CN108102994B

CN108102994B - 一种抗酸胁迫元器件

Info

Publication number: CN108102994B
Application number: CN201711354622.4A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 堵国成; 朱政明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN108102994A

Abstract

本发明公开了一种抗酸胁迫元器件，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的rbsA基因，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)。pH 4.0条件下胁迫3h，重组菌株的存活率为对照的5.8倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种抗酸胁迫元器件

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫元器件，属于生物工程技术领域。

背景技术

当乳酸菌被用作工业化生产之后，在其发酵过程中，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，导致细胞面临严重的酸胁迫。为维持发酵生产的稳定性并提高生产效率，工业上通常在发酵的过程中通过添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围。例如通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而碱性物质的添加往往会导致副产物的积累。而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

在低pH的环境条件下，微生物细胞活性显著降低，从而导致发酵产物的生产效率显著下降。因此提高乳酸菌的酸胁迫耐受性对于其在发酵生产中的应用有着重要的意义。目前提高乳酸菌的酸胁迫耐受性的方法主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径。上述方法或存在成本问题，或存在成功率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗酸胁迫元器件以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

本发明首先提供了抗酸胁迫元器件，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸乳球菌，过量表达D核糖转运ATP结合蛋白RbsA。

在本发明的一种实施方式中，所述RbsA的氨基酸序列是如SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述RbsA的核苷酸序列是如SEQ ID NO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述RbsA的核苷酸序列来源于Lactococcuslactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为乳酸乳球菌Lactococcuslactis NZ9000。

本发明还提供了一种所述重组菌的构建方法，所述方法是将编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再分别转化到宿主菌中获得重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒为pNZ8148。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌是Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RbsA，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)。

本发明还提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中过量表达D核糖转运ATP结合蛋白RbsA。

在本发明的一种实施方式中，所述D核糖转运ATP结合蛋白RbsA氨基酸序列是如SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RbsA，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)，诱导表达RbsA。

本发明还提供所述重组乳酸乳球菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

本发明的有益效果：本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达RbsA蛋白，得到了一株酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RebsA)。在酸胁迫条件下，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)的存活率为对照的5.8倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/RbsA的结构图；

图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；

图3：pH 4.0条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1：重组菌株的构建

从NCBI数据库的L.lactis NZ9000中得到如SEQ ID NO.2所示的rbsA的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RbsA，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)。

具体如下：

根据rbsA的基因序列设计分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物rbsA-F、rbsA-R(表1)，以L.lactis NZ9000的基因组为模板PCR扩增，获得SEQ ID NO.2所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/RbsA(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)。

电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17培养基+0.5％glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物

实施例2过量表达RbsA蛋白菌株的生长性能试验

对于考察菌株在过量表达RbsA蛋白时的生长情况，将菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)和L.lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基(1mL)中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜。再以2％的接种量将种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养。每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值。培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达RbsA蛋白。以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。

结果如图2所示。经生长性能试验分析，重组菌株的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在L.lactis NZ9000中过量表达RbsA蛋白对菌株的生长性能没有影响。

实施例3酸胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在pH 4.0条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有10μg/mL氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率。

经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RbsA)的存活率为对照的5.8倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。说明通过在L.lactis NZ9000中过量表达RbsA蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种抗酸胁迫元器件

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Ile Glu Met Lys Asn Ile Ser Lys Ser Phe Gly Thr Asn Lys

1 5 10 15

Val Leu Glu Ala Ile Asp Leu Thr Ile Asn Ser Gly Glu Val His Ala

20 25 30

Leu Met Gly Glu Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Met Asn Ile Leu

35 40 45

Thr Gly Leu Phe Pro Ala Ser Gly Gly Glu Ile Glu Ile Asp Lys Glu

50 55 60

Asp Lys Thr Phe Lys Asn Pro Gln Glu Ala Glu Gly Phe Gly Ile Ser

65 70 75 80

Phe Ile His Gln Glu Met Asn Thr Trp Pro Asp Leu Thr Val Leu Glu

85 90 95

Asn Leu Phe Leu Gly Arg Glu Ile Lys Asn Lys Phe Gly Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Lys Ala Met Arg Lys Lys Ala Thr Phe Ala Phe Glu Gln Leu Gly

115 120 125

Val Thr Ile Asp Leu Asp Lys Glu Ile Gly Asn Leu Ser Val Gly Gln

130 135 140

Gln Gln Met Val Glu Ile Ala Lys Ser Phe Leu Ser Asp Leu Lys Ile

145 150 155 160

Leu Ile Met Asp Glu Pro Thr Ala Ala Leu Thr Glu Arg Glu Thr Glu

165 170 175

Arg Leu Phe Ser Val Ile Ala Gly Leu Lys Ala Gln Gly Val Gly Ile

180 185 190

Ile Tyr Ile Ser His Arg Met Glu Glu Ile Phe Lys Ile Thr Asp Cys

195 200 205

Val Thr Val Met Arg Asp Gly Leu Val Ile Asp Thr Lys Lys Thr Lys

210 215 220

Glu Thr Asn Val Asp Glu Leu Val Arg Lys Met Val Gly Arg Ser Ile

225 230 235 240

Thr Asp Tyr Tyr Pro Gln Lys Asn Ala Lys Ile Arg Glu Ile Val Phe

245 250 255

Glu Ala Glu Asn Leu Ser Thr Ala Asp Phe Lys Asn Ile Ser Phe Ser

260 265 270

Val Arg Ser Gly Glu Ile Leu Gly Phe Ala Gly Leu Met Gly Ala Gly

275 280 285

Arg Thr Glu Val Met Arg Ala Ile Phe Gly Ile Asp Lys Leu Lys Ser

290 295 300

Gly Thr Ile Lys Ile Asn Gly Lys Ser Leu Thr Ile Asn Asn Pro Ala

305 310 315 320

Gln Ala Ile Lys Ala Gly Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Arg Lys Asp

