CN106520819A - 一种乳酸菌双基因表达盒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳酸菌双基因表达盒，用于插入外源基因后在乳酸菌中对外源基因进行表达，包括：第一表达盒和第二表达盒，该第一表达盒包含pldh启动子及第一终止子，第二表达盒包含p23启动子及第二终止子；本发明还提供了含有该乳酸菌双基因表达盒的表达载体及该表达载体的构建方法。利用本发明提供的含有该乳酸菌双基因表达盒的表达载体，能够实现两个目的外源基因在乳酸菌中的共表达，使得干酪乳杆菌能够表达两种胆盐水解酶并表现出具有胆盐降解活力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种乳酸菌双基因表达盒及该双基因表达盒的构建方法和应用。
背景技术
乳酸菌(如植物乳杆菌、干酷乳杆菌和嗜热链球菌等)被公认为安全级微生物，其中的多个种类都属于益生菌，对肠道菌群有改善作用，因此被广泛地应用于食品、保健品及药品的生产当中。同时，由于天然菌株的功能特性已经无法满足社会的需要，因此当前乳酸菌研究的热点是对其进行基因工程改造，使得到的重组乳酸菌中表达各种各样的功能性蛋白。
目前，应用于乳酸菌的表达载体有pMG36e、pNZ9520、pMSP3535、pNZ8008、pNZ8048、pNZ2103、pLP3537、pLEB590等，但这些表达载体最多只能表达一个外源基因，在一定程度上限制了重组乳酸菌的应用。
胆盐水解酶(Bile salt hydrolase，以下简称BSH)能水解结合态的牛磺胆酸盐和甘氨胆酸盐，并将其转变成游离胆酸和牛磺酸/甘氨酸，使胆固醇沉淀或使胆固醇转化为胆酸的转化率增加，因此BSH具有降低胆固醇的功效。乳酸菌被认为是产BSH的主要菌株，许多乳酸菌中含有多个胆盐水解酶基因(即同工酶)，但不同基因的功能及对胆盐的降解特性有一定差异。例如，植物乳杆菌中含有四个胆盐水解酶，但它们的氨基酸序列相似度较低，对胆盐的降解能力差异较大。
在各类乳酸菌中，干酪乳杆菌是一种常用的益生菌，具有降血压、增强人体免疫力等功效，还能够缓解乳糖不耐症和过敏，因此常被应用于功能性乳制品的研发当中。尽管干酪乳杆菌能够耐受有机体的防御机制，包括口腔中的酶、胃液中低PH值和小肠的胆汁酸等，但干酪乳杆菌基因组中并不含有胆盐水解酶基因，因此，干酪乳杆菌不能够降解胆盐，也就不具有降低胆固醇的功效。
发明内容
为解决上述问题，提供一种能够在插入至多两个外源基因并在乳酸菌中同时对该外源基因进行表达的表达盒以及表达载体，本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了一种乳酸菌双基因表达盒，用于插入外源基因后在乳酸菌中对外源基因进行表达，其特征在于，包括:第一表达盒和第二表达盒，第一表达盒的序列如SEQ IDNo:1所示，第二表达盒的序列如SEQ ID No:2所示。
本发明提供的乳酸菌双基因表达盒，还可以具有如下技术特征:其中，乳酸菌双基因表达盒的序列如SEQ ID No:3所示。
进一步，本发明还提供了一种含有如上所述的乳酸菌双基因表达盒的表达载体。
本发明所提供的表达载体，还可以具有如下技术特征:其中，表达载体的序列如SEQ ID No:4所示。
进一步，本发明还提供了一种如上所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:
步骤1，以干酪乳杆菌LC2W基因组为模板，用引物Pldh-F及引物Pldh-R进行扩增，得到第一片段，该第一片段包含第一启动子，该第一启动子为pldh启动子；
步骤2，以pIB184质粒为模板，用引物P23+ter-F及引物P23+ter-R进行扩增，得到第二片段，该第二片段包含第二启动子和第二终止子，该第二启动子为p23启动子；
步骤3，以pMG36e质粒为模板，用引物PMG-F及引物PMG-R进行扩增，得到第三片段，该第三片段包含第一终止子；
步骤4，采用无缝克隆试剂盒对第一片段、第二片段以及第三片段进行无缝连接，得到表达载体，
其中，引物Pldh-F的序列如SEQ No:5所示，引物Pldh-R的序列如SEQ No:6所示，引物P23+ter-F的序列如SEQ No:7所示，引物P23+ter-R的序列如SEQ No:8所示，引物PMG-F的序列如SEQ No:9所示，引物PMG-R的序列如SEQ No:10所示。
进一步，本发明还提供了如上所述的表达载体在乳酸菌表达外源基因中的应用。
发明作用与效果
本发明提供的乳酸菌双基因表达盒及其表达载体中包含两个基因表达盒，该两个基因表达盒的启动子分别为pldh启动子和p23启动子，因此能够插入至多两个外源基因，并且在转化进入乳酸菌后能够对插入的外源基因进行高效共表达。
附图说明
图1为实施例一的第一片段及第二片段PCR扩增电泳图；
图2为实施例一的第三片段PCR扩增电泳图；
图3为实施例二的表达质粒PCR验证电泳图；
图4为pMG-pldh-p23表达载体的基因图谱；
图5为实施例四中植物乳杆菌来源的胆盐水解酶的目的条带扩增PCR电泳图；
图6为实施例四中pMG-BSH1-BSH3质粒的菌液PCR验证电泳图；
