FR2753202A1 - Bacteries multiresistantes, procedes d'obtention et utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des bactéries présentant une résistance aux stress améliorée par rapport à la souche sauvage, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une mutation dans un gène qui altère l'activité normale dudit gène, ce gène étant impliqué dans le transport d'électron, d'acides aminés, d'oligopeptides, du phosphate ou dans le métabolisme de l'arginine et choisi parmi: - les gènes de la voie de biosynthèse du GTP, pppGpp ou ppGpp, - les gènes du clone SS80, R1.4, GlnQ, de la carbamoyl phosphate synthétase, GlnH, GlnJ, R1.14, GlnP, R1.20, Rel, d'un transporteur ABC hypothétique (R2.6), AhrC, SupE, R2.15, R2.16, R2.17, d'une protéine hypothétique de B. subtilis (R2.20), pstB, tktA et trl1.

Description

La présente invention concerne des nouvelles souches de bactéries lactiques présentant des résistances aux stress, le procédé d'obtention desdites souches ainsi que leur utilisation notamment dans des procédés de fermentation.

L'un des facteurs importants dans les procédés de fermentation est la qualité de la croissance et de la survie des ferments bactériens, ainsi que la survie bactérienne dans le produit final. Ainsi, les souches qui se sont révélées croître très bien en laboratoire peuvent tout à fait se révéler sensibles à des conditions de stress intervenant lors des fermentations industrielles, par exemple par acidification du milieu (qui est une conséquence naturelle de la croissance), augmentation de la température, présence ou absence d'oxygène, présence de sel (en particulier pour la préparation des fromages) ou problèmes liés au froid (durant le stockage).

Des taux de survie insuffisants des bactéries peuvent conduire à des mauvaises fermentations et à un accroissement de la mortalité dans la conservation des cultures ferments.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet de nouvelles souches bactériennes qui présentent une résistance accrue aux stress.

De façon générale, la croissance bactérienne dans les laboratoires a été étudiée depuis des dizaines d'années et on sait que la courbe de croissance des bactéries en laboratoire suit une courbe de croissance sigmoïde, ainsi, lors de l'inoculation d'un milieu frais, il y a une période de latence pendant laquelle la bactérie se prépare à la croissance, suivie par une multiplication cellulaire dans laquelle les cellules croissent de manière exponentielle jusqu'à ce que le milieu devienne une condition limitante pour la croissance. C'est à ce point que les cellules rentrent dans ce qui est appelé la phase stationnaire durant laquelle la multiplication est arrêtée et le métabolisme des cellules diminue. La survie durant ces trois phases de croissance, c'est-à-dire les phases de latence, exponentielle et stationnaire, peut varier de façon très importante en fonction des conditions spécifiques de croissance et du type de souche utilisée. Bien que les conditions de laboratoire soient des conditions optimales pour la croissance, dans les processus de fermentation industrielle on peut trouver des conditions qui conduisent à la mort des bactéries. Ci-après on donne des exemples dans lesquels la survie des bactéries lactiques dépend des conditions de croissance.

1. L. lactis, comme d'autres bactéries lactiques, acidifient le milieu durant leur croissance et sont capables de supporter les conditions acides allant jusqu'à pH 4, pH qui est atteint durant la phase stationnaire. Toutefois, si le milieu de culture est acidifié brutalement durant la phase exponentielle, les cellules meurent rapidement. Les cellules peuvent être adaptées à des bas pH en les exposant tout d'abord à des pH intermédiaires, entre pH 5 et 6 par exemple, avant de passer à des pH plus bas. Dans ce cas, on obtient une meilleure survie.

2. Les cellules de L. lactis meurent si elles sont exposées à des hautes températures (par exemple 55"C). Toutefois, si on les expose à des températures intermédiaires (37"C) avant un choc thermique, on note une meilleure survie des cellules.

3. L'oxygénation par agitation constitue une partie du processus de fermentation, L. lactis est tolérant à l'oxygène durant la croissance.

