CN103981112A - 一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，所述菌株命名为毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO：9049。本发明的菌株通过两种质粒pPIC9K和pGAPZαA将菊粉内切酶基因INU2多拷贝整合入毕赤酵母GS115基因组上，并从中筛选获得了高效表达菊粉内切酶的双启动子多拷贝酵母基因工程菌株。实验证实，该菌株在3L高密度发酵中菊粉酶酶活性可达3006U/ml，简单纯化的粗酶液即可直接用于水解菊粉产生低聚果糖，转化效率高，使其在工业中用菊粉酶解法生产低聚果糖成为现实，具有巨大的实用价值。

Description

一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。 

背景技术

菊粉是由β粉2，1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子，末端常含有一个葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一种催化水解菊粉中β-2，1-呋喃果糖苷键的水解酶。根据其对底物的作用方式，可将其分为2类：一类是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能从菊粉末端逐一切下一个果糖单位，产物为果糖及少量葡萄糖；另一类是菊粉内切酶(endoinμlinase)，它从菊粉分子内部随机切断某个β-2，1-糖苷键，水解产物为寡聚糖，可以用来生产低聚果糖。 

低聚果糖（Inulooligosaccharides，IOS）是功能性低聚糖，在食品、医药等方面具有极大的应用价值，相比于蔗糖，具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性，适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点，逐渐成为菊粉生物转化应用中极其重要的方向。 

低聚果糖的生产方法主要有两种：一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备，该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖，通常占到35%以上，去除难度大，导致其生产成本的增加；另一种方法是以菊粉为原料利用微生物产出生产用的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖，该方法的优点势是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖，产物中的葡萄糖含量极低，又由于菊粉的来源丰富，价格便宜，使得该方法具有非常广阔的应用前景。 

用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺，对微生物具有较高要求，首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶，而不能有外切酶及转移酶的存在；第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此，获得优良的产菊粉内切酶微生物是以菊粉为原料用菊粉酶解法生产低聚果糖能否工业应用的关键。然而自然界菌株中已知具有上述功能菌株一般表达水平很低并且既表达菊粉内切酶也表达菊粉外切酶，使的大规模生产困难而且产物纯化成本很高，所以到目前为止，菊粉内切酶生产低聚果糖的工艺没有真正实现在工业生产中规模化应用。因此，通过生物技术开发出酶活力高、产量大、热稳定性好的产菊粉内切酶菌株意义重大。经检索，目前具有高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的重组毕赤酵母菌株还未见报道。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。 

本发明的技术方案概述：分别构建组成型和诱导型两种启动子所调控的菊粉内切酶 INU2基因的表达质粒，再将这两种质粒多拷贝整合在宿主巴斯德毕赤酵母的基因组上，获得高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，实现对菊粉内切酶INU2的高水平表达。 

本发明所述的高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO：9049。 

上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤是： 

克隆菊粉内切酶基因INU2，将菊粉内切酶基因，通过限制性内切酶位点分别与毕赤酵母表达质粒pPIC9K和pGAPZαA连接获得重组表达载体pPIC9K-INU2和pGAPZαA-INU2；然后将pPIC9K-INU2导入巴斯德毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素G418筛选得到多拷贝AOX启动子的转化子，再将pGAPZαA-INU2导入多拷贝AOX启动子的转化子中，通过博来霉素抗性筛选获得多拷贝GAP启动子的转化子；用实时荧光定量PCR确定多拷贝转化子的拷贝数，对不同拷贝数的转化子进行诱导发酵比较，确定出产量最高的双启动子多拷贝转化子，即获得高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株。 

上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法中：所述产量最高的双启动子多拷贝转化子优选是GS115-A3-G2，其中：GS115表示巴斯德毕赤酵母基因，A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。 

本发明所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。 

将本发明所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在3L高密度发酵中菊粉酶酶活性可达3006U/ml，简单纯化的粗酶液即可直接用于水解菊粉产生低聚果糖，转化效率高，在工业中用菊粉酶解法生产低聚果糖具有巨大的发展前景。 

