CN104593405A

CN104593405A - 一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法

Info

Publication number: CN104593405A
Application number: CN201410680819.7A
Authority: CN
Inventors: 童望宇; 于振海; 谢球
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明公开了一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的制备方法，包括利用同源重组方法敲除B. subtilis 168染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因L-乳酸脱氢酶基因(ldh)和乙酸激酶基因（ackA），获得突变菌株。单基因突变菌株保藏编号是IBL23-ldh，该突变菌株的构建是通过对枯草杆菌敲除部分乳酸脱氢酶基因实现的；双基因突变菌株是在单基因突变菌株的基础上再次敲除乙酸激酶基因获得，编号为IBL23-ldh/ackA。

Description

一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，确切地说是一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法。

背景技术

L-丙氨酸是一种非必需脂肪族的非极性氨基酸，但却是人体血液中含量最高的氨基酸，丙氨酸在生物体的代谢中有重要的作用，在食品工业和医药上都具有重要意义。直到80年代才在日本形成工业化生产，L-丙氨酸的制备由一开始的蛋白水解提取法、发酵法到现在流行的酶法。酶法转化即通过富有L-天冬氨酸-B-脱羧酶活力的微生物(如pseudomonas dacunhae等)细胞催化L-天冬氨酸而得到，其中日本多采用固定化细胞法，而我国均采用游离完整细胞法。许多微生物都能够发酵生产L-丙氨酸，近年来有文献报道，利用基因工程手段构建高效生产L-丙氨酸的工程菌，并以葡萄糖为原料生产丙酮酸，然后微生物将丙酮酸通过丙氨酸脱氢酶发生还原氨化反应或者直接发生氨基转移反应生成L-丙氨酸。发酵法主要原料葡萄糖成本低，培养基成分简单，产品收率高。丙氨酸脱氢酶催化的酶促反应如图2所示。氨基转移反应如图3所示。

北井等用溶胶棒杆菌7183在10％葡萄糖，K₂HPO₄0.l％，MgSO₄·7H₂O0.04％，酵母浸出汁0.1％，玉米浆0.4％，尿素1.8％，pH 7.6～7.8的培养基中，在30℃培养60h，可积累3％DL-丙氨酸。另外用嗜氨小杆菌的精氨酸氧酸抗性菌株(MAH2-22)，可在加有0.001％ZnSO₄·7H₂O的葡萄糖培养基中积累DL-丙氨酸47mg/ml，如用10％葡萄糖加10％乳酸铵的培养基中培养，则产量达60mg/ml。山田分离了一株耐高温，可在55℃培养，避免污染的凝结芽孢杆菌,培养43h，生成DL-丙氨酸达29.5g/L。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，为革兰氏阳性细菌，被FDA认为是安全菌株，可以代谢多种糖，能够合成多种蛋白酶并能把它们分泌到细胞外。由于其非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。在枯草芽孢杆菌中，葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶(PTS)系统被细胞吸收。在细胞中，葡萄糖的代谢途径有：磷酸戊糖途径(ppp途径)、糖酵解途径(EMP途径)、TCA循环和电子传递链。PPP途径主要提供NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原剂，如参与脂肪酸和固醇类物质的合成。TCA循环主要提供合成脂类和氨基酸的前体，如α-酮戊二酸和草酰乙酸分别是合成谷氨酸和天冬氨酸的前体；草酰乙酸先转变成丙酮酸再合成丙氨酸；许多氨基酸通过草酰乙酸可异生成糖。因此可以利用增加氨基酸前体的方法，提高氨基酸的产量。枯草芽孢杆菌代谢途径如图4所示。

丙氨酸脱氢酶首先在枯草芽孢杆菌中被发现，说明枯草杆菌本身能生产L-丙氨酸，能直接满足食品工业的安全生产要求，同时产生的L-丙氨酸分泌到胞外相比大肠杆菌表达系统更简化，但是产量偏低。

在B.subtilis IBL23中，乳酸和乙酸是丙氨酸发酵的主要副产物，导致碳源流向乳酸个乙酸削弱了流向丙氨酸的量。基于此，可通过敲除乳酸脱氢酶基因(ldh)和乙酸激酶基因(ackA)，以增加流向丙氨酸的碳源提高丙氨酸的产量，但基因的敲除可能会对菌株本身的生长造成一定的影响。本研究的主要内容就是通过基因敲除技术敲除B.subtilis IBL23染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因ldh基因和ackA基因从而达到提高L-丙氨酸产量的目的。然后野生菌和工程菌在LB液体培养基中进行培养，研究其发酵特性并通过HPLC检测其丙氨酸产量，研究ldh基因的缺失和ackA基因的缺失对丙氨酸产量的影响。并通过向LB培养基中加入20g/L葡萄糖，探讨葡萄糖对丙氨酸产量的影响。

发明内容

本发明的目的在于通过编号为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建，和构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株，编号为IBL23-ldh/ackA，从而提供一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法。

上述目的通过以下方案实现：

一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、编号为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建:

以B.subtilis IBL23基因组DNA为模板，PCR扩增得到ldh基因，将ldh基因连接到T载体pTG19-T上，在大肠杆菌IBL15中转化，蓝白筛选得到重组质粒pTG19-T-ldh；然后以质粒pKD3为模板，PCR扩增得到氯霉素cm基因，将cm 基因用NdeⅠ和EcoRⅤ双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ldh上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过氯霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ldh∷cm；通过Spizizen法把pTG19-T-ldh∷cm在IBL23中转化，成功敲除IBL23染色体上的ldh基因，获得了L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23-ldh；

(2)、构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株:

从L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23-ldh的基因组中PCR扩增得到ackA基因，连接到T载体pTG19-T上得到重组质粒pTG19-T-ackA，然后以质粒pKD4为模板，PCR扩增得到卡那霉素kana基因，将kana基因用EagI和HpaI双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ackA上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过卡那霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ackA∷kana；通过Spizizen法把pTG19-T-ackA∷kana在IBL23-ldh中转化，成功敲除IBL23-ldh染色体上的ackA基因，获得了L-乳酸脱氢酶和乙酸激酶缺失突变型菌株IBL23-ldh/ackA。

所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：(3)研究了野生型B.subtilis 168、单基因突变株IBL23-ldh和双基因突变株IBL23-ldh/ackA的发酵特性，通过多次传代和抗生素筛选得到了稳定；通过显微镜发现三株菌在形态方面的区别；通过HPLC分析三株菌中的丙酮酸产量和丙氨酸产量。

所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：所述的乳酸脱氢酶基因和乙酸激酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列如下：

a.乳酸脱氢酶基因(ldh)的核苷酸序列如列表中SEQ ID NO.1所示；乳酸脱氢酶基因(ldh)的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQ ID NO.2所示；

b.乙酸激酶基因(ackA)的核苷酸序列如列表中SEQ ID NO.3所示；乙酸激酶基因(ackA)的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果为：

(1)首次用枯草杆菌表达系统生产丙氨酸；

(2)编号为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株，是敲除乳酸脱氢酶基因(ldh)的微生物菌株；

(3)编号为IBL23-ldh/ackA的双基因突变的枯草杆菌菌株，是敲除乙酸激酶基因(ackA)的微生物菌株。

(4)首次与野生型B.subtilis 168相比，在外源添加葡萄糖条件下，单基因突变菌株丙氨酸产量达到1.602g/L,比野生型提高8.21倍，双基因突变菌株丙氨酸最高产量3.104g/L，提高15.9倍。

(5)构建得到编号为IBL23Δldh的单基因突变的枯草杆菌菌株和编号为IBL23ΔldhΔackA的双基因突变的枯草杆菌菌株。对它们进行了应用，发酵检测其的发酵特性。实验结果分析，三株菌均为革兰氏阳性菌，菌落形态发生显著变化，短杆状转变为球形；菌浓和培养基pH方面无显著变化；在添加葡萄糖的条件下丙酮酸产量方面，单基因突变菌株最高提高1.62倍，双基因突变菌株最高可提高2.1倍；在添加葡萄糖条件下，单基因突变菌株丙氨酸产量达到1.602g/L,比野生型提高8.21倍，双基因突变菌株丙氨酸最高产量3.104g/L，提高15.9倍。本研究是首次用枯草杆菌表达系统表达丙氨酸，可用于丙氨酸的生产。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌代谢简图；

图2为丙氨酸脱氢酶催化的酶促反应示意图；

图3为氨基转移反应；

图4为枯草芽孢杆菌氨基酸代谢途径示意图；

图5为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌菌株阳性筛选电泳图；

图6为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌菌株PCR ldh∷cm基因片段测序验证；

图7为IBL23-ldh/ackA的双基因突变的枯草杆菌菌株阳性筛选电泳图；

图8为IBL23-ldh/ackA的双基因突变的枯草杆菌菌株PCR ackA∷kana基因片段测序验证；

图9为IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌显微照片下菌落形态变化；

图10为IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌菌浓比较；

图11为IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌pH方面比较；

图12为IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙酮酸产量方面比较；

图13为IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙氨酸产量方面比较。

具体实施方式

(1)下面的实施例中的所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的B.subtilis IBL23是本实验室为模式菌株B.subtilis 168的编号。

一构建乳酸脱氢酶单基因敲除突变株B.subtilis IBL23-ldh

构建方法包括以下步骤：

1.1B.subtilis IBL23基因组提取

采用上海生工SK8255试剂盒提取B.subtilis IBL23基因组DNA

1).取1ml过夜培养的B.subtilis IBL23菌液，加入1.5ml EP管中，8000转/分钟室温离心1分钟，彻底弃上清，收集菌体。

2).加入180μl 20mg/ml溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴0.5～1小时，水浴时，每5～10分钟颠倒EP管一次。