Néanmoins, les cellules oxygénées meurent plus rapidement lorsqu'elles entrent dans la phase stationnaire.

4. Lors de la préparation du fromage durant la phase de maturation on ajoute du sel. Les cellules en phase stationnaire sont plus résistantes au traitement par le sel que dans la phase exponentielle.

Ces exemples montrent des conditions de stress qui peuvent conduire à une survie très faible de L. Jactais, même si dans certains cas le taux de survie peut être augmenté par une préadaptation des cellules à ce stress.

L'existence d'un mécanisme de résistance au stress a été établie dans toutes les bactéries examinées jusqu'à présent. Dans chaque cas, un stress particulier conduit à l'induction de l'expression d'un ensemble de gènes qui aide la cellule à s'adapter au stress. Les différentes protéines qui sont synthétisées en réponse au stress sont souvent fortement conservées. De nombreux gènes requis pour un stress particulier, par exemple l'endommagement de l'ADN (induit par l'oxygène ou les rayonnements ultraviolets) ou le choc thermique, ont été identifiés dans L. lactis par homologie avec les gènes connus dans E coli ou d'autres organismes. Les gènes du choc thermique (Heat shock genes) comprennent notamment dnaj, grpE-dnaK, groELS et hflB. Les gènes à impliquer dans la réparation des dommages causés par l'oxygène comportent notamment recA et sodA.

Néanmoins, chaque espèce bactérienne présente une niche spécifique et doit par conséquent être adaptée à son environnement particulier. Dans ces conditions, la régulation des gènes de réponse au stress doit être différente pour différents organismes.

Il existe un grand nombre d'informations concernant le contrôle de réponse aux stress dans différentes bactéries. Essentiellement deux types de contrôle semblent exister : un type de contrôle qui induit les gènes en réponse seulement à un stress spécifique, l'autre type de contrôle résultant en l'expression de nombreux gènes qui vont protéger la cellule contre différents types de stress. Dans les bactéries, le premier type de contrôle peut se faire par l'intermédiaire d'activateurs ou de represseurs, tandis que le second type de contrôle peut être effectué par les enzymes de transcription, l'ARN polymérase (par les facteurs o).

Dans E. coli, le facteur a impliqué dans la réponse aux stress en général, est as, le facteur a de la phase stationnaire. Dans B. subtilis, la réponse aux stress générale semble être un facteur crB. Dans L. lactis, aucun facteur a de stress spécifique n'a pu être isolé. Toutefois, il existe une évidence physiologique d'une protection croisée lorsqu'on expose les cellules à un stress déterminé. Par exemple en soumettant L. lactis à une irradiation on obtient un taux de survie amélioré en présence d'acide, d'éthanol, d'H2 02 ou d'un choc thermique. Les résultats montrent que le gène recA est nécessaire pour une résistance complète à l'oxygène et à la chaleur. En outre, conformément aux observations sur E coli, les cellules en phase stationnaire non adaptées de L. lactis sont plus résistantes aux stress que les cellules en croissance exponentielle. Ces résultats suggèrent qu'une réponse générale aux stress est induite à la fois en cas d'insuffisance du milieu de croissance ou lorsque les bactéries sont soumises à un stress particulier. Jusqu'à présent, rien n'était connu sur la régulation de ces systèmes, ni sur les gènes qui y étaient impliqués.

La présente invention concerne la mise en évidence des gènes impliqués dans la résistance aux stress et dont la mutation conduit à une augmentation de la résistance aux stress des bactéries correspondantes.

