CN109628364B

CN109628364B - 一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法

Info

Publication number: CN109628364B
Application number: CN201910004718.0A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨佩珊; 刘为佳; 朱政明; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CN109628364A

Abstract

本发明公开了一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白，得到了在酸性条件下的耐受能力显著提高的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)以及L lactis(GlnQ)；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)对在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了15.2倍；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnQ)在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了11.4倍。

Description

一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是人类应用最早的细菌之一，早在公元前3世纪，我们的祖先就用它来制作泡菜和腌菜，长期以来，这些细菌一直被用于食品的加工制作。同时，乳酸菌中的部分益生菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。

但是，在食品工业生产过程中，随着乳酸菌菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累；此外，当乳酸菌被食用后进入胃，胃酸的产生会使胃中的pH值极低，因此，在乳酸菌的在食品工业生产过程中以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。

而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

因此，急需找到一种可提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，所述方法为以乳酸菌为宿主，过量表达微生物细胞膜上用于转运谷氨酰胺的谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或微生物细胞膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因与表达载体构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒的方法为先以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为Nco I以及Xba I。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒的方法为先以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述构建含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为Nco I以及Hind III。

本发明还提供了利用上述方法制备得到的在酸性条件下的耐受能力提高的乳酸菌。

本发明还提供了上述方法在提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力方面的应用。

本发明还提供了上述方法或上述制备得到的在酸性条件下的耐受能力提高的乳酸菌在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白可显著提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白，得到了在酸性条件下的耐受能力显著提高的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)以及L lactis(GlnQ)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)对在酸性条件下的耐受能力较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了15.2倍；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnQ)对在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了11.4倍；

(4)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌在构建时具有成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的优势，可适应大规模工业化生产。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148-glnP的结构图。

图2：重组质粒pNZ8148-glnQ的结构图。

图3：重组质粒pNZ8148-oppB的结构图。

图4：重组质粒pNZ8148-malF的结构图。

图5：重组菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)、L lactis(OppB)、L lactis(MalF)和对照菌株的生长曲线。

图6：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株L lactis(GlnP)与对照菌株的存活率对比。

图7：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株L lactis(GlnQ)与对照菌株的存活率对比。

图8：重组菌株L lactis(GlnP)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。

图9：重组菌株L lactis(GlnQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。

图10：重组菌株L lactis(GlnP)和对照菌株酸胁迫前后的胞内谷氨酸含量对比。

图11：重组菌株L lactis(GlnP)和对照菌株酸胁迫前后的胞内天冬酸含量对比。

图12：重组菌株L lactis(GlnQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内谷氨酸含量对比。

图13：重组菌株L lactis(GlnQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内天冬氨酸含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及琼脂条2％(m/v)，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。

GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)的琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的glnP基因序列(glnP基因是编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因，谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP是膜上用于转运谷氨酰胺的蛋白)、如SEQ ID NO.2所示的glnQ基因序列(glnQ是编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因，谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ是膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的蛋白)、如SEQID NO.3所示的oppB基因序列(oppB是编码肽转运系统通透酶OppB的基因，肽转运系统通透酶OppB是膜上用于转运寡肽的蛋白)、如SEQ ID NO.4所示的malF基因序列(malF是编码麦芽糖ABC转运蛋白通透酶MalF的基因，麦芽糖ABC转运蛋白通透酶MalF是膜上用于转运麦芽糖的蛋白)，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；

(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的基因片段；

(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148-glnP(结构如图1所示)、pNZ8148-glnQ(结构如图2所示)、pNZ8148-oppB(结构如图3所示)和pNZ8148-malF(结构如图4所示)；

(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)、L lactis(OppB)和L lactis(MalF)；

其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物与酶切位点

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)、L lactis(OppB)和L lactis(MalF)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔一定时间取样，测定600nm波长下的OD值；

(4)培养至OD₆₀₀ 0.4时加入10ng/mL的Nisin诱导表达转运蛋白，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图5所示)。