图7为pMG-BSH1-BSH3表达载体的基因图谱；
图8为干酪乳杆菌工程菌的SDS-PAGE蛋白电泳图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例来说明本发明的具体实施方式。在下述各实施例中，所采用的试剂、酶及试剂盒如无特殊说明均从商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商的建议条件。
此外，各实施例中所使用的各引物在序列表中的编号见下表:
表1引物表
<实施例一>
本实施例为乳酸菌双基因表达盒及其表达载体的构建。
本实施例提供的乳酸菌双基因表达盒及其表达载体的构建方法包括如下步骤:
步骤1，以干酪乳杆菌LC2W基因组为模板，用引物Pldh-F及引物Pldh-R进行扩增，得到第一片段，该第一片段包含第一启动子，该第一启动子为pldh启动子；
步骤2，以pIB184质粒为模板，用引物P23+ter-F及引物P23+ter-R进行扩增，得到第二片段，该第二片段包含第二启动子和第二终止子，该第二启动子为p23启动子；
步骤3，以pMG36e质粒为模板，用引物PMG-F及引物PMG-R进行扩增，得到第三片段，该第三片段包含第一终止子；
步骤4，采用无缝克隆试剂盒对第一片段、第二片段以及第三片段进行无缝连接，得到表达载体。
图1为实施例一的第一片段及第二片段PCR扩增电泳图，图中条带M为DNA MarkerDL2000，条带1为第一片段，条带2为第二片段。
如图1所示，第二片段和第一片段分别在约600bp和350bp处可以看到清晰条带，与预期结果相符。
图2为实施例一的第三片段PCR扩增电泳图，图中条带M为DNA Marker DL10000，条带1为第三片段。
如图2所示，第三片段在约3300bp处有清晰可见的条带，与预期结果相符。
<实施例二>
本实施例为实施例一得到的表达载体的验证。
将实施例一得到的表达载体转化入大肠杆菌Top10中，将转化得到的大肠杆菌37℃培养平板24小时得到大肠杆菌菌落；取平板上的单菌落进行液体培养，用引物Pldh-F、P23+ter-R进行PCR扩增得到质粒载体(即、实施例一得到的表达载体)，扩增结果如图3所示。
图3为实施例二的表达质粒PCR验证电泳图，图中条带M为DNA Marker DL2000，条带1、2、3、4、5、6均为菌液PCR验证条带。
从图3可以看出，菌液PCR得到的质粒在约950bp处有清晰可见的条带，与预期相符。
对验证无误的大肠杆菌转化子进行质粒提取，将提取得到的质粒进行测序，测序结果表明，该质粒为pMG-pldh-p23表达载体，即、包含pldh和p23两个组合型启动子的双基因表达盒的表达载体。
图4为pMG-pldh-p23表达载体的基因图谱，如图4所示，该表达载体包含第一表达盒及第二表达盒，其中第一表达盒包含pldh启动子及第一终止子，第二表达盒包含p23启动子及第二终止子。
<实施例三>
本实施例为pMG-pldh-p23表达载体在乳酸菌中的转化效率考察。
本实施例中，质粒转化采用电转化法，具体步骤如下所述:
步骤1，将乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳杆菌LC2W和植物乳杆菌WCFS1感受态细胞中加入实施例二中得到的质粒，轻柔混匀，转移至冰上预冷的电击杯中，调节电转化参数(乳酸乳球菌NZ9000和干酪乳杆菌LC2W是2.0KV，植物乳杆菌WCFS1是2.0KV，4.0ms)，电击电转化杯，然后迅速向电转化杯中加入1ml预冷的恢复培养基，混匀后转移1.5ml离心管中，于厌氧培养箱中静置复苏培养(培养条件具体是:乳酸乳球菌NZ9000为30℃，2h；干酪乳杆菌LC2W和植物乳杆菌WCFS1为37℃，3h)；
步骤2，取适量菌液涂布含20mg/L的红霉素的MRS培养基(每升含蛋白胨10.0g酵母膏5.0g,牛肉膏10.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g,pH 6.2-6.6)平板上，于厌氧培养箱中倒置培养24-48h，计平板中的菌落数。
其中，感受态细胞的电转化效率计算公式为:电转化效率(cfg/μg DNA)＝稀释倍数×菌落数/质粒DNA数量。
电转化实验结果如表2所示:
表2 pMG-pldh-p23质粒的电转化效率
根据表2可知，实施例二得到的质粒(即pMG-pldh-p23表达载体)在乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳杆菌LC2W和植物乳杆菌WCFS1中均能成功电转，且转化效率大于3×103cfg/μg。
<实施例四>
本实施例为利用pMG-pldh-p23表达载体在干酪乳杆菌中表达两种胆盐水解酶的应用。
一、在pMG-pldh-p23表达载体中插入目的外源基因
以植物乳杆菌AR113基因组为模板，用113-BSH-F1/113-BSH-R1、113-BSH-F3/113-BSH-R3引物扩增两种胆盐水解酶(BSH)的目的片段，将该两个目的片段分别命名为113-BSH1和113-BSH3，该两个目的片段分别对应于两种目的外源基因，即BSH1和BSH3。