3).加入20μl蛋白酶K溶液，用快速混匀器震荡混匀。56℃水浴1小时至细胞完全裂解。

4).加入200μl Buffer BD，充分混匀。

5).加入200μl无水乙醇，充分混匀。

6).装好吸附柱和收集管，将全部溶液加入吸附柱中静置2分钟后室温12000转/分钟离心1min，倒掉收集管中的废液。

7).将吸附柱重新放回收集管，加入500μl PW Solution，10000转/分钟室温离心1min倒掉滤液。

8).将吸附柱重新放回收集管，加入500μl Wash Solution，10000转/分钟室温离心1min倒掉滤液。

9).将吸附柱重新放回收集管中，室温12000转/分钟离心2min。将吸附柱打开盖子在超净工作台中放置10分钟以彻底晾干残留的Wash Solution。

10).将吸附柱放入一个新的1.5ml EP管中，加入70μl CE Buffer静置5min，12000转/分钟室温离心2min，收集DNA溶液。

11).吸取5μl DNA溶液在浓度0.8％的琼脂糖凝胶电泳上检测提取的基因组的纯度，电泳缓冲液为1×TAE，110V恒压电泳约40min。凝胶成像系统下用透射光观察，基因组DNA纯度很高，将其余基因组DNA放在-20℃冰箱中保存。

1.2乳酸脱氢酶基因(ldh)片段PCR扩增

以5'GGGCAAGGCTAGACGGGACT 3'和5'AGCAAGACTCATCGCAACCC 3'为引物，以1.1提取的B.subtilis IBL23基因组为模板，进行PCR反应，PCR体系为50μl体系，反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s；51℃退火30s；72℃延伸1min；扩增30个循环；72℃再延伸10min。

1.3重组质粒pTG19-T-ldh的构建和鉴定

通过TA克隆构建重组质粒pTG19-T-ldh，pTG19-T载体是一种带有3’T突出端的载体，而通过HiFi Taq酶扩增得到的ldh片段的3’端会加上一个A，在T4连接酶的作用下将纯化后的ldh片段和pTG19-T载体按4:1比例混合，置于PCR仪中，16℃反应48小时后，然后65℃灭活20分钟。连接产物转化E.coliIBL15，在含有X-Gal、IPTG、100μg/ml Amp的LB琼脂平板进行蓝白筛选。挑取全部单菌落接入含有100μg/ml Amp的30ml LB液体三角瓶中培养12～24小时。小提质粒，用酶切法和PCR法鉴定转化子中是否含有重组质粒pTG19-T-ldh。

1.4重组质粒pTG19-T-ldh∷cm的构建和鉴定

质粒pKD3上含有完整的氯霉素抗性基因(cm)，以质粒pKD3为模板，以5'ACGCCATATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3'(NdeⅠ)和5'ACGCGATATCTGACATGGGAATTAGCCATGGTCC3'(EcoRV)为引物，在上下引物中分别加上NdeⅠ、EcoRⅤ酶切位点。进行PCR反应，PCR体系为50μl体系，反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；扩增30个循环；72℃再延伸10min。

用快速限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅤ分别处理纯化后的cm基因及重组质粒pTG19-T-ldh。纯化酶切后的cm基因和pTG19-T-ldh，在T4DNA连接酶的作用下进行第二次连接，置于PCR仪中22℃反应2小时后，然后65℃灭活20分钟。将所有的连接产物在100μl大肠杆菌感受态细胞中转化，在含有氯霉素的LB琼脂平板培养基上筛选，形成单菌落。挑取单克隆，提取质粒，用酶切及PCR检测重组质粒，酶切和PCR检测验证正确的重组质粒命名为pTG19-T-ldh∷cm。

1.5B.subtilis IBL23甘油感受态细胞的制备

(1)接种新鲜的枯草芽孢杆菌IBL23单菌落于5ml GMⅠ中，30℃，100～150转/分钟摇床培养过夜。

(2)接种1ml上述培养物于9ml GMⅠ培养基中，在摇床中37℃，200转/分钟培养3～4h。

(3)取5ml第二步培养物转接于45ml GMⅡ培养基中进行第二次传代，37℃，100～150转/分钟摇床培养90min。

(4)取全部培养物，4000转/分钟室温离心5min，用1/10体积上清液重悬菌体，即得枯草芽孢杆菌感受态细胞。

1.6B.subtilis IBL23ldh基因敲除及转化子筛选

1)取适量重组质粒pTG19-T-ldh∷cm加入1ml枯草芽孢杆菌感受态细胞悬液中混匀。37℃恒温水浴中静置30～60min,然后在摇床中以37℃，200转/分钟振荡培养2～4h。

2)将上述转化液涂布含有氯霉素抗性的(终浓度5μg/ml)LB固体，在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，次日检查转化子。

3)挑取抗性平板上长出的单菌落，接入含有5μg/ml氯霉素的30ml LB液体三角瓶中培养12～24小时。按1.1的方法提取其基因组。

4)以上步提取的基因组为模板，采用1.2中的引物和PCR反应条件，用1×TAE电泳缓冲液配制0.8％琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，EB替代物作为指示剂，以5～10μl样品检测为宜，在110V恒压电泳约40min。在凝胶成像系统下用透射光观察，并分析形成的DNA区带，最后保存实验结果。

5)将PCR产物送去上海生工测序，用BLAST将测序结果与理论结果进行比对。

将PCR得到的ldh∷cm基因测序，将测序结果与理论结果进行比对。发现中间cm基因片段，两者的同源性为99％。证明所得的菌株确实为ldh缺失型菌株，将其命名为B.Subtilis IBL23-ldh。该菌株经过传代培养和抗性筛选得到稳定遗传的菌株后可以用于后续实验，研究ldh基因的缺失对丙氨酸产量的影响。