本发明的有益效果是：所述工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2能够利用组成型和诱导型启动子调控菊粉内切酶INU2的高水平表达，可以无需甲醇诱导就可以高产菊粉内切酶INU2，在3L高密度发酵中，未经甲醇诱导，粗酶液（发酵上清液）酶活即可以达到800U/ml以上，可以通过组成型启动子来达到快速发酵获取菊粉内切酶INU2；也可以再用甲醇进行该菌株发酵的诱导，在3L高密度发酵中，甲醇诱导8～10天，粗酶液酶活可达到3000U/ml以上，酶蛋白分泌量在2g/L以上，预示可以用此来工业上大批量生产菊粉内切酶。并且提供的重组菌株所产的重组菊粉内切酶INU2可以直接作用于底物菊粉来生产高附加值的低聚果糖，具有巨大的商业应用价值。 

附图说明

本发明所述巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO：9049。 

图1：重组质粒pPIC9K-INU2的构建示意图。 

图2：INU2和GAPDH的标准曲线。 

图3：多拷贝INU2转化子酶活曲线。 

图4：质粒pGAPZαA-3INU2的构建方案图。 

图5：质粒pGAPZαA-INU2的构建图。 

图6：质粒pGAPZαA-2INU2的构建图。 

图7：质粒pGAPZαA-3INU2的构建图。 

图8：GS115-A3-G2的生长和酶活曲线。 

图9：薄层层析结果图。 

图10：ImageJ软件分析结果图。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明内容进行进一步说明。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，如《分子克隆实验指南》（Molecμlar Cloning:A Laboratory Manual,2002）中所述的条件进行。 

本发明的实施例中使用了一下菌株和质粒： 

大肠杆菌（E.coli DH5α）：北京全式金生物科技有限公司。 

无花果曲霉（Aspergillus ficuum）CGMCC3.4322：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

pPIC9K质粒：表达质粒，具有AOX启动子，遗传霉素（G418）抗性，购买于Invitrogen。 

pGAPZαA质粒：表达质粒，具有GAP启动子，博来霉素（Zeocin）抗性，购买于Invitrogen。 

巴斯德毕赤酵母GS115：购买于Invitrogen。 

实施例1：AOX启动子菊粉内切酶INU2多拷贝重组毕赤酵母的构建 

1.重组质粒pPIC9K-INU2的构建 

1.1基因组的提取 

用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（Bioer Technology co.,Ltd.）提取无花果曲霉（Aspergillus ficuum）CGMCC3.4322的基因组，具体制备方法参考试剂盒的操作手册。 

1.2基因INU2的克隆 

将1.1提取的基因组作为PCR反应的模板，根据NCBI上已知的菊粉内切酶基因序列设计1对引物：INU2-EcoR I上游：ACGCGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTT（划线部分为EcoR I酶切位点），INU2-Not I下游：ATAGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCC（划线部分为Not I酶切位点），进行PCR反应，克隆INU2。PCR扩增条件： 预变性94℃2min;98℃10sec;退火55℃30sec;延伸72℃2min;35个循环；72℃延伸10min;12℃保温。利用DNA纯化回收试剂盒（购买于天根生化科技(北京)有限公司）对目的基因产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。目的条带大小为1503bp。 

1.3重组质粒pPIC9K-INU2的构建 

用限制性内切酶EcoR I和Not I分别对回收的目的基因产物INU2和质粒载体pPIC9K进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的INU2和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将这两个片段进行连接，形成重组质粒载体pPIC9K-INU2。它的构建过程如图1。具体酶切和连接步骤，参考操作说明书。 

1.4测序分析 

将1.3中的连接液转化大肠杆菌（E.coli DH5α），具体转化步骤参考说明书，获得的阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序分析，INU2的开放阅读框（ORF）包括1482bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码494个氨基酸。 

经测序无误的阳性克隆表达质粒命名为pPIC9K-INU2。 

2.pPIC9K-INU2电转毕赤酵母GS115及其多拷贝的筛选验证 

2.1制备线性化质粒pPIC9K-INU2 

利用限制性内切酶SacI/SalI对质粒pPIC9K-INU2进行酶切线性化，利用DNA纯化回收试剂盒进行回收，确保回收浓度在200ng/μl以上，保存备用。 

2.2制备毕赤酵母GS115感受态细胞 

（1）接种毕赤酵母单菌落到含有5ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜； 

（2）转接培养液到含有50ml液体YPD的大三角瓶中，接种量1%（v/v），30℃培养过夜，直到OD₆₀₀=1.3～1.5； 

（3）在1500g，4℃条件下，离心培养液5min，沉淀用50ml冰浴的双蒸水重悬； 

（4）在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用25ml冰浴的双蒸水重悬； 

（5）在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用2ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬； 

