EP1274836A1 - Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides - Google Patents

Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides

Info

Publication number
EP1274836A1
EP1274836A1 EP01928002A EP01928002A EP1274836A1 EP 1274836 A1 EP1274836 A1 EP 1274836A1 EP 01928002 A EP01928002 A EP 01928002A EP 01928002 A EP01928002 A EP 01928002A EP 1274836 A1 EP1274836 A1 EP 1274836A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
eps
pgm
sequence
lactic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01928002A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jamila Anba
Juliette Hagege
Stéphane Chaillou
Iris Besancon-Yoshpe
Christophe Fremaux
Jérôme MENGAUD
Pierre Renault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Rhodia Chimie SAS
Original Assignee
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Rhodia Chimie SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Rhodia Chimie SAS filed Critical Gervais Danone SA
Publication of EP1274836A1 publication Critical patent/EP1274836A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the invention relates to the regulation of the production of exocellular heteropolysaccharides by lactic acid bacteria.
  • polysaccharides are widely used as additives in food, but also in cosmetics and pharmaceuticals, for example as thickening agents and / or gelling agents, texture stabilizers, fat substitutes, etc.
  • cosmetics and pharmaceuticals for example as thickening agents and / or gelling agents, texture stabilizers, fat substitutes, etc.
  • polysaccharides used in this way particular mention will be made of those produced by microorganisms in particular bacteria, such as dextrans, xanthans, gellans, pullulans, etc.
  • lactococci such as Lactococcus lactis, Leuconostoc such as Leuconostoc mesen teroide, streptococci such as Streptococcus thermophilus, and lactobacilli such as Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus rhamnosus achamusus Lhamobusus achamusus Lhamobusus achamusus subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, etc. produce polysaccharides.
  • homopolysaccharides such as dextrans, which result from the polymerization of a single sugar
  • heteropolysaccharides of complex structure, associating basic units made up of 2 or more different sugars ( frequently D-galactose, D-glucose and L-rhamnose).
  • the heteropolysaccharides of lactic acid bacteria are usually designated by the general term EPS (for exopolysaccharides), which will also be used below. They play a major role in the development of the texture, the perception in the mouth and the rheology of fermented dairy products. In addition, it was observed that some of them possessed biological activities by which they could exert various effects health benefits, [for review, cf. DE VUYST, and DEGEEST, FEMS Microbiology Reviews, 23, 153-177, (1999)].
  • heteropolysaccharides produced by lactic acid bacteria is generally low (of the order of 10 to 200 mg per liter of fermented product).
  • manufacturers of fermented products add other texturing agents such as stabilizers (modified starches, carragheen, guar, pectin, gelatin ).
  • stabilizers modified starches, carragheen, guar, pectin, gelatin .
  • these additions are not always allowed (for example in plain yogurt), and generally affect the taste and aroma of the product.
  • Optimized production of exocellular heteropolysaccharides (EPS) in the product is therefore preferable.
  • the inventors have set themselves the goal of obtaining mutants of lactic acid bacteria which can be controlled and in particular increase the capacity to use sugars available in the medium, and in particular galactose, to produce EPS.
  • the inventors have now managed to clone and characterize a pgm gene, coding for an ⁇ -PGM of Streptococcus thermophilus.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid sequence coding for an ⁇ -PGM whose amino acid sequence has at least 70% identity or at least 85% similarity, preferably 80% identity or at least 90% similarity, advantageously at least 90% identity or at least 95% similarity, and most preferably at least 95% identity or at least 99% similarity, with the ⁇ -PGM represented by the sequence SEQ ID NO: 2, as well as any fragment of more than 20 bp of said sequence.
  • the percentage identity of a sequence with a reference sequence is defined here as the percentage of residues of this sequence which are identical with those of the reference sequence when the 2 sequences are aligned for a maximum correspondence between the positions of the residues .
  • a polypeptide whose amino acid sequence has at least X% identity with a reference sequence can thus comprise up to 100-X modifications per 100 amino acids of the reference sequence. These modifications include the deletion, substitution, or insertion of amino acid residues, consecutive or not.
  • the percentage similarity of a sequence with a reference sequence is defined here as the percentage of residues of this sequence which are identical to those of the reference sequence or which differ from it only by one conservative substitution, when the 2 sequences are aligned for a maximum correspondence between the positions of the residues.
  • a polypeptide whose amino acid sequence has at least X% similarity to a reference sequence can thus include up to 100-X non-conservative modifications per 100 amino acids of the reference sequence. These modifications include deletion, non-conservative substitution, or insertion of amino acid residues, consecutive or not.
  • the polypeptides thus exhibiting the highest percentages of identity or similarity with the sequence SEQ ID NO: 2, identified by search on the "GENBANK nr" database using the BLASTp software [ALTSCHUL et al. , Nucleic Acids Res. , 25, 3389-3402, (1997)], with the default settings, are as follows:
  • Strepto / nyces coelicolor 42% identity, and 55% similarity
  • the inventors have carried out site-directed mutagenesis of the pgm gene of S. thermophil us, and found that, from surprisingly, the total or partial inactivation of this gene led to an increase in the production of EPS.
  • the present invention also relates to a mutant of an EPS-producing lactic acid bacteria in which the pgm gene for alpha-phosphoglucomutase is totally or partially inactivated.
  • Said lactic acid bacteria will preferably be a mesophilic or thermophilic bacterium, chosen from streptococci and lactobacilli.
  • it may be La ctococcus la cti s, Streptococcus thermophil us, Leuconos toc mesen teroide, La ctoba cill us casei, La ctoba ci l l us delbrueckii, La ctoba ci ll us sake, etc.
