BRPI0514734B1 - VARIEDADE BACTERIANA DE E. Coli MODIFICADA - Google Patents

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Abstract

variedade bacteriana geneticamente planejada, método para produzir ácidos carboxílicos em uma cultura anaeróbica e método para produzir ácido succínico a invenção refere-se a uma variedade mutante de bactérias, que são desprovidas ou que contêm genes mutantes para diversas enzimas metabólicas chave, e que produzem grandes quantidades de ácido succínico sob condições anaeróbicas.

Description

(54) Título: VARIEDADE BACTERIANA DE E. COLI MODIFICADA (51) Int.CI.: C12P 7/46; C12N 1/21; C12N 1/20; C12P 21/04; C12P 1/00 (30) Prioridade Unionista: 27/08/2004 US 60/604,922 (73) Titular(es): RICE UNIVERSITY (72) Inventor(es): KA-YIU SAN; GEORGE N. BENNETT; AILEN SANCHEZ
1/27 “VARIEDADE BACTERIANA DE E. CoH MODIFICADA
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] Refere-se a presente invenção a métodos para produzir ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico, e outros ácidos carboxílicos em microorganismos projetados metabolicamente.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] O succinato químico especialidade valiosa e seus derivados têm extensas aplicações industriais. O ácido succínico e usado como um material bruto para alimentos, medicina, plásticos, cosméticos, e têxteis, bem coma no revestimento e na depuração de gases residuais (61). O ácido succínico pode servir como um material de alimentação para precursores de plástico tais como 1,4-butanodiol (BDO), tetraidrofurano e gamabutirolactona. Além disso, o ácido succínico e o BDO podem ser usados como monômeros para poliésteres. Se o custo do succinato puder ser reduzido, ele tornar-se-á mais útil como um material de alimentação intermediário para produzir outros produtos químicos a granel (47). Juntamente com o ácido succínico, outros ácidos dicarboxílicos com 4 átomos de carbono, tais como ácido málico e ácido fumárico, também têm potencial como material de alimentação.
[0003] A produção de succinato, malato e fumarato a partir de glicose, xilose, sorbitol e outros materiais de alimentação renováveis “verdes” (neste caso através de processos de fermentação) constitui um caminho para suplantar os métodos de energia mais intensa de derivar esses ácidos a partir de fontes não-renováveis. O succinato é um intermediário para fermentações anaeróbicas por bactérias de produção de propionato, mas esses processos resultam em baixos rendimentos e concentrações. É sabido há muito tempo que as misturas de ácidos são produzidas a partir de fermentação de E. coli. Entretanto,
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2/27 para cada mol de glicose fermentada, somente são produzidos
1,2 mols de ácido fórmico, 0,1-0,2 mols de ácido láctico, e 0,3-0,4 mols de ácido succínico. Dessa forma, esforços para produzir ácidos carboxílicos de forma fermentada resultaram em quantidades relativamente grandes de substratos de crescimento, tais como glicose, não serem convertidos para o produto desejado.
[0004] Realizaram-se numerosas tentativas para projetar metabolicamente o percurso metabólico central anaeróbico de E. coli para aumentar o rendimento e produtividade de succinato (7, 8, 12, 14, 15, 20, 24, 32, 44, 48). Planejamento genético conjugado com otimização de condições de produção também tem mostrado aumentar a produção de succinato. Um exemplo é o desenvolvimento da espécie de E. coli mutante utilizando-se modalidade de produção por fermentação de fase dupla, a qual compreende uma fase de crescimento aeróbico inicial seguida por uma fase de produção anaeróbica e/ou pela mudança das condições de espaço superior da fermentação anaeróbica utilizando-se dióxido de carbono, hidrogênio ou uma mistura dos dois gases (35, 49) .
[0005] Especificamente, a manipulação de níveis de enzimas através de amplificação, adição, ou redução de um percurso particular pode resultar em altos rendimentos de um produto desejado. Foram descritos vários aperfeiçoamentos genéticos para produção de ácido succínico sob condições anaeróbicas que utilizam os caminhos de fermentação de ácidos misturadas de E. coli. Um exemplo é a sobre expressão de fosfoenolpiruvato carboxilase (pepc) a partir de E. coli (34). Em outro exemplo, a conversão de fumarato para succinato foi aperfeiçoada pela sobreexpressão de reductase de fumarato nativo (frd) em E. coil (17, 53) . Determinadas enzimas não são inatas no E. coli, mas podem ajudar potencialmente a aumentar a produção de
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3/27 succinato. Pela introdução de piruvato carboxilase (pyc) a partir de Rhizobium etli em E. coli , a produção de succinato foi aumentada (14, 15, 16). Outras estratégias de planejamento metabólico incluem inativar caminhos concorrentes de succinato. Quando enzima málica foi sobreexpressada em um hospedeiro com genes de piruvato formato liase inativado (pfl) e lactato desidrogenase (ldh), o succinato tornou-se o principal produto de fermentação (44, 20) . Um sistema de glicose fosfotransferase inativa (ptsG) na mesma variedade mutante (pfl- e ldh-) também mostrou proporcionar produção de succinato mais alta na E. coli e aperfeiçoar o crescimento (8).
[0006] O rendimento teórico máximo (base molar) de succinato a partir de glicose sob condições anaeróbicas está limitado a 1 mol/mol, supondo-se que todo o fluxo de carbono seguirá através do caminho de fermentação de succinato nativo (Figura 1). O caminho de fermentação converte oxaloacetato (OAA) em malato, fumarato e, então, succinato e este caminho requer 2 mols de NADH por mol de succinato produzido. Um obstáculo principal para alto rendimento de succinato através do caminho de fermentação é devido à limitação de NADH. Isto ocorre porque um mol de glicose pode proporcionar apenas dois mols de NADH através do caminho glicolítico; entretanto, a formação de um mol de succinato através do caminho de fermentação nativo requer dois mols de NADH. A produção anaeróbica de succinato também é embaraçada pelas limitações do lento crescimento e produção de célula.