（6）在第三步条件下执行离心操作，沉淀细胞用1ml冰浴的1M的山梨醇溶液重悬，使菌悬液体积大约为1.5ml，得到毕赤酵母感受态细胞，每管80μl于-80℃中保存备用。2.3电转质粒 

（1)将2.2中制备的80μl感受态细胞和2.1中制备的5～20μg线性化质粒pPIC9K-INU2加入到1.5ml预冷的离心管中，混匀。将反应液转移到预先冰浴的转化杯中； 

（2）冰浴装有转化液的转化杯5min； 

（3）按照如下参数设置电转仪，进行酵母电转化：Cuvette Gap0.2cm；Voltage1.5kV；Field Strength7.5kV/cm；Capacitor25μF;Resistor（pulse control）400；Time constant approximately9.0msec； 

（4）脉冲后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1M的山梨醇溶液，把转化液转移到 一个新的1.5ml离心管中； 

（5）30℃静置培养1～2h； 

（6）分别吸取毕赤酵母GS115电转液50μl,100μl,150μl，分别涂布在MD培养基上； 

（7）30℃培养直至转化子出现。 

2.4筛选不同遗传霉素G418抗性的转化子 

（1）吸取1-2ml无菌水于转化子平板上，用灭菌刮子将His4+转化子全部洗脱下来，将细胞悬液混合转移到灭菌的离心管中，用分光光度计测定浓度，得到OD₆₀₀=5×10⁷个细胞/ml的细胞悬液。 

（2）准备10个YPD平板，遗传霉素G418浓度分别为0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8mg/L，在每个YPD平板涂上10⁵个细胞，置于30℃孵育，2～5天出现抗性克隆子。 

（3）挑取步骤（2）中长出来的抗性单克隆子，接种于对应同抗性的YPD液体培养基中，30℃，200r/min，过夜培养，检测是否能够在该抗性压力下正常生长，如果长起来，则继续加大G418抗性，直至该克隆无法生长。 

（4）挑选出步骤（3）中检测出的具有明显不同G418抗性的单克隆转化子，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组，备用于实时荧光定量PCR实验，并保存菌株。 

2.5实时荧光定量PCR确定转化子的INU2拷贝数 

（1）标准曲线的建立 

根据文献的报道，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）在毕赤酵母基因组中是单拷贝，因而选取GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）基因作为内参基因，根据NCBI上已知的GAPDH基因序列设计引物：GAP-上游：CACAATGGCTATCACTGTCG，GAP-下游：CACACTACAGCCCGCATT，以野生型GS115（his4-）基因组作为模板，克隆GAPDH基因。将GAPDH基因构建到pEASY-T3载体上，获得重组质粒pEASY-GAP，操作方法参见pEASY-T3克隆盒的指导说明书。同样的方法，将目的基因INU2也构建到pEASY-T3载体上，获得重组质粒pEASY-INU2。 

参考天根生化科技（北京）有限公司提供的荧光定量实验技术手册。用核酸定量仪检测提取的标准质粒pEASY-INU2和pEASY-GAP的浓度，根据公式： 

其中，pEASY-INU2的碱基数为1472256bp，pEASY-GAP的碱基数为1346868bp。计算出目的基因和内参基因的绝对拷贝数，将原液分别都梯度稀释到1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴拷贝数／μl做标准品。应用SYBR Green法进行绝对定量分析，INU2上下游引物分别为RT-INU2-F，RT-INU2-R扩增长度165bp。GAP上下游引物分别为 RT-GAP-F、RT-GAP-R扩增长度169bp，见表1。 

