KR101245428B1 - 숙신산 생산이 증가된 돌연변이 대장균 균주 - Google Patents

숙신산 생산이 증가된 돌연변이 대장균 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여러 핵심적인 물질대사 효소에 대한 유전자가 부재하거나 이들 효소에 대한 돌연변이 유전자를 보유하고, 혐기성 조건 하에 다량의 숙신산을 생산하는 돌연변이 세균 균주에 관계한다.
돌연변이 세균 균주

Description

숙신산 생산이 증가된 돌연변이 대장균 균주{MUTANT E. COLI STRAIN WITH INCREASED SUCCINIC ACID PRODUCTION}
본 발명은 물질대사가 조작된 미생물에서 숙신산, 말산, 푸마르산 및 다른 카르복실산을 생산하는 방법에 관계한다.
특히 귀중한 화학물질인 숙신산염과 이의 유도체는 산업 분야에서 폭넓게 사용되고 있다. 숙신산은 도금(plating)과 폐가스 제거(waste-gas scrubbing)에서 뿐만 아니라 식품, 약품, 플라스틱, 화장품, 직물의 원료로서 사용된다(61). 숙신산은 1,4-부탄디올(BDO), 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran), 감마-부티로락톤(gamma-butyrolactone)과 같은 플라스틱 전구체용 공급재료(feedstock)로서 기능할 수 있다. 더 나아가, 숙신산과 BDO는 폴리에스테르용 단량체로서 사용될 수 있다. 숙신산염의 가격이 인하될 수 있다면, 이는 다른 원료 화학물질(bulk chemical)을 생산하기 위한 중간 공급재료로서 더욱 유용할 것이다(47). 숙신산과 함께, 다른 4-탄소 디카르복실산, 예를 들면, 말산과 푸마르산 역시 공급재료로서 유망하다.
글루코오스, 자일로오스, 소르비톨 및 다른 “녹색” 재생가능 공급재료(이 경우에, 발효 처리를 통하여)로부터 숙신산염, 능금산염, 푸마르산염의 생산은 재 생불가능 원료로부터 이들 산을 유도하는 더욱 많은 에너지 집중 방법의 대체 수단이다. 숙신산염은 프로피온산염-생산 세균의 혐기성 발효 동안 생성되는 중간물질이긴 하지만, 이들 처리는 수율과 농도가 낮다. 산의 혼합물이 대장균(E. coli) 발효로부터 생산된다는 것은 오래전부터 알려져 왔다. 하지만, 발효된 글루코오스 1 몰당 단지 1.2 몰의 포름산, 0.1-0.2 몰의 유산, 0.3-0.4 몰의 숙신산이 생산된다. 이런 이유로, 발효 방식으로 카르복실산을 생산하려는 시도에서, 글루코오스와 같은 성장 기질(growth substrate)의 상당량이 원하는 산물로 전환되지 않았다.
숙신산염 수율과 생산력을 증가시키기 위하여, 대장균(E. coli)의 혐기성 중심 물질대사 경로를 조작하려는 다양한 시도가 있어왔다(7, 8, 12, 14, 15, 20, 24, 32, 44, 48). 생산 조건의 최적화와 함께 유전자 조작 역시 숙신산염 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 실례는 초기 호기성 성장 단계와 이후의 혐기성 성장 단계를 포함하는 이원 단계 발효 생산 방식을 이용하고 및/또는 이산화탄소, 수소 또는 이들 가스의 혼합물을 이용하여 혐기성 발효의 상부 공간(headspace) 조건을 변화시켜, 숙신산염-생산 돌연변이 대장균(E. coli) 균주를 생산하는 것이다(35, 49).
구체적으로, 특정 경로의 증폭, 부가 또는 결실을 통한 효소 수준의 조작은 원하는 산물의 높은 수율을 유도할 수 있다. 대장균(E. coli)의 혼성-산 발효 경로를 이용하는, 혐기성 조건 하에 숙신산 생산을 위한 다양한 유전적 개선이 보고되었다. 한가지 실례는 대장균(E. coli)으로부터 포스포에놀피루빈산염 카르복실라아제(pepC)의 과다발현이다(34). 다른 실례에서, 푸마르산염의 숙신산염으로의 전환 이 대장균(E. coli)에서 고유 푸마르산염 환원효소(frd)를 과다발현함으로써 개선되었다(17, 53). 특정 효소는 대장균(E. coli)에서 고유하지 않지만, 숙신산염 생산을 증가시키는데 잠재적으로 도움이 될 수 있다. 리조비움 에틸(Rhizobium etli)로부터 유래된 피루빈산염 카르복실라아제(pyc)를 대장균(E. coli) 내로 도입함으로써, 숙신산염 생산이 강화되었다(14, 15, 16). 다른 물질대사 조작 전략에는 숙신산염의 경쟁 경로를 불활성화시키는 것이 포함된다. 말산 효소(malic enzyme)가 피루빈산염 포름산염 리아제(pfl)와 유산염 탈수소효소(Idh) 유전자가 불활성화된 숙주에서 과다발현되는 경우에, 숙신산염이 주요 발현 산물이었다(44, 20). 동일한 돌연변이 균주(pfl-과 Idh-)에서 불활성 글루코오스 인산전이효소 시스템(ptsG) 역시 대장균(E. coli)에서 더욱 높은 숙신산염 생산을 유도하고 성장을 개선하는 것으로 밝혀졌다(8).
혐기성 조건 하에 글루코오스로부터 숙신산염의 최대 이론적 수율(몰 기준)은 모든 탄소 플럭스(carbon flux)가 고유 숙신산염 발효 경로를 통과한다고 가정하는 경우에, 1 mol/mol로 제한된다(도 1). 이러한 발효 경로는 옥살로아세트산염(OAA)을 능금산염, 푸마르산염, 숙신산염으로 전환시키는데, 상기 경로는 생산된 숙신산염 1 몰당 2 몰의 NADH를 요한다. 이 발효 경로를 통한 높은 숙신산염 수율에 한가지 주요 장애물은 NADH 제한에 기인한다. 이는 1 몰의 글루코오스가 단백분해 경로를 통하여 단지 2 몰의 NADH를 생성하기 때문이다; 하지만, 고유 발효 경로를 통한 1 몰의 숙신산염의 형성은 2 몰의 NADH를 요한다. 숙신산염의 혐기성 생산 역시 느린 세포 성장과 생산의 제한에 의해 저해된다.
