitar também reações

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51/91 indesejadas, degradação de produto e formação de cor, pelo uso, por exemplo, de um reebulidor de filme descendente.

[0131] Aqueles versados na técnica reconhecerão que as várias configurações das centrifugações enumeradas,

filtração,	troca de íon,	evaporador	cristalizador,
evaporador	e	aparelho de	destilação	são úteis	na
purificação de	um composto de	! interesse,	o que inclui	o
1,4-BDO.	Uma	configuração exemplificativa inclui, por
exemplo,	a	centrifugação	de disco empilhado,
ultrafiltração,	cristalização	evaporativa,	troca de íon	e
destilação	, conforme mostrado	no diagrama	do esquema	de
fluxo da	Figura 15. Assim,	em algumas	modalidades,	a

presente invenção fornece um processo de isolamento de 1,4BDO de um caldo de fermentação que inclui remover uma porção de sólidos através da centrifugação de disco empilhado para fornecer uma fração líquida, remover uma porção adicional de sólidos da fração líquida através de ultrafiltração, remoção de uma porção de sais da fração líquida por cristalização evaporativa, remoção de uma porção adicional de sais da fração líquida através da troca de íon e destilação de 1,4-BDO.

[0132] Conforme mostrado na Figura 15, as células e sólidos são primeiro removidos através da centrifugação de disco empilhado. As células podem ser opcionalmente recicladas de volta à fermentação. A ultrafiltração remove fragmentos de célula, DNA e proteínas precipitadas. A cristalização evaporativa remove uma porção dos sais e água do meio, qualquer um dos dois pode ser opcionalmente reciclado de volta à fermentação. Seguindo a cristalização evaporativa, a fase líquida restante é passada através de uma coluna de troca de íon para remover sais adicionais. Após a troca de íon, uma porção da água pode ser evaporada em um sistema evaporador, conforme descrito acima. A

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52/91 destilação de fração leve é seguida pela destilação de 1,4BDO para fornecer substancialmente 1,4-BDO puro.

[0133] Outra configuração exemplificativa inclui centrifugação de disco empilhado, ultrafiltração, nanofiltração, troca de íon, evaporação e destilação, como mostrado na Figura 16. Dessa forma, em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um processo de isolar 1,4BDO de um caldo de fermentação gue inclui remover uma porção de sólidos através da centrifugação de disco empilhado para fornecer uma fração líguida, remover uma porção adicional de sólidos a partir da fração líguida através de ultrafiltração, remover uma porção de sais a partir da fração líguida através de nanofiltração, remover uma porção adicional de sais a partir da fração líguida através da troca de íon, evaporar uma porção de água e destilar 1,4-BDO.

[0134] Como mostrado em Figura 16, células e sólidos são primeiramente removidos através da centrifugação de disco empilhado. As células podem ser opcionalmente recicladas de volta por fermentação. A ultrafiltração remove detritos de célula, DNA, e proteínas precipitadas. A nanofiltração remove uma porção dos sais médios, gue podem ser opcionalmente reciclados de volta por fermentação. Após a nanofiltração, o permeado é passado através de uma coluna de troca de íon para remover sais adicionais. Após a troca de íon, uma porção da água pode ser evaporada em um sistema evaporador, como descrito acima. A destilação da fração de luz, é seguida de destilação de 1,4-BDO para fornecer substancialmente 1,4BDO puro.

[0135] O composto de interesse pode ser gualguer composto para gue o produto possa ser projetado para biossíntese em um micro-organismo. Os processos revelados

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53/91 neste documento são aplicáveis a compostos de interesse que tem pontos de ebulição maiores do que a água. Especificamente, compostos de interesse podem ter um ponto de ebulição entre cerca de 120°C e 400°C. Outras propriedades incluem alta solubilidade ou miscibilidade em água e a incapacidade para apreciavelmente solubilizar sais (quando emprego de cristalização evaporativa) , e compostos neutros com peso molecular abaixo cerca de 100-150 Daltons (para adequação com nanofiltração).

[0136] Os processos e princípios descritos neste documento podem ser aplicados para isolar um composto de interesse de um caldo de fermentação, onde o composto de interesse tem as propriedades gerais descritas acima. Tal processo inclui separar uma fração líquida enriquecida no composto de interesse a partir de uma fração sólida que inclui a massa de célula, seguido de remoção de água e sal e seguido de purificação.

[0137] Em algumas modalidades, a invenção também proporciona um processo para reciclar componentes de um caldo de fermentação. O caldo de fermentação pode incluir 1,4-BDO ou qualquer composto de interesse que tenha um ponto de ebulição maior do que água, células capazes de produzir 1,4-BDO ou o composto de interesse, sais médios e água. O processo inclui separar uma fração líquida enriquecida em 1,4-BDO ou o composto de interesse a partir de uma fração sólida que inclui as células. As células são então recicladas no caldo de fermentação. A água pode ser removida antes ou após separação de sais a partir da fração líquida. A água evaporada a partir da fração líquida é reciclada no caldo de fermentação. Sais da fração líquida podem ser removidos e reciclados no caldo de fermentação ou por remoção de água a partir da fração líquida, causando a cristalização dos sais, ou através de nanofiltração e/ou

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54/91 troca de íon. Os sais separados a partir da nanof iltração são então reciclados no caldo de fermentação. 0 processo proporciona 1,4-BDO ou outros compostos de interesse que podem ser ainda purificados, por exemplo, por destilação.

[0138] Em algumas modalidades, um processo para produzir um composto de interesse, tal como 1,4-BDO, inclui cultivar um micro-organismo produtor do composto em um fermentador por um período de tempo suficiente para produzir o composto de interesse. O organismo inclui a micro-organismo que tem uma trajetória de composto que compreende um ou mais genes exógenos que codificam uma enzima de trajetória de composto e/ou uma ou mais rupturas de gene. O processo para produzir o composto também inclui isolar o composto por um processo que inclui separar uma fração líquida enriquecida no composto de interesse a partir de uma fração sólida que compreende células, remover água a partir da fração líquida, remover sais a partir da fração líquida e purificar o composto de interesse. O composto de interesse tem um ponto de ebulição maior do que água.

[0139] Em uma modalidade específica, um processo para produzir 1,4-BDO inclui cultivar um micro-organismo produzido por 1,4-BDO em um fermentador por um período de tempo suficiente para produzir 1,4-BDO. O organismo inclui um micro-organismo que tem uma trajetória 1,4-BDO que inclui um ou mais genes exógenos que codificam a enzima de trajetória de composto e/ou uma ou mais rupturas de gene. O processo para produzir 1,4-BDO também inclui isolar o composto por um processo que inclui separar a fração líquida enriquecida em composto de interesse a partir de uma fração sólida que compreende células, remover água a partir da fração líquida, remover sais a partir da fração líquida e purificar o composto de interesse.

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55/91 [0140] Em modalidades particulares onde o produto de interesse é 1,4-BDO, a produção começa com o cultivo de um organismo microbial capaz de produzir 1,4-BDO através de um conjunto de enzima de trajetória de 1,4-BDOs. Organismos microbiais exemplificativos incluem, sem limitação, aqueles descritos em U.S. 2009/0075351 e U.S. 2009/0047719, cuja integridade é aqui incorporada a título de referência.

[0141] Organismos podem ser proporcionados de forma que incorporem um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam enzimas em uma trajetória de 1,4-BDO. Tais organismos incluem, por exemplo, organismos microbiais que não ocorrem naturalmente projetados para ter uma trajetória biossintética 1,4-BDO completa. Tais trajetórias podem incluir enzimas codificadas tanto por endógeno quanto por ácidos nucléicos exógenos. Enzimas normalmente não presentes em um hospedeiro microbial pode adicionar em funcionalidade para completar umas trajetórias por incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos, por exemplo. Tal trajetória de 1,4-BDO inclui enzimas que codificam uma 4hidroxibutanoato desidrogenase, uma succinil-CoA sintetase, um semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, um 4-hidroxibutirato:CoA transferase, uma 4-butirato quinase, uma fosfotransbutirilase, uma a-cetoglutarato descarboxilase, uma aldeído desidrogenase, uma álcool desidrogenase ou uma aldeído/álcool desidrogenase.