表1实时荧光定量PCR引物 

20μl PCR扩增体系： 

进行实时荧光定量PCR，反应程序：95℃30s，95℃5s，60℃20s，40个循环。每个样品3个重复。 

将实时荧光定量得到的Ct指与相对应的拷贝数对数构建标准曲线，算出标准曲线方程。本实施例的结果如图2。 

（2）转化子拷贝数的确定 

将步骤1（4）中获得的不同G418抗性的单克隆转化子基因组作为样品模板，根据上述（1）中的反应体系，进行实时荧光定量PCR反应，将得到的Ct值带入标准曲线方程，分别计算出每组样品中目的基因和内参基因的绝对拷贝数，再根据如下公式计算目的基因的拷贝数。基因组中外源基因拷贝数的计算： 

本实施例的结果如表2。 

表2转化子实时荧光定量PCR结果 

从表中可以看出，筛选出的转化子中有1拷贝、2拷贝、3拷贝和5拷贝的转化子。 

3.多拷贝转化子的摇瓶发酵比较 

根据步骤2中确定的转化子拷贝数，分别选取1、2、3、5不同拷贝数的转化子INU2-1、INU2-2、INU2-3、INU2-5，进行甲醇诱导发酵，比较不同拷贝转化子的酶活。具体方法为： 

（1）将不同拷贝数的转化子分别接种到YPD培养基中，30℃、200r/min条件下培养过夜。 

（2）转接培养物到BMGY培养基中，培养至OD₆₀₀值8～10，收集菌体。用BMMY培养基重悬菌体，将初始菌浓都稀释到0D₆₀₀=2，各做3组平行。 

（3）每24h加甲醇至终浓度1%，并取样测菌浓OD₆₀₀，样品在4℃条件下，12000r/min离心2min，去沉淀得上清液，即粗酶液，放在4℃中保存，连续诱导培养10天后停止，检测酶活。 

依据国际上绝大多数惯例本发明菊粉酶活单位定义为：反应体系中每毫升每分钟产生1μM还原糖所需酶量即为1个酶活单位。 

菊粉酶INU1酶活的测定如下，取菌液100μl与900μl菊粉浓度为2%的pH4.6、0.1M醋酸缓冲液混合，55℃反应10min，反应液置于沸水中灭活10min，取100μl的反应液加入到含有1.5ml的DNS和1.4ml无菌水中，沸水中反应5min，反应完毕立即冷却，定容到20ml，比色。此操作以沸水中处理5min的菌液作为对照，每个反应设置3个对照。根据标准曲线求出酶解产物中还原糖含量及其酶活性。 

本实施例中筛选到的不同拷贝数转化子的诱导发酵结果如图3，从图中可以看出单拷贝INU2-1的酶活力最低，最高达到506U/ml，2拷贝以上的转化子的酶活力差别不大，最终都达到了570U/ml。 

实验结果表明：拷贝数增加，确实能够提高菌株产酶量，但是超过3个以上，继续增加目的基因拷贝数，提高的产酶量有限，反而会加重了菌株的负担，减弱了菌株本身的生长力。综合比较，认为3拷贝转化子INU2-3具有比较好的运用潜力。 

实施例2双启动子多拷贝菊粉内切酶基因工程菌的构建 

1.多拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建 

首先构建INU2在毕赤酵母中的表达盒，然后将INU2的表达盒3拷贝构建到质粒pGAPZαA上，构建的方案如图4。具体的构建过程如下： 

（1）重组质粒pGAPZαA-INU2即INU2表达盒的构建 

pGAPZαA-INU2的构建方法如图5。具体方法： 

首先设计合成扩增INU2基因的引物： 

模板为重组质粒pPIC9K-INU2（实施例1中所构建），PCR扩增获得带有EcoR I和Xba I限制性酶切位点的目的基因INU2，纯化回收。 

用限制性内切酶EcoR I和Xba I对目的基因INU2和质粒pGAPZαA进行双酶切，T4 连接酶过夜连接后，转染大肠杆菌DH5α，用博来霉素Zeocin浓度为0.25μg/ml的低盐LB平板进行阳性转化子筛选，用菌落PCR进行验证（引物为通用引物α-factor和3’AOX）并测序重组质粒pGAPZαA-INU2的插入基因，确保INU2无移码突变。 