물질대사 조작은 물질대사 경로의 처리량(throughput)을 조작함으로써 처리 생산성(process productivity)을 현저하게 개선하는데 유망하다. 구체적으로, 특정 경로의 증폭, 부가 또는 결실을 통한 효소 수준의 조작은 원하는 산물의 높은 수율을 유도할 수 있다. 따라서, 더욱 높은 수준으로 숙신산염과 다른 카르복실산을 생산하는 개선된 세균 균주가 당분야에 필요하다.
본 발명의 요약
혐기성 조건 하에 카르복실산 생산을 개선하기 위하여 2가지 이상의 경로가 불활성화된 세균이 기술되는데, 여기서 생산되는 카르복실산은 숙신산염, 푸마르산염, 능금산염, 옥살로아세트산염, 또는 글리옥실산염(glyoxylate)이다. 본 발명의 한 구체예에서, 단백질 ADHE, LDHA, ACKA, PTA, ICLR, ARCA가 불활성화된다. 본 발명의 다른 구체예에서, ADHE, LDHA, ACKA, PTA, ICLR, ARCA를 비롯한 단백질의 다양한 조합이 불활성화된다. 또한, 이들 단백질의 불활성화는 숙신산염 수율을 더욱 증가시키기 위하여, ACEA, ACEB, ACEK, PEPC, PYC, 또는 CITZ의 과다발현과 결합될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, adhE, IdhA, iclR, arcA, ack-pta 유전자가 파괴된 파괴 균주(disruption strain)가 생성된다. 본 발명의 다른 구체예에서, adhE, IdhA, iclR, arcA, ack-pta 유전자의 다양한 조합이 파괴된다. 본 발명의 일부 구체예에서, SBS330MG, SBS440MG, SBS550MG, SBS660MG, SBS99OMG로 명명된 돌연변이 균주가 제시된다.
더 나아가, 돌연변이 세균 균주로 카르복실산을 생산하는 혐기성 방법이 기 술되는데, 상기 방법은 앞서 기술된 돌연변이 세균 균주로 배양액을 접종하고, 혐기성 조건 하에 상기 세균 균주를 배양하고, 배지로부터 카르복실산을 분리하는 단계를 포함한다. 세균 균주는 카르복실산을 수득하기 위하여 플라스크, 생물반응기, 유가식(fed batch) 생물반응기, 또는 키모스탯(chemostat) 생물반응기에서 배양될 수 있다. 카르복실산 수율은 혐기성 조건 하에 숙신산염 생산에 앞서, 호기성 조건 하에 이들 세포를 배양함으로써 더욱 증가될 수 있다.
부가적으로, 세균 내에서 당분해 플럭스(glycolytic flux)를 변형하여 카르복실산을 OAA-시트르산염과 OAA-능금산염 경로를 통하여 분할하는 과정이 예시된다. 당분해 플럭스는 10-40% 시트르산염과 90-60% 능금산염, 더욱 바람직하게는 대략 30% 시트르산염과 대략 70% 능금산염의 비율일 수 있다. 앞서 기술된 세균 균주는 당분해 플럭스를 이러한 방식으로 분할한다.
본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명을 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1: 유전자 조작된 혐기성 물질대사 경로. NADH 경쟁 경로: 유산염(LDH), 에탄올(ADH), 아세트산염 경로(ACK-PTA). 글리옥실산염 우회(glyoxylate bypass)(ICLR 적중)의 개시 및 락토코커스 락티스(L. lactis)로부터 이질성 피루빈산염 카르복실라아제(PYC)의 과다발현. 여기에 도시된 유전자 조작된 균주는 균주 SBS550MG이다.
도 2: 글루코오스 소비와 생산 농도.
도 3: 생산 수율.
도 4: 누적 숙신산염 수율.
도 5: 균주 SBS55OMG(pHL413)으로 유가식 생산. 닫힌 기호는 첫 번째 작업(run)에서 측정된 대사물질에 상응하고, 열린 기호는 반복 작업에서 측정된 대사물질에 상응한다. 글루코오스가 화살표로 표시된 바와 같이 대략 20mM로 떨어지면, 글루코오스를 적용량(pulse)으로 첨가하였다.
본 발명에 기술된 카르복실산은 구조, pH, 존재하는 이온에 따라 염, 산, 염기 또는 유도체일 수 있다. 가령, “숙신산염”과 “숙신산”은 본 발명에서 동일한 의미로 이용된다. 숙신산은 또한, 부탄이산(butanedioic acid)(C4H604)으로 불린다. 본 발명에 사용된 화학물질은 포름산염, 글리옥실산염, 유산염, 능금산염, 옥살로아세트산염(OAA), 포스포에놀피루빈산염(PEP), 피루빈산염 등이다. 크랩스 회로(Krebs cycle)(일명, 시트르산, 트리카르복실산, 또는 TCA 회로)를 비롯한 세균 물질대사 경로는 Principles of Biochemistry,, Lehninger 및 다른 생화학 교과서에 확인할 수 있다.
본 발명에서 “작동가능하게 연결된”은 가능적으로 결합된 핵산 서열을 의미한다.
“감소된 활성” 또는 “불활성화”는 적절한 대조 종과 비교하여 단백질 활성에서 적어도 75% 감소로서 정의된다. 적절하게는, 활성에서 적어도 80, 85, 90, 95% 감소가 달성되고, 가장 바람직한 구체예에서, 활성의 완전한 제거(100%)가 달성된다. 단백질은 저해물질로, 돌연변이에 의해, 또는 발현이나 번역의 억제에 의해 불활성화될 수 있다.