[0142] Outra trajetória pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma 4-aminobutirato CoA transferase, uma 4-aminobutiril-CoA hidrolase, uma 4aminobutirato-CoA ligase, uma 4-aminobutiril-CoA oxidoredutase (desaminação), uma 4-aminobutiril-CoA transaminase, ou uma 4-hidroxibutiril-CoA desidrogenase. Tal trajetória pode ainda incluir uma 4-hidroxibutiril-CoA

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56/91 redutase (formação de álcool), uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butano diol desidrogenase.

[0143] Outra trajetória pode ainda incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma 4aminobutirato CoA transferase, uma hidrolase, uma 4-aminobutirato-CoA

4-aminobutiril-CoA ligase, uma 4aminobutiril-CoA redutase (formação de álcool), uma 4aminobutiril-CoA desidrogenase, aminobutirato desidrogenase desidrogenase, (desaminação), redutase, uma 4-aminobutan-l-ol uma 4-aminobutan-l-ol oxidoredutase (desaminação) ou uma 4-aminobutan-l-ol transaminase. Tal trajetória pode ainda incluir uma 1,4-butano diol desidrogenase.

[0144] Uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma 4quinase, uma 4-aminobutiraldeído (fosforilação), uma 4-aminobutan-l-ol uma 4-aminobutan-l-ol oxidoredutase uma 4-aminobutan-l-ol transaminase, uma ácido [ (4-aminobutanolil) oxi] fosfônico oxidoredutase (desaminação), uma ácido [(4-aminobutanolil)oxi] fosfônico transaminase, uma 4-hidroxibutiril-fosfato desidrogenase, ou uma 4-hidroxibutiraldeído desidrogenase (fosforilação). Tal trajetória pode ainda incluir um 1,4-butano diol desidrogenase.

[0145] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma alfa-cetoglutarato 5-quinase, uma 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação), a ácido 2,5dioxopentanóico redutase, uma alfa-cetoglutarato CoA transferase, uma alfa- cetoglutaril-CoA hidrolase, uma alfa-cetoglutaril-CoA ligase, uma alfa-cetoglutaril-CoA redutase, uma ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase, uma alfa-cetoglutaril-CoA redutase (formação

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57/91 de álcool), uma ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase, ou uma ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (decarboxilação). Tal trajetória pode ainda incluir uma 4- hidroxibutiril-CoA redutase (formação de álcool), uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou uma 1,4butano diol desidrogenase.

[0146] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma glutamato CoA transferase, uma glutamil-CoA hidrolase, uma glutamil-CoA ligase, uma glutamato 5-quinase, uma glutamato-5-semialdeído desidrogenase (fosforilação), uma glutamil-CoA redutase, uma glutamato-5-semiadeído redutase, uma glutamil-CoA redutase (formação de álcool), uma ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico oxidoredutase (desaminação), uma ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase, uma ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase, ou uma ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (decarboxilação). Tal trajetória pode ainda incluir uma 4hidroxibutiril- CoA redutase (formação de álcool) , uma 4hidroxibutiril-CoA redutase ou uma 1,4-butano diol desidrogenase.

[0147] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, uma 3hidroxibutiril-CoA desidratase, uma vinilacetil-CoA Δisomerase, ou uma 4-hidroxibutiril-CoA desidratase. Tal trajetória pode ainda incluir uma 4- hidroxibutiril-CoA redutase (formação de álcool), uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase ou uma 1,4- butano diol desidrogenase.

[0148] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma homoserina deaminase, uma homoserina CoA transferase, uma homoserina-CoA hidrolase, uma homoserina-CoA ligase,

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58/91 uma homoserina-CoA deaminase, uma 4-hidroxibut-2-enoil-CoA transferase, uma 4-hidroxibut- 2-enoil-CoA hidrolase, uma

4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase, uma 4-hidroxibut-2-enoato redutase, uma 4-hidroxibutiril-CoA transferase, uma 4hidroxibutiril-CoA hidrolase, uma 4-hidroxibutiril-CoA ligase, ou uma 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase. Tal trajetória pode ainda incluir uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase (formação de álcool), uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase ou uma 1,4-butano diol desidrogenase.

[0149] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam uma succinil-CoA redutase (formação de álcool), uma 4hidroxibutiril-CoA hidrolase, uma 4-hidroxibutiril-CoA ligase, ou uma 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação). Tal trajetória pode ainda incluir uma succinil-CoA redutase, uma 4-hidroxibutirato desidrogenase, uma 4-hidroxibutiril-CoA transferase, uma 4-hidroxibutirato quinase, uma fosfotrans-4-hidroxibutirilase, uma 4hidroxibutiril-CoA redutase, uma 4-hidroxibutiril-CoA redutase (formação de álcool) ou uma 1,4- butano diol desidrogenase.

[0150] Ainda, uma trajetória adicional pode incluir um ou mais ácido nucléico exógeno que codificam uma glutamato desidrogenase, 4-aminobutirato oxidoredutase (desaminação), 4-aminobutirato transaminase, glutamato descarboxilase, 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4hidroxibutiril-CoA ligase ou 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação). Tal trajetória pode ainda incluir uma alfacetoglutarato descarboxilase, uma 4-hidroxibutirato desidrogenase, uma 4-hidroxibutiril-CoA transferase, uma 4hidroxibutirato quinase, uma fosfotrans-4hidroxibutirilase, a 4-hidroxibutiril-CoA redutase, uma 4Petição 870180049241, de 08/06/2018, pág. 64/97

59/91 hidroxibutiril-CoA redutase (formação de álcool) ou uma

1.4- butano diol desidrogenase.

[0151] Em adição a, ou no lugar de inserções de gene, um organismo pode incluir ruptura de gene para direcionar o fluxo de carbono à direção de sintetização de

1.4- BDO. Tais organismos incluem, por exemplo, microorganismo que não ocorre naturalmente que tem um conjunto de modificações metabólicas que juntam produção de

1.4- butano diol ao crescimento. Em algumas modalidades, a produção de 1,4-butano diol não é acoplada ao crescimento. O conjunto de modificações metabólicas pode incluir interrupção de um ou mais genes, ou um ortólogo dos mesmos. A interrupção pode incluir deleção completa de gene em algumas modalidades. A interrupção pode também incluir modificação por meio de remoção de uma sequência de promotor e similares. Para produção de 1,4-BDO, um conjunto de modificações metabólicas pode incluir interrupção de adhE e ldhA, por exemplo. Outra interrupção pode incluir o gene mdh. Outras interrupções podem ainda incluir um ou mais genes selecionados a partir do conjunto de genes que inclui mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB e gdhA. Outras interrupções podem ainda incluir um ou mais genes selecionados a partir do conjunto de genes que inclui pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW prpC, e gsk. Outras interrupções podem ainda incluir interrupção de pflAB. Um conjunto exemplificativo de interrupções pode incluir um ou mais genes selecionados a partir do conjunto de genes que compreende adhE, ldhA, pflAB, mdh e aspA, que inclui interrupção de cada um dos genes adhE, ldhA, pflAB, mdh e aspA.