二、构建乳酸脱氢酶和乙酸激酶双基因敲除突变株IBL23-ldh/ackA

构建方法包括以下步骤

2.1乙酸激酶基因(ackA)片段PCR扩增

以5'GGGCAAGGCTAGACGGGACT 3″和5'AGCAAGACTCATCGCAACCC 3'为引物，提取B.Subtilis IBL23-ldh基因组为模板，进行PCR反应，PCR体系为50μl体系，反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s；47℃退火30s；72℃延伸1min30s；扩增30个循环；72℃再延伸10min。

2.2重组质粒pTG19-T-ackA的构建和鉴定

通过TA克隆构建重组质粒pTG19-T-ackA，pTG19-T载体是一种带有3’T突出端的载体，而通过HiFi Taq酶扩增得到的ackA基因片段的3’端会加上一个A，在T4连接酶的作用下将纯化后的ackA基因片段和pTG19-T载体按3:1比例混合反应，连接产物转化E.coli IBL15，通过LB琼脂平板进行蓝白筛选。挑取全部单菌落接入含有50μg/ml Amp的30ml LB液体三角瓶中过夜培养。用质粒DNA小量制备试剂盒提取转化子中的质粒，然后用限制性内切酶酶切处理重组质粒，琼脂糖凝胶电泳上检测转化子中是否含有重组质粒pTG19-T-ackA。

2.3重组质粒pTG19-T-ackA∷kana的构建和鉴定

质粒pKD4上含有完整的卡那霉素抗性基因(kana)，以质粒pKD4为模板，以5'CGGCCGAAACGCAAGCGCAAAGAG 3'(EagⅠ)和5'GTTAACGGACAACAAGCCAGGGAT3'(HpaⅠ)为引物，在上下引物中分别加上EagⅠ和HpaⅠ酶切位点。进行PCR反应，PCR体系为50μl体系，反应条件为94℃预变性10min；94℃变性30s；44℃退火30s；72℃延伸1min30s；扩增30个循环；72℃再延伸10min。

用快速限制性内切酶EagⅠ和HpaⅠ分别处理纯化后的kana基因及重组质粒pTG19-T-ackA。用酶切纯化后的kana基因和pTG19-T-ackA在T4DNA连接酶的作用下进行第二次连接，构建重组质粒pTG19-T-ackA∷kana。将200μl的PCR管置于冰中，加入连接体系，将加完的连接体系短暂离心混匀后置于PCR仪中22℃反应2小时后，然后65℃灭活20分钟。将所有的连接产物在100μl大肠杆菌IBL15感受态细胞中转化，在含有卡那霉素的LB琼脂平板培养基上筛选，形成单菌落。挑取单克隆过夜培养，提取质粒，用酶切及PCR检测重组质粒，验证正确的重组质粒命名pTG19-T-ackA∷kana。

2.4ackA基因在B.subtilis IBL23-ldh菌株内敲除及转化子筛选

提取重组质粒pTG19-T-ackA∷kana，将其转入用spizizen法制备的B.subtilis IBL23-ldh的感受态细胞中，在含有10μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上进行筛选。挑取单菌落接入含有10μg/ml卡那霉素的30ml LB液体三角瓶中培养12～24小时。提取其基因组进行PCR，一组用2.1里面的ackA基因引物和反应条件扩增得到ackA∷kana基因片段；另外一组用2.3里面的kana基因引物PCR扩增得到kana基因片段。

为了进一步确证所得的菌株为ackA基因缺失型菌株，将PCR得到的ackA∷kana基因片段送去上海生物工程有限公司测序，将测序结果与理论结果通过BLAST比对(图3-13)。发现中间kana基因片段，两者的同源性为99％。证明所得的菌株确实为ackA基因缺失型菌株，将其命名为B.Subtilis IBL23-ldh/ackA。该菌株经过传代培养和抗性筛选得到稳定遗传的菌株后可以用于后续实验，研究ackA基因的缺失对丙氨酸产量的影响。

三、B.subtilis IBL23-ldh、B.subtil is IBL23-ldh/ackA和IBL23发酵特性及葡萄糖对其影响

3.1基因缺失突变菌株的培养、筛选与保存

(1)超净工作台中，挑取第三章得到基因缺失突变菌株的平板上的单菌落接种于30ml LB液体培养基中，LB液体培养基中加入合适的抗生素(终浓度5μg/ml)，在摇床中37℃，200rpm活化12～24小时。

(2)10倍稀释涂平板，平板中加入相同的抗生素(终浓度5μg/ml)，37℃恒温培养箱中培养12～24小时。

(3)重复上述步骤8～10次，得到稳定遗传的基因缺失型菌株，保存菌株于20％的甘油管中。平时用的应保存平板，平板上菌落大小2mm左右为宜，在4℃冰箱中平板一般可使用1个月。