본 발명에서 “과다발현” 또는 “과다발현된”은 적절한 대조 종과 비교하여 단백질 활성의 적어도 150%로서 정의된다. 과다발현은 더욱 높은 활성 형태 또는 저해에 저항하는 형태를 생산하도록 단백질을 돌연변이시킴으로써, 저해물질을 제거함으로써, 또는 활성인자(activator) 등을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 과다발현은 또한, 억제체(repressor)를 제거함으로써, 유전자의 복수 사본을 세포에 부가함으로써, 또는 내인성 유전자 등을 상향 조절함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에서 “파괴”와 “파괴 균주”는 유전자의 활성이 감소되는 방식으로 고유 유전자 또는 프로모터가 돌연변이되거나, 결실되거나, 단절되거나, 또는 하향 조절되는 세포 균주를 의미한다. 유전자는 전체 게놈 DNA 서열의 적중이나 제거에 의해 완전히(100%) 제거될 수 있다. 핵심 잔기의 구조 이동 돌연변이(frame shift mutation), 조기 종결 코돈(early stop codon), 점 돌연변이(point mutation)의 이용, 또는 결실이나 삽입 등은 활성 단백질의 전사 및/또는 번역을 완전히 차단함으로써 유전자 산물을 완전히(100%) 불활성화시킬 수 있다.
본 발명에서 “재조합”은 유전자 조작된 물질에 관련되거나, 이로부터 유래되거나, 또는 이를 포함하는 것을 의미한다.
유전자는 아래와 같이 약어로서 표기된다: 이소시트르산염 리아제(aceA a.k.a. icl); 능금산염 신타아제(aceB); thy 글리옥실산염 분로(shunt) 오페론(aceBAK); 이소시트르산염 탈수소효소 키나아제/포스포릴라아제(aceK); 아세트산염 키나아제-포스포트랜스아세틸라아제(ackA-pta); 알코올 탈수소효소(adhE); 호기성 호흡 제어 조절인자 A와 B(arcAB); 과산화물 감수성(arg-lac); 알코올 아세틸트랜스퍼라아제 1과 2(atf1과 atf2); 추정 카다베린/리신 안티포터(cadR); 시트르산염 신타아제(citZ); 지방산 분해 레굴론(fadR); 푸마르산염 환원효소(frd); 과당 레굴론(fruR); 푸마라아제 A, B 또는 C(fumABC); 이소시트르산염 탈수소효소(icd); 이소시트르산염 리아제(icl); aceBAK 오페론 억제체(iclR); 유산염 탈수소효소(IdhA); 능금산염 탈수소효소(mdh); 포스포에놀 피루빈산염 카르복실라아제(pepC); 피루빈산염 포름산염 리아제(pfl); 피루빈산염 산화효소(poxB); 인산전이효소 시스템 유전자 F와 G(ptsF와 ptsG); 피루빈산염 카르복실라아제(pyc); 구아노신 3',5'-비스피로포스페이트 합성효소 I(relAl); 리보좀 단백질 S12(rpsL); 숙신산염 탈수소효소(sdh). △lac(arg-lac)205(U169)는 세포를 H2O2에 감작화시키는 유전자를 보유하는 arg-lac 영역의 크로모좀 결실체이다(51). PYC는 다양한 종으로부터 유래될 수 있는데, 예로써 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) pyc로부터 발현된다(AF068759).
약어: 암피실린(ampicillin)(Ap); 옥사실린(oxacillin)(Ox); 카르베니실린(carbenicillin)(Cn); 클로람페니콜(chloramphenicol)(Cm); 카나마이신(kanamycin)(Km); 스트렙토마이신(streptomycin)(Sm); 테트라사이클린(tetracycline)(Tc); 날리딕스산(nalidixic acid)(Nal); 에리트로마이신(erythromycin)(Em); 암피실린 내성(ApR); 티암페니콜/클로람페니콜(thiamphenicol/chloramphenicol) 내성(ThiR/CmR); 마크로리드(macrolide), 린코사마이드(lincosamide), 스트렙토그라민(streptogramin) A 내성(MLSR); 스트렙토마이신 내성(SmR); 카나마이신 내성(KmR); 그람-음성 복제 기점(origin of replication)(ColE1); 그람-양성 복제 기점(OriII). 통상의 제한 효소와 제한 부위는 NEB(NEW ENGLAND BIOLABS, www.neb.com), INVITROGEN(www.invitrogen.com), ATCC(AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION)(www.atcc.org)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에 이용되는 플라스미드와 균주는 표 1과 2에서 제시된다. MG1655는 F 접합이 결함된 F-λ- 자발적 변이체이며, Guyer, et al. (18)에 의해 보고되었다. 경로 결실(pathway deletion)은 P1 파지 형질도입(transduction) 및 λ 레드 재조합효소에 기초한 1-단계 불활성화를 이용하여 수행하였다(10). 플라스미드와 돌연변이 대장균(E. coli) 균주의 작제는 본 명세서 및 Sambrook(38)와 Ausebel(5)에 인용된 표준 생화학 기술을 이용하여 수행하였다.
플라스미드
플라스미드 유전형 Ref
pTrc99A 클로닝 벡터 ApR 1
pDHC29 클로닝 벡터 CmR 37
pDHK29 클로닝 벡터 KmR 37
pUC19 클로닝 벡터 ApR 60
pHL413 pTrc99A, ApR 내에서 락토코커스 락티스(L. lactis) pyc 40
pCPYC1 락토코커스 락티스(L. lactis) pyc CmR 54
pHL531 pDHK29, KmR 내에서 NADH 무감성 citZ 41
pLOI2514 pCR2.1-TOPO KmR/ApR 내에서 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) citZ 46
균주
균주 유전형 Ref ATCC#
GJT001 MC4100(ATC35695) cadR 변이체
△lac(arg-lac)U169rpsL150relA1ptsF SmR 		45