[0152] Conjuntos ainda exemplificativos de interrupções incluem adher, nadh6; adher, ppck; adher, sucd4; adher, atps4r; adher, fum; adher, mdh; adher, pfli,

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60/91 ppck; adher, pfli, sucd4; adher, ackr, nadh6; adher, nadh6, pfli; adher, aspt, mdh; adher, nadh6, ppck; adher, ppck, thd2; adher, atps4r, ppck; adher, mdh, thd2; adher, fum, pfli; adher, ppck, sucd4; adher, glcpts, ppck; adher, gludy, mdh; adher, gludy, ppck; adher, fum, ppck; adher, mdh, ppck; adher, fum, gludy; adher, fum, hexl; adher, hexl, pfli; adher, hexl, thd2; adher, frd2, ldh_d, mdh;

adher, frd2, ldh_d, me2; adher, mdh, pgl, thd2; adher, g6pdhy, mdh, thd2; adher, pfli, ppck, thd2; adher, ackr, akgd, atps4r; adher, glcpts, pfli, ppck; adher, ackr, atps4r, sucoas; adher, gludy, pfli, ppck; adher, me2, pfli, sucd4; adher, gludy, pfli, sucd4; adher, atps4r, ldh_d, sucd4; adher, fum, hexl, pfli; adher, mdh, nadh6 ,thd2; adher, atps4r, mdh, nadh6; adher, atps4r, fum, nadh6; adher, aspt, mdh, nadh6; adher, aspt, mdh, thd2; adher, atps4r, glcpts, sucd4; adher, atps4r, gludy, mdh; adher, atps4r, mdh, ppck; adher, atps4r, fum, ppck; adher, aspt, glcpts, mdh; adher, aspt, gludy, mdh; adher, me2, sucd4, thd2; adher, fum, ppck, thd2; adher, mdh, ppck, thd2; adher, gludy, mdh, thd2; adher, hexl, pfli, thd2; adher, atps4r, g6pdhy, mdh; adher, atps4r, mdh, pgl; adher, ackr,frd2, ldh_d; adher, ackr, ldh_d, sucd4; adher, atps4r, fum, gludy; adher, atps4r,fum, hexl; adher, atps4r, mdh, thd2; adher, atps4r,frd2, ldh_d; adher, atps4r, mdh, PSD; adher, glcpts, ppck, thd2; adher, gludy, ppck, thd2; adher, fum, hexl, thd2; adher, atps4r, me2, thd2; adher, fum, me2, thd2; adher, glcpts, gludy, ppck; adher, me2, pgl, thd2; adher, g6pdhy, me2, thd2; adher, atps4r,frd2, ldh_d, me2; adher, atps4r, frd2, ldh_d, mdh; adher, aspt, ldh_d, mdh, pfli; adher, atps4r, glcpts, nadh6, pfli; adher, atps4r, mdh, nadh6, pgl; adher, atps4r, g6pdhy, mdh, nadh6; adher, ackr, fum, gludy, ldh_d; adher, ackr, gludy, ldh_d, sucd4; adher, atps4r, g6pdhy, mdh, thd2; adher, atps4r, mdh, pgl, thd2;

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61/91 adher, aspt, gôpdhy, mdh, Pink; adher, aspt, mdh, pgl, Pink; adher, aspt, ldh_d, mdh, sucoas; adher, aspt, fum, ldh_d, mdh; adher, aspt, ldh_d, mas, mdh; adher, aspt, id, ldh_d, mdh; adher, Ford. 2, gludy, ldh_d, ppck; adher, frd2, ldh_d, ppck, thd2; adher, ackr, atps4r, ldh_d, sucd4; adher, ackr, acs, ppc, ppck; adher, gludy, ldh_d, ppc, ppck; adher, ldh_d, ppc, ppck, thd2; adher, aspt, atps4r, glcpts, mdh; adher, g6pdhy, mdh, nadh6 ,thd2; adher, mdh, nadh6,pgl, thd2; adher, atps4r, g6pdhy, glcpts, mdh; adher, atps4r, glcpts, mdh, pgl; e adher, ackr, ldh_d, mdh, sucd4. Os genes mencionados acima são incluídos em uma ampla lista de candidatos knockout, junto com as reações que esses genes catalisam, na Tabela la abaixo.

Tabela la. Candidatos Knockout de Gene em E.

coli.

Abreviação de Reação	Estequiometria de Reação*	Genes que codificam enzimas que catalisam cada reaçãofi
ACKr	[c] : ac + atp <==> actp + adp	(b3115 ou b2296 ou bl849)
ACS	[c] : ac + atp + coa —> accoa + amp + ppi	b4069
ACt6	ac[p] + h[p] <==> ac[c] + h[c]	Gene não associado
ADHEr	[c] : etoh + nad <==> acald + h + nadh [c] : acald + coa + nad <==> accoa + h + nadh	(b0356 ou bl478 ou bl241) (bl241 ou b0351)
AKGD	[c] : akg + coa + nad —> co2 + nadh + succoa	(b0116 e b0726 e b0727 )
ASNS2	[c] : asp-L + atp + nh4 —> amp + asn-L + h + ppi	b3744
ASPT	[c] : asp-L —> fum + nh4	b4139
ATPS4r	adp[c] + (4) h[p] + pi[c] <==> atp[c] + (3) h[c] + h2o[c]	( ( (b3736 e b3737 e b3738) e (b3731 e b3732 e b3733 e b3734 e b3735)) ou ( (b3736 e b3737 e b3738) e (b3731 e b3732 e b3733 e b3734 e b3735) e b3739))
CBMK2	[c] : atp + co2 + nh4 <==> adp + cbp + (2) h	(b0521 ou b0323 ou b2874 )
EDA	[c] : 2ddg6p —> g3p + pyr	b!850

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62/91

ENO	[c] : 2pg <==> h2o + pep	b2779
FBA	[c] : fdp <==> dhap + g3p	(b2097 ou b2925 ou bl773 )
FBP	[c] : fdp + h2o —> f6p + pi	(b4232 ou b3925)
FDH2	for[p] + (2) h[c] + q8[c] — > co2[c] + h[p] + g8h2[c]	( (b3892 e b3893 e b3894) ou (bl474 e bl475 e bl476))
for[p] + (2) h[c] + mgn8[c] —> co2[c] + h[p] + mql8[c]
FRD2	[c] : fum + mql8 —> mqn8 + succ [c] : 2dmmql8 + fum —> 2dmmq8 + succ	(b4151 e b4152 e b4153 e b4154)
FTHFD	[c] : lOfthf + h2o —> for + h + thf	bl232
FUM	[c] : fum + h2o <==> mal-L	(bl612 ou b4122 ou bl611 )
G5SD	[c] : glu5p + h + nadph —> gluõsa + nadp + pi	b0243
G6PDHy	[c] : g6p + nadp <==> 6pgl + h + nadph	bl852
GLCpts	glc-D[p] + pep[c] —> g6p[c] + pyr[c]	((b2417 e bllOl e b2415 e b2416) ou (bl817 e bl818 e bl819 e b2415 e b2416) ou (b2417 e bl621 e b2415 e b2416))
GLU5K	[c] : atp + glu-L —> adp + glu5p	b0242
GLUDy	[c] : glu-L + h2o + nadp <==> akg + h + nadph + nh4	bl761
GLYCL	[c] : gly + nad + thf —> co2 + mlthf + nadh + nh4	(b2904 e b2903 e b2905 e b0116)
HEX1	[c] : atp + glc-D —> adp + g6p + h	b2388
ICL	[c] : icit —> glx + succ	b4015
LDH_D	[c] : lac-D + nad <==> h + nadh + pyr	(b2133 ou bl380)
MALS	[c] : accoa + glx + h2o —> coa + h + mal-L	(b4014 ou b2976)
MDH	[c] : mal-L + nad <==> h + nadh + aa	b3236
ME2	[c] : mal-L + nadp —> co2 + nadph + pyr	b2463
MTHFC	[c] : h2o + methf <==> lOfthf + h	b0529
NADH12	[c] : h + mgn8 + nadh —> mgl8 + nad [c] : h + nadh + q8 —> nad + q8h2 [c] : 2dmmq8 + h + nadh —>	bll09