3.2稳定遗传的突变株和野生型菌株的菌浓测定

菌浓测定：以生理盐水为空白对照，取适量的发酵液用生理盐水稀释，在600nm波长下测定发酵液的吸光度A，则：OD₆₀₀＝A×稀释倍数。

挑取稳定遗传的突变株和野生型菌株单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养12～72小时。每隔12小时测定发酵液的OD₆₀₀，每个样品做2组平行(表1)

表1 IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌菌浓比较

3.3稳定遗传的突变株和野生型菌株的pH值测定

pH值是用上海雷磁PHs-3C型pH计直接测定的。

挑取稳定遗传的突变株和野生型菌株单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养12～72小时。每隔12小时测定发酵液的pH值，每个样品做2组平行(表2)。

表2 IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌pH方面比较

3.4稳定遗传的突变株和野生型菌株发酵液中丙酮酸的测定

1.样品预处理

挑取稳定遗传的单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养12～72小时。每隔12小时收集上述菌液5ml，于10000rpm 条件下室温离心5min分别收集上清和沉淀，沉淀用生理盐水洗2遍，彻底弃去上清，合并洗涤后的菌体和上清于5ml EP管中，然后超声破碎备用，将超声破碎后的菌液10000rpm室温离心5min，取上清液用装有0.22μm滤膜的针头过滤器过滤，滤液供HPLC分析用。

2.绘制标准曲线

准确称取丙酮酸钠1g，用少量双蒸水溶解，用100ml容量瓶定容待用，所得标准液浓度为10mg/ml。将上述标准品稀释成10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml。进样10μl，每个浓度平行进样3次，记录保留时间和峰面积。以质量浓度Y(μg/ml)对峰面积X进行线性回归。HPLC条件如下：色谱柱:Symmetry C18,5μm,4.6×250mm；流动相:pH 3.8H₂O；流速:0.8ml/min；进样体积:10μl；检测波长:220nm；检测器:UV detector；柱温:35℃；等度洗脱。

将供HPLC分析用的2组平行样品的滤液按1:1比例混合均匀后进样。HPLC分析完毕后选择保留时间和标准品保留时间一致的数据进行分析并计算出各个样品中的丙酮酸产量(表3)。

表3 IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙酮酸产量方面比较

3.5稳定遗传的突变株和野生型菌株发酵液中丙氨酸的测定

1.样品预处理

挑取稳定遗传的突变株和野生型单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养。每隔12小时取5ml发酵液，于10000rpm 条件下室温离心5min分别收集上清和沉淀，沉淀用生理盐水洗2遍，彻底弃去上清，合并洗涤后的菌体和上清于5ml EP管中，将超声破碎后的菌液10000rpm室温离心5min，上清液用PITC衍生，将衍生液10000rpm室温离心5min后取上清液用装有0.22μm滤膜的针头过滤器过滤，滤液供HPLC分析用。

2.绘制标准曲线

准确称取L-丙氨酸1g，用少量双蒸水溶解，用100ml容量瓶定容待用，所得标准液浓度为10mg/ml。将上述标准品稀释成10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml。用PITC衍生，将衍生液10000rpm室温离心5min，取上清液进样10μl，每个浓度平行进样3次，记录保留时间和峰面积。以质量浓度Y(μg/ml)对峰面积X进行线性回归。HPLC条件如下：色谱柱:SymmetryC18,5μm,4.6×250mm；流动相:A:acetonitrile:pH6.50.1M NaAc＝6:94；B:acetonitrile:H₂O＝80:20；流速:1ml/min；进样体积:10μl；检测波长:254nm；检测器:UV detector；柱温:40℃。梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：

将供HPLC分析用的2组平行样品的衍生化滤液按1:1比例混合均匀后进样。HPLC分析完毕后选择保留时间和标准品保留时间一致的数据进行分析并计算出各个样品中的丙氨酸产量(表4)。

表4 IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙氨酸产量方面比较

3.6添加葡萄糖对稳定遗传的突变株和野生型菌株发酵特性的影响

(1)挑取稳定遗传的突变株和野生型菌株单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基和添加20g/L葡萄糖的LB液体培养基中，在摇床中37℃，200rpm培养12～72小时。每隔24小时测定发酵液的OD₆₀₀，每个样品做3组平行(表5)。

表5 外源添加葡萄糖对IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌菌浓的影响(以OD₆₀₀计)

(2)挑取稳定遗传的突变株和野生型菌株单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基和添加20g/L葡萄糖的LB液体培养基中，在摇床中37，℃200rpm培养12～72小时。每隔24小时测定发酵液的pH值，每个样品做3组平行(表6)。

表6 外源添加葡萄糖对IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌菌浓的影响(以OD₆₀₀计)

(3)将供HPLC分析用的2组平行样品的滤液按1:1比例混合均匀后进样。HPLC分析完毕后选择保留时间和标准品保留时间一致的数据进行分析并计算出各个样品中的丙酮酸产量(表7)。

表7 外源添加葡萄糖对IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙酮酸产量方面的影响

(4)将供HPLC分析用的2组平行样品的衍生化滤液按1:1比例混合均匀后进样。HPLC分析完毕后选择保留时间和标准品保留时间一致的数据进行分析并计算出各个样品中的丙氨酸产量(表8)。