MG1655 야생형(F-λ-) 18 47076TM
MG1655 arcA △arcA::KmR 23
CD55K △ldhA::KmR 11
YBS121 △ack-pta::CmR 56
HL5K △iclR::KmR 28
SBS100MG △adhE△, KmR 41
SBS110MG △adhE△ldhA, KmS 40
SBS330MG △adhE△ldhA△iclR, KmS 41
SBS440MG △adhE△ldhA△iclR△arcA, KmS 41
SBS990MGC △adhE△ldhA△ack-pta::CmR 41
SBS550MG △adhE△ldhA△iclR△ack-pta::CmR 41
SBS660MGC △adhE△ldhA△iclR△arcA△ack-pta::CmR 41
각 실험을 위하여, 이들 균주는 적절한 플라스미드로 새로이 형질전환시켰다. 단일 콜로니는 적절한 항생제를 포함하는 평판 상에 재도말(restreaking)하였다. 단일 콜로니는 적절한 항생제를 보유하는 50 ㎖의 LB 배지를 포함하는 250 ㎖ 교반 플라스크로 이전하고, 250 rpm에서 12시간동안 교반하면서 37℃에서 호기성 배양하였다. 세포는 LB 배지로 2회 세척하고 적절한 항생제 농도를 갖는 400 ㎖의 각 LB 배지를 포함하는 2ℓ 교반 플라스크 내로 1% v/v 접종하고, 250 rpm에서 12시간동안 교반하면서 37℃에서 호기성 배양하였다. 원심분리로 적당한 세포 바이오매스(cell biomass)(~1.4 gCDW)를 수집하고 상층액을 버렸다. 이들 세포는 60 ㎖의 혐기성 LB 배지(20 g/ℓ의 글루코오스, 1 g/ℓ의 NaHCO3으로 보충된 LB 액체 배지)에 재현탁시키고, 대략 10 OD600의 농도로 반응기에 즉시 접종하였다.
발효는 완전 혐기성 조건하에, 적절한 항생제와 함께 0.66 ℓ의 LB 배지의 최초 부피를 갖는 1ℓ 생물반응기에서 수행하였다. 0시에, 반응기는 앞서 기술된 바와 같이, 대략 10의 OD600으로 접종하였다. 앞서 기술된 반응기에서 글루코오스, 항생제, 세포 밀도의 최초 농도는 접종물이 배양 농도를 변화시킬 만큼 충분한 시점에서 상기 접종물에 의한 희석을 고려한 농도이다. 발효 기간 동안, 1.0 M Na2CO3으로 pH를 7.0에 유지시키고, 0.2 ℓ/min의 일정한 유속으로 CO2를 배양액 전체에 살포하였다. 온도와 교반 속도는 각각, 37℃와 250 rpm로 유지되었다. 글루코오스와 산물 농도의 결정을 위하여 샘플을 반응기로부터 채취하고, 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과하고, HPLC로 즉시 분석하였다.
실시예 1: NADH 경쟁 경로의 제거
숙신산염을 소모하는 알코올과 유산염의 생산에서 NADH의 손실을 해결하기 위하여 SBS110MG에서 알코올 탈수소효소(adhE)와 유산염 탈수소효소(IdhA) 활성을 감소시켰다(39). SBS110MG(pTrc99A)는 낮은 숙신산염 수율과 높은 아세트산염 수율로 11%의 최초 글루코오스를 소비하였다.
실시예 2: 피루빈산염 카르복실라아제의 발현
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 이질성 PYC(플라스미드 pHL413)의 발현은 피루빈산염의 OAA로의 직접적인 전환에 의해 OAA 풀을 증가시키는데 도움을 주는데, OAA는 글리옥실산염 경로와 발효 경로의 전구체로서 기능하고, 이들 두 경로 모두 도 1에 도시된 바와 같이 숙신산 생산을 유도한다. 균주 SBS99OMG는 활성 iclR로 인하여 예상되는 바와 같이, SBS330MG(pHL413)와 SBS550MG(pHL413)보다 낮은 ICL과 MS 활성을 보이지만, 기초 효소 수준은 글리옥실산염 경로를 유도할 만큼 충분한 것으로 보인다.
숙신산염 생산 대장균(E. coli) 균주에서 PYC의 이질성 발현은 피루빈산염에서 OAA로의 플럭스를 증가시킨다. PYC는 숙신산염 생성에 유리하도록 피루빈산염을 OAA로 지향시킨다. 락토코커스 락티스(L. lactis)로부터 이질성 피루빈산염 카르복실라아제를 인코딩하는 플라스미드 pHL413을 보유하는 SBS110MG는 CO2 대기에서 24시간 배양이후 18.7 g/ℓ(104 mM)의 글루코오스로부터 15.6 g/ℓ(132 mM)의 숙신산염을 생산하여, 글루코오스 1 몰당 1.3 몰의 숙신산염을 산출하였다. 숙신산염 생 산을 증가시키기 위하여 OAA를 증가시키는 과정의 유효성이 입증되었다.
실시예 3: 글리옥실산염 분로의 활성화
ICLR의 불활성화는 aceBAK 오페론의 활성화에 의해 아세틸 CoA를 숙신산 생산의 방향으로 지향시켜 아세트산염을 통한 탄소 플럭스를 감소시키고 아세틸 CoA의 재순환을 지속시킨다. 균주 SBS330MG(pHL413) 내에서는 ACK-PTA가 활성화되기 때문에, 이러한 경로가 유전적으로 활성화되는 경우에도 탄소 유동은 글리옥실산염으로 거의 지향되지 않는다. 글리옥실산염 경로의 활성은 야생형 대조에 비하여 상기 균주에서 나타나는 더욱 높은 효소 활성에 의해 입증된다(데이터 제시되지 않음). 더욱 높은 ICL과 MS 활성을 갖는 균주는 SBS330MG(pHL413)와 SBS550MG(pHL413)이었다. 이들 균주는 야생형 균주에 비하여 2배 이상의 활성을 보였다. 균주 SBS330MG는 adh, Idh 변이체, SBS11OMG에서 iclR 유전자를 불활성화시킨 중간 균주로서 생성되었다. IdhA adhE 변이체에서, 아세틸-CoA는 글리옥실산염 경로로 지향되고, 따라서 아세트산염 배출을 감소시킨다. 상기 균주에서 글리옥실산염 경로가 본질적으로 활성화되는 경우에도, 아세틸-CoA는 아세트산염 경로를 향한다.