结果如图5所示，经生长性能试验分析，重组菌株L lactis(GlnP)和L lactis(GlnQ)的生物量与对照菌株没有太大差距，这说明在L lactis NZ9000中过量表达GlnP和GlnQ蛋白对菌株的生长性能没有影响；然而，重组菌株L lactis(OppB)和L lactis(MalF)的生物量明显低于对照菌株，说明在L lactis NZ9000中过量表达BglF和OppB蛋白会影响菌株的正常生长。因此，后续实验对能正常生长的重组菌株L lactis(GlnP)和L lactis(GlnQ)的耐酸性能进行试验。

实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，分别胁迫1.5h、2.5h以及3h；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图6-7所示)；

其中，存活率＝(N/N₀)×100％；

式中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。

由图6-7可知，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株Llactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)的存活率为分别对照的15.2、11.4倍，说明重组菌株Llactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)对酸胁迫的耐受性明显提高。

实施例4：重组菌株胞内ATP含量的测定

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫1h，取4.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，用ATP检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定胞内ATP的含量(结果如图8-9所示)。

由图8-9可知，酸胁迫前后重组菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)胞内ATP含量均高于对照菌株，其中，由图8可知，在pH 4.0的GM17中胁迫1h后重组菌株L lactis(GlnP)的胞内ATP含量是对照菌株的1.92倍，由图9可知，在pH 4.0的GM17中胁迫1h后重组菌株L lactis(GlnQ)的胞内ATP含量较是对照菌株的1.4倍，这表明重组菌株可以释放更多的ATP，满足胁迫条件下细胞对能量的需求，进而增强L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性。

实施例5：重组菌株胞内氨基酸含量的测定

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(GlnP)、L lactis(GlnQ)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫3h，取10.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，应用高效液相色谱仪对重组菌株胞内氨基酸含量进行检测(结果如图10-13所示)；

其中，高效液相色谱仪检测样品的制备：取1mL磷酸缓冲液重悬菌体，菌悬液转移至破碎管，使用FastPrep-24振荡破碎细胞(4.0m·s^-1)至菌悬液澄清；离心，取上清500μL，加等体积5％(m/v)的三氯乙酸(TCA)，静止放置30min去除可溶性蛋白；离心，取上清液，用水系滤膜(0.2μm)过滤到干净的样品瓶中备用；

高效液相色谱仪分析方法：OPA和硼酸进行柱前衍生；柱温设定为40.0℃；流速设定为1.0mL·min^-1；紫外检测器的波长为338nm；色谱柱选用ODS HYPERSIL(250.0mm×4.6mm×5.0μm)。

由图10可知，酸胁迫前重组菌株L lactis(GlnP)胞内谷氨酸含量低于对照菌株，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株L lactis(GlnP)胞内谷氨酸含量明显高于对照菌株，是对照菌株的1.65倍，表明重组菌株L lactis(GlnP)可以在酸胁迫过程中维持相对较高的谷氨酸含量，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，生成碱性较强的γ-氨基丁酸并释放CO₂；由图11可知，酸胁迫前重组菌株L lactis(GlnP)胞内天冬氨酸含量低于对照菌株，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株L lactis(GlnP)胞内天冬氨酸含量明显高于对照菌株，是对照菌株的1.47倍，表明重组菌株L lactis(GlnP)可以在酸胁迫过程中维持相对较高的天冬氨酸含量，天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，脱掉β位置的羧基，生成丙氨酸和CO₂，有效维持胞内pH的相对平衡。可见，重组菌株L lactis(GlnP)可通过调节氨基酸代谢，消耗胞内H⁺，生成碱性物质，从而维持胞内pH的稳态，进而帮助细胞抵御酸胁迫。