（2）2拷贝重组质粒pGAPZαA-2INU2的构建 

pGAPZαA-2INU2的构建方法如图6。具体方法： 

首先设计合成扩增INU2表达盒的2对引物 

模板为重组质粒pGAPZαA-INU2，用引物Kpn I-box上游和Nhe I-box下游PCR扩增获得带有Kpn I和Nhe I限制性酶切位点的INU2表达盒；用Nhe I-box上游和Not I-box下游PCR扩增获得带有Nhe I和Not I限制性酶切位点的INU2表达盒，纯化回收。 

用对应的限制性内切酶两种INU2表达盒进行双酶切，并用限制性内切酶Kpn I和Not I对质粒pGAPZαA进行双酶切，纯化回收后将三种酶切产物片段混合，T4连接酶过夜连接后，转染大肠杆菌DH5α。用博来霉素Zeocin浓度为0.25μg/ml的低盐LB平板进行阳性转化子筛选，用菌落PCR（引物为通用引物α-factor和3’AOX）初步验证，再用限制性内切酶对重组质粒进行酶切验证：分别用SacⅡ和KpnⅠ进行酶切验证。SacⅡ酶切的pGAPZαA-2INU2，大小为8.5kb；KpnⅠ酶切的pGAPZαA-2INU2，3个片段的大小为2kb+2.67kb+3.8kb。 

（3）3拷贝重组质粒pGAPZαA-3INU2的构建 

pGAPZαA-3INU2的构建方法如图7。具体方法： 

首先设计合成扩增INU2表达盒的1对引物 

模板为重组质粒pGAPZαA-INU2，PCR扩增获得带有Kpn I和Sfi I限制性酶切位点的INU2表达盒，纯化回收。 

用限制性内切酶Kpn I和Sfi I对INU2表达盒和步骤（2）已构建好的pGAPZαA-2INU2进行双酶切，T4连接酶过夜连接后，转染大肠杆菌DH5α，用博来霉素Zeocin浓度为0.25μg/ml的低盐LB平板进行阳性转化子筛选，用菌落PCR进行验证（引物为通用引物α-factor和3’AOX），初步验证，再用限制性内切酶对重组质粒进行酶切验证：用NheⅠ进行单酶切验证，用SacⅡ和KpnⅠ进行双酶切验证。 

SacⅡ和KpnⅠ双酶切pGAPZαA-3INU2，两个片段的大小为5329bp+3134bp。 

2.重组毕赤酵母INU2-3感受态的制备及电转化 

（1）INU2-3感受态的制备 

制备方法见实施例1中的2.2。 

（2）重组质粒pGAPZαA-3INU2电转入INU2-3 

由于重组质粒pGAPZαA-3INU2无法线性化，本试验选择直接将质粒电转入重组毕赤酵母INU2-3感受态。电转方法见实施例中的2.3。电转液涂布在博来霉素Zeocin浓度为1μg/ml的YPD平板上，30℃孵育直至转化子出现。 

3.双启动子转化子的验证 

由于阳性转化子能够利用组蛋白启动子GAP对INU2进行表达，所以能够在菌液上清液中测到菊粉酶酶活，而对照组重组毕赤酵母INU2-3中连锁INU2的启动子AOX必须在甲醇为唯一碳源的条件下，才能表达INU2，所以对照组在YPD中不能测到菊粉酶酶活。 

本实施例中的转化子接种到20ml Zeocin浓度为1μg/ml的YPD液体培养基中，30℃，200r/min摇瓶活化菌株，再转接到100ml YPD液体培养基中，30℃，200r/min摇瓶发酵3天，离心发酵液取上清，检测到上清液中的酶活达到80U/ml以上。这个结果表明了带有GAPDH启动子的目的基因INU2成功整合到出发菌株INU2-3基因组上。 

4.双启动子转化子中INU2拷贝数的确定 

出发菌株INU2-3中有3个拷贝的由醇氧酶AOX启动子所调控的INU2，通过实时荧光定量PCR的方法，检测出双启动子转化子中的INU2拷贝数，就可以确定整合进入的由组蛋白DAPDH启动子所调控的INU2拷贝数。 

提取双启动子转化子和INU2-3的基因组，其中INU2-3和单拷贝的INU2-1基因组作为对照组。以基因组为模板，进行实时荧光定量PCR实验，具体操作见实施例1中的2.5。 