[0007] O planejamento metabólico tem o potencial de aperfeiçoar consideravelmente a produtividade de processo pela manipulação do rendimento do caminho metabólico. Especificamente, a manipulação de níveis de enzimas através de amplificação, adição, ou retirada de um caminho particular pode resultar em altos rendimentos de um
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4/27 produto desejado. O que é necessário na técnica é uma variedade bacteriana aperfeiçoada que produza níveis mais altos de succinato e outros ácidos carboxílicos do que foi proporcionado até agora.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0008] Descrevem-se bactérias com mais de duas proteínas da via de sinalização para aperfeiçoar produção de ácido carboxílico sob condições anaeróbicas, em que o ácido carboxílico produzido é succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, ou glioxilato. Em uma concretização da invenção, as proteínas ADHE, LDHA, ACKA, PTA, ICLR, e ARCA são inativadas. Em uma outra concretização da invenção várias combinações de proteínas são inativadas, incluindo ADHE, LDHA, ACKA, PTA, ICLR, e ARCA. A inativação destas proteínas também pode ser combinada com a sobre expressão de ACEA, ACEB, ACEK, PEPC, PYC, ou CITZ para aumentar mais o rendimento de succinato.
[0009] Em uma outra concretização da invenção, são criadas variedades de rompimento em que os genes adhE, 1dhA, ic1R, arcA, e ack-pta são rompidos. Em uma outra concretização da invenção varias combinações dos genes adhE, ídhA, ic1R, arcA, e ack-pta são rompidos. As variedades mutantes designadas por SBS330MG, SBS440MG, SBS550MG, SBS660MG, e SBS990MG, proporcionam algumas concretizações da invenção.
[0010] Além disso, descreve-se um método anaeróbico variedade compreende para produzir ácidos carboxílicos com uma bacteriana mutante, em que inocular uma cultura com bacteriana mutante descrita anteriormente, cultivar a dita variedade bacteriana sob condições anaeróbicas, e isolar ácidos carboxílicos a partir dos meios. As variedades bacterianas podem ser cultivadas em um balde de vidro, um bio-reator, um bio-reator de carga de alimentação, ou um o dito método uma variedade
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5/27 bio-reator quimio-estatico carboxílicos. O ainda aumentado aeróbicas antes aeróbicas.
rendimento de cultivando-se da produção para se obterem ácidos acidos carboxílicos pode ser as células sob condições de succinato sob condições [0011] Adicionalmente, demonstra-se a modificação do fluxo glicolítico nas bactérias para distribuir ácido carboxílico através do caminho de OAAcitrato e OAA-malato. O fluxo glicolítico pode ser uma relação entre citrato 10-40% e entre malato 90-60%, com maior preferência cerca de 30% citrato e cerca de 70% malato. As variedades bacterianas descritas anteriormente dividem o fluxo glicolítico desta maneira.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS [0012] Os desenhos anexos que são incorporados e que constituem uma parte deste relatório exemplificam a invenção e em conjunto com a descrição, servem para explanar os princípios da invenção.
[0013] A Figura 1 Caminhos Metabólicos Anaeróbicos Planejados Geneticamente. Caminhos concorrentes NADH: lactato (LDH), etanol (ADH), e via do acetato (ACKPTA) . A abertura da derivação de glioxilato (combinação JCLR) e a sobre expressão de uma piruvato carboxilase heterólogo planejada a partir de L. lactis. A variedade ilustrada representa a
Consumo de Glicose e (PYC) geneticamente aqui variedade SBS 550MG.
[0014] A Figura
Concentração de produção.
[0015] A Figura 3 Rendimento de Produto.
[0016] A Figura
Rendimento de Succinato
Cumulativo.
[0017] A Figura 5 Produção de Carga de Alimentação com variedade SBS550MG (pHL413). Os símbolos cheios correspondem aos metabólitos medidos em uma primeira
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6/27 corrida e os símbolos abertos correspondem aos metabólitos medidos em uma corrida replicada. Glicose foi adicionada em pulsos quando a glicose caiu para cerca de 20 mM, conforme indicado pelas setas.
DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES DA INVENÇÃO [0018] Os ácidos carboxílicos descritos neste contexto podem ser um sal, ácido, base, ou derivado, na dependência da estrutura, pH, e íons presentes. Por exemplo, os termos succinato e “ácido succínico” são usados neste contexto de forma permutável. O ácido succínico também é chamado ácido butanodióico (C4H6O4. Os produtos químicos usados neste contexto incluem formato, glioxilato, lactato, malato, oxaloacetato (OAA), fosfoenolpiruvato (PEP), e piruvato. As vias metabólicas bacterianas que incluem o ciclo de Krebs (que também é chamado ácido cítrico, ácido tricarboxílico, ou ciclo TCA) podem ser encontrados em Principles of Biohemistry, por Lehninger, bem como em outros textos de bioquímica.
[0019] Da maneira que são utilizados neste contexto, os termos associados operacionalmente” ou vinculados operacionalmente” referem-se a sequências de ácidos nucléicos acoplados funcionalmente.
[0020] Atividade reduzida” ou inativação” é definida neste contexto como sendo pelo menos uma redução de 75% na atividade da proteína, em comparação com uma espécie de controle apropriada. Preferentemente, redução de pelo menos 80, 85, 90, 95% na atividade é alcançada, e na concretização de maior preferência, a atividade é eliminada (100%). As proteínas podem ser inativadas com inibidores, por mutação, ou por supressão de expressão ou translação, e assemelhados.