由图12可知，酸胁迫前重组菌株L lactis(GlnQ)胞内谷氨酸含量低于对照菌株，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株L lactis(GlnQ)胞内谷氨酸含量明显高于对照菌株，是对照菌株的1.53倍，表明重组菌株L lactis(GlnQ)可以在酸胁迫过程中维持相对较高的谷氨酸含量，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，生成碱性较强的γ-氨基丁酸并释放CO₂；由图13可知酸胁迫前重组菌株L lactis(GlnQ)胞内天冬氨酸含量低于对照菌株，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株L lactis(GlnQ)胞内天冬氨酸含量明显高于对照菌株，是对照菌株的1.88倍，表明重组菌株L lactis(GlnQ)可以在酸胁迫过程中维持相对较高的天冬氨酸含量，天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，脱掉β位置的羧基，生成丙氨酸和CO₂，有效维持胞内pH的相对平衡。可见，重组菌株L lactis(GlnQ)可通过调节氨基酸代谢，消耗胞内H⁺，生成碱性物质，从而维持胞内pH的稳态，进而帮助细胞抵御酸胁迫。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagaaat tatttttcgc tctggcactc atgtttgcca ctgttacagc tttcctagta 60

gcgccttcgg tcaaggccga gacgactgtc aaaatcgcgt ctgatagctc ttatgcacca 120

tttgaatttc aaaatggtca gaaaaaatgg gtaggcatcg acgttgatgt tatgcaagaa 180

gttgcaaaaa tcaatgattg gaaattagaa atgtcttacc caggttttga tgctgcactt 240

caaaatctca aagctggaca agtagacggt gtaattgctg gaatgacaat caccgatgaa 300

cgtaaagaca cttttgattt ttctaatcct tactatacat ctgcactaac tattgcgact 360

accaaagatt ctaagcttac tgattatagt gaacttaaag gaaaagcagt tggagcaaaa 420

aacggaactg ccgctcaaac ttggcttcaa gaaaatcaaa agaaatatgg ctataacatc 480

aaaacctatt ctgatggtgt tcatatgttt gcctcactta gttcaggaaa catcgtagga 540

gcaatggatg aagttccagt tatctcttat gctatgaaac aaggtcaaga tttagctaca 600

aacttccctt ctatctctct ttcaggaggt tatggttttg ctgtgatgaa aggcaaaaac 660

caaacgctcg tggatggttt caataaagca ttgactgaaa tgaaatcaaa tggagattat 720

gataaaatcc tgaaaaaata tggaataaca acttctaaaa aagcaacacc gaaaaaagat 780

gtttatacca ttgcctcaga taatagcttt gccccttttg aatttcaaaa tgacaacaaa 840

caattcactg gtatcgacgt tgacttacta aatgccatcg ccaagaacca aggattcaaa 900

ctcaaatgga atttcattgg tttccaagca gctgttgact ctgttcaatc tggtcatgct 960

gacggaatga tgtcagggat gtcaattacc gatgcccgta aacaagtttt tgattatggt 1020

aatccttact attcatctaa cttaaccatt gctacatcaa gtaccgatga ttctatcaaa 1080

tcatggaaag acctaaaagg taaaacactt ggggctaaaa acggtactgc ctctttcgat 1140

tatcttaatg atcacgcaaa agaatacggt tatactgtaa aaacatttac tgatgcaaca 1200

accatgtact catcattaaa taacggctct atcaatgctt taatggacga tgaacctgtc 1260

atcaaatatg ccattaaaca aggacaaaaa tttactacac caattaaacc aatccctgac 1320

ggtcaatatg gatttgccgt taaaaaagga agcaatcctg aactgattga aatgtttaat 1380

aatggtttag ctaatctccg tgcaaatggt gaatatgata aaatcattga taaatattta 1440

gctagtgata ctaaaaccat tcaatcaagt gcaaaagaaa atactttctt tggtattttg 1500

caaaacaact gggaacaaat cggacgcggg ttgctcgtta cacttgaact tgctgttctc 1560

tcatttatcc tagcaatgat tgtcggaatt atctttggac tcttctctgt agctccaagc 1620

aagattcttc gtacaattgc acgaatttat gtcgacctta accgttcaat tccgctttta 1680

gtgttaacaa tctttatctt ctacgggatt cctaaccttc tacaaatcat tactggtcat 1740