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63/91

	2dmmgl8 + nad
NADH6	(4) h[c] + nadh[c] + q8[c] -> (3) h[p] + nad[c] + g8h2[c] 4 h[c] + mqn8c + nadh[c] —> (3) h[p]+ mqll8[c] + nad[c] 2dmmg8[c] + (4) h[c] + nadh[c] —> 2dmmgl8[c] + (3) h[p] + nad[c]	(b2276 e b2277 e b2278 e b2279 e b2280 e b2281 e b2282 e b2283 e b2284 e b2285 e b2286 e b2287 e b2288)
PFK	[c] : atp + f6p —> adp + fdp + h	(b3916 ou bl723)
PFLi	[c] : coa + pyr —> accoa + for	( ( (b0902 e 60903) e b2579) ou (b0902 e b0903) ou (b0902 e b3114) ou (b3951 e b3952))
PGDH	[c] : 6pgc + nadp —> co2 + nadph + ru5p-D	b2029
PGI	[c] : g6p <==> f6p	b4025
PGL	[c] : 6pgl + h2o —> 6pgc + h	b0767
PGM	[c] : 2pg <==> 3pg	(63612 ou 64395 ou 60755 )
PPC	[c] : co2 + h2o + pep —> h + oaa + pi	b3956
PPCK	[c] : atp + oaa —> adp + co2 + pep	b3403
PROlz	[c] : fad + pro-L —> lpyr5c + fadh2 + h	bl014
PYK	[c] : adp + h + pep —> atp + pyr	bl854 ou bl676)
PYRt2	h[p] + pyr[p] <==> h[c] + pyr[c]	Gene não associado
RPE	[c] : ru5p-D <==> xu5p-D	(b4301 ou b3386)
SO4t2	so4[e] <==> so4[p]	(b0241 ou b0929 ou bl377 ou b2215)
SUCD4	[c] : q8 + succ —> fum + q8h2	(b0721 e b0722 e b0723 e b0724)
SUCOAS	[c] : atp + coa + succ <==> adp + pi + succoa	(b0728 e b0729)
SULabc	atp[c] + h2o[c] + so4[p] —> adp[c] + h[c] + pi[c] + so4[c]	( (b2422 e b2425 e b2424 e b2423) ou (b0763 e b0764 e b0765) ou(b2422 e b2424 e b2423 e b3917))
TAL	[c] : g3p + s7p <==> e4p + f 6p	(b2464 ou b0008)

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THD2	(2) h[p] + nadh[c] + nadp[c] —> (2) h[c] + nad[c] + nadph[c]	(bl602 e bl603)
THD5	[c] : nad + nadph —> nadh + nadp	(b3962 ou (bl602 e bl603))
TPI	[c] : dhap <==> g3p	b3919

[0153] As abreviações para os metabólitos na

Tabela la são mostradas abaixo na Tabela lb.

Tabela lb. Nomes de metabólitos correspondentes a abreviações usadas na Tabela la.

TABELA lb

Abreviação do metabólito	Nome metabólito
lOfthf	10-Formiltetraidrofolato
lpyrõc	1-Pirrolina-5-carboxilato
2ddg6p	2-Deidro-3-deoxi-D-gluconato 6-fosfato
2dmmq8	2-Demetilmenaquinona 8
2dmmgl8	2-Demetilmenaquinol 8
2pg	D-Glicerato 2-fosfato
3pg	3-Fosfo-D-glicerato
6pgc	6-Fosfo-D-gluconato
6pgl	6-fosfo-D-glucono-l,5-lactona
ac	Acetato
acald	Acetaldeído
accoa	Acetil-CoA
actp	Acetil fosfato
adp	ADP
akg	2-0xoglutarato
amp	AMP
asn-L	L-Asparagina
asp-L	L-Aspartato
atp	ATP
cbp	Carbamoil fosfato
co2	C02
coa	Coenzima A
dhap	Dihidroxiacetona fosfato
e4p	D-Eritrose 4-fosfato
etoh	Etanol
f 6p	D-Frutose 6-fosfato
fad	Flavina adenina dinucleotideo oxidada

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fadh2	Flavina adenina dinucleotídeo reduzida
fdp	D-Frutose 1,6-bisfosfato
for	Formiato
fum	Fumarato
g3p	Gliceraldeído 3-fosfato
g6p	D-Glicose 6-fosfato
glc-D	D-Glicose
glu5p	L-Glutamato 5-fosfato
glu5sa	L-Glutamato 5-semialdeído
glu-L	L-Glutamato
glx	Glioxilato
gly	Glicina
h	H+
h2o	H2O
icit	Isocitrato
lac-D	D-Lactato
mal-L	L-Malato
methf	5,10-Meteniltetraidrofolato
mlthf	5,10-Metilenotetraidrofolatp
mg 18	Menaquinol 8
mqn8	Menaquinona 8
nad	Nicotinamida adenina dinucleotídeo
nadh	Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
nadp	Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
nadph	Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato - reduzido
nh4	Amônio
oaa	Oxaloacetato
ΡθΡ	Fosfoenolpiruvato
Pi	Fosfato
PPi	Difosfato
pro-L	L-Prolina
pyr	Piruvato
q8	Ubiquinona-8
q8h2	Ubiquinol-8
ru5p-D	D-Ribulose 5-fosfato
s7p	Sedoheptulose 7-fosfato
so4	Sulfato
succ	Sucinato
succoa	Succinil-CoA
thf	5,6,7,8-Tetraidrofolato
xu5p-D	D- Xilulose 5-fosfato

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66/91 [0154] Qualquer microorganismo que não ocorre naturalmente que incorpora qualquer combinação da ruptura de gene acima pode também incluir uma inserção de gene de pelo menos um ácido nucléico exógeno. Quaisquer das trajetórias de inserção de gene descritas acima podem ser integradas com ruptura de gene. Por exemplo, uma trajetória que inclui interrupções dos genes adhE, ldhA, pflAB, mdh e aspA pode também incluir inserção de uma 4-hidroxibutanoato desidrogenase, uma semialdeído succínico desidrogenase independente de CoA, uma succinil-CoA sintetase, uma semialdeído succínico desidrogenase dependente de CoA, uma

4-hidroxibutirato:CoA transferase, uma glutamato: semialdeído succínico transaminase, uma glutamato descarboxilase, uma aldeído desidrogenase independente de CoA, a Aldeído desidrogenase dependente de CoA ou uma álcool desidrogenase.

[0155] A Tabela 2 abaixo resume organismos exemplificativos projetados para a produção de 1,4-BDO que incorpora combinações de interrupção de gene e inserção de gene. Observe que inserção de gene pode ser na forma de inserção de cromossomos ou proporcionar um plasmídeo.

[0156] Tabela 2. Projetos de Interrupção-Inserção de combinação para produção de 1,4-BDO.

Cepa n°	Cromossomo hospedeiro	Descrição de hospedeiro	Baseado em plasmídeo

1	AldhA	Deleção única derivada de E. coli MG1655	E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE 2

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2	AadhE AldhA ApflB	Cepa de produção de sucianato; derivado de E. coli MG1655	E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE 2
3	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322	Aprimoramento de lpdA para aumentar fluxo de piruvato dehidrogenase	E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE 2
4	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322		E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. acetobutylicum AdhE2
5	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA	Deleções em mdh e arcA para direcionar fluxo através de ciclo TCA oxidativo	E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE 2
6	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA		M. bovis sucA, E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2

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7	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L	Mutação em cítrato sintase para aprimorar atividade anaeróbica	E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE 2
8	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L		M. bovis sucA, E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2
9	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L		M. bovis sucA, E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. beijeriuckii Aid
10	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd	Ramificação de sucianato de trajetória a montante integrada em ECKh-422	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid
11	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd	Sucianato e alfacetoglutarato a montante de ramificações de trajetória integradas em ECKh-422	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid

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12	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd		C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. beijerinckii Aid
13	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L AackA fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd	Deleção de Acetato quinase de ECKh-432	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid
14	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L AackA Appc::H.i.ppck fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd	Deleção de Acetato quinase e substituição PPC/PEPCK de ECKh- 432	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid
15	AadhE AldhA ApflB AlpdA: :fnr-pflB 6K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd	Substituição de promotor lpdA com promotor anaeróbico em ECKh-432	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid
16	AadhE AldhA ApflB AlpdA:: K.p.lpdA322 ApdhR:: fnr-pflB6 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd	Substituição de pdhR e promotor aceEF com promotor anaeróbico em ECKh-432	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid

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17	AadhE AldhA ApflB AlpdA:: K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd fimD:: C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb	Integração de BK/PTB em ECKh-432	C. beijerinckii Aid
18	AadhE AldhA ApflB AlpdA:: K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd fimD:: C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb		C. beijerinckii Aid, G. thermoglucosidasius adhl
19	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd rrnC::cscAKB	Genes de sacarose não PTS inseridos em ECKh-432	P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid
20	AadhE AldhA ApflB AlpdA::K.p.lpdA3 2 2 Amdh AarcA gltAR163L fimD:: E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd fimD:: M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd rrnC::cscAKB		C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. beijerinckii Aid

*0 símbolo delta (Δ) indica deleção de gene.