图5为实施例四中植物乳杆菌来源的胆盐水解酶的目的条带扩增PCR电泳图，图中条带M为DNA Marker DL2000，条带1为113-BSH 1条带，条带2为113-BSH 3条带。
如图5所示，113-BSH 1及113-BSH 3的大小约为1000bp，与预计符合。
将上述两个目的片段用PCR产物清洁回收试剂盒进行回收，得到113-BSH 1片段和113-BSH 3片段。
双基因表达盒质粒pMG-pldh-p23用BamHI和EcoRI酶切，与用相同内切酶酶切纯化回收后的113-BSH1片段进行连接，构建成重组质粒pMG-113-BSH1；双基因表达盒质粒pMG-pldh-p23用EcoRV和NaeI双酶切，与用相同内切酶酶切纯化回收后的113-BSH3片段进行连接酶切，构建成重组质粒pMG-113-BSH3；以连接成功后的重组质粒pMG-BSH1为载体，用EcoRV和NaeI双酶切，与用相同内切酶酶切纯化回收后的113-BSH3片段进行连接，构建成重组质粒pMG-BSH1-BSH3。
在上述三种重组质粒中，pMG-113-BSH1中只插入了BSH1基因，pMG-113-BSH3中只插入了BSH3基因，pMG-BSH1-BSH3则同时插入了BSH1基因及BSH3基因。
将重组质粒pMG-BSH1-BSH3转化入大肠杆菌Top10菌株，对培养得到的菌液进行PCR验证。
图6为pMG-BSH1-BSH3质粒的菌液PCR验证电泳图，图中条带M为DNA MarkerDL2000，条带1和条带2均为pMG-BSH1-BSH3质粒的菌液PCR验证条带。
如图6所示，菌液PCR得到的条带与预期相符。
对验证无误的大肠杆菌转化子进行质粒提取，并对提取得到的质粒进行测序，测序结果表明，该质粒为pMG-BSH1-BSH3表达载体，即、插入了两个目的外源基因BSH1及BSH3的表达载体。
图7为pMG-BSH1-BSH3表达载体的基因图谱。
如图7所示，该插入了两个目的外源基因的表达载体中，第一表达盒中插入了BSH3基因，第二表达盒中插入了BSH1基因。
二、pMG-BSH1-BSH3表达载体的表达验证
将三种重组质粒载体(pMG-113-BSH1质粒、pMG-113-BHS3质粒以及pMG-BSH1-BSH3质粒)分别通过电转化法(具体方法如实施例二所述)转化至干酪乳杆菌LC2W中，得到三株工程菌，该三株工程菌分别为pMG-113-BSH1工程菌、pMG-113-BHS3工程菌及pMG-BSH1-BSH3工程菌。
分别对三株工程菌进行平板培养，得到各工程菌的菌落；挑单菌落过夜培养，按2％(v/v)接种至50mL红霉素终浓度为20mg/L的MRS培养基中，37℃静置培养至OD600＝1.00，得到发酵液。
将上述发酵液在10000rpm、4℃条件下离心10min，弃上清得到菌体沉淀，该菌体沉淀用50mmol/L NaAc、pH5.4的缓冲液重悬洗涤3次，超声波破碎(破碎条件:5s/次，每次工作间隔时间10s，破碎时间20min)，得到细胞破碎上清液。
对上述细胞破碎上清液进行SDS-PAGE电泳分析，得到各工程菌的蛋白表达量结果。
图8为干酪乳杆菌工程菌的SDS-PAGE蛋白电泳图，图中各条带为M：UnstainedProtein Ladder(上海生工，Middle Range)；2：pMG-113-BSH1工程菌；4：pMG-113-BSH3工程菌；6：pMG-BSH1-BSH3工程菌；7：对照组(转化入pMG-pldh-p23质粒的干酪乳杆菌)。
BSH1和BSH3蛋白理论大小为37.06和36.17kDa。如图8所示，对照组在37KDa左右并无条带，说明干酪乳杆菌本身并不表达任何一种胆盐水解酶。pMG-113-BSH1工程菌、pMG-113-BSH3工程菌和pMG-BSH1-BSH3工程菌分别在37KDa处均具有明显条带(图中箭头所指处)，说明三株工程菌均表达了胆盐水解酶。此外，pMG-BSH1-BSH3工程菌的条带比其余四个工程菌更明显，说明该工程菌中胆盐水解酶表达量大于其他工程菌，一定程度上证实了两种胆盐水解酶在pMG-BSH1-BSH3工程菌中的共表达。
另取各工程菌的细胞破碎上清液进行酶活测定。测定方法为：将1ml细胞破碎上清液与1mL 2mg/mL甘氨胆酸钠、甘氨去氧胆酸钠和甘氨鹅脱氧胆酸钠三种胆盐混合溶液混匀，37℃下进行催化反应6h，并取样得到酶活反应的样品。将得到的样品进行HPLC分析，分析条件如下:
色谱柱:Sepax Bio-C18(31xm，4.6mm×150mm)；流速:0.6mL/min；检测波长:205nm；流动相A:水/TFA＝100/0.1，流动相B:乙腈/TFA＝100/0.09；洗脱梯度如下:0min-8min，流动相B 25％-35％；8min-30min，流动相B35％-48％；30min-30.5min，流动相B48％-25％；30.5min-40min，流动相B 25％。
通过HPLC分析，测定反应液中结合胆盐的剩余量，计算得出粗酶液中BSH的酶活力。酶活力单位定义如下:37℃、pH 5.4、1h内分解1nmol胆盐的酶量为一个酶活单位(U)。酶活力计算公式为:酶活力/(U/mL)＝(a-b)/(酶液体积/ml)×1/3h(a为起始各胆盐含量；b为反应结束后各胆盐含量)。