C'est pourquoi la présente invention concerne des bactéries présentant une résistance aux stress améliorée par rapport à la souche sauvage, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une mutation dans un gène qui altère l'activité normale dudit gène, ce gène étant impliqué dans le transport d'électron, d'acides aminés, d'oligopeptides, du phosphate ou dans le métabolisme de l'arginine et choisi parmi - les gènes de la voie de biosynthèse de la pppGpp ou de la ppGpp, - les gènes du clone SS80, R1.4, GlnQ, de la carbamoyl phosphate synthétase,
GlnH, GlnJ, R1.14, GlnP, R1.20, Rel, d'un transporteur ABC hypothétique
(R2.6), AhrC, SupE, R2.15, R2.16, R2.17, d'une protéine hypothétique de B.

subtilis (R2.20), pstB, tktA et trll.

Avantageusement, le gène de la voie de biosynthèse du GTP, pppGpp ou ppGpp est choisi parmi deoB, hpt, guaA, relA/spoT, gppS.

Comme cela sera démontré dans l'exemple, une mutation introduite dans ces gènes conduit à l'augmentation de la résistance aux stress qui dans la plupart des cas sera une résistance multiple.

I1 faut préciser que la terminologie employée "altération de l'activité normale dudit gène" peut également comporter une diminution voire une augmentation de l'activité du gène lorsque celui-ci conduit à une amélioration de la résistance aux stress.

La mutation en cause pourra être aussi bien une mutation par insertion d'une séquence d'ADN, délétion d'une séquence d'ADN et/ou mutation ponctuelle au moyen par exemple d'un agent mutagène.

De préférence, les mutations seront obtenues par les techniques de recombinaison génétique.

Dans le cas d'insertion d'une séquence d'ADN, on préfèrera tout particulièrement l'introduction d'éléments génétiques mobiles tels que des séquences d'insertion comme cela sera décrit dans l'exemple avec ISS1.

Bien entendu, il est possible de prévoir d'autres techniques assurant la mutation en cause, on pourra utiliser les systèmes de mutation connus de l'homme du métier ainsi que les insertions ou autres modifications d'ADN obtenues par les techniques de recombinaisons homologues.

De préférence, lorsque l'ADN sera inséré, il s'agira d'un ADN provenant de la même espèce, ceci de façon à garder l'acceptabilité sur le plan agro-alimentaire de la souche ainsi obtenue.

Parmi les bactéries multiples qui pourront bénéficier des avantages de la présente invention, il faut citer tout particulièrement les bactéries lactiques en particulier Lactobacillus et Lactococc us.

Comme cela sera montré dans l'exemple, on a pu insérer des séquences d'ADN dans les gènes qui ont été ensuite déterminés, les bactéries ainsi obtenues présentent un accroissement de la résistance à certains stress ou bien à un ensemble de conditions de stress. Il est possible d'envisager des mutations multiples sur différents gènes. Pour chaque problème spécifique posé, il est préférable de composer un ensemble de bactéries mutées dans différents gènes et de sélectionner les mutants les plus appropriés pour les conditions de stress qui sont susceptibles de survenir durant le procédé de fermentation.

Bien que l'on préfère utiliser les méthodes mettant en oeuvre les
ADN recombinants, il est également possible de prévoir de sélectionner des mutants dans les mêmes gènes par des moyens traditionnels de mutations en sélection en particulier lorsque l'on connaît, comme cela sera décrit ci-après, les voies métaboliques dans lesquelles sont impliqués les gènes en cause et que l'on aura les moyens d'agir directement sur ces voies métaboliques par l'intermédiaire d'agents mutagènes appropriés.

La présente invention concerne également un procédé de fermentation mettant en oeuvre une bactérie selon la présente invention et en particulier les procédés de fermentation utilisant comme milieu de fermentation le lait ou des sous-produits du lait. On peut également envisager l'utilisation de ces bactéries pour la production des ferments.

Parmi les fermentations qui peuvent bénéficier des bactéries selon la présente invention, il faut citer en particulier les produits lactés fermentés tels que les yaourts et produits équivalents ainsi que la préparation des fromages.

Les bactéries conformes à la présente invention peuvent également être utilisées pour la conservation des produits alimentaires ou à des fins probiotiques.