[0021] Sobre-expressão” e sobre-expressado” é definido neste contexto como sendo pelo menos 150% da atividade de proteína em comparação com uma espécie de
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7/27 controle apropriada. A sobre-expressão pode ser conseguida por mutação da proteína para produzir uma forma mais ativa ou uma forma que é resistente à inibição, por remoção de inibidores, ou adição de ativadores, e assemelhados. A sobre-expressão também pode ser conseguida pela remoção de repressores, adição de múltiplas cópias do gene à célula, ou sobre-regulagem do gene endógeno, e assemelhado.
[0022] Da maneira que são utilizados neste contexto, os termos disrupção e “variedades de disrupção”, referem-se a variedades de células em que o gene nativo ou promotor é alterado, suprimido, interrompido, ou desregulado de uma maneira tal a diminuir a atividade do gene. Um gene pode ser completamente (100%) reduzido por eliminação ou remoção de toda a sequência de DNA genômica. O uso de uma mutação de deslocamento de quadro, antecipação de códon de parada, mutações de pontos de resíduos de maior importância, ou supressões ou inserções, e assemelhadas, podem inativar completamente (100%) o produto de gene, ao impedir completamente a transcrição e/ou translado de proteína ativa.
[0023] Tal como utilizado neste contexto recombinante” refere-se a, deriva de, ou contém material planejado geneticamente.
[0024]
Os genes são abreviados como se segue isocitrato liase (aceA a.k.a. icl); malato sintase (aceB);
thy glioxilato shunt operon (aceBAK) ;
isocitrato desidrogenase quinase/fosforilase (aceK); acetato quinasefosfotransacetilase (ackA-pta); álcool desidrogenase (adhE); regulador de controle respiratório aeróbico A e B (arcAB); sensibilidade a peróxido (arg-lac) ; álcool acetiltransferases 1 e 2 (atfl e atf2); antiporter lisina / cadaverina putativa (cadR); citrato sintase (citZ); regulon de degradação de ácido graxo (fadR); fumarato reductase (frd); frutose regulon (fruR); fumarase A, B, ou C
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8/27 (fumABC) ; isocitrato desidrogenase (icd); isocitrato liase (icl); aceBAK operon repressor (iclR); lactato desidrogenase (ldhA); malato desidrogenase (mdh); fosfoenol piruvato carboxilase (pepC); piruvato formato liase (pfl) ; piruvato oxidase (poxB); genes de sistema de fosfotransferase F e G (ptsF e ptsG); piruvato carboxilase (pyc); guanosina 3',5'- bispirofosfato sintase I (relAl); proteína S12 de ribosomal (rpsL); e succinato desidrogenase (sdh). Alac(arg-lac)205(U169) é uma supressão cromossômica da região arg-lac que conduz um gene ou genes que sensibilizam células a H2O2 (51) . PYC pode ser derivado de várias espécies, Lactococcus lactis pyc é expressado como um exemplo (AF068759).
[0025] Abreviaturas: ampicilina (Ap);
oxacilina (Ox); carbenicilina (Cn) ; cloranfenicol (Cm);
canamicina (Km); estreptomicina (Sm) ; tetraciclina (Tc);
ácido nalidíxico (Nal); eritromicina (Em); resistência a
ampicilina (ApR); resistência a tianfenicol/cloranfenicol (ThiR/CmR); resistência a macrolida, lincosamida e estreptogramina A (MLSR) ; resistência a estreptomicina (SmR) ; resistência a canamicina (KmR); origen Gram-negativa de replicação (ColE1); e origem Gram-positiva de replicação (OriII). Enzimas de restrição comuns e locais de restrição podem ser encontrados em NEB® (NEW ENGLAND BIOLABS®, www.neb.com) e INITROGEN® (www.invitrogen.com). ATCC®,
TM
AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION “ (www.atcc.org).
[0026] Os plasmídios e variedades usados em algumas concretizações da invenção encontram-se expostos nas Tabelas 1 e 2. MG1655 é um mutante espontâneo F-À- deficiente em conjugação F e como reportada por Guyer, et al. (18). Supressões de caminho foram realizadas utilizando-se transdução de fage P1 e a inativação de uma etapa baseada em recombinase vermelha λ (10) . A construção de plasmídios e espécies de E. coli mutantes foram
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9/27 realizadas utilizando-se técnicas de bioquímica padrão referenciadas neste contexto e descritas em Sambrook (38) e Ausebel (5).