325 330 335

Glu Gly Leu Val Leu Asp Phe Ser Ile Lys Asp Asn Ile Thr Leu Pro

340 345 350

Ser Thr Lys Asp Phe Ile His His Gly Leu Phe Asp Asp Lys Thr Ala

355 360 365

Thr Thr Phe Val Lys Gln Leu Ser Glu Arg Leu Asn Val Lys Ala Thr

370 375 380

Asp Glu Glu Gln Met Val Gly Ser Leu Ser Gly Gly Asn Gln Gln Lys

385 390 395 400

Val Val Leu Ala Lys Trp Ile Gly Ile Ala Pro Lys Val Leu Ile Leu

405 410 415

Asp Glu Pro Thr Arg Gly Val Asp Val Gly Ala Lys Arg Glu Ile Tyr

420 425 430

Gln Leu Met Asn Glu Leu Ala Glu Arg Gly Val Pro Ile Ile Met Ile

435 440 445

Ser Ser Asp Leu Pro Glu Ile Leu Gly Val Ala Asp Arg Ile Ala Val

450 455 460

Met His Glu Gly Lys Ile Ala Gly Phe Leu Asn Lys Lys Glu Ala Thr

465 470 475 480

Gln Glu Asn Val Met Gln Leu Ala Thr Gly Gly Lys

485 490

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgaaaatag aaatgaagaa catttctaaa tcatttggaa ccaacaaagt tctcgaagca 60

attgatttaa ctatcaattc tggagaagtt catgccttaa tgggggaaaa tggtgctgga 120

aaatccacgc taatgaatat tctgactgga cttttcccag cttctggtgg agaaattgag 180

attgataagg aggataaaac tttcaagaat cctcaagagg cagaaggatt tggcattagc 240

tttattcatc aggaaatgaa tacatggcct gatttaacag tcttagagaa cctttttctt 300

ggtcgagaaa taaaaaataa atttggtatt ttagatacaa aagctatgcg taaaaaagct 360

acttttgctt ttgaacaatt gggagtaact attgatttag ataaagaaat cgggaacttg 420

tcagttggtc agcaacaaat ggttgaaatt gctaaaagtt ttttatctga tttgaaaatt 480

ttgattatgg atgaaccgac agccgcgttg acagaaagag aaacagaacg tttattttca 540

gttatcgcag gccttaaagc acaaggcgtt ggtattattt atatttctca ccgaatggaa 600

gaaattttta agattaccga ttgtgtgaca gttatgcgtg atggtttggt catcgatact 660

aaaaaaacaa aagagacaaa tgttgatgag ttagttcgga aaatggttgg tcgctcaatt 720

acagattatt atccccaaaa aaatgctaaa attcgagaaa ttgtattcga agcagaaaat 780

ttatccacag ctgactttaa aaatatttcc ttttcagttc gttcaggtga aatccttggt 840

tttgcaggac tcatgggagc tggtagaacc gaggtcatgc gagcaatttt tggaattgac 900

aagctaaaat caggcacaat aaaaattaat ggaaagagcc taactatcaa taacccagca 960

caagcgatta aagcaggaat tggcttttta accgaagacc gaaaagatga agggcttgtt 1020

cttgattttt caataaaaga taatattact ctgccaagta caaaggactt tatccatcac 1080

ggactcttcg atgataaaac tgcaacaact ttcgttaaac aactttctga gcgactcaat 1140

gttaaagcaa cagatgaaga acaaatggtt ggctcattat cgggagggaa tcaacaaaaa 1200

gttgtacttg ccaaatggat tggaattgca cctaaagtat taattttaga tgaaccaaca 1260

cgtggagtcg atgtaggagc caaacgagag atttatcaat tgatgaatga actcgcagaa 1320

cgtggggttc caatcattat gatttccagt gatttacctg aaatacttgg tgtcgctgac 1380

cgaattgcag tcatgcacga aggtaaaata gccgggtttt taaataaaaa agaagcaaca 1440

caagaaaatg tgatgcagct cgcaacagga ggaaaatga 1479

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgccatgg ggttgaaaat agaaatgaag aacatttcta aatc 44

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaagctttc attttcctcc tgttgcgag 29

Claims

1.一种重组乳酸菌，其特征在于，过量表达D核糖转运ATP结合蛋白RbsA，所述D核糖转运ATP结合蛋白RbsA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组乳酸菌，其特征在于，宿主为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000，表达载体为pNZ8148。

3.权利要求1或2所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

4.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达D核糖转运ATP结合蛋白RbsA，所述D核糖转运ATP结合蛋白RbsA的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。