[0157] As cepas resumidas na tabela 2 são como a seguir: Cepa 1: Deleção derivada única de E. coli MG1655, com deleção de endógeno ldhA; expressão de plasmídeo de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P.

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71/91 gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2. Cepa 2: Cepa hospedeira AB3, a cepa de produção de sucinato, derivada de E. coli MG1655, com deleções de endógeno adhE ldhA pflB; expressão de plasmídeo de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2 , C. acetobutylicum AdhE2.

[0158] Cepa 3: Cepa hospedeira ECKh-138, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA; expressão de plasmídeo de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd,

P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2; cepa proporciona aprimoramento de lpdA para aumentar fluxo de piruvato desidrogenase. Cepa 4: Cepa hospedeira ECKh-138, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, e lpdA, inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys; expressão de plasmídeo E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. acetobutylicum AdhE2.

[0159] Cepa 5: Cepa hospedeira ECKh-401, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA; expressão de plasmídeo de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2; a cepa tem deleções em mdh e arcA para direcionar fluxo através de ciclo TCA oxidativo. Cepa 6: cepa hospedeira ECKh-401, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA; expressão de plasmídeo de M. bovis sue A, E. coli sucCD, P.

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72/91 gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C.

acetobutylicum AdhE2.

[0160] Cepa 7: Cepa hospedeira ECKh-422, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu; expressão de plasmídeo de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2 , C. acetobutylicum AdhE2; a cepa tem mutação em citrato sintase para aprimorar atividade anaeróbica. Cepa 8: cepa ECKh-422, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu; expressão de plasmídeo de M. bovis sucA, E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. acetobutylicum AdhE2. Cepa 9: cepa hospedeira ECKh-422, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu; expressão de plasmídeo de M. bovis sucA, E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid.

[0161] Cepa 10: cepa hospedeira ECKh-426, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd;

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73/91 expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2 , C. beijerinckii Aid; a cepa tem ramificação de sucinato de trajetória à montante integrada na cepa ECKh-422 no local fimD. Cepa 11: cepa hospedeira ECKh-432, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu,inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd; expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2 , C. beijerinckii Aid; a cepa tem sucinato e alfacetoglutarato a montante de ramificações de trajetória integrada em ECKh-422. Cepa 12: cepa hospedeira ECKh-432, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA Mutante Argl63Leu,inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd; expressão de plasmídeo de C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. beijerinckii Aid.

[0162] Cepa 13: cepa hospedeira ECKh-439, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu,deleção de endógeno ackA, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local

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74/91 fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd; expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2 , C. beijerinckii Aid; a cepa tem deleção de acetato quinase deleção em cepa ECKh432. Cepa 14: cepa hospedeira ECKh-453, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA [0163] Mutante Argl63Leu, deleção de endógeno ackA, deleção de endógeno ppc e inserção de Haemophilus influenza ppck no local ppc, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd; expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid; a cepa tem deleção de acetato quinase e substituição PPC/PEPCK em cepa ECKh432 .

[0164] Cepa 15: cepa hospedeira ECKh-456, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd, substituição de promotor lpdA com sítio de ligação fnr, promotor pflB-p6 e RBS de pflB; expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid; a cepa tem substituição de promotor lpdA com promotor anaeróbico em cepa ECKh-432. Cepa 16: cepa hospedeira ECKh455, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA,

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75/91 deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu,inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbdl, substituição de pdhR e promotor aceEF com sitio de ligação fnr, promotor pflB-p6 e RBS de pflB; expressão de plasmideo de P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid; a cepa tem substituição de pdhR e promotor aceEF com promotor anaeróbico em ECKh-432.

[0165] Cepa 17: cepa hospedeira ECKh-459, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb; expressão de plasmideo de C. beijerinckii Aid; a cepa tem integração de BK/PTB na cepa ECKh-432. Cepa 18: cepa hospedeira ECKh-459, deleção de endógeno adhE, IdhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb; expressão de plasmideo de C. beijerinckii Aid, G. thermoglucosidasius adhl .

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76/91 [0166] Cepa 19: cepa hospedeira ECKh-463, deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA Mutante Argl63Leu, inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd, inserção no local rrnC de genes de operon sacarose não PTS de sacarose permease (cscB), Dfrutoquinase (cscK), sacarose hidrolase (cscA), e um repressor específico de sacarose relativo a Lacl (cscR); expressão de plasmídeo de P. gingivalis Cat2, C. beijerinckii Aid; a cepa tem genes de sacarose não PTS inseridas na cepa ECKh-432. Cepa 20: cepa hospedeira ECKh463 deleção de endógeno adhE, ldhA, pflB, deleção de endógeno lpdA e inserção de cromossomos de Klebsiella pneumoniae lpdA com uma mutação Glu354Lys no local lpdA, deleção de endógeno mdh e arcA, substituição de cromossomos de gltA com gltA mutante Argl63Leu,inserção de cromossomos no local fimD de E. coli sucCD, P. gingivalis sucD, P. gingivalis 4hbd, inserção de cromossomos no local fimD de M. bovis sucA, C. kluyveri 4hbd, inserção no local rrnC de operon sacarose não PTS; expressão de plasmídeo de C. acetobutylicum bukl, C. acetobutylicum ptb, C. beijerinckii Aid.

[0167] Cepas projetadas para a utilização de sacarose por meio de um sistema de fosfotransferase (PTS) produz quantidades significantes de piruvato como um subproduto. Dessa forma, o uso de um sistema de sacarose não PTS pode ser usado para diminuir formação de piruvato porque a importação de sacarose não será acompanhada pela conversão de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato. Isso irá

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77/91 aumentar a acumulação de PEP e o fluxo de oxaloacetato através de PPC ou PEPCK.

[0168] A inserção de um operon sacarose não PTS na região do rrnC pode ser executada. Para gerar um produto de PCR que contém os genes de sacarose não PTS flanqueados por regiões de homologia à região de rrnC, dois oligos são usados para amplificar por PCR os genes esc de Machl^{™) (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Essa cepa é uma descendente da cepa W que é uma cepa de E. coli conhecida por ser capaz catabolizar a sacarose (Orencio-Trejo et al., Biotechnology Biofuels 1:8 (2008)) . A sequência foi derivada da cepa W de E. coli KO11 (n° de acesso AY314757) (Shukla et al. , Biotechnol. Lett. 26:689 a 693 (2004)) e inclui genes para codificar a sacarose permease (cscB), D-frutocinase (cscK) , sacarose hidrolase (cscA) e um repressor especifico de sacarose relativo a LacI (cscR) . Os primeiros 53 aminoácidos do cscR foram efetivamente removidos pela colocação do iniciador. Após a purificação, o produto de PCR é eletroporado em células eletrocompetentes MG1655 que foram transformadas com pRedET (tet) e preparadas de acordo com as instruções do fabricante (www.genebridges.com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modificati on%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf). O produto de PCR é projetado de modo que integre no genoma na região do rrnC cromossomo. O mesmo efetivamente apaga 191 nucleotídeos a montante do rrlC (23S rRNA) , todos do gene rrlC rRNA e 3 nucleotídeos a jusante do rrlC e o substitui com a sacarose operon. A região rrnC: crcAKB inteira é transferida para a cepa hospedeira BDO ECKh-432 por transdução de Pl (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (2001), que resulta em ECKh-463 (AadhE AldhA ApflB AlpdA: K.p.lpdA322 Amdh AarcA gltARl63L fimD::E. coli sucCD, P. gingivalis

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78/91 sucD, P. gingivalis 4hbd fimD::M. bovis sucA, C. kluyveri

4hbd rrnC::cscAKB). Os recombinantes são selecionados por crescimento em saearose e verificados por PCR de diagnóstico.

[0169] Antes de cultivar os organismos de produção de compostos ou de produção de 1,4-BDO, as matérias-primas em bruto como xarope de saearose e componentes do meio podem ser tratados, por exemplo, por esterilização por calor antes da adição ao biorreator de produção para eliminar quaisquer contaminantes biológicos. De acordo com algumas modalidades, a matéria-prima pode incluir, por exemplo, saearose ou glicose para a fermentação de BDO. Em algumas modalidades, a matéria-prima pode incluir gás de síntese. Componentes adicionais do meio usados para dar suporte crescimento dos micro-organismos incluem, por exemplo, sais, fontes de nitrogênio, tampões, metais traço e uma base para controle de pH. Os componentes mais importantes de um pacote de meio exemplificativo, expresso em g/1 de caldo de fermentação, são mostrados abaixo na Tabela 3.