Tabela 1 Plasmídios
Plasmídio Genótipo Ref
pTrc99A Vetor de clonagem APR 1
pDHC29 Vetor de clonagem CmR 37
pDHK29 Vetor de clonagem KmR 37
pUC19 Vetor de clonagem ApR 60
pHL413 L. lactis pyc em pTrc99A, ApR 40
pCPYC1 L. lactics pyc CmR 54
pHL531 NADH insensitivo citZ em pDHK29, KmR 41
pLO12514 B subtilis citZ in pCR2.1-TOPO KmR/ApR 46
TABELA 2: VARIEDADES
Variedade Genótipo Ref ATCC#
GJT001 MC4100(ATC35695) cadR mutante 45
Alac(arg-lac)U169rpsL150relA1ptsF SmR 47076
MG 1655 Tipo silvestre (F-À-) 18 TM
MG1655 arcA AarcA::KmR 23
CD55K AldhA::KmR 11
YBS121 Aack-pta : : CmR 56
HL5K diclR::KmR 28
SBS100MG AadhE, KmR 41
SBS110MG AadhEAldhA, KmS 40
SBS330MG AadhEAldhAAiclR, KmS 41
SBS440MG AadhEAldhAAiclRAarcA, KmS 41
SBS990MGC AadhEAldhAAack-pta::CmR 41
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10/27
TABELA 2: VARIEDADES
Variedade Genótipo Ref ATCC#
SBS550MG AadhEAldhAAiclRAack-pta::CmR 41
SBS660MGC AadhEAldhAAiclRAarcAAack-pta::CmR 41
[0027] Para cada experiência as variedades foram recém transformadas com plasmídeo, quando apropriado. Uma única colônia foi distribuída em uma placa que continha antibióticos apropriados. Uma única colônia foi transferida em um balão de vidro de agitação de 250 ml que continha 50 ml de meio LB com antibióticos apropriados e desenvolvidos aerobiamente a 37°C com agitação a 250 rpm durante 12 horas. As células foram lavadas duas vezes com meio LB e inoculadas a 1% v/v em balões de vidro de agitação de 2 l que continham 400 ml cada um de meio LB com concentração de antibiótico apropriado e desenvolvido aerobiamente a 37°C com agitação a 250 rpm durante 12 horas. Biomassa de células apropriadas (~1,4 g CDW) foi colhida por centrifugação e o sobrenadante descartado. As células foram novamente colocadas em suspensão em 60 ml de meio LB anaeróbico (meio de caldo LB suplementado com 20 g/l de glicose, 1 g/l de NaHCO3) e inoculadas imediatamente no reator para uma concentração de aproximadamente 10 OD600.
[0028] Fermentações foram realizadas sob condições plenamente aeróbicas. Um bioreator de 2 L com um volume inicial de meio LB de 0,66 L com antibióticos apropriados. No tempo zero, o reator foi inoculado para um OD600 de aproximadamente 10 tal como descrito. As concentrações iniciais de glicose, antibióticos e densidade de células no reator descrito são as concentrações depois de se levar em consideração a diluição pelo inóculo, quando o inóculo é suficiente para alterar as concentrações da cultura. O pH foi mantido a 7,0 com 1,0 M de Na2CO3 e uma
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11/27 taxa de fluxo constante de 0,2 L/min foi aspergida através da cultura durante o período de fermentação. A temperatura e agitação foram mantidas a 37°C e 250 rpm, respectivamente. As amostras para determinação de concentrações de glicose e de produto foram retiradas do reator e filtradas através de um filtro de 0,2 pm e imediatamente analisadas por meio de HPLC.
EXEMPLO 1: REMOÇÃO DE CAMINHOS CONCORRENTES DE NADH [0029] Atividade de álcool desidrogenase (adhE) e lactato desidrogenase (ldhA) foi reduzida em SBS110MG para aplicar a perda de NADH à produção de álcool e lactato à custa de succinato (39) . SBS119MG (pTrc99A) consumiu 11% da glicose inicial com baixo rendimento de succinato e altos rendimentos de acetato
EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE PIRUVATO CARBOXILASE [0030] A expressão do heterólogo PYC a partir de Lactococcus lactis (plasmídeo pHL413) ajuda a aumentar o grupo OAA pela conversão direta de piruvato em OAA, que serve como um percurso do glioxilato e via de fermentação, os quais conduzem os dois à produção de ácido succínico conforme ilustrada na Figura 1. A variedade SBS990MG mostrou atividades de ICL e MS mais baixas do que SBS330MG (pHL413) e SES550MG (pHL413) como esperado devido a um iclR ativo, entretanto, os níveis de enzima pareceram ser suficientes para tocar o caminho do glioxilato.
[0031] A expressão heteróloga de PYC nas variedades de E. coli produtoras de succinato aumenta o fluxo a partir do piruvato para OAA. PYC desvia piruvato no sentido de OAA para favorecer a geração de succinato. SBS110MG acolhendo plasmídeo pHL413, que codifica a piruvato carboxilase heterólogo a partir de L. lactis, produziu 15,6 g/L (132 mM) de succinato a partir de 18,7 g/L (104 mM) de glicose depois de 24 horas de cultura em uma atmosfera de CO2 produzindo 1,3 mols de succinato por
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12/27 mol de glicose. Foi demonstrada assim a eficiência de aumentar-se OAA para se aumentar a produção de succinato.
EXEMPLO 3: ATIVAÇÃO DE DERIVAÇÃO DE GLIOXILATO [0032] A inativação de ICLR desvia acetil CoA no sentido da produção de ácido succínico pela ativação do operon acdBAK, diminuindo assim o fluxo de carbono através de acetato e continuando a reciclagem de acetil CoA. Na variedade SBS339MG (pHL413) ACK-PTA está ativo e portanto pouco fluxo de carbono é desviado para o glioxilato mesmo quando este caminho foi geneticamente ativado. A atividade da via do glioxilato é evidenciada pela atividade de enzima mais alta mostrada por esta variedade com relação ao controle de tipo silvestre (dados não ilustrados). As variedades com atividades de ICL e MS mais altas foram SBS330MG (pHL413) e SBS550MG (pHL413). Estas variedades mostraram mais do dobro da atividade da variedade do tipo silvestre. A variedade SBS330MG foi criada como uma variedade intermediária pela inativação do gene iclR no mutante adh, ldh, SBS110MG. Em um mutante de ldhA adhE, acetil-CoA 6 desviado no sentido da via de glioxilato, portanto, reduzindo a excreção de acetato. Mesmo quando a via de glioxilato foi ativada constitutivamente nesta variedade, acetil-CoA é encaminhado através da via do acetato.
[0033] Tal como pode ser observado na Figura 3, a variedade SBS330MG produziu 1,1 mol/mol de succinato por glicose, 0,66 mol/mol de formado por glicose, e 0,89 mol/mol de acetato por glicose. Muito embora SBS330MG (pHL413) tenha produzido succinato significativo, ele também produziu os mais altos níveis de formato e acetato.