各工程菌降解胆盐的结果如表3所示，表3中，对照组为转化入pMG-pldh-p23质粒的干酪乳杆菌，实验组1为pMG-BSH1-BSH3工程菌，实验组2为pMG-113-BSH1工程菌，实验组3为pMG-113-BSH3工程菌。
表3干酪乳杆菌工程菌胆盐水解酶酶活测定
根据表3可知，对照组完全不具备对该三种胆盐底物的降解活性，因此干酪乳杆菌本身并不表达任何一种胆盐水解酶。实验组3表现出对三种胆盐底物的降解活性，说明其中成功表达了BSH3基因；在该实验组3中，对甘氨鹅脱氧胆酸钠底物的酶活明显低于另外两种底物，说明BSH3对甘氨鹅脱氧胆酸钠底物的酶活很弱。实验组2表现出对三种胆盐底物的降解活性，说明其中成功表达了BSH1基因；在该实验组2中，对甘氨鹅脱氧胆酸钠底物的酶活较高，说明BSH1对甘氨鹅脱氧胆酸钠底物的酶活较好。而实验组1表现出了对三种胆盐底物的降解活性，并且对三种底物的活力分别相当于实验组2与实验组3之和，即、实验组1中对各底物的酶活为实验组2和实验组3的叠加。
综合蛋白电泳结果以及酶活测定结果可知，pMG-BSH1-BSH3工程菌成功表达了BSH1和BSH3两种基因，并且两种基因在工程菌中能够独立表达，二者的表达互不干扰。
实施例作用与效果
根据上述各实施例结果可知，利用本发明提供的方法能够构建得到包含双基因表达盒的pMG-pldh-p23表达载体，该双基因表达盒中包含p23及pldh两个组合型启动子，因此能够对两个外源目的基因进行共表达。
实施例结果表明，本发明提供的含有双基因表达盒的表达载体为穿梭表达载体，能够在大肠杆菌中大量复制并在在乳酸菌中高效转化；在插入外源基因后，该表达载体能够在乳酸菌中对外源基因进行高效共表达；其得到的双胆盐水解酶基因工程菌具有较高的胆盐底物降解活性，说明插入的目的外源基因得到了正确表达，并且目的外源基因的表达互不干扰。
以上实施例仅为说明本发明的具体实施方式，而非对本发明进行限制；依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海理工大学
<120> 一种乳酸菌双基因表达盒及其构建方法和用途
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
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cacaaaaatt ggcactcggc acttaatggg gggtcgtagt acggaagcaa aattcgcttc 240
ctttcccccc atttttttcc aaattccaaa tttttttcaa aaattttcca gcgctaccgc 300
tcggcaaaat tgcaagcaat ttttaaaatc aaacccatga gggaatttca ttccctcata 360
ctcccttgag cctcctccaa ccgaaataga agggcgctgc gcttattatt tcattcagtc 420
atcggctttc ataatctaac agacaacatc ttcgctgcaa agccacgcta cgctcaaggg 480
cttttacgct acgataacgc ctgttttaac gattatgccg ataactaaac gaaataaacg 540
ctaaaacgtc tcagaaacga ttttgagacg ttttaataaa aaatcgagct tgcgtttgat 600
tttcaaactt cgcaacagaa ccgtttctac tcaatgaact ataagcaaaa ggcagctgat 660
ctcaacaatg tgaagtcagc tgcctaagca aggttcaaaa tattaaattt taccggtcat 720
cagtaccatt tgactttgaa cctcaactcc aaatatcgta gcgccggggt accctcgagg 780
gtaccgacgt cagcgatcgc gtggccggcc gatatccaat tgagatctgg tgatatcatc 840
ctttcttatg tgcatgcaaa ctgcatttca cgttgagtat aacacattat caattccctg 900
aaacaaattt gatagacttt ttcatgattt tgccattgtc aaaaaatggc gtcgagcctt 960
actacagcaa gacttgtgaa tcctgtttca agcaagcttc caataacgta agcgtttcca 1020
gcatctgttt tcacgaatgt gggaaattca acagttccca cggtcaactc gcacagacgc 1080
aaggcgtcag tatggtatac tgctctggac ggaaaaggca aaatcccgaa aagccctgac 1140