도 3에 도시된 바와 같이, SBS330MG 균주는 글루코오스 1 몰당 1.1 몰의 숙신산염, 글루코오스 1 몰당 0.66 몰의 포름산염, 글루코오스 1 몰당 0.89 몰의 아세트산염을 생산하였다. SBS330MG(pHL413)은 상당량의 숙신산염을 생산할 뿐만 아니라 최대 수준의 포름산염과 아세트산염 역시 생산하였다.
실시예 4: 호기성 호흡 제어의 제거
ARCA 단백질은 2-구획(ARCB-ARCA) 신호-전달 체계 집단에 속하고, 동족 감각 키나아제(sensory kinase) ARCB와 공조하여, 황색 단백질(flavoprotein) 부류의 여러 탈수소효소, 말단 산화효소, 트리카르복실산 회로, 글리옥실산염 분로의 효소, 지방산 분해를 위한 경로의 효소와 같은 다양한 오페론의 발현을 부정적으로 또는 긍정적으로 제어하는 포괄적 조절 시스템(global regulation system)을 형성한다. 돌연변이 균주 SBS440MGC는 호기성 호흡의 제어에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자인 arcA의 변이 형태를 보유한다.
SBS440MGC 균주에서 arcA의 결실은 도 3에 도시된 바와 같이, 글루코오스 1 몰당 1.02 몰의 숙신산염, 글루코오스 1 몰당 0.45 몰의 포름산염, 글루코오스 1 몰당 0.75 몰의 아세트산염을 생산하였다. ARCA의 제거는 글루코오스 소비에 별다른 영향을 주지 않았지만(도 2), 전체 숙신산염 수율을 약간 감소시켰다(도 3).
실시예 5: 아세트산염 생산의 감소
균주 SBS99OMGC에서, 숙신산염 생산을 증가시키고 에탄올과 유산염 생산을 통한 NADH 소비를 감소시키기 위하여 알코올 탈수소효소(adhE)와 유산염 탈수소효소(IdhA) 배경에서 아세트산염 키나아제-포스포트랜스아세틸라아제(ackA-pta)를 제거하였다. ack와 pta 유전자의 결실은 주요 아세트산염 생성 경로를 제거한다. 돌연변이 균주 SBS99OMG는 adhE, IdhA, ack-pta가 결실되지만 원형의 iclR을 여전히 보유한다. 활성 ICLR은 ACEBAK 발현을 감소시키지만, 잔여 ACEA와 ACEB 효소 활성은 잔여 글리옥실산염 분로 활성을 여전히 가능하게 한다.
SBS99OMG에서 증가된 NADH 이용도는 완전 혐기성 조건 하에 글루코오스로부 터 숙신산염 수율을 1.6 mol/mol로 증가시키는데 기여한다(도 2와 3). SBS99OMG는 높은 숙신산염 수율을 달성할 수 있었다.
실시예 6: 이중 숙신산염 합성 루트
활성 글리옥실산염 경로를 통한 경로 설계(pathway design)는 숙신산염 수율을 증가시키고 NADH 이용도 압박(availability constraint)을 완화하기 위하여 이미 인-실리코(in silico) 개발되고 조사되었으며(9), 유전자 조작된 대장균(E. coli)에 의해 생체내에서 수행되었다(41). 균주 SBS550MG(pHL413)는 발효 경로와 글리옥실산염 경로를 통한 탄소 플럭스의 균형을 맞춤으로써, 전통적인 발효 경로를 통한 NADH의 요구량을 우회하고 숙신산염으로 전환된 탄소를 극대화시키는 이중 숙신산염 합성 루트를 보유하도록 작제하였다(NADH 요구조건이 더욱 낮다). 재설계된 경로는 야생형 대장균(E. coli) 균주에서 숙신산염 1 몰당 2 몰의 NADH의 이론적 요구조건에 대조적으로, 숙신산염 1 몰당 글루코오스로부터 ~1.25 몰의 NADH의 실험적 요구조건을 보였다.
IdhA adhE iclR 돌연변이체 내에서 ack-pta의 불활성화는 아세틸-CoA를 글리옥실산염 경로로 지향시키는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 아세트산염 경로의 결실은 탄소 분자를 아세틸-CoA 형태로 보존하는데 도움이 되는데, 아세틸-CoA는 글리옥실산염과 숙신산염의 형성으로 지향된다. 글리옥실산염의 능금산염으로, 이후 푸마르산염으로, 최종적으로 숙신산염으로의 전환 역시 NADH 요구조건을 감소시키는데 도움이 된다. 이러한 경로는 2 몰의 아세틸-CoA와 1 몰의 OAA로부터 2 몰의 숙신산염을 생산하기 위하여 단지 1 몰의 NADH를 필요로 한 다(41).
PYC를 과다발현하는 균주 SBS550MG의 능력을 검사하고, 결과는 도 2에 도시한다. PYC를 포함하는 균주 SBS550MG가 혐기성 조건 하에 충분히 성장할 수 있긴 하지만, 이들 세포를 혐기성 숙신산염 생산 단계에 적용하기에 앞서 바이오매스를 더욱 빠르게 축적하기 위하여 본 연구에 호기성 조건을 이용하였다. pHL531을 포함하거나 포함하지 않는 균주 SBS550MG는 100%의 글루코오스를 소모하고, 양쪽 균주 모두 100 mM 글루코오스로부터 유사한 수준의 숙신산(160 mM)을 생산하였다. NADH 무감성 시트르산염 신타아제를 과다발현하는 플라스미드 pHL531을 보유하는 균주에서, 잔여 포름산염의 증가 및 아세트산염 수준의 감소가 관찰되었다. SBS550MG-기초된 균주의 배양액에서 관찰되는 아세트산염 수준은 SBS11OMG(pHL413)의 배양액에서 관찰되는 아세트산염 수준보다 훨씬 낮았다. SBS550MG(pHL413, pHL531)와 SBS550MG(pHL413, pDHK29)의 숙신산염 수율은 거의 유사하였다(글루코오스 1 몰당 대략 1.6 몰의 숙신산염).