Tabela 3

Categoria	Concentração
N-Fonte	3 g/1
Tampão	5 g/1
Sais	0,65 g/1
Base	1,4 g/1
	10,1 g/1

[017 0] O tipo de fonte de carbono pode variar consideravelmente e pode incluir glicose, frutose, lactose, saearose, maltodextrinas, amido, insulina, glicerol, óleos vegetais tais como óleo de soja, hidrocarbonetos, alcoóis tais como metanol e etanol, ácidos orgânicos tais como acetato, gás de síntese e combinações semelhantes de CO,

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C02 e Η2. 0 termo glicose inclui xaropes de glicose, isto é, composições de glicose que compreendem oligômeros de glicose. Plantas e material de biomassa derivada de plantas pode ser uma fonte de matéria-prima de baixo custo. Tal matéria-prima pode incluir, por exemplo, milho, soja, algodão, semente de linhaça, colza, cana de açúcar e óleo de palma. A biomassa pode sofrer hidrólise mediada por enzima ou química para liberar substratos que podem ser, ainda, processados por meio de biocatálise para produzir produtos químicos de interesse. Esses substratos incluem misturas de carboidratos, bem como compostos aromáticos e outros produtos que são coletivamente derivados das porções celulósicas, hemicelulósicas e de lignina da biomassa. Os carboidratos gerados a partir da biomassa são uma mistura rica em 5 e 6 açúcares de carbono que incluem, por exemplo, sacarose, glicose, xilose, arabinose, galactose, manose e frutose.

[0171] Fonte de carbono pode ser adicionada à cultura como um sólido, líquido ou gás. A fonte de carbono pode ser adicionada de uma maneira controlada para evitar stress nas células devido à superalimentação. A esse respeito, a batelada alimentada e cultura contínua são modos de cultura úteis conforme discutido acima.

[0172] O tipo de fonte de nitrogênio pode variar consideravelmente e pode incluir ureia, hidróxido de amônio, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, cloreto de amônio e nitrato de amônio, outros nitratos, aminoácidos tais como glutamato e lisina, extrato de levedura, autolisatos de levedura, base de nitrogênio de levedura, hidrolisados de proteína (que incluem, mas não se limitam a, peptonas, hidrolisados de caseína tais como triptona e casaminoácidos), farelo de

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80/91 soja, Hy-Soy, caldo tripticase soja, farelo de semente de algodão, extrato de malte, milhocina e melaços.

[0173] O pH da cultura pode ser controlado pela adição de ácidos ou alcalinos. Devido ao fato de que o pH pode cair durante a cultura, o alcalino pode ser adicionado conforme o necessário. Exemplos de alcalinos adequados incluem NaOH e NH4OH.

[0174] Os procedimentos de cultivo de células exemplificativos usados na produção de um composto de interesse, como 1,4-BDO, incluem, fermentação por batelada, fermentação por batelada alimentada com separação em batelada; fermentação por batelada alimentada com separação contínua, e fermentação contínua com separação contínua. Todos esses processos são bem conhecidos na técnica. Dependendo do tipo de organismo, as fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas. Em algumas modalidades, a temperatura das culturas mantidas entre cerca de 30 e cerca de 45 °C, incluindo 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, e 44 °C.

[0175] Em fermentação por batelada, um fermentador de tanque (ou biorreator) é preenchido com os meios preparados para dar suporte ao crescimento. A temperatura e o pH para a fermentação microbiana é ajustada adequadamente, e quaisquer suplementos adicionais são adicionados. Um inóculo de um organismo de produção de 1,4BDO é adicionado ao fermentador. Na fermentação por batelada a fermentação geralmente será realizada por um período fixo e então os produtos da fermentação são isolados. O processo pode ser repetido em bateladas.

[0176] Fermentação por batelada, meio fresco é contínua ou periodicamente adicionado ao biorreator de fermentação. A fermentação por batelada alimentada de volume fixo um tipo de fermentação por batelada

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81/91 alimentada em que a fonte de carbono é alimentada sem diluir a cultura. 0 volume de cultura também pode ser mantido quase constante fermentando-se a fonte de carbono de crescimento como um líquido ou gás concentrado. Em outro tipo de cultura de batelada alimentada de volume fixo, às vezes chamada de cultura de batelada alimentada cíclica, a porção da cultura é periodicamente retirada e usada como o ponto de início para outro processo de batelada alimentada. Uma vez que a fermentação alcança um determinado estágio, a cultura é removida e a biomassa é diluída para o volume original com água estéril ou meio que contém o substrato de alimentação de carbono. A diluição diminui a concentração de biomassa e resulta em um aumento na taxa de crescimento específico. Subsequentemente, como a alimentação continua, a taxa de crescimento declinará gradualmente conforme a biomassa aumenta e se aproxima do máximo sustentável no vaso uma vez mais, no ponto em que a cultura pode ser diluída novamente. Alternativamente, a fermentação por batelada alimentada pode ser de volume variável. No modo de volume variável o volume do caldo de fermentação muda com o tempo de fermentação conforme os nutrientes e meios são continuamente adicionados à cultura sem remoção de uma porção do caldo de fermentação.

[0177] Em uma fermentação contínua, meios frescos são, em geral, continuamente adicionados com separação contínua do meio gasto, que pode incluir o produto de interesse, como 1,4-BDO, quando o produto é secretado. Um atributo da cultura contínua é que um estado estacionário independente de tempo pode ser obtido que possibilita que alguém determine as relações entre comportamento microbiano e as condições ambientais. A obtenção desse estado estacionário é realizada por meio de um quimiostato, ou um biorreator semelhante. Um quimiostato permite que a adição

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82/91 contínua de meio fresco enquanto o líquido de cultura é continuamente removido para manter o volume de cultura constante. Alterando-se a taxa em que o meio é adicionado ao quimiostato, a taxa de crescimento do micro-organismo pode ser controlada.

[0178] A produção contínua e/ou quase contínua de um composto de interesse, como 1,4-BDO pode incluir cultivar um organismo de produção de composto em nutrientes e meio suficientes para sustentar e/ou quase sustentar o crescimento em uma fase exponencial. A cultura contínua sob tais condições pode incluir, por exemplo, 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Adicionalmente, a cultura contínua pode incluir 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até vários meses. Alternativamente, os organismos que produzem um composto de interesse podem ser cultivados por horas, se for adequado para uma aplicação particular. Deve-se entender que as condições de cultura contínua e/ou quase contínua também podem incluir todos os intervalos de tempo entre esses períodos exemplificativos. Deve-se entender também que o tempo de cultivo do organismo microbiano de produção de composto é por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade suficiente de produto para um propósito desejado.

[0179] Em algumas modalidades, a cultura pode ser conduzida sob condições aeróbicas. Uma alimentação de oxigênio à cultura pode ser controlada. O oxigênio pode ser fornecido como ar, oxigênio enriquecido, oxigênio puro ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos de monitoramento da concentração de oxigênio são conhecidos na técnica. O oxigênio pode ser liberado em uma determinada taxa de alimentação ou pode ser liberado por demanda medindo-se o teor de oxigênio dissolvido da cultura e alimentação de acordo com a intenção de se manter um teor de oxigênio

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83/91 dissolvido constante. Em outras modalidades, a cultura pode ser conduzida sob substancialmente condições anaeróbicas. Substancialmente anaeróbicas significa gue a guantidade de oxigênio é menos de cerca de 10% de saturação para oxigênio dissolvido em meios líguidos. Condições anaeróbicas incluem câmaras seladas de meio líguido ou sólido mantidas com uma atmosfera de menos de cerca de 1% de oxigênio.

[0180] Fermentações podem ser executadas sob condições anaeróbicas. Por exemplo, a cultura pode ser processada substancialmente livre de oxigênio primeiro borrifando-se o meio com nitrogênio e, então, selando-se o vaso de cultura (por exemplo, frascos pode ser selados com um septo e tampa de friso). Microcondições aeróbicas também podem ser utilizadas fornecendo-se um pegueno orifício para aeração limitada. Em escala comercial, microcondições aeróbicas são obtidas borrifando-se um fermentador com ar ou oxigênio como no caso aeróbico, mas em uma taxa muito baixa e com agitação controlada firmemente.