I1 est important de rappeler que les gènes décrits dans le cadre de la présente invention ont pour un grand nombre d'entre eux été isolés chez
Lactococcus mais que leurs équivalents existent chez E. coli dans d'autres souches. Dans ces conditions, la présente invention n'est nullement limitée à des fermentations de type lactique mais peut également s'envisager pour d'autres bactéries et d'autres types de fermentations.

La Figure 1 illustre le système de mutagénèse via le plasmide pGh
ISS1.

La Figure 2 illustre l'obtention de mutants dépourvus d'ADN étranger.

La Figure 3 illustre le procédé d'identification du gène muté.

La Figure 4 représente la voie de biosynthèse du GTP, pppGpp ou ppGpp.

La Figure 5 liste les séquences des gènes mutés, à l'origine de la multirésistance, aux jonctions de l'insertion plasmidique, les microorganismes concernés étant issus de ce que l'on a appelé la Sélection 1 dans l'exemple.

La Figure 6 liste les séquences des gènes mutés, à l'origine de la multirésistance, aux jonctions de l'insertion plasmidique, les microorganismes concernés étant issus de ce que l'on a appelé la
Sélection 2 dans l'exemple.

La Figure 7 liste les séquences des gènes mutés par mutagénèse dirigée.

La Figure 8 liste les séquences des gènes mutés, à l'origine d'une résistance à l'acide supérieur à la souche parentale (données non montrées) aux jonctions de l'insertion plasmidique, les mutants étant issus de la
Sélection 1.

La Figure 1A représente une cellule de microorganisme avec son chromosome, dans laquelle a été introduit par transformation le plasmide pGh: ISS1 lequel contient le réplicon pG+host (Ts ori), un gène de résistance à un antibiotique (AbR) et un élément mobile ISSU. A 30"C, le plasmide se réplique dans la cellule du microorganisme.

La Figure 1B représente la population de cellules bactériennes mutantes résultant de l'intégration du plasmide dans le chromosome bactérien après duplication de 1'lSS1. En effet, à 37"C, la replication plasmidique est inactive et le plasmide est perdu sauf si la bactérie subit un événement de transposition.

La Figure 2A représente la structure chromosomique d'un mutant obtenu par transposition de l'lSSl dupliqué. Les éléments ISS1 encadrent le plasmide pG+host. A 30"C, la replication du pG+host est activée et stimule la recombinaison homologue entre les séquences ISS1 dupliquées.

La Figure 2B représente la recombinaison homologue ayant lieu entre les deux séquences ISS1 aboutissant à l'excision du plasmide pGh : ISSU qui est ensuite perdu lorsque la souche est étalée à la température non permissive de 37 C. Suite à l'événement de recombinaison, la souche mutée contient seulement un exemplaire de l'ISSl qui est une séquence originaire du microorganisme muté, lequel ne contient donc aucune trace d'ADN étranger.

La Figure 3 représente le clonage des jonctions entre l'ISSl et le chromosome. Les sites de restriction HindIII et EcoR1 sont uniques dans la structure transposée et se situent de part et d'autre du plasmide pG+host. La digestion par HindIII de l'ADN chromosomique du mutant produit un fragment constitué du pG+host et de la jonction droite ISS1 - chromosome.

Après circularisation, ce fragement s'établit comme un plasmide chez E. coli..

La jonction est alors séquencée au moyen d'amorces correspondant à la séquence de l'ISSl ou à celle du pG+host. La jontion gauche ISS1 chromosome est obtenue en appliquant la même procédure après digestion par EcoR1 de l'ADN chromosomique du mutant.

La Figure 5 liste les séquences des gènes mutés telles qu'elles ont pu être déterminées conformément au protocole illustré par la Figure 3. Un code en "R" a été donné pour identifier chaque gène concerné. Chaque jonction séquencée a été comparée, en terme d'homologie, aux séquences de microorganismes déjà connues, et quand l'une d'entre elles a été identifiée, elle a été mentionnée. NS signifie qu'aucune homologie significative avec un gène déjà connu n'a pu être établie. La donnée numérique apparaissant (pour chaque jonction identifiée), correspond à la probabilité qu'a la séquence représentée de ne pas être identique aux gènes déjà connus mentionnés.