NADH 무감성 시트르산염 신타아제의 과다발현에도 불구하고 1.6 mol/mol의 높은 숙신산 수율이 변하지 않는다는 사실은 고유 시트르산염 신타아제 시스템이 글리옥실산염 경로를 유도할 만큼 이미 충분하다는 것을 암시한다. 이에 더하여, 이들 결과는 이중-루트 숙신산염 생산 시스템이 매우 강력하다는 것을 더욱 입증하였다; 상기 시스템은 수율에서 별다른 변화 없이 OAA 중심점에서 상당한 혼란을 극복할 수 있었다. 명백하게, 이들 세포는 효율적인 최대 숙신산 생산에 이용가능한 환원 등가물(reducing equivalent)과 탄소 원자의 측면에서, 발효 경로와 글리옥실 산염 경로 사이에 균형 잡힌 분할을 달성할 수 있다.
SBS660MG-기초된 균주의 배양액은 24시간 시점에 25-35% 정도의 글루코오스를 소비하였다. SBS660MG(pHL413, pHL531)와 SBS660MG(pHL413, pDHK29) 균주 둘 모두 대략 1.7 mol/mol의 유사한 숙신산염 수율을 달성하였다. 이들 수율 값은 조사된 모든 균주 중에서 최고이었다(표 3). 대조에 비하여 형질전환된 변이 균주 SBS660MG(pHL413, pHL531)의 숙신산, 아세트산염 또는 포름산염 수율에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 3). arcA의 결실은 글루코오스 1 몰당 숙신산염 생산을 증가시키지만 글루코오스 소비를 감소시켰다.
실시예 7: 시트르산염 신타아제의 발현
도 1에서는 피루빈산염 카르복실라아제 인코딩 플라스미드 pHL413 및 시트르산염 신타아제 발현 플라스미드 pHL531로 형질전환된 대장균(E. coli) 변이 균주, SBS550MG, SBS660MGC, SBS99OMGC에서 생산된 다양한 대사물질을 도시한다. SBS330MG(pHL413)에서 아세트산염 수율은 대조 및 SBS11OMG(pHL413)에 비하여 증가하였다. 이들 결과는 더욱 높은 NADH 수준에 의해 유인되고 더욱 낮은 NAD+ 수준에 의해 촉진되는, 시트르산염 신타아제의 일부 저해가 존재할 수 있음을 암시한다. 널리 알려진 바와 같이, NADH는 시트르산염 신타아제를 알로스테릭하게 저해하고(33, 43), NAD+는 NADH 결합의 약한 경쟁성 저해물질이다(13). SBS330MG(pHL413)에서 관찰되는 절대 시험관내 시트르산염 신타아제 활성은 조사된 모든 균주 중에서 최저이었다.
균주 SBS550MG(pHL413+pDHK29)는 대조로서 이용되었는데, SBS550MG(pHL413+pHL531)은 이질성 PYC와 시트르산염 신타아제를 동시-발현하였다. pHL531을 포함하거나 포함하지 않는 균주 SBS550MG는 100%의 글루코오스를 소모하고, 양쪽 균주 모두 100 mM 글루코오스로부터 유사한 수준의 숙신산(160 mM)을 생산하였다. 아세트산염 경로가 적중되었음에도 불구하고, 발효의 종결 시점에서 낮은 농도의 아세트산염이 배양액에서 검출되었다. NADH 무감성 시트르산염 신타아제를 과다발현하는 플라스미드 pHL531을 보유하는 균주에서 잔여 포름산염의 증가 및 아세트산염 수준의 감소가 관찰되었다.
카르복실산 수율A
균주 숙신산 포름산염 아세트산염
SBS550MG(pHL413 + pDHK29) 1.59± 0.01 O.13± 0.03 0.08± 0.01
SBS550MG(pHL413 + pHL531) 1.61± 0.01 O.18± 0.04 0.06± 0.00
SBS660MG(pHL413 + pDHK29) 1.72± O.13 0.11± 0.01 0.09± 0.00
SBS660MG(pHL413 + pHL531) 1.73± O.18 0.10± 0.06 0.10± 0.03
SBS99OMG(pHL413 + pDHK29) 1.50± 0.00 0.26± 0.03 0.09± 0.01
SBS99OMG(pHL413 + pHL531) 1.58± 0.01 0.15± 0.01 0.06± 0.00
A 24시간 혐기성 생산 단계 동안 글루코오스 1 몰당 생성물의 몰
SBS660MG(pHL413, pHL531) 균주에서 NADH 시트르산염 신타아제의 발현은 SBS660MG(pHL413, pDH29) 대조 균주에 비하여 글루코오스 소비 및 생산된 대사물질을 대략 40% 증가시켰다. SBS660MG(pHL413, pHL531)와 SBS660MG(pHL413, pDHK29) 둘 모두 대략 1.7 mol/mol의 유사한 숙신산염 수율을 달성하였다. 이들 수율 값은 조사된 모든 균주 중에서 최고이었다(표 3). 균주 SBS99OMG(pHL413, pDHK29)에 의해 생산된 숙신산 수준은 SBS550MG(pHL413, pDHK29) 균주의 수준과 거의 유사하였다.
이들 결과는 이중-루트 숙신산염 생산 시스템이 매우 강력하다는 것을 더욱 입증하였다; 상기 시스템은 수율에서 별다른 변화 없이 OAA 중심점에서 상당한 혼란을 극복할 수 있었다. 이들 조작된 세포는 효율적인 최대 숙신산 생산에 이용가능한 환원 등가물(reducing equivalent)과 탄소 원자의 측면에서, 발효 경로와 글리옥실산염 경로 사이에 균형 잡힌 분할을 달성할 수 있다. 이들 결과는 adhE, IdhA, ack-pta가 불활성화되는 경우에 글리옥실산염 경로가 상당히 활성화된다는 가설을 더욱 뒷받침한다.
실시예 8: NADH 플럭스 분석
회분식 배양(batch cultivation) 조건 하에 측정된 플럭스를 이용하여 세포내 플럭스를 개산하고 결정적인 분기점 플럭스 분할 비율(flux split ratio)을 확인하였다. 상이한 돌연변이의 결과로써 OAA 중심점에서 글리옥실산염 경로와 발효 경로로 분기점 플럭스 분할 비율에서 변화를 비교하여 이들 조작에 대한 숙신산염 수율의 감수성을 확인하였다.