表8 外源添加葡萄糖对IBL23、IBL23-ldh和IBL23-ldh/ackA三株菌丙氨酸产量方面的影响

一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法;安徽大学

Ldh基因

上游引物Ldh-F为: gggCAAggCTAgACgggACT

下游引物Ldh-R为：AgCAAgACTCATCgCAACCC

PCR ldh片段扩增出的序列

Gggcaaggctagacgggacttaccgaaagaaaccatcaatgatggtttcttttttgttcataaatcagacaaaacttttctcttgcaaaagtttgtgaagtgttgcacaatataaatgtgaaatacttcacaaacaaaaagacatcaaagagaaacataccctggaaggatgattaatgatgaacaaacatgtaaataaagtagctttaatcggagcgggttttgttggaagcagttatgcatttgcgttaattaaccaaggaatcacagatgagcttgtggtcattgatgtaaataaagaaaaagcaatgggcgatgtgatggatttaaaccacggaaaggcgtttgcgccacaaccggtcaaaacatcttacggaacatatgaagactgcaaggatgctgatattgtctgcatttgcgccggagcaaaccaaaaacctggtgagacacgccttgaattagtagaaaagaacttgaagattttcaaaggcatcgttagtgaagtcatggcgagcggatttgacggcattttcttagtcgcgacaaatccggttgatatcctgacttacgcaacatggaaattcagcggcctgccaaaagagcgggtgattggaagcggcacaacacttgattctgcgagattccgtttcatgctgagcgaatactttggcgcagcgcctcaaaacgtacacgcgcatattatcggagagcacggcgacacagagcttcctgtttggagccacgcgaatgtcggcggtgtgccggtcagtgaactcgttgagaaaaacgatgcgtacaaacaagaggagctggaccaaattgtagatgatgtgaaaaacgcagcttaccatatcattgagaaaaaaggcgcgacttattatggggttgcgatgagtcttgct（901 bp）

cm基因

上游引物cm-ldh01N-F为：ACGCCATATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

下游引物cm-ldh01E-R为：ACGCGATATCTGACATGGGAATTAGCCATGGTCC

PCR cm片段扩增出的序列

CATATGgtgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcatttaaatggcgcgccttacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtattcattaagcatctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacgtaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgacaactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtaggcgcgccgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggaccatggctaattcccatgtcaGATATC (1049 bp)

Ldh::cm片段理论序列

GggcaaggctagacgggacttaccgaaagaaaccatcaatgatggtttcttttttgttcataaatcagacaaaacttttctcttgcaaaagtttgtgaagtgttgcacaatataaatgtgaaatacttcacaaacaaaaagacatcaaagagaaacataccctggaaggatgattaatgatgaacaaacatgtaaataaagtagctttaatcggagcgggttttgttggaagcagttatgcatttgcgttaattaaccaaggaatcacagatgagcttgtggtcattgatgtaaataaagaaaaagcaatgggcgatgtgatggatttaaaccacggaaaggcgtttgcgccacaaccggtcaaaacatcttacggaaCATATGgtgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcatttaaatggcgcgccttacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtattcattaagcatctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacgtaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgacaactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtaggcgcgccgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggaccatggctaattcccatgtcaGATATCctgacttacgcaacatggaaattcagcggcctgccaaaagagcgggtgattggaagcggcacaacacttgattctgcgagattccgtttcatgctgagcgaatactttggcgcagcgcctcaaaacgtacacgcgcatattatcggagagcacggcgacacagagcttcctgtttggagccacgcgaatgtcggcggtgtgccggtcagtgaactcgttgagaaaaacgatgcgtacaaacaagaggagctggaccaaattgtagatgatgtgaaaaacgcagcttaccatatcattgagaaaaaaggcgcgacttattatggggttgcgatgagtcttgct (1769 bp)

PCR Ldh::cm片段

上游引物Ldh-F为: gggCAAggCTAgACgggACT

下游引物Ldh-R为：AgCAAgACTCATCgCAACCC

AAACCCGCGCCTTTTTTCTCATGATATGGTAAGCTGCGTTTTTCACATCATCTACAATTTGGTCCAGCTCCTCTTGTTTGTACGCATCGTTTTTCTCAACGAGTTCACTGACCGGCACACCGCCGACATTCGCGTGGCTCCAAACAGGAAGCTCTGTGTCGCCGTGCTCTCCGATAATATGCGCGTGTACGTTTTGAGGCGCTGCGCCAAAGTATTCGCTCAGCATGAAACGGAATCTCGCAGAATCAAGTGTTGTGCCGCTTCCAATCACCCGCTCTTTTGGCAGGCCGCTGAATTTCCATGTTGCGTAAGTCAGGATACGC~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~CATATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGG~ATATATCAACGGTGGCTATATCCAGTGATTTTTTTTTCTCATTTTAGCTTCCTTTAGCTCCTGAAAATTCTCGACAACCTCGAGA（1173bp）

比对结果

Range 1: 379 to 1160GraphicsNext Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand

1404 bits(760) 0.0 780/788(99%) 7/788(0%) Plus/Plus

Query 324 CATATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC 383 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 379 CATATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC 438