La Figure 6 liste les séquences des gènes mutés telles qu'elles ont été déterminées conformément au protocole illustré par la Figure 3 (sauf indications contraires).

La Figure 7 représente les séquences de fragment interne de certains gènes dont on avait déjà déterminé la séquence des jonctions conformément à la Figure 5. Le fragment interne du gène en question a été amplifié par PCR puis séquencé sur les deux brins. Ces fragments ont ensuite été utilisés pour inactiver, par recombinaison homologue, les gènes correspondants dans la souche sauvage de façon à vérifier que les phénotypes de multirésistance étaient bien dus à l'inactivation de ces gènes.

La Figure 8 ne concerne que des gènes dont l'inactivation a permis de mettre en évidence au moins une résistance à l'acide des souches concernées.

La présente invention sera mieux comprise au moyen de l'exemple qui suit. Cet exemple n'est cependant qu'illustratif et ne limite aucunement l'invention.

EXEMPLE
Lactococcus lactis est une bactérie qui, à l'état sauvage, présente les caractéristiques suivantes - sur un milieu à 30"C, que le pH soit de 7 ou de 5,5, elle présente une même
efficacité d'étalement - sur un milieu à 37"C, l'efficacité d'étalement sur pH 7 est 104 fois
supérieure à celle obtenue sur pH 5,5.

Deux groupes de mutants de Lactococcus lactis ont été sélectionnés.

Un groupe de mutants, appelé Sélection 1, est issu de la souche sauvage MG1363 de Lactococcus lactis et est constitué de mutants présentant à 37"C une efficacité d'étalement sur un milieu à 37"C à pH 5,5 comprise entre 1 et 0,01 par rapport à ph 7. Une trentaine de mutants ont ainsi été isolés.

Un deuxième groupe de mutants, appelé Sélection 2, est issu de la souche sauvage MG1363 de Lactococcus lactis préalablement mutée dans le gène recA la rendant sensible à la température. Cette souche, appelée
VEL1122 est sensible à la tempéraute. On a constaté qu'à la température de 39,3 C (avec un pH du milieu d'environ 7 mais non déterminant) la souche recA présentait une efficacité d'étalement inférieure à 10-8 quand la souche sauvage MG1363 présentait une efficacité d'étalement de 1. On a sélectionné des mutants à partir de la souche VEL1122 capables de croître à une température de 39,3"C. Une vingtaine de mutants ont ainsi été isolés.

Les mutants de la Sélection 1 et de la Sélection 2 ont été obtenus après mutagénèse par l'intermédiaire du plasmide thermosensible pGh : 1551 (cf. référence 16). Ce plasmide se compose du réplicon pc+host (Ts ori), d'un gène de résistance à un antibiotique (dans le cas présent l'érythromycine) et de l'élément mobile ISS1 (cf. Figure 1). Ce plasmide présente la particularité de se répliquer dans les cellules à 30"C, mais pas à 37"C. Ce plasmide peut s'intégrer dans le chromosome des bactéries via un événement de transposition de 1'ISS1. Lors de la transposition, la totalité du plasmide, flanquée de part et d'autre de l'IS51 est intégrée dans le chromosome. Les sites d'intégration du transposon sont aléatoires. Les bactéries ayant intégré dans leur chromosome le plasmide pGh : 1551 conservent donc une résistance à l'érythromycine à 37"C. Par conséquent, parmi les bactéries ayant subi la susdite mutagénèse, on sélectionne celles encore capables de croître en présence d'antibiotiques sur un milieu à 37"C. Ces bactéries ont subi un événement de transposition qui génère des mutations aléatoires.