aacccttgtt cctaaaaagg aataagcgtt cggtcagtaa ataatagaaa taaaaaatca 1200
gacctaagac tgatgacaaa aagagaaaat tttgataaaa tagtcttaga attaaattaa 1260
aaagggaggc caaatataat gaaaaatatg aatgacaatg atgttggatc cccgcggtac 1320
ccgggaattc tagagctcga gatctatcga taagcttaag tgattagtca aagaatggtg 1380
atgacaattg taaattctat ttaatcactt tgactagcaa atactaacaa caagacacac 1440
acaccaaaaa tcaaaaattc actactttta gttaaaaacc acgtaaccac aagaactaat 1500
ccaatccatg taatcgggtt cttcaaatat ttctccaaga ttttcctcct ctaatatgct 1560
caacttaaat gacctattca ataaatctat tatgctgcta aatagtttat aggacaaata 1620
agtatactct aatgacctat aaaagataga aaattaaaaa atcaagtgtt cgcttcgctc 1680
gaagaggatg aagaggatga ggaggcagat tgccttgaat atattgacaa tactgataag 1740
ataatatatc ttttatatag aagatcgacc gtgctataat tatactaatt ttataaggag 1800
gaaaaaatat gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat caaccaaaca 1860
aaaaataagt ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca aattaaagag 1920
ggttataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt caaaacataa 1980
tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct ttgaaatcgg 2040
ctcaggaaaa ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat 2100
tgaaatagac cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc acgataattt 2160
ccaagtttta aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat cctataaaat 2220
atatggtaat ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg tttttgatag 2280
tatagctaat gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat tattaaatac 2340
aaaacgctca ttggcattac ttttaatggc agaagttgat atttctatat taagtatggt 2400
tccaagagaa tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca gattaagtag 2460
aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa acaaaagtat aattatttcg ttatgaaatg 2520
ggttaacaaa gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt ccttaaaaca 2580
tgcaggaatt gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttttcaatag 2640
ctataaatta tttaataagt aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt aacttgtttt 2700
tcgtgtgcct attttttgtg aatcgggtcg atcggggaag aacagtatgt cgagctattt 2760
tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat tttactggat 2820
gaattgtttt agtacctaga tttagatgtc taaaaagcta gctttttaga catctaatct 2880