EXEMPLO 4: REMOÇÃO DE CONTROLE RESPIRATÓRIO AERÓBICO [0034] A proteína ARCA pertence a família dos sistemas de transdução de sinal (ARCB-ARCA) de dois componentes, e em concerto com seu ARCB de quinase sensório
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13/27 cognato, representa um sistema de regulação global que controle negativamente ou positivamente a expressão de muitos operons, tais como: várias desidrogenases da classe de flavoproteínas, oxidases terminais, ciclo do ácido tricarboxílico, enzimas da derivação de glioxilato e enzimas da via para degradação de ácidos graxos. A variedade mutante SBS440MGC contém uma versão mutante de arcA, um gene que codifica uma proteína envolvida no controle de respiração aeróbica.
[0035] A supressão de arcA na variedade SBS440MGC produziu 1,02 mol/mol de succinato por glicose, 0,45 mol/mol de formato por glicose, e 0,75 mol/mol de acetato por glicose, tal como observado na Figura 3. A remoção de ARCA não afetou drasticamente o consumo de glicose (Figura 2), mas diminuiu levemente o rendimento de succinato global (Figura 3).
EXEMPLO 5: REDUÇÃO DA PRODUÇÃO DE ACETATO [0036] Na variedade SBS990MGC, acetato quinase com fosfotransacetilase (ackA-pta) foi reduzida em um fundo de álcool desidrogenase (adhE) e lactato desidrogenase (ldhA) para aumentar a produção de succinato e reduzir o consumo de NADH através da produção de etanol e lactato. A supressão dos genes ach e pta elimina a principal via de formação de acetato. Muito embora a variedade mutante SBS990MG contenha supressões de adhE, ldhA e ack-pta, a SBS990MG ainda tem um iclR intacto. ICLR ativo pode reduzir a expressão de ACEBAK, mas a atividade da enzima ACEA e ACEB residual pode ainda permitir atividade de derivação de glioxilato residual.
[0037] A disponibilidade de NADH aumentada na SBS990MG foi implementada para aumentar o rendimento de succinato a partir de glicose para 1,6 mol/mol sob condições anaeróbicas plenas (Figuras 2 e 3). A SBS990MG foi capaz de alcançar um alto rendimento de succinato.
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EXEMPLO 6: ROTEIRO DE SÍNTESE DE SUCCINATO DUPLO [0038] Um estudo de via com uma via de glioxilato ativado foi previamente desenvolvido e examinado in silico (9) e implementado in vivo mediante planejamento genético de E. coli (41) para aumentar o rendimento de succinato e aliviar a restrição de disponibilidade de NADH. A variedade SBS550MG (pHL413) foi construída de forma a possuir um roteiro de síntese de succinato duplo que desvia quantidades de NADH requeridas através da via de fermentação tradicional e eleva ao máximo o carbono convertido para succinato pelo equilibrio do fluxo de carbono através da via de fermentação e da via de glioxilato (que tem requisito de NADH mais baixo) (41) . A via reformada mostrou um requisito de NADH experimental a partir de glicose de ~1,25 mols de NADH por mol de succinato, em contraste com o requisito teórico de 2 mols de NADH por mol de succinato na variedade E. coli do tipo silvestre.
[0039] A inativação de ack-pta em um mutante IdhA adhE iclR provou ser a chave para encaminhar acetilCoA no sentido da via de glioxilato. A supressão da via de acetato ajudou a conservar as moléculas de carbono na forma de acetil-CoA que é desviado para a formação de glioxilato e succinato. Outra conversão do glioxilato para maleato para fumarato e finalmente para succinato também ajudou a reduzir o requisito de NADH. Este caminho apenas requer um mol de NADH para produzir dois mols de succinato a partir de 2 mols de acetil-CoA e 1 mol de OAA (41).
[0040] O desempenho de sobreexpressão de PYC da variedade SES550MG foi examinado e os resultados encontram-se ilustrados na Figura 2. Muito embora a variedade SES550MG com PYC possa se desenvolver razoavelmente bem sob condições anaeróbicas, usaram-se condições aeróbicas neste estudo para acumular biomassa
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15/27 mais rapidamente antes de submeter as células à fase de produção de succinato anaeróbico. A variedade SBS550MG com e sem pHL531 consumiu 100% da glicose, e as duas variedades produziram níveis de ácido succínico similares (160 mM) a partir de 100 mM de glicose. Um aumento no formato residual e diminuição nos níveis de acetato foi observado com a variedade portadora do plasmídeo pHL531 que provoca a sobreexpressão da citrato sintase insensível a NADH. Os níveis de acetato encontrados nas culturas de variedades baseadas em SBS550MG foram muito mais baixos do que os níveis de acetato encontrados nas culturas de SBS110MG (pHL413). Os rendimentos de succinato de SBS550MG (pHL413, pHL531) e SBS550MG (pHL413, pDHK29) foram muito semelhantes (cerca de 1,6 mol/mol de succinato por glicose.
[0041] O fato de que o alto rendimento de ácido succínico de 1,6 mol/mol permanece inalterado apesar da sobreexpressão da citrato sintase insensível a NADH também sugeriu que o sistema de citrato sintase nativo já é suficiente para tocar a via de glioxilato. Além disso, os resultados mostraram ainda que o sistema de produção de succinato de duplo roteiro é muito robusto; o sistema teve a capacidade de manipular perturbações significativas no modo OAA sem que ocorressem alterações significativas no rendimento. Aparentemente as células são capazes de conseguir uma divisão equilibrada entre a via de fermentação e a de glioxilato em termos de equivalentes redutores disponíveis e átomos de carbono para produção de ácido succínico eficientemente máxima.