Par rapport au nombre de bactéries de départ contenant le pGh ISS1 , on obtient de 1 à 5 % de bactéries mutantes. A partir de cette population de bactéries mutantes, des mutants plus résistants aux stress ont été sélectionnés suivant les méthodes précédemment indiquées (Sélection 1 ou 2).

Les mutants résultant des Sélections 1 et 2 sont soumis à une température de 30"C qui active la réplication du pG+host et stimule la recombinaison homologue entre les séquences ISS1 dupliquées ce qui aboutit à l'excision du plasmide pGh :1551. Les bactéries en question ne contiennent donc, inséré dans leur chromosome, plus qu'un exemplaire de l'ISSl (cf.

Figure 2).

Les bactéries Lactococcus lactis ainsi obtenues (mutants Sélection 1 ou Sélection 2), sont ensuite soumises à différentes conditions de stress à l'égard desquelles leur résistance a été testée comparativement à celle de la souche parentale soumise aux mêmes conditions.

Chaque fois qu'il a été constaté qu'une souche présentait une résistance supérieure à celle de la souche parentale, on a cherché à identifier le gène responsable de cette résistance, c'est-à-dire le gène au niveau duquel le plasmide pGh: : ISSU s'était inséré. Les jonctions entre l'ISS1 et le chromosome ont donc été clonées puis séquencées. Puis, les séquences ainsi déterminées ont été comparées aux séquences des banques de données afin de rechercher le degré d'homologie qu'elles présentaient avec d'autres gènes connus issus des bactéries lactiques ou d'autres organismes (cf. Figure 3).

Les résultats de ces tests sont rassemblés dans le tableau I pour ce qui concerne une partie des mutants issus de la Sélection 1 et dans le tableau II pour ce qui concerne les mutants issus de la Sélection 2.

Les gènes identifiés dans le tableau I correspondent à ceux listés dans la Figure 5.

Les gènes identifiés dans le tableau II correspondent à ceux listés dans la Figure 6.

Ces tableaux rassemblent des données calculées par rapport à la mesure de la résistance à chacun des stress concernés de la souche parentale qui sert donc de référence. En fonction des conditions imposées, on remarquera que les mutants survivent jusqu'à environ 2 500 fois mieux que la souche parentale correspondante. Ces résultats montrent que lesdits mutants, c'est-à-dire les souches présentant une altération du gène concerné, sont potentiellement capables de survivre mieux dans les conditions de stress des procédés industriels.