tttctgaagt acatccgcaa ctgtccatac tctgatgttt tatatctttt ctaaaagttc 2940
gctagatagg ggtcccgagg tcgatcattt tgtttattgc aattgtattg ctattaatcg 3000
caacatcaaa ccaaaataaa aacccccttc gactttcgtc agggggcttt tatttattca 3060
ataatccctc ctctcaataa atctattgtt gtacttaatt caacttccat ttctctgtat 3120
ctttcaatac gctcttttaa gtccttaatt tcttttttta attcctcatt ttcagcaaat 3180
aactcttttt ctttgtttgt cattttattt cccccgtttc agcatcaaga acctttgcat 3240
aacttgctct atatccacac tgataattgc cctcaaacca taatctaaag gcgctagagt 3300
ttgttgaaac aatatctttt acatcattcg tatttaaaat tccaaactcc gctcccctaa 3360
ggcgaataaa agccattaaa tcttttgtat ttaccaaatt atagtcatcc actatatcta 3420
aaagtaaatt cttcaattct cttttttggc tttcatcaag tgttatatag cggtcaatat 3480
caaaatcatt aatgttcaaa atatcttttt tgtcgtatat atgtttattc ttagcaatag 3540
cgtcctttga ttcatgagtc aaatattcat atgaaccttt gatataatca agtatctcaa 3600
catgagcaac tgaactattc cccaattttc gcttaatctt gttcctaacg ctttctattg 3660
ttacaggatt tcgtgcaata tatataacgt gatagtgtgg ttttttatag tgctttccat 3720
ttcgtataac atcactacta ttccatgtat ctttatcttt tttttcgtcc atatcgtgta 3780
aaggactgac agccatagat acgcccaaac tctctaattt ttctttccaa tcattaggaa 3840
ttgagtcagg atataataaa aatccaaaat ttctagcttt agtattttta atagccatga 3900
tataattacc ttatcaaaaa caagtagcga aaactcgtat ccttctaaaa acgcgagctt 3960
tcgcttattt tttttgttct gattcctttc ttgcatattc ttctatagct aacgccgcaa 4020
ccgcagattt tgaaaaacct ttttgtttcg ccatatctgt taatttttta tcttgctctt 4080
ttgtcagaga aatcataact ctttttttcg attctgaaat cacc 4124
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatcgcgtgg ccggccgata tccaattgag atctggtgat atcatccttt cttat 55
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtcagggct tttcgggatt ttgccttttc cgtcc 35
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acggaaaagg caaaatcccg aaaagccctg acaacc 36
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctcatcctct tcatcctctt cgagcgaagc gaacacttga t 41
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atcaagtgtt cgcttcgctc gaagaggatg aagaggatga g 41
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggccggccac gcgatcgctg acgtcggtac cctcgagggt accccggcgc tacgat 56
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cagcagaaaa attcgtaatt cgagctcgca tgtgtactgc cataacttat c 51