实验结果如表3。 

表3双启动子转化子实时荧光定量PCR结果图 

实验结果表明了，待测样品的双启动子转化子有5个拷贝的目的基因INU2，除去出发菌株的3个拷贝，被整合进去的携带组蛋白DAPDH启动子的INU2有2个拷贝，将5拷贝INU2的转化子标记为GS115-A3-G2，其中A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。 

上述双启动子转化子GS115-A3-G2命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO：9049。 

5.双启动子转化子GS115-A3-G2的高密度发酵 

双启动子转化子GS115-A3-G2子进行3L发酵罐分批补料培养，高水平表达菊粉内切酶，具体方法为： 

（1）将转化子接种到120ml YPD培养基中，摇瓶培养1至菌浓OD₆₀₀值为4-6，以10%的接种量接到装有1.2L BSM基础盐培养基的3L发酵罐中，进行分批补料培养。 

（2）发酵过程中流加氨水控制pH值，通气量维持在1～3vvm，转速500-900r/min。菌体生长阶段，温度设定为30℃，pH为4.5，溶氧保持在10%以上。培养22-24h后碳源甘油耗尽（溶氧陡然上升），开始补加约500ml50%(w/w)的甘油，此过程中每12h取一次样，测菌浓OD₆₀₀，并测定菊粉酶酶活力。 

（3）诱导产酶阶段：当溶氧再次陡然上升时，温度设置为25℃，pH为5.5，开始流加甲醇，维持甲醇浓度为1%（w/w），直至发酵结束，补加100%甲醇约1L，此阶段发酵过程中每12h取一次样，测定菌浓OD₆₀₀，并测定菊粉酶酶活力。 

（4）诱导发酵8～10天，当发酵液中酶活趋于平稳时结束反应，在4℃条件下，对发酵液10000g离心10min，去沉淀得上清液，添加适当的保护剂，4℃保存。 

试验结果如图8，菌体在甘油补料期快速生长，甘油耗尽时（124h）菌浓OD₆₀₀达到了275，然后一直保持较慢速度生长。在菌体快速生长期，没有甲醇诱导的条件下，通过组蛋白启动子的分泌表达，发酵液中的菊粉酶酶活在缓慢的增长，在培养到124h时，补加的甘油耗尽，此时的酶活在307U/ml,此时开始补加甲醇并用甲醇检测流加控制器维持甲醇浓度1%进行诱导表达，从图中可以看，从诱导0h开始，酶活力以较快速度持续增长，在诱导204h时酶活趋于稳定，达到了3006U/ml。 

6.重组酶酶解菊粉产物的薄层层析 

发酵上清液中的重组菊粉内切酶INU2对底物菊粉进行作用，酶解后的产物进行薄层层析，结果如图9：1～5泳道分别是5个标准品，依次对应为果糖，蔗糖，蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，6为对照，7为待测样品，其展开结果可以看出，被测样品中存在三个标样对应的点，分离得很清晰，可以确定被测样品的成分有单糖，二糖和三糖，其中三糖对应的点很大很深，说明被测样品成分主要是三糖，对照组没有任何层析出来的点，说明这些低聚果糖是菊粉内切酶所作用的结果。 

应用ImagieJ软件对被测样品的成分进行分析，结果如图10，单糖占有12.38%，二糖占有10.58%，而三糖占了77.04%。 

Claims (4)

1.一种高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO：9049。

2.权利要求1所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤是：

克隆菊粉内切酶基因INU2，将菊粉内切酶基因，通过限制性内切酶位点分别与毕赤酵母表达质粒pPIC9K和pGAPZαA连接获得重组表达载体pPIC9K-INU2和pGAPZαA-INU2；然后将pPIC9K-INU2导入巴斯德毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素G418筛选得到多拷贝AOX启动子的转化子，再将pGAPZαA-INU2导入多拷贝AOX启动子的转化子中，通过博来霉素抗性筛选获得多拷贝GAP启动子的转化子；用实时荧光定量PCR确定多拷贝转化子的拷贝数，对不同拷贝数的转化子进行诱导发酵比较，确定出产量最高的双启动子多拷贝转化子，即获得高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组巴斯德毕赤酵母工程菌株。

3.如权利要求2所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：所述产量最高的双启动子多拷贝转化子是GS115-A3-G2，其中：GS115表示巴斯德毕赤酵母基因，A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。

4.权利要求1所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。