TABLEAU I

Sélection <SEP> 1 <SEP> Stress <SEP> acide <SEP> Stress <SEP> thermique <SEP> Survie <SEP> long <SEP> terme <SEP> Stress <SEP> oxydatif
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> 55 C <SEP> sans <SEP> 55 C <SEP> avec <SEP> Glucose <SEP> limitant <SEP> H2O2 <SEP> 1 <SEP> mM#
<tb> adaptation <SEP> adaptation* <SEP> pH <SEP> final <SEP> : <SEP> 4.30
<tb> Gènes <SEP> Durée <SEP> du <SEP> stress <SEP> 2 <SEP> heures <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> 5 <SEP> min <SEP> 15 <SEP> min <SEP> 2 <SEP> jours <SEP> 30 <SEP> min
<tb> Souche <SEP> parentale <SEP> (7e-5)# <SEP> (6e-5)# <SEP> (9e-4)# <SEP> (8e-4)# <SEP> (8e-4)# <SEP> (1e-4)# <SEP> (1e-4)#
<tb> MG1363 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.1 <SEP> Clone <SEP> SS80 <SEP> 79 <SEP> 1 <SEP> 249 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1000
<tb> R1.4 <SEP> NS <SEP> 372 <SEP> 24 <SEP> 224 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 300 <SEP> à <SEP> 1000
<tb> R1.5 <SEP> GinQ. <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.7 <SEP> Carb, <SEP> phos. <SEP> synth. <SEP> 192 <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.8 <SEP> GinH./GinJ. <SEP> 1 <SEP> 11 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.14 <SEP> NS <SEP> 233 <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> R1.16 <SEP> GinP. <SEP> 1 <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.17 <SEP> GinQ. <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R1.19 <SEP> Hpt <SEP> 111 <SEP> 46 <SEP> 13 <SEP> 1
<tb> R1.20 <SEP> NS <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R2.2 <SEP> Rel. <SEP> 1176 <SEP> 54 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 20 <SEP> 1225
<tb> R2.3 <SEP> GuaA. <SEP> 364 <SEP> 438 <SEP> 352 <SEP> 3 <SEP> 107 <SEP> 2503 <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 3
<tb> R2.6 <SEP> Trans. <SEP> ABC <SEP> hyp. <SEP> 7 <SEP> 13 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R2.9 <SEP> AhrC. <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 4
<tb> R2.11 <SEP> SupE. <SEP> 288 <SEP> 27 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> R2.14 <SEP> GuaA. <SEP> 1072 <SEP> 421 <SEP> 12 <SEP> 7 <SEP> 57 <SEP> 1330 <SEP> 10
<tb> R2.15 <SEP> MNS <SEP> 624 <SEP> 9 <SEP> 7 <SEP> 3 <SEP> 15 <SEP> 605
<tb> R2.16 <SEP> NS(arl <SEP> 2) <SEP> 19 <SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> 1
<tb> R2.17 <SEP> NS <SEP> (arl <SEP> 1) <SEP> 244 <SEP> 492 <SEP> 28 <SEP> 6 <SEP> 107 <SEP> 1728 <SEP> 0.2 <SEP> à <SEP> 12
<tb> R2.20 <SEP> Prot.hyp.de <SEP> B.subt. <SEP> 86 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> ahrC <SEP> 22 <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> guaA <SEP> 1028 <SEP> 117 <SEP> 12 <SEP> 7 <SEP> 48 <SEP> 1318
<tb> hpt <SEP> 1032 <SEP> 28 <SEP> 4 <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> 820
<tb> relA <SEP> 1176 <SEP> 83 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 19 <SEP> 1321
<tb> NS: <SEP> Non <SEP> significatif
<tb> A les bactéries, en phase exponentielle sur un milien à pH 7, ont été étalées sur un milieu à pH 3.7.

B les bactéries, en phase stationnaire sur un milieu à pH 7, ont été étalées sur un milieu à pH 3,0.

C les bactéries, en phase exponentielle sur un milieu à pH 7, ont été étalées pendant 30 min sur un milieu à pH 5.5 puis sur un milieu à pH 3.2.

les microorganismes, cultivés à 30 C, sont directement soumis à un stress thermique de 55 C.

* les microorganismes, cultivés à 30 C, sont soumis pendant 15 minutes à une température de 37 C puis à un stress thermique de 55 C.

# les bactéries ont été maintenues en carence en glucose et à pH acide durant 2 jours avant d'être étalées sur un milieu à pH 7.

# les bactéries en phase exponentielle à pH neutre ont été incubées 30 minutes en présence de 1mM de H2O2 avant d'être étalées sur un milieu à pH 7.