세포내 중간 대사물질 상에서 질량 보존의 법칙 및 가상-정상 상태(pseudo-steady state) 가설(PSSH)에 기초하여 물질대사 행렬(metabolic matrix)을 작성하였다. 도 1에 도시된 물질대사 네트워크에 기초하여 작성된 일단의 선형 방정식으로부터 획득된 화학량적 행렬(stoichiometric matrix)은 순전히, 측정된 대사물질, 세포내 대사물질 상에서 PSSH 균형, NADH 균형에 기초하여 크기 15 X 15의 정사각형 행렬을 제공하였다. NADH 균형의 경우에, NADH 생산과 소비가 동등하다고 가정하였다. 산화-환원 균형(redox balance)의 편차는 바이오매스로 동화된 탄소를 고려하지 않는다. 이러한 바이오매스(υ2)는 야생형을 제외한 모든 돌연변이체에서 0으로 가정되고, 해답이 최소 제곱법(least-squares fit)으로 구해지는 중복 결정 시스템(overdetermined system)을 산출하는 척도로서 이용되었다. 이러한 네트워크 내에서 다양한 종과 관련된 수학적 표현(mathematical representation), 화학량적 행렬, 순 전환(net conversion) 방정식은 표 4에서 제시된다.
Figure 112007015511587-pct00001
Figure 112007015511587-pct00002
벡터 r(t)(m x 1)(m=15, 16 또는 17)은 다양한 대사물질에 대한 순 전환 비율(net conversion rate)을 표시한다:
rT=[r1……r8 O O O O O O O O O]
MG1655(pHL413)의 경우에, H2와 바이오매스에 대한 균형은 배제되었고, 따라서, 행렬 A는 15 X 15 정사각형 행렬로 환원되었다. 정확한 해답은 방정식 1로 구하였다:
υ(t)= A-1 r(t) (1)
돌연변이 균주 SBS110MG(pHL413), SBS330MG(pHL413), SBS550MG(pHL413), SBS99OMG(pHL413)의 경우에, H2 균형의 배제와 바이오매스의 포함은 해답이 최소 제곱법(least-squares fit) 방식으로 구해지고 아래의 방정식 2에 따라 개산되는 중복 결정 시스템(overdetermined system)을 결과적으로 제공하였다:
υ(t) = (ATA)-1 AT r(t) (2)
배출된 대사물질의 시간에 따라 변하는 농도의 개산은 t=Oh 내지 t=6h 또는 7h에서, 평균 세포 밀도(average cell density)에 기초하여 아래와 같이 결정되었다(4):
Figure 112007015511587-pct00003
숙신산염 수율은 PEP/PYR 중심점 보다는 OAA 중심점에서 분할 비율에 상대적으로 더욱 민감한 것으로 밝혀졌다. 최대의 숙신산염 수율을 획득하는 가장 유리한 분할 비율은 균주 SBS550MG(pHL413)와 SBS99OMG(pHL413)에서 달성되는 OAA의 0.32의 글리옥실산염 경로 및 0.68의 발효 경로로의 부분 분할(fraction partition)이었다. 이들 두 균주에서 달성되는 숙신산염 수율은 각각, 1.6 mol/mol과 1.7 mol/mol이었다. IdhA, adhE, ack-pta 돌연변이 균주에서 활성 글리옥실산염 경로는 혐기성으로 달성되는 높은 숙신산염 수율의 기초가 되는 것으로 밝혀졌다. 야생형에 비하여 높은 세포내 수준의 NADH와 아세틸-CoA가 혐기성 발효의 시작 시점에서 SBS550OMG(pHL413)와 SBS99OMG(pHL413)에서 관찰되지만, 이들 수준은 급격하게 감소하는데, 이는 이들 균주가 PEP/PYR 분기점의 하류 효소의 불활성화에도 불구하고 높은 당분해 플럭스를 이용할 수 있음을 암시한다.
균주 SBS550MG(pHL413)의 당분해 플럭스(υ1 내지 υ4)는 SBS330MG(pHL413)에 비하여 증가하지만 야생형 대조 균주에 비하여 감소하였다. PFL 플럭스(υ7) 역시 야생형 대조 균주에 비하여 감소하여, 아세트산염과 포름산염 플럭스에서 상당한 감소를 유도하였다. 이들 당분해 플럭스(glycolytic flux)는 높은 숙신산염 수율이 OAA-시트르산염과 OAA-능금산염 사이에 카르복실산 생산의 분할에 좌우된다는 것을 입증한다. 이러한 플럭스 분할(flux partitioning)은 NADH 소비의 균형을 맞추고 숙신산염의 증가된 생산을 유도한다. 높은 숙신산염 생산 균주에서 분할은 10-40% 시트르산염 유래된 숙신산염 내지 90-60% 능금산염 유래된 숙신산염 생산 사이에서 변한다(도 1 참조).
물질대사 플럭스
플럭스 To: MG1655
(pHL413) 		SBS110MG
(pHL413)		 SBS330MG
(pHL413)		 SBS550MG
(pHL413)		 SBS99OMG
(PHL413)
υ1 글루코오스 흡수* 3.46 2.78 1.28 2.13 1.96
υ2 바이오매스 0.07 0.00 0.00 0.00 0.00
υ3 G-3-P 3.38 2.83 1.37 2.16 2.08
υ4 PEP + 피루빈산염 6.77 5.66 2.77 4.32 4.19
υ5 OAA 2.90 2.94 1.31 2.57 2.53
υ6 유산염* 0.00 0.00 0.21 0.00 0.00
υ7 세포내 포름산염 3.87 2.74 1.27 1.76 1.72
υ8 H2 0.42 0.27 0.00 0.77 0.63
υ9 아세트산염* 2.58 2.35 1.22 0.14 0.12
υ10 에탄올* 0.65 0.00 0.00 0.00 0.00
υ11 글리옥실산염
숙신산염 		0.32 0.21 0.05 0.82 0.83
υ12 능금산염 2.58 2.74 1.28 1.76 1.72
υ13 세포내 숙신산염 2.90 2.97 1.35 2.58 2.58
υRF 잔여 포름산염* 3.45 2.47 1.62 0.99 1.09
υES