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttttcagact ttgcaagctt gcatgcttag ttaactgcat agtattgtg 49
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cagcagaaaa attcgtaatt cgagctcgca tgtgcactag tctaacttat acaaa 55
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttttcagact ttgcaagctt gcatgcttaa tgggccgctg gcaa 44
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagcagaaaa attcgtaatt cgagctcgca tgtgtactag tttaacgatt ca 52
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttttcagact ttgcaagctt gcatgcttag tttgctaacc ggaac 45
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cagcagaaaa attcgtaatt cgagctcgca tgtgtaccag cttaacttat cttg 54
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttttcagact ttgcaagctt gcatgctcaa tcggcaggaa agaggt 46
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgggatccat gtgtactgcc ataacttatc 30
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cggaattctt agttaactgc atagtattgt g 31
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cggatatcac cccatgtgta ctagtttaac gattca 36
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctagccggct tagtttgcta accggaac 28
Claims (6)
1.一种乳酸菌双基因表达盒，用于插入外源基因后在乳酸菌中对所述外源基因进行表达，其特征在于，包括：
第一表达盒和第二表达盒，
所述第一表达盒的序列如SEQ ID No：1所示，所述第二表达盒的序列如SEQ ID No：2所示。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌双基因表达盒，其特征在于：
其中，所述乳酸菌双基因表达盒的序列如SEQ ID No：3所示。
3.一种含有如权利要求1所述的乳酸菌双基因表达盒的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：
其中，所述表达载体的序列如SEQ ID No：4所示。
5.一种如权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，以干酪乳杆菌LC2W基因组为模板，用引物Pldh-F及引物Pldh-R进行扩增，得到第一片段，该第一片段包含第一启动子，该第一启动子为pldh启动子；
步骤2，以pIB184质粒为模板，用引物P23+ter-F及引物P23+ter-R进行扩增，得到第二片段，该第二片段包含第二启动子和第二终止子，该第二启动子为p23启动子；
步骤3，以pMG36e质粒为模板，用引物PMG-F及引物PMG-R进行扩增，得到第三片段，该第三片段包含第一终止子；
步骤4，采用无缝克隆试剂盒对所述第一片段、所述第二片段以及所述第三片段进行无缝连接，得到所述表达载体，
其中，所述引物Pldh-F的序列如SEQ No：5所示，所述引物Pldh-R的序列如SEQ No：6所示，所述引物P23+ter-F的序列如SEQ No：7所示，所述引物P23+ter-R的序列如SEQ No：8所示，所述引物PMG-F的序列如SEQ No：9所示，所述引物PMG-R的序列如SEQ No：10所示。
6.如权利要求3所述的表达载体在乳酸菌表达外源基因中的应用。
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- 2016-12-28 CN CN201611235844.XA patent/CN106520819A/zh active Pending
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