[0042] As culturas das variedades baseadas em SBS660MG consumiram apenas 25-35% da glicose ao final de 24 horas. Tanto a variedade SBS660MG(pHL413, p-HL531) quanto a variedade SBS660MG(pHL413, pDHK29) produziram rendimentos de succinato semelhantes de aproximadamente 1,7 mol/mol. Estes valores de rendimento estão entre os mais altos de
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16/27 todas as variedades estudadas (Tabela 3). Nenhuma diferença significativa foi observada no rendimento de ácido succínico, acetato ou formato da variedade mutante transformada SBS660MG(pHL413, pHL531) em relação ao seu controle (Figura 3). A supressão de arcA aumentou a produção de succinato por mol de glicose, mas reduziu o consumo de glicose.
EXEMPLO 7: EXPRESSÃO DE CITRATO SINTASE [0043] A Figura 1 ilustra os vários metabólitos produzidos nas variedades mutantes de E. coli, SBS550MH, SBS660MGC e SBS990MGC transformados com o plasmídeo de codificação de piruvato carboxilase pHL413 e o plasmídeo de expressão de citrato sintase pHL531. O rendimento de acetato em SBS330MG (pHL413 aumentou com relação ao controle e SBS110MG (pHL413). Estes resultados sugerem que pode ocorrer alguma inibição de citrato sintase causada pelos níveis de NADH mais altos e favorecida pelos níveis de NAD+ mais baixos. É amplamente conhecido que NADH inibe a citrato sintase alostericamente (33, 34) e NAD+ é um fraco inibidor competitivo de aglutinação de NADH (13). A atividade de citrato sintase in vitro observada em SBS330MG (pHL413) foi a mais baixa de todas as variedades estudadas.
[0044] A variedade SBS550MG (pHL413 + pDHK29) foi usada como o controle, e SBS550MG (pHL413 + pHL531) coexpressam PYC heterólogo em citrato sintase. A variedade SBS550MG com e sem pHL531 consumiram 100% de glicose, e as duas variedades produziram níveis assemelhados de “ácido succínico (160 mM) a partir de 100 mM de glicose. Apesar do fato de que o caminho de acetato foi eliminado, baixas concentrações de acetato foram detectadas nas culturas ao final da fermentação. Um aumento no formato residual e diminuição nos níveis de acetato foram observados com a variedade que portava o plasmídeo pHL531 que sobreexpressa
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17/27 a sintase de citrato insensível de NADH.
TABELA 3: Rendimento de Ácido CarboxílicoA
Ácido
Variedade Formato Acetato succínico
SBS550MG (pHL413 + pDHK29) 1.59 ± 0.01 0.13 ± 0.03 0.08 ± 0.01
SBS550MG (pHL413 + pHL531) 1.61 ± 0.01 0.18 ± 0.04 0.06 ± 0.00
SBS660MG (pHL413 + pDHK29) 1.72 ± 0.13 0.11 ± 0.01 0.09 ± 0.00
SBS660MG (pHL413 + pHL531) 1.73 ± 0.18 0.10 ± 0.06 0.10 ± 0.03
SBS990MG (pHL413 + pDHK29) 1.50 ± 0.00 0.26 ± 0.03 0.09 ± 0.01
SBS990MG (pHL413 + pHL531) 1.58 ± 0.01 0.15 ± 0.01 0.06 ± 0.00
( ) mol de produto/mol de glicose durante uma face de produção anaeróbica de 24 horas [0045] A expressão da citrato sintase de NADH na variedade SBS660MG(pHL413, pHL531) aumentou o consumo de glicose, bem como os metabólitos produzidos em cerca de 40% quando comparados com a variedade de controle SBS660MG (pHL413, pDHK29). Tanto a variedade SBS660MG( pHL413, pHL531) quanto a variedade SBS660MG(pHL413, pDHK29) produziram rendimentos de succinato semelhantes de aproximadamente 1,7 mol/mol. Estes valores de rendimento estão entre os mais altos de todas as variedades estudadas (Tabela 3) . O nível de ácido succínico produzido pela variedade SES990MG (pHL413, pDHK29) foi muito semelhante àquele da variedade SBS550MG (pHL413, pDHK29).
[0046] Os resultados mostraram que o sistema de produção de succinato de duplo roteiro é muito robusto; o sistema foi capaz de manipular perturbações significativas no nó OAA sem alterações significativas no rendimento. As células planejadas são capazes de alcançar uma divisão equilibrada entre o caminho de fermentação e de glioxilato em termos de equivalentes de redução disponíveis e átomos de carbono para produção de ácido succínico eficientemente máxima. Estes resultados suportam ainda a
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18/27 hipótese de que pode haver um determinado grau de ativação do caminho de glioxilato quando adhE, IdhA e ack-pta são inativados.
EXEMPLO 8: ANÁLISE DE FLUXO DE NADH [0047] Fluxos medidos obtidos sob condições de cultivo de batelada foram usados para avaliar fluxos intracelulares e identificar relações de divisão de fluxo de ponto de ramificação críticos. A comparação de mudanças nas relações de divisão de fluxo de ponto de ramificação para o caminho de glioxilato e o caminho de fermentação no nó OAA como um resultado de diferentes mutações revelou a sensibilidade do rendimento de succinato a essas manipulações.