[0181] Em algumas modalidades, o composto de interesse, incluindo 1,4-BDO, pode ser produzido em uma fermentação anaeróbica por batelada com o uso de E. coli geneticamente modificada. Na fermentação, a porção do substrato de matéria-prima é usada para crescimento da célula e o substrato adicional é convertido em outros subprodutos de fermentação. Componentes do meio tais como sais, tampão, nitrogênio, etc. podem ser adicionados em excesso à fermentação para dar suporte ao crescimento da célula. O caldo de fermentação é, assim, uma mistura complexa de água, do composto de interesse, subprodutos, meios residuais, substrato residual e matériaprima/impurezas dos meios. É desse caldo de fermentação gue p composto de interesse é isolado e purificado. Uma

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84/91 composição de caldo de fermentação exemplificativa é mostrada abaixo na Tabela 4.

Tabela 4*

Quantidade	Componente
-100 g/1	1,4-BDO
~5g/l	massa celular
-10 g/1	subprodutos (etanol, ácido acético, ácido 4hidroxibutirico, GBL, proteínas)
<10 g/1	meios/sais residuais
<1 g/i	sacarose/glicose residual
<2 g/1	não fermentáveis (matéria-prima/impurezas)

* Balanço hídrico [0182] A concentração de produto de cerca de 5 a

15% em peso de 1,4-BDO pode ser obtida através de processos de produção biossintética com base em fermentação.

[0183] Deve-se entender que modificações que não afetam substancialmente a atividade de várias modalidades dessa invenção são também incluídas dentro da definição da invenção fornecida no presente documento. Portanto, os exemplos a seguir se destinam a ilustrar, mas não limitar a presente invenção.

EXEMPLO I

Centrifugação de Caldo de fermentação [0184] Esse exemplo mostra o uso de uma centrífuga de disco empilhado para remover massa celular e outros sólidos de um caldo de fermentação.

[0185] Um caldo de fermentação de 1,4-butanodiol produzido por uma E. coli geneticamente modificada foi clarificada por meio de centrifugação. Uma centrífuga de disco empilhado GEA-Westfalia foi usada para essa etapa. A centrífuga de escala de laboratório, modelo CTC 1 Whispefuge, tem uma capacidade de recipiente de 1,0 litros e um espaço de armazenamento de sólidos de 0,55 litro. A cobertura do recipiente, distribuidor, discos empilhados e todas as peças úmidas do processo são construídas com aço inoxidável de alta resistência tênsil. A alimentação para a

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85/91 unidade centrífuga foi controlada com o uso de uma bomba peristáltica, com a taxa de fluxo mantida constante em aproximadamente 0,25 litros por minuto. Uma pressão de retorno de cerca de 15 psi foi mantida no sistema regulando-se a pressão de uma válvula reguladora no fluxo de concentração de saída. A centrífuga foi operada em 12.000 rpm e a alimentação foi em temperatura ambiente. A centrifugação remove biomassa celular e materiais insolúveis do caldo de fermentação. A concentração de biomassa celular e material insolúvel é indicada pela turvação, conforme é medida por densidade óptica (OD) em 600 nm. Os dados de turvação para o caldo de fermentação de alimentação e concentrado clarificado são mostrados na Tabela 5. A alimentação estava visivelmente obscura e tinha a medida de OD de 13,3. O concentrado clarificado estava visualmente mais claro e tinha a medida de OD de 0,18. No geral a turvação foi diminuída em aproximadamente 99%, mostrando excelente clarificação pela centrífuga de disco empilhado.

Tabela 5. Turvação medida por densidade óptica (OD) em 600 nm

OD em 600 nm

Alimentação, caldo de fermentação 13,3

Concentrado clarificado 0,18

EXEMPLO II

Ultrafiltração de Caldo de fermentação [0186] Esse exemplo mostra a ultrafiltração do caldo de fermentação após a remoção de massa celular e outros sólidos pela centrifugação conduzida no Exemplo I.

[0187] A unidade de filtração de escala de laboratório GEA, Modelo L, foi usada para clarificar posteriormente o produto produzido no Exemplo 1. A Unidade de filtração Modelo L foi equipada com membranas de lâmina lisa Hydranautics 5K PES. A área de membrana instalada

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86/91 total foi de 0,144 m². A pressão de transmembrana foi mantida em aproximadamente 36 psi ajustando-se o fluxo de entrada e a válvula reguladora de pressão de retorno. A temperatura da alimentação foi mantida em aproximadamente 27 °C com o uso de um trocador de calor de entrada. A taxa de fluxo de permeado foi medida ao longo do curso do experimento para determinar o fluxo. A Tabela 6 mostra o fluxo permeado em litros/m²/h como uma função do fator de concentração volumétrica (VCF).

Tabela 6. Fluxo de ultrafiltração contra o VCF

	Fluxo
VCF	litros/m²/h
1,18	15,02
1,44	15,37
1,86	15,29
2,60	15,34
4,33	15,06
6,50	14,79

[0188] Amostras foram também retiradas ao longo do experimento para determinar a qualidade de permeado. A concentração de proteína na alimentação e permeado foi medida com o uso do Ensaio de Bradford. A Tabela 7 mostra a concentração de proteína na alimentação, permeado e retentado. A concentração de proteína diminuiu aproximadamente 68% no permeado em comparação com a alimentação.

Tabela 7. Concentração de proteína medida com o uso do Ensaio de Bradford

Concentração de Proteína, mg/1

Alimentação, Caldo centrifugado 84,09

Permeado de UF 27,11

Retentado de UF 248,90

EXEMPLO III

Nanofiltração de Caldo de fermentação

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87/91 [0189] Esse exemplo mostra a nanofiltração do caldo de fermentação seguido de ultrafiltração conduzida no Exemplo II.

[0190] Uma unidade de filtração de escala de laboratório GEA, Modelo L, foi eguipada com membranas de lâmina lisa de nanof iltração GE DK. A área de membrana instalada total foi 0,072 m². Essa configuração foi usada para filtrar o permeado de UF obtida a partir do Exemplo 2. A pressão de transmembrana foi mantida em aproximadamente 270 psi ajustando-se o fluxo de entrada e a válvula reguladora de pressão de retorno. A temperatura da alimentação foi mantida a 38 °C com o uso de um trocador de calor de entrada. O fluxo de permeado foi medido ao longo do curso do experimento para determinar o fluxo. A Tabela 8 mostra o fluxo in litros/m2/h como um função da fator de concentração volumétrica (VCF).

Tabela 8. Fluxo de nanofiltração

VCF	Fluxo
litros/m²/h
1,33	14,69
1,74	13,41
2,50	10,42

[0191] Amostras foram também retiradas ao longo do experimento para determinar a gualidade de permeado. Ácidos orgânicos foram medidos com o uso de LC-MS, íons de sal foram analisados com o uso de Cromatografia (IC) , e a glicose foi medida com o uso de um analisador Analox G6. A Tabela 9 mostra a rejeição percentual para glicose, íons, e ácidos orgânicos. No pH da alimentação espera-se gue os ácidos orgânicos estejam presente em forma de sais. O permeado de nanofiltração também tinha uma redução visual na cor a partir de um amarelo nítido na alimentação a um amarelo muito suave no permeado produto.

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Tabela 9. Porcentagem de rejeição de glicose, íons e ácidos orgânicos através de nanofiltração

Glicose	Cátions Monovalentes	Cátions Bivalentes	Ânions	Ácidos Orgânicos
88,57%	72,80%	100,00%	82,45%	64,39%

EXEMPLO IV

Troca de íon de Caldo de fermentação [0192] Esse exemplo mostra a purificação cromatográfica de troca de íons do caldo de fermentação seguido de nanofiltração conduzida no Exemplo III.