caatctccac tcaatgaatt tacggccggt gttattgccc ttaccttaaa ctcttctgct 1800

tatatcgcag aaatcgttcg ttctggtgtc caagcagtac cttctggaca aatggaagcc 1860

agccgttcac ttggtgtgac atacctaact tcaatgcgta aggttatctt gcctcaagcc 1920

attaaaatca caattcctag cttgattaac caattcatca tcactttgaa agatacaaca 1980

ttggtttcag ttatcggact tgttgaatta ctccaaacag gtcaaatcat cgtggcccgt 2040

aacttccaag ccttccgcgt ttatgggtta attggtttag tttacatgat tgttcttctc 2100

ttcttgatgt gggttggacg tcgtgtagaa aaaagaatga aataa 2145

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggaatca atactcaaat tgaagtcact gatcttcaca aatcttttgg aaaaaatgaa 60

gttctaaaag gaattactac aaaatttgaa aaaggggatg tcgtatgtat tatcggtccc 120

tcaggttctg gaaaatcgac ttttcttaga gctttgaatg gtcttgaaac agctacttct 180

ggtgatatca ttattgacgg atttaatctg actgataaaa atacaaatct caatctcgtt 240

cgtcaaaacg ttggaatggt ctttcaacat ttcaatcttt ttccaaacat gactgttttg 300

caaaatatta cttatgcccc aattgagttg aaaaaattat ctaaagatga tgcaaatgaa 360

aaagccatgc agcttctcga aacagttggc ttggtagata aaaaagacgc gatgccagaa 420

atgctttctg gaggacaaaa acaacgtgtt gcgattgctc gtgccctcgc aatgaatcct 480

gatgttatgc tctttgatga gccaacctca gcgcttgacc ctgaaatggt cggagatgtc 540

ctcgcggtta tgcaaaaact tgctgaagaa ggaatgacaa tgttaattgt cactcacgaa 600

atgggctttg ctcgtaaagt tgccaatcgc gtgattttca ctgatggtgg agtaatccta 660

gaagatggta cccctgaaga actttttgac aatcctaaac atccacgttt acaagacttt 720

ttatcaaaag ttttaaatgc ctaa 744

<210> 3

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtggaaag taattattag acgtatttta ttgatgatcc ctcaattatt tatcttgagt 60

attcttgttt tcttctttgc taaattgatg cctggtgatc ctttttcagg gttgattggt 120

cctcataccg acccacatga agttgaagca ttaagacggg cagcaggttt atatgaccct 180

tggtgggagc agtatctcag gtggctaggg aatgccatac atgggaattt aggaatgtcc 240

tataatctca aagagcctgt gatgactgtc attggacata gagcgattaa tactttttgg 300

atgtcacttt tgtcagttat tttaacttac ttatttgcta ttccgatgtc gatagttgca 360

gctcgaaatg aaggaaaatg gcaagaccaa ttgtggttga cctataattc aattactttt 420

ggtattccac cttacgtatt ctatctcttg attatcttta tctttggtta tagtcttaat 480

tggtttccga caggtgggac ggtaagtcca gatgcgatgg gaataattcc tgttttcttt 540

agtaagattt atcacatgat tcttccggct tttagtttgg cggtctttgg aacagttgga 600

atctttactt acttccgctc aggaatttta gatgaacaaa cacaagatta tgtacgaacg 660

gctcgagcca aaggggttaa ggaaaaagtg atttttagac gtcatatttt gagaaatgcc 720

tcattaccaa ttgcttctaa ttttggattt gtgattactg gactcttggg aggagcaatc 780

tttgctgaaa caattttcgg ctatcctggc ttaggacaac tttttattac ttcaatatct 840

gggcgagatt attcaatgat tacggctttg attttattaa atggtttttt gggacttctt 900

ggagccctcc tgtcggatat tatcatggca atggttgacc cacgaattcg gattcaataa 960

<210> 4

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgactaaaa agaaaaaaag aaaacaaacc gaaagtaatg tttctcctga agaaaaatct 60