[0048] Uma matriz metabólica foi construída com base na lei de conservação de massa e na hipótese de estado pseudo-estável (PSSH) nos metabólitos intermediários intracelulares. A matriz estequiométrica obtida a partir do conjunto de equações lineares formuladas com base na rede metabólica ilustrada na Figura 1 deu uma matriz quadrada de dimensões 15 x 15 baseadas somente nos metabólitos medidos, equilíbrios de PSSH nos metabólitos intracelulares e equilíbrio de NADH. Para o equilíbrio de NADH, supôs-se que a produção de NADH e consumo devem ser iguais. A derivação do equilíbrio redox não leva em consideração qualquer carbono assimilado em biomassa. Supôs-se a biomassa (02) como sendo zero para todos os mutantes exceto o tipo silvestre e foi usada como uma medição que produziu um sistema superdeterminado onde a solução foi encontrada por ajuste dos mínimos quadrados. A representação matemática, matriz estequiométrica e equações de conversão efetiva referentes às varias espécies na rede estão representadas na Tabela 4: Reações Enzimáticas.
TABELA 4: REAÇÕS ENZIMÁTICAS
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Reação
Enzima(s)
Glicose + PEP « Glicose 6-P + Piruvato
Glicose: PTS enzimas; Enzima I, HPr, IIGlc,
IIIG
Glicose-6-P
Biomassa
Gliceraldeido 3-P
Glicose 6-P + ATP 4 + ADP
a. Glicose 6-P « Frutose 6-P
b. Frutose-6-P + ATP « Frutose 1,6-diP +
ADP
c. Frutose 1,6-diP « Diidroxiaccone-P + Gliceraldeido 3-P
d. Dihydroxyacetonc-P « Gliceraldeido 3-P
Gliceraldeido 3-P + NAD+ + Pi + 2ADP « Piruvato+ H2O NADH + H+ 2ATP
a. Gliceraldeido 3-P + NAD+ + Pi « Glicerato1,3-diP + NADH + H+
b. Glicerato 1,3-diP + ADP « Glicerato 3-P + ATP
c. Glicerato 3-P « Glicerato 2-P
d. Glicerato 2-P « PEP + H2O
e. PEP + ADP « Piruvato + ATP
Glicose-6-fosfato ismerase
Fosfofrutoquinase, PFK Frutose-diP aldolase
I. PEP + CO2
OAA + P.
II. Pyr + ATP + CO2 Pi oxaloacetato + ADP +
Piruvato +NADH « lactato + NAD+
Piruvato + HSCoA « Formato + Acetyl-CoA
Formato « CO2+ H2
Acetil-CoA + Pi + ADP « Acetato + HSCoA +
ATP
a. Acetil-CoA + Pi « Acetil-P + HSCoA
b. Acetil-P + ADP « Acetato + ATP
Triose-P isomerase
3-P Gliceraldeido deidrogenase
3-P glicerato quinase
P glicerato mutase Enolase
Piruvato quinase
PEP carboxilase
Piruvato carboxilase
Lacatato desidrogenase
Piruvato format liase
Formatato hidrogênio liase
Acetato fosfotransferase, PTA
Acetato quinase, ACK; ou hidrólise química
Acetil-CoA + 2 NADH + 2 H+ « Etanol + HSCoA
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0+2 NAD+
a. Acetil-CoA + NADH+ θ Acetaldeído + HSCoA + NAD+
b. Acetaldeído + NADH +H+ θ Etanol + NAD+
2 acetil-CoA + H2O + oxaloAcetato θ Malato 1 + Succinato HSCoA + CoA
a. acetil-CoA + H2O + oxaloAcetato θ citrato + CoA
b. citrato θ isocitrato
c. Isocitrato θ glioxalato + succinato
d. gliosalato + acetilCoA θ Malato + HSCoA oxaloacetato + NADH θ Fumarato + NAD+ + H2O
a. oxaloacetato + NADH θ Malato + NAD+ b. malato θ fumarato + H2O
Fumarato + NADH + P2 + ADP θ Succinato +
NAD+ + ATP
Aldeído desidrogenase
Álcool desidrogenase
Citrato sintase
Acinitato hidratase
Isocitrato liase
Malato sintase
Malato desidrogenase Fumarase C
Fumarato reductase [0049] Vetor r(t) (m x 1) r onde m = 15, 16 ou 17) indica as taxas de conversão efetiva para os vários metabólitos:
RT = [rx ...... r8 00000000 0] [0050] Para MG1655 (pHL413), os equilíbrios para H2 e biomassa foram excluídos, portanto a matriz A foi reduzida para uma matriz quadrada de 15 X 15. A solução exata foi obtida pela equação 1:
V(t) = A'1 r(t) [0051] Para as variedades mutantes SBS110MG (pHL413), SBS330MG (pHL413), SBS550MG (pHL413) e SBS990MG (pHL413) a exclusão do equilíbrio de H2 e a inclusão de biomassa deu como um resultado um sistema super determinado (m=16 e n=15) que foi solucionado utilizando-se a abordagem de ajuste dos mínimos quadrados e foi avaliado de acordo com a seguinte equação 2:
O(t) = (ATA)’1 AT r(t) (2)
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21/27 [0052] A avaliação das concentrações variáveis de tempo dos metabólitos excretados foi determinada entre t=Oh e t=6h ou 7h e com base na densidade de células médias como se segue (4):
qO + ÃQ-CXt) õtxX
Onde,
- x(t+st)~xp) ln
X(t+5t) (3) (4)
X<t) [0053]
Constatou-se que rendimento de succinato é relativamente mais sensitivo à relação de divisão no nó OAA do que no nó PEP/PYR. A relação de divisão mais favorável para se obter o rendimento de succinato mais elevado foi a divisão de fração de OAA para glioxilato de 0,32 e 0,68 para a via de fermentação obtida nas variedades SBS550MG (pHL413) e SBS990MG (pHL413). Os rendimentos de succinato alcançados nestas duas variedades foram 1,6 mol/mol e 1,7 mol/mol, respectivamente. Foi demonstrado que uma via de glioxilato ativo em uma variedade mutante ldhA, adhE, ack-pta é responsável pelos altos rendimentos de succinato alcançados anacrobicamente. Altos níveis intracelulares de NADH e acetil-CoA comparados com o tipo silvestre foram encontrados em SBS550MG (pHL413) e SBS990MG (pHL413) no início da fermentação anaeróbica, mas estes níveis caíram rapidamente sugerindo que estas variedades são capazes de manipular altos fluxos glicolíticos apesar da inativação de enzimas a jusante do ponto de ramificação PEP/PYR.