# survie réelle de la souche parentale (MG1363) qui sert de référence et à lequelle on attribue la valeur de 1.

TABLEAU II

Sélection <SEP> 2 <SEP> Stress <SEP> Oxydatif <SEP> Stress <SEP> Thermique
<tb> Résistance <SEP> au <SEP> Survie <SEP> à <SEP> 55 C <SEP> Survie <SEP> à <SEP> 55 C <SEP> Survie <SEP> à <SEP> long <SEP> terme
<tb> H2O2 <SEP> 1mM <SEP> sans <SEP> adaptation <SEP> avec <SEP> adaptation*
<tb> Durée <SEP> du <SEP> stress <SEP> 15 <SEP> minutes <SEP> 15 <SEP> minutes <SEP> 15 <SEP> minutes <SEP> 2 <SEP> jours
<tb> VEL11221 <SEP> (3e-2)# <SEP> (5e-6)# <SEP> (2e-4)# <SEP> (6e-3)3
<tb> Souche <SEP> parentale <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> guaA <SEP> 10 <SEP> 1190 <SEP> 320 <SEP> 160
<tb> deo <SEP> B <SEP> 6 <SEP> 120 <SEP> 170 <SEP> 8
<tb> Gènes <SEP> pst <SEP> B <SEP> 7 <SEP> 28 <SEP> 100 <SEP> 5
<tb> gpp <SEP> S <SEP> 6 <SEP> 82 <SEP> 10 <SEP> 5
<tb> tkt <SEP> A <SEP> 5 <SEP> 140 <SEP> 260 <SEP> 5
<tb> trl <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 270 <SEP> 90 <SEP> 8
<tb> : les microorganismes, cultivés à 30 C, sont directement soumis à un stress thermique de 55 C.

* : les microorganismes, cultivés à 30 C, sont soumis pendant 15 minutes à une température de 37 C puis à un stress thermique de 55 C.

# : survie réelle de la souche parentale; cette valeur est ensuite ramenée à 1.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1/ Bactéries présentant une résistance aus stress améliorée par rapport à la souche sauvage, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une mutation dans un gène qui altère l'activité normale dudit gène, ce gène étant impliqué dans le transport d'électron, d'acides aminés, d'oligopeptides, du phosphate ou dans le métabolisme de l'arginine et choisi parmi: - les gènes de la voie de biosynthèse de la pppGpp ou de la ppGpp, - les gènes du clone SS80, Ri.4, Glana de la carbamoyl phosphate synthétase,

GlnH, GlnJ, R1.14, GlnP, R1.20, Rel, d'un transporteur ABC hypothétique

(R2.6), AhrC, SupE, R2.15, R2.16, R2.17, d'une protéine hypothétique de

B. subtilis (R2.20), pstB, tktA et trll.

2/ Bactéries selon la revendication 1, caractérisées en ce que le gène de la voie de synthèse du GTP, pppGpp ou ppGpp est choisi parmi deoB, hpt, guaA, relA/spoT, gppS.

3/ Bactéries selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que la mutation provient de l'introduction ou de la délétion d'une séquence d'ADN par voie recombinante dans ledit gène.

4/ Bactéries selon la revendication 3, caractérisées en ce que la séquence d'ADN introduite comporte au moins un élément génétique mobile.

5/ Bactéries selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que la mutation inactive ou modifie l'expression dudit gène.

6/ Bactéries selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la bactérie est une bactérie lactique.

7/ Procédé de préparation d'une bactérie présentant une résistance aux stress améliorée par rapport à la souche sauvage, caractérisé en ce qu'il consiste à altérer par mutation un gène desdites bactéries, le gène étant impliqué dans le transport d'électron, d'acides aminés, d'oligopeptides, du phosphate ou dans le métabolisme de l'arginine et choisi parmi: - les gènes de la voie de biosynthèse du GTP, pppGpp ou ppGpp, - les gènes du clone SS80, R1.4, Glana de la carbamoyl phosphate synthétase,

GlnH, GlnJ, R1.14, GlnP, R1.20, Rel, d'un transporteur ABC hypothétique

(R2.6), AhrC, SupE, R2.15, R2.16, R2.17, d'une protéine hypothétique de

B. subtilis (R2.20), pstB, tktA et trll.

8/ Procédé de fermentation, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre, sur le milieu à fermenter, des bactéries selon l'une des revendications 1 à 6.

9/ Utilisation de bactéries selon l'une des revendications 1 à 6, dans des procédés de fermentation.

10/ Utilisation des bactéries selon l'une des revendications 1 à 6, dans des procédés de conservation de produits alimentaires.