attaaactac gtgaagtttt ccaaaaaggt aataccgtta caaaattaac tttcttcgtg 120

atgggcctga atcaaataaa aaacaaacag tgggtaaaag gatttacttt cttaattctt 180

gaaattgcat ttattggttg gcttcttttc tctggactta gtgctttttc tcttttgagt 240

agcttaggtc caaataaaac acttaaagaa acaacagacg ccaatggctt tccagttatt 300

attcaacccg atcactctgt tttgatttta ctttggggac tcattgcttg tcttgtcgtt 360

gttctcttta ttttacttta ctggttcaac tatcgttcaa acaaacatct ctactattta 420

gaacgggaag gcaaacatat ccctacaaat agagaagaac ttgcatccct acttgatgaa 480

aaactctatg cgacattaat ggctgttcct ttaattggag ttctagcttt cactgttttg 540

cctactgttt acatgatttc gatggctttc acaaactatg atcgtctaca tgctactgct 600

ttctcatgga ccggttttca agcctttggt aatgtcttaa ccggggattt agcgggaaca 660

ttcttccccg ttcttggttg gacattagta tgggcaattg tagcaacagc aacaacattt 720

ctcggtggtg ttttacttgc cttactcatt gagtcaactg gaattaaatt taaaggattc 780

tggagaacag tttttgttat cgtctttgcc gttccacaat ttgtaaccct attaatgatg 840

gcacaatttt tggaccaaca aggagctttt aatggaattt tgatgaatct tcatctaatt 900

tccaatccga tcaactttat tggtgcggct tctgacccaa tggttgcaag aatcactgtt 960

atatttgtta atatgtggat tggtatccct gtttcaatgc ttgtatctac agcaattatc 1020

caaaaccttc cccaagacca aatcgaagct gcacgtattg atggagcaaa tagtttaaat 1080

atcttccgtt ctatcacttt tcctcagatt ctctttgtta tgactcctgc attgattcaa 1140

caatttattg gtaacatcaa taacttcaat gttatttatc tactaacgca aggttggcca 1200

atgaatccaa actaccaagg agcaggttca accgaccttc ttgttacttg gctctacaac 1260

ctcgtctttg gtcaaactca acgttacaat gctgccgctg ttcttggtat cttgattttc 1320

attgttaatg catcaatttc attagtagca taccgtcgta ccaatgcatt taaggagggc 1380

taa 1383

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catgccatgg ggatgaagaa attatttttc gctctgg 37

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagatt atttcattct tttttctaca cgacg 35

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgccatgg ggatgggaat caatactcaa attgaag 37

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccaagctttt aggcatttaa aacttttgat aaaaag 36

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catgccatgg ggatgtggaa agtaattatt agacgtattt tatt 44

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccaagcttt tattgaatcc gaattcgtgg g 31

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catgccatgg ggatgactaa aaagaaaaaa agaaaac 37

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccaagcttt tagccctcct taaatgcatt g 31

Claims

1.一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述方法为以乳酸菌为宿主，过量表达微生物细胞膜上用于转运谷氨酰胺的谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或微生物细胞膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ；编码所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

2.如权利要求1所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述过量表达为先将编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因与表达载体构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

3.如权利要求2所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体。

4.如权利要求3所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为Nco I以及Xba I。

6.如权利要求3所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQID NO.7、SEQ ID NO.8所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒。

7.利用权利要求1-6任一所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

8.权利要求1-6任一所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

9.权利要求1-6任一所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法或权利要求7所述的制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。