[0054] Os fluxos glicolíticos (Ui até υ4) da variedade SBS550MG (pHL413) aumentaram com relação a SBS330MG (pHL413), mas diminuíram com relação à variedade de controle do tipo silvestre. O fluxo (υ?) de PFL também
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22/27 diminuiu com relação à variedade de controle do tipo silvestre ocasionado uma redução principal no fluxo de acetato e formato. Estes fluxos glicolíticos demonstraram que alto rendimento de succinato é dependente da divisão da produção de ácido carboxílico entre OAA-citrato e OAAmalato. A divisão de fluxo equilibra o consumo de NADH e conduz à produção de succinato aumentada. A divisão em variedades de alta produção de succinato varia entre 10-40% de citrato derivado de succinato e 90-60%- de malato derivado da produção de succionato (vide Figura 1).
TABELA 5: FLUXOSMETABÓLICOS
Fluxo Para: MG1655 (pHL413) SBS110MG (pHL413) SBS330MG (pHL413) SBS550MG (pHL413) SBS990MG (pHL413)
υ1 Apreensão de Glicose* 3,46 2,78 1,28 2,13 1,96
υ2 Biomassa 0,07 0,00 0,00 0,00 0,00
υ3 G-3-P 3,38 2,83 1,37 2,16 2,08
υ4 PEP + Piruvato 6,77 5,66 2,77 4,32 4,19
υ5 OAA 2,90 2,94 1,31 2,57 2,53
υ6 Lactato* 0,00 0,00 0,21 0,00 0,00
υ7 Formato Intracelular 3,87 2,74 1,27 1,76 1,72
υ8 H2 0,42 0,27 0,00 0,77 0,63
υ9 Acetato* 2,58 2,35 1,22 0,14 0,12
υ10 Etanol* 0,65 0,00 0,00 0,00 0,00
υ11 Glioxilato Succinato 0,32 0,21 0,05 0,82 0,83
υ12 Malato 2,58 2,74 1,28 1,76 1,72
υ13 Succinato Intracelular 2,90 2,97 1,35 2,58 2,58
uRF Formato Residual* 3,45 2,47 1,62 0,99 1,09
uES Succinato Excretado* 3,22 3,19 1,43 3,41 3,44
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CO2 -2,48 -2,67 -1,31 -1,80 -1,90
Rendimento de 0,93 1,15 1,12 1,60 1,75
Succinato
(NADH)u/G1 1,96 2,04 2,17 2,03 2,14
(NADH)3/Succinato 1,70 1,79 1,83 1,27 1,25
EXEMPLO 9: FERMENTAÇÃO ANAERÓBICA BATELADA ALIMENTADA [0055] Um bioreator gera produtividade mais alta devido a um ambiente mais controlado. Uma experiência em batelada foi realizada em duplicata para examinar a eficiência da SBS550(pHL314) na produção de succinato sob condições controladas (Figura 5). Nesta experiência o bioreator foi inicialmente carregado com LB e suplementado com 86 mM de glicose. No tempo zero, o reator foi inoculado para um OD de 17. Glicose foi adicionada em pulsos quando a glicose caiu para cerca de 20 mM conforme indicado pelas setas. Diferenças na concentração de glicose inicial e no tempo de adição de glicose entre as corridas não afetaram o desempenho da variedade.
[0056] Tal como observado na Figura 5, a variedade é muito eficiente na produção de ácido succínico. A produção de ácido succínico varia entre 12 a 9 mM de succinato com um rendimento muito eficiente de 1,6 mol/mol. O sistema apenas produziu quantidades diminutas de outros metabólitos, tais como formato e acetato como subprodutos. Espera-se igualmente que o sistema possa ser ainda otimizado para aperfeiçoar o rendimento de succinato para 1,8, 1,9 ou 2,0 mol/mol, ou ainda mais elevado.
[0057] Todas as referências citadas neste contexto estão expressamente incorporadas por referência. As referências encontram-se aqui listadas novamente por conveniência:
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1/1

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Variedade bacteriana de E. coli modificada, caracterizada por a dita bactéria compreender:
    a) um rompimento de lactato desidrogenase (ldhA);
    b) um rompimento de álcool desidrogenase (adhE);
    e
    c) um rompimento de acetato quinase - acetil fosfotransferase (ack-pta).
  2. 2. Variedade bacteriana de E. coli modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita bactéria compreender um rompimento de iclR (aceBAK operon repressor) .
  3. 3. Variedade bacteriana de E. coli modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita bactéria compreender um gene piruvato carboxilase (pyc) ligado operacionalmente a uma construção de expressão.
  4. 4. Variedade bacteriana de E. coli modificada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o dito piruvato carboxilase (pyc) ser derivado de Lactobacillus lactis.
  5. 5. Variedade bacteriana de E. coli modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita bactéria compreender um gene citrato sintase (citZ) ligado operacionalmente a uma construção de expressão.
  6. 6. Variedade bacteriana de E. coli modificada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o dito 25 citrato sintase (citZ) ser derivado de Bacillus subtilis.
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