Query 384 GGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTA 443 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 439 GGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTA 498

Query 444 CTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAAC 503 |||||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 499 CTGTTGTA-TTCATTAAGCA-TCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAAC 556

Query 504 CTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAA 563 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 557 CTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAA 616

Query 564 AACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCAC 623 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 617 AACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCAC 676

Query 624 CCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAG 683 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 677 CCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAG 736

Query 684 GTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTC 743 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 737 GTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTC 796

Query 744 GTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACA 803 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 797 GTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACA 856

Query 804 AGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGG 863 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 857 AGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGG 916

Query 864 ATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATT 923 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 917 ATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATT 976

Query 924 TTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACA 983 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 977 TTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACA 1036

Query 984 TTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATT-GGATATATCAAC 1042 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||

Sbjct 1037TTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAAC 1096

Query 1043 GGTGGCTATATCCAGTGAtttttttttCTCATTTTAGCTTCCTTTAGCTCCTGAAAATTC 1102 ||||| ||||||||||||||||||| || ||||||||||||| ||||||||||||||| |

Sbjct 1097GGTGG-TATATCCAGTGATTTTTTTCTC-CATTTTAGCTTCC-TTAGCTCCTGAAAAT-C 1152

Query 1103 TCGACAAC 1110

||||||||

Sbjct 1153 TCGACAAC 1160

Query:测序结果（sequenced） Sbjct:理论结果（theory）

ldh∷cm测序比对结果。

ackA基因

上游引物ACKA-01F为: TTACTggAgAATgCggATAg

下游引物ACKA-01R为：ATggCTCAATTTgATgAATg

PCR扩增出的ACKA基因序列

Ttactggagaatgcggatagctgatgaaagcttcctcgccgcgcacgttattaagcgcagggtcccagtatacgcccatgaattctaaaccgcgaagaacgcgttctctgacttccacactgttttcaccgataccggcagtaaagatgatcgcatctacaccgctcattcttgcagcgtaagaaccgatgtatttgtggattctgcttgcgaatacttcaagagccgtttccgcgcgctcatttccttctttcgtagcttcaacgatgtcacgaagatcgcttgagaaaccggaaatgccgagcagtccgctttttttgtttaatgtattcagtacttcgtcagccgtttggcctgttttctccatgatgtatgggatcagggcagggtcgatgtttccagagcgtgtgcccattgctacaccggcaagcggcgtaaagcccatggatgtgtcaatagattttccgccttcaacagcggcaatacttgctccgtttccaaggtggcaggaaatcaggcgcaagtcttttaacggacggccgagaagctctgccgcacgctcagttacatatttatgtgaagtgccgtggaagccgtatttacggatgccgaatttttcatagtattcatacggcaagctgtaaaggtaagactgctcaggcattgtttggtggaatgctgtatcaaatacagctaccgcaggaacatttggaagcacttctttgaacgctttaattccaacgatatttgccggattgtgaagcggtgccaattcagaaatatcttcgatttccttaatggtttcatccgttaataaaacagaatcgctgaatttttctccgccgtgaacgacacgatggccaattccgtcaatttcattcaagtctttaataatgccgaattccgttaacttattcagcagcattttaacagctaccgcatgatctggaatatcagttacttctgtatttttttcgccgttcacagaaattgtgaatacgctgtcggcgataccgattcgttcaactaaacccttcgttaaaacggtttctgaaggcatttcgaaaagctgaaatttcaaagacgagcttcctgcgttaattgcaataattttggacat~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ttacttttcttttttaaaccattcatcaaattgagccat (1505 bp)

Kana基因

上游引物Kan-ack-01F为: CGGCCGAAACGCAAGCGCAAAGAG

下游引物Kan-ack-01R为：GTTAACGGACAACAAGCCAGGGAT

PCR扩增出的kana 序列

CGGCCGaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggaccatggctaattcccatgtcagccgttaagtgttcctgtgtcactgaaaattgctttgagaggctctaagggcttctcagtgcgttacatccctggcttgttgtccGTTAAC (1395 bp)

ackA::kana片段理论序列

TtactggagaatgcggatagctgatgaaagcttcctcgccgcgcacgttattaagcgcagggtcccagtatacgcccatgaattctaaaccgcgaagaacgcgttctctgacttccacactgttttcaccgataccggcagtaaagatgatcgcatctacaccgctcattcttgcagcgtaagaaccgatgtatttgtggattctgcttgcgaatacttcaagagccgtttccgcgcgctcatttccttctttcgtagcttcaacgatgtcacgaagatcgcttgagaaaccggaaatgccgagcagtccgctttttttgtttaatgtattcagtacttcgtcagccgtttggcctgttttctccatgatgtatgggatcagggcagggtcgatgtttccagagcgtgtgcccattgctacaccggcaagcggcgtaaagcccatggatgtgtcaatagattttccgccttcaacagcggcaatacttgctccgtttccaaggtggcaggaaatcaggcgcaagtcttttaacggaCGGCCGaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggaccatggctaattcccatgtcagccgttaagtgttcctgtgtcactgaaaattgctttgagaggctctaagggcttctcagtgcgttacatccctggcttgttgtccGTTAACttattcagcagcattttaacagctaccgcatgatctggaatatcagttacttctgtatttttttcgccgttcacagaaattgtgaatacgctgtcggcgataccgattcgttcaactaaacccttcgttaaaacggtttctgaaggcatttcgaaaagctgaaatttcaaagacgagcttcctgcgttaattgcaataattttggacat~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ttacttttcttttttaaaccattcatcaaattgagccat (2537 bp)