[0193] O permeado de nanofiltração obtida a partir do Exemplo III foi processada através de uma etapa de troca de íon para remover os íons restantes e, ainda, clarificar o produto. Amberlite IR 120H, uma resina de troca de cátion de ácido forte, e Amberlite IRA 67, a resina de troca de ânion de base fraca, foram usadas para essa etapa. Colunas de troca de cátion e ânion individuais, de 2 pés de altura (60 cm) x 1 polegada de diâmetro, foram carregadas com 5,3 x 10^-3 pés³ de resinas de troca de ânion cátion, respectivamente. O permeado de nanofiltração foi primeiro alimentada para a coluna de troca de cátion, e então para a coluna de troca de ânion a 10 ml/min e 40 °C. A troca de íon foi analisada para teor de íon por meio de IC. Todos os íons restantes foram removidos para uma concentração de menos de 0,1 mEq/1. Todos os ácidos orgânicos restantes foram também removidos nesse etapa. O produto estava muito claro sem cor amarela visível.

EXEMPLO V

Cristalização evaporativa de uma Alimentação Sintética [0194] Esse exemplo mostra a remoção de sais a partir de uma alimentação sintética por cristalização evaporativa em escala de laboratório com o auxílio de um evaporador giratório.

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89/91 [0195] A evaporação foi executada com o uso de um Buchi Rotavap R-2 05 em temperatura de banho de 50 °C e um vácuo de ~100 mm de Hg. Um material de alimentação sintética foi preparado com cerca de 8% de BDO em água que contém aproximadamente 92 mEq/1 de cátions monovalentes, 5 mEq/1 cátions bivalentes e 125 mEq/L de ânions. a água foi evaporada a partir dessa mistura enquanto os íons de sal foram permitidos a precipitar simultaneamente a partir da solução. Concentrações de íon na solução foram monitorados ao longo da evaporação tomando-se alíquotas de amostras pequenas para análise por Cromatografia de íon. Antes da análise sólidos precipitados foram filtrados. A Tabela 10 mostra a concentração de íons na solução (normalizada a 100% na amostra de alimentação) já que o BDO foi concentrado a partir de aproximadamente 10 a 95%. As concentrações de íon aumentaram até o ponto de saturação na solução (em aproximadamente 30% de BDO) . Após esse ponto outra evaporação forçou a cristalização (precipitação) dos sais. Em geral, essa etapa de cristalização evaporativa fez com que 97.5 % dos íons de sal se precipitassem a partir da solução de BDO.

Tabela 10. Precipitação evaporativa do caldo sintético

Tempo, h	BDO% em peso	% de cátions monoatômicos	% de cátions diatômicos	% de ânions
0	10,00	100,00	100,00	100,00
0,25	15,47	159,75	132,32	161,25
0,5	33,79	344,61	159,73	353,02
0,75	81,32	35,49	0,00	47,24
1,5	94,25	22,43	0,00	20,17

EXEMPLO VI

Solubilidade de sal [0196] Esse exemplo mostra os perfis de solubilidade de sais em vários dióis de cadeia de carbono pequena, incluindo 1,4-BDO.

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90/91 [0197] A solubilidade de sal em diferentes soluções que contêm quantidades variáveis de 1,4-Butanodiol (BDO)_r 1_r3-Propanodiol (PDO) ou 1,2-Etanodiol (mono etilenogligol, MEG) foi medida. Os sais foram adicionados a 10 ml da solução até que a solução foi saturada. A solubilidade de sal saturada foi medida com o uso de Cromatografia de íon. A Tabela 11 mostra a solubilidade de sal de quatro sais diferentes à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). A solubilidade de sal diminui significativamente com o aumento na concentração de BDO demonstrando a viabilidade da remoção de sal com o uso de cristalização evaporativa. A Tabela 12 mostra a solubilidade de sal de três sais diferentes em diferentes concentrações de soluções de 1,4-BDO, PDO ou MEG à temperatura ambiente. Os resultados mostram uma diminuição nas solubilidades de sal que vão a partir do MEG, a PDO, a 1,4-BDO, demonstrando que 1,4-BDO é mais adequado para uma cristalização evaporativa entre os três compostos.

[0209] Tabela 11. Solubilidade de quatro sais diferentes em soluções que contém 0 a 100% de 1,4Butanodiol (1,4-BDO)

Solução (% de 1,4-BDO)	Solubilidade Medida Média (% em peso^	~20 C
KH₂PO₄	NaCl	MgSO«	(NH₄)₂SO₄
0 (água)	20,101	32,300	34,354	57,375
33	3,296	10,803	7,346	11,639
80	0,056	2,592	0,035	0,173
90	0,011	0,314	0,015	0,022
95	0,005	0,314	0,028	0,008
98	0,031	0,175	0,011	0,005
100	0,003	0,050	0,009	0,004

[0198] Tabela 12. Solubilidade de três sais diferentes em 50, 80 ou 100% de 1,4-Butanodiol (BDO), 1,3Propanodiol (PDO) ou 1,2-Etanodiol (MEG)

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Solvente	Solução (% de solvente)	Solubilidade Medida Média (% em peso) ~20 C
KCL	Na2SOi	(NH₄)H₂PO₄
BDO	50	8,21	0,63	2,97
80	0,94	0,04	0,16
100	0,05	0,00	0,01
PDO	50	8,70	2,38	3,62
80	1,45	0,10	0,46
100	0,30	0,01	0,09
MEG	50	14,11	9,42	80,6
80	7,72	1,81	2,90
100	4,76	0,69	1,22

[0199] Ao longo desse pedido várias publicações foram referidas entre parênteses. As apresentações dessas publicações em sua integridade são incorporadas no presente documento a título de referência, nesse pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual essa invenção pertence.

[0200] Embora a invenção tenha sido descrita com referência às modalidades apresentadas, aqueles versados na técnica logo verificarão que os exemplos específicos e estudos detalhados acima são apenas ilustrativos da invenção. Deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Portanto, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações a seguir.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de isolamento de 1,4-butanodiol (1,4-BDO) de um caldo de fermentação caracterizado pelo fato de que compreende separar uma fração líquida enriquecida em 1,4-BDO de uma fração sólida que compreende células, em que a etapa de separação da fração líquida da fração sólida compreende ultrafiltração;

remover água da dita fração líquida, remover sais da dita fração líquida, em que sais são removidos por nanofiltração e troca iônica antes da remoção de água e purificar o 1,4-BDO.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ultrafiltração compreende filtrar uma membrana que tem tamanhos de poro de 0,005 a 0,1 mícron.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a remoção da água é realizada por evaporação com um sistema evaporador que compreende um ou mais efeitos.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema evaporador compreende um efeito evaporador duplo ou triplo.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema evaporador compreende adicionalmente um recompressor térmico.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema evaporador compreende, ainda, um recompressor mecânico.

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7. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema evaporador compreende um evaporador selecionado a partir do grupo que consiste em um evaporador de filme descendente, um evaporador molecular de filme descendente, um evaporador de circulação forçada, um evaporador de placa, um evaporador de circulação, um evaporador de leito fluidizado, um evaporador de filme ascendente, um evaporador de gotejamento em contrafluxo, um evaporador agitador e um evaporador de tubo espiralado.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema evaporador compreende um vácuo.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que substancialmente todos os sais são removidos antes da remoção de água.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que substancialmente todos os sais são removidos após a remoção de uma porção de água.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os sais são removidos após a remoção de substancialmente toda a água.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração compreende filtrar uma membrana que tem uma faixa de tamanho de poro de 0,0005 a 0,005 mícron.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fração sólida que

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3/3 compreende células é reciclada formando o dito caldo de fermentação.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita água removida é reciclada formando o dito caldo de fermentação.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos sais removidos são reciclados formando o dito caldo de fermentação.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a purificação de 1,4-BDO compreende destilação.

17. Processo para produzir 1,4-BDO caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar um micro-organismo produtor de 1,4-BDO em um fermentador para um período de tempo suficiente para produzir 1,4-BDO, sendo que o dito micro-organismo produtor de 1,4-BDO compreende um micro-organismo que tem uma trajetória de 1,4-BDO compreendendo um ou mais genes exógenos que codificam uma enzima de trajetória de 1,4-BDO e/ou uma ou mais rupturas de gene;

isolar o 1,4-BDO através de um processo, conforme definido na reivindicação 1.

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Vapores de processo

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