배출된 숙신산염*

CO2

숙신산염 수율

(NADH)υ/Gl

(NADH)s/숙신산염 		3.22

-2.48

0.93

1.96

1.70 		3.19

-2.67

1.15

2.04

1.79 		1.43

-1.31

1.12

2.17

1.83 		3.41

-1.80

1.60

2.03

1.27 		3.44

-1.90

1.75

2.14

1.25
실시예 9: 유가식 혐기성 발효
생물반응기는 더욱 통제된 환경으로 인하여 더욱 높은 생산력을 산출한다. 배치 실험(batch experiment)을 이중으로 수행하여, 통제된 조건 하에 숙신산염을 생산하는데 있어 SBS550(pHL314)의 유효성을 조사하였다(도 5). 이러한 실험에서, 생물반응기는 LB로 먼저 채우고 86 mM의 글루코오스로 보충하였다. 0시에, 반응기는 17의 OD로 접종하였다. 글루코오스가 화살표로 표시된 바와 같이 대략 20mM로 떨어지면, 글루코오스를 적용량(pulse)으로 첨가하였다. 최초 글루코오스 농도에서 차이 및 작업(run)간 글루코오스 첨가 시간에서 차이는 균주 능력에 영향을 주지 않았다.
도 5에 도시된 바와 같이, 상기 균주는 숙신산을 생산하는데 있어 매우 유효하다. 숙신산 생산의 범위는 1.6 mol/mol의 매우 유효한 수율에서, 12 내지 9 mM의 숙신산염/hr이다. 상기 시스템은 부산물로서 다른 대사물질, 예를 들면, 포름산염과 아세트산염을 극히 소량으로 생산하였다. 또한, 상기 시스템은 숙신산염 수율을 1.8, 1.9, 또는 2.0 mol/mol, 또는 그 이상으로 개선하기 위하여 더욱 최적화될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 편의를 위하여 참고문헌 목록을 아래에 기재한다:
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Claims (41)

  1. 혐기성 조건 하에 카르복실산 생산을 개선하기 위하여 2개 이상의 경로 단백질(pathway protein)의 활성이 감소하도록 유전자 조작된 세균 균주에 있어서,
    이때 균주는 SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR, SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta, SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta, SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(L. 락티스 pyc+를 인코드하는 pHL413), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413 pyc+), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta,(pHL413), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(NADH 비감응성 citZ를 인코드하는 pHL413+pHL531), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413 + pHL531), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531)로 구성된 군에서 선택되는 세균을 포함하며, 이 세균 균주는 혐기성 조건하에 글루코오스 1몰당 적어도 1.5 몰의 숙신산염을 생산하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 세균은 혐기성 조건 하에 글루코오스 1몰당 적어도 1.6 몰 숙신산염을 생산하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
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  8. 혐기성 세균 배양액에서 카르복실산을 생산하는 방법에 있어서,
    a) 배양액에 세균을 제공하고, 이때 균주는 SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR, SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta, SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta, SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(L. 락티스 pyc+를 인코드하는 pHL413), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413 pyc+), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta,(pHL413), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(NADH 비감응성 citZ를 인코드하는 pHL413+pHL531), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413 + pHL531), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531)로 구성된 군에서 선택되는 세균을 포함하며;
    b) 상기 세균에 당 기질(sugar substrate)을 제공하고;
    c) 상기 세균이 당을 물질대사할 수 있도록 하고; 그리고
    d) 배양액으로부터 카르복실산을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 카르복실산 생산 방법.
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  22. 제 8항에 있어서, 세포를 플라스크, 생물반응기, 유가식(fed-batch) 생물반응기, 또는 키모스탯(chemostat) 생물반응기에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 카르복실산 생산 방법.
  23. a) IdhA의 파괴;
    b) adhE의 파괴; 그리고
    c) ack-pta의 파괴를 포함하는 유전자 조작된 세균 균주.
  24. 제 23항에 있어서, iclR의 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  25. 제 23항에 있어서, 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 pyc 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  26. 제 25항에 있어서, pyc는 락토바실루스 락티스(Lactobacillus lactis)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  27. 제 23항에 있어서, 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 citZ 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  28. 제 27항에 있어서, citZ는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  29. 제 23항에 있어서, 세균 균주는 SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR, SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta, SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta, SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(L. 락티스 pyc+를 인코드하는 pHL413), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413 pyc+), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(NADH 비감응성 citZ를 인코드하는 pHL413+pHL531), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413+pHL531), 그리고 SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  30. 삭제
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  32. 숙신산을 생산하는 방법에 있어서,
    a) 혐기성 조건 하에, SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(L. 락티스 pyc+를 인코드하는 pHL413), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413 pyc+), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531)으로 구성된 군에서 선택되는 세균 균주를 배양하고;
    b) 당 기질을 제공하고;
    c) 상기 세균이 기질을 물질대사할 수 있도록 하고; 그리고
    d) 숙신산을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.
  33. 카르복실산을 생산하도록 조작된 세균 균주에 있어서, 상기 세균 균주는 혐기성 배양 조건하에 10 내지 40% 시트르산염/옥살아세트산염 및 90 내지 60% 능금산염/옥살아세트산염 사이에 당분해 플럭스(glycolytic flux)를 분할하고, 이때 세균은 글루코오스 1몰당 1.5 몰 이상의 숙신산염을 생산하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세균 균주.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 당분해 플럭스(glycolytic flux)에서 옥살아세테트산염의 30%는 시트르산염으로 전환하고, 옥살아세테트산염의 70%는 능금산염으로 전환하는 것을 특징으로 하는 조작된 세균 균주.
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  38. 제 33항에 있어서, 세균 균주는 SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR, SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta, SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta, SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA, SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(L. 락티스 pyc+를 인코드하는 pHL413), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413 pyc+), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413), SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413), SBS330MG △adhE, △ldhA, △iclR(NADH 비감응성 citZ를 인코드하는 pHL413+pHL531), SBS440MG △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531), SBS99OMGC △adhE, △ldhA, △ack-pta(pHL413+pHL531), SBS550MG △adhE, △ldhA, △iclR, △ack-pta(pHL413+pHL531), 그리고 SBS660MGC △adhE, △ldhA, △iclR, △arcA(pHL413+pHL531)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세포 균주.
  39. 삭제
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  41. 숙신산을 생산하는 방법에 있어서,
    a) i) ldh, ii) adh, iii)iclR 및 iv) ack-pta 파열을 포함하는 유전자 조작된 대장균 세포를 수득하고;
    b) 피드-배치(fed-batch) 반응기내에서 혐기성 조건하에 상기 세포를 배양하고, 이때 당분해 플럭스(glycolytic flux)에서 옥살아세테트산염의 10-40%는 시트르산염으로 전환하고, 옥살아세테트산염의 90-60%는 능금산염으로 전환하고, 이때 세포는 글루코오스 1몰당 1.5 몰 이상의 숙신산염을 생산하는 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.
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