PCR ackA::kana片段测序结果

上游引物ACKA-01F为: TTACTggAgAATgCggATAg

下游引物ACKA-01R为：ATggCTCAATTTgATgAATg

GCCGTTACTCTTGTCGCGCCGTATATATATATATATATCTATATATATATATAGATTTATATATCTATAAGAATGTGTAGTAGACTTCCACACTGATATCACCGATACCGGAAGTAAAGATGTTTGCATCTACACCGCTCATTCTTGCAGCGTAAGAACCGATGTATTTGTGGATTCTGCTTGCGAATACTTCAAGAGCCGTTTCCGCGCGCTCATTTCCTTCTTTCGTAGCTTCAACGATGTCACGAAGATCGCTTGAGAAACCGGAAATGCCGAGCAGTCCGCTTTTTTTGTTTAATGTATTCAGTACTTCGTCAGCCGTTTGGCCTGTTTTCTCCATGATGTATGGGATCAGGGCAGGGTCGATGTTTCCAGAGCGTGTGCCCATTGCTACACCGGCAAGCGGCGTAAAGCCCATGGATGTGTCAATAGATTTTCCGCCTTCAACAGCGGCAATACTTGCTCCGTTTCCAAGGTGGCAGGAAATCAGGCGCAAGTCTTTTAACGGACGGCCGAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGCGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGGTAATCCATCCATGGACTGATTGCAAATGCGGCGG（1113）

Range : 233 to 824GenBankGraphics

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand

1061 bits(574) 0.0 591/598(99%) 6/598(1%) Plus/Plus

Query 516 AAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGA 575 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 233 AAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGA 292

Query 576 CTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAA 635 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 293 CTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAA 352

Query 636 GGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCG 695 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 353 GGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCG 412

Query 696 CAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGA 755 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 413 CAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGA 472

Query 756 TGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGC 815 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 473 TGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGC 532

Query 816 ACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCC 875 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 533 ACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCC 592

Query 876 GGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGC 935 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 593 GGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGC 652

Query 936 GCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCAC 995 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 653 GCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCAC 712

Query 996 TGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGCGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATC 1055 |||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 713 TGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATC 772

Query 1056TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGGTAATCCATCCATGGACTGATTGCAAATGCGGCGG 1113 ||||||||||||||||||||||| || |||||| |||| ||||| |||| ||||||||

Sbjct 773 TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAG-TA-TCCATC-ATGG-CTGAT-GCAA-TGCGGCGG 824

Query:测序结果（sequenced） Sbjct:理论结果（theory）

ackA∷kana测序比对结果。

Claims

1.一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、编号为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建:

以B.subtilis IBL23基因组DNA为模板，PCR扩增得到ldh基因，将ldh基因连接到T载体pTG19-T上，在大肠杆菌IBL15中转化，蓝白筛选得到重组质粒pTG19-T-ldh;然后以质粒pKD3为模板，PCR扩增得到氯霉素cm基因，将cm基因用NdeⅠ和 EcoRⅤ双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ldh上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过氯霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ldh∷cm;通过Spizizen法把pTG19-T-ldh∷cm在IBL23中转化，成功敲除IBL23染色体上的ldh基因，获得了L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23-ldh;

、构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株:

从L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23-ldh的基因组中PCR扩增得到ackA基因，连接到T载体pTG19-T上得到重组质粒pTG19-T-ackA，然后以质粒pKD4为模板，PCR扩增得到卡那霉素kana基因，将kana基因用EagI和 HpaI双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ackA上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过卡那霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ackA∷kana；通过Spizizen法把pTG19-T-ackA∷kana在IBL23-ldh中转化，成功敲除IBL23-ldh染色体上的ackA基因，获得了L-乳酸脱氢酶和乙酸激酶缺失突变型菌株IBL23-ldh/ackA。

2.根据权利要求1所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：（3）研究了野生型B. subtilis 168、单基因突变株IBL23-ldh和双基因突变株IBL23-ldh/ackA的发酵特性，通过多次传代和抗生素筛选得到了稳定；通过显微镜发现三株菌在形态方面的区别；通过HPLC分析三株菌中的丙酮酸产量和丙氨酸产量。

3.根据权利要求1所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：所述的乳酸脱氢酶基因和乙酸激酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列如下：

a.乳酸脱氢酶基因（ldh）的核苷酸序列如列表中SEQ ID NO.1所示；乳酸脱氢酶基因（ldh）的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQ ID NO.2所示；

b.乙酸激酶基因（ackA）的核苷酸序列如列表中SEQ ID NO.3所示；乙酸激酶基因（ackA）的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQ ID NO.4所示。