  • Inactivation of the pgm gene can be obtained by carrying out one or more mutations at the level of the sequence coding for ⁇ -PGM, and / or at the level of sequences controlling its expression.
  • an exogenous sequence for example a transposon.
  • one or more modification, by insertion, deletion, or substitution, of one or more nucleotides, consecutive or not, is carried out within a sequence identical to that of the region of the gene which one wishes to mutate. .
  • the mutated sequence is inserted into a vector allowing integration by recombination (simple crossing-over) between the bacterial DNA fragment cloned into the vector and the homologous region of the bacterial genome. Excision of vector sequences can be performed following a second recombination event (double crossing-over), which results in the substitution of the wild chromosomal form by the modified form.
  • Vectors allowing the integration of an exogenous sequence into the chromosome of a lactic acid bacteria are known in themselves, and available for most species of lactic acid bacteria; they may, for example, be non-replicative vectors, unstable or conditional replicative vectors, vectors carrying insertion sequences, etc. It is also possible, in certain cases, to carry out the direct transformation of the bacteria with the DNA carrying the mutated sequence which it is desired to insert.
  • Mutants of the pgm gene in accordance with the invention can also be obtained by random mutagenesis (for example by chemical mutagenesis or by radiation); they may also be natural mutants selected from cultures of lactic acid bacteria by screening on the basis of their phenotypic properties.
  • mutants in which the ⁇ -PGM is partially or completely inactive have normal growth on lactose, and very slow growth on glucose or galactose alone. Such mutants can therefore, whether they are natural mutants, or whether they result from mutagenesis, be selected directly on the basis of this property.
  • EPS production it is also possible, if desired, to increase or decrease EPS production at will as a function, for example, of culture conditions, by placing the pgm gene under transcriptional control of an inducible promoter.
  • the inventors have also cloned and characterized the gal U gene which codes for glucose-1-phosphate uridyl transferase from S. thermophilus. This gene is represented in the sequence list in the appendices under the number SEQ ID NO: 3.
  • the GalU protein encoded by this gene is represented under the number SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence coding for a glucose-1-phosphate uridyl transferase whose amino acid sequence has at least 90% identity or at least 95% similarity, and advantageously at least 95% identity or at least 99% similarity with glucose-1-phosphate uridyl transferase represented by the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the polypeptides thus having the highest percentages of identity or similarity with the sequence SEQ ID NO: 4, identified by research on the "GENBANK nr" database using the BLASTp software [ALTSCHUL et al. , Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)] are as follows: Streptococcus mutans glucose-1-phosphate uridyltransferase: 87% identity, and 93% similarity;
  • Streptococcus pyogenes 84% identity, and 90% similarity
  • Cap3C protein of Streptococcus pneumoniae 76% identity, and 88% similarity
  • UDP-glucose pyrophosphorylase from Bacillus subtil is: 55% identity, and 74% similarity.
  • the overexpression of the gal U gene makes it possible to increase the synthesis of EPS, by increasing the quantity of their precursors.
  • the present invention therefore also relates to a mutant of an EPS-producing lactic acid bacteria in which the gal U gene is overexpressed.
  • Such a mutant can in particular be obtained by introducing one or more copies of this gene into a lactic acid bacterium, and / or by replacing its promoter with a strong promoter.
  • said mutant is obtained from a lactic acid bacterium also having a partially or completely inactive ⁇ -PGM.
  • Mutant strains in accordance with the invention can in particular be obtained from S. thermophil us, and in particular from strains of S. thermophilus selected for their growth capacity on galactose.
  • another limiting factor for the synthesis of EPS may come from the fact that a large number of strains do not use galactose efficiently, either for their growth or for the synthesis of EPS.
  • gal + strains of S. thermophil us selected for their growth capacity on galactose could synthesize a larger amount of EPS. From these strains capable of using galactose for their growth, it is possible to carry out a second selection of the strains producing the colonies of larger appearance, which translates a more important synthesis of EPS.
  • Strains of lactic acid bacteria according to the invention can advantageously be used for the manufacture of fermented products, in particular food products, the EPS content of which it is desired to control, and in particular to increase, as well as for the production of EPS.
  • the growths are carried out as follows: overnight precultures in 10 ml of BELLIKER medium
  • Figure 1 represents the growth on different sugars, of the industrial strain JIM7459 (1A) and of a gal + mutant selected from this strain (1B).
  • FIG. 2 represents the growth on different sugars, of a gal + (2A) mutant selected as described in A above, from a culture of a strain industrial (JIM7446, DANONE collection), and a gal ++ mutant (2B) selected from a culture of this gal + mutant, based on the size of the colonies.
  • the bacterial pellet of the gal + mutants is more filamentous than that of the wild-type strains, which may reflect a difference in the production of EPS between the mutants obtained and their strain. parental.
  • the production of EPS of these strains was determined from culture in 80 ml of chemically defined medium [SISSLER et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, no. 16, 8985-8990, (1999)].
  • the cultures are centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4 ° C.
  • the cell pellet is eliminated, and the supernatant is precipitated (2 volumes of 100% ethanol for one volume of supernatant) for 24 hours at 4 ° C.
  • centrifugation is carried out at 16,000 g for 15 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is removed and the residue is resuspended in 60 ml of water.
  • Dialysis is performed against water for 4 days by changing the water 3 to 4 times a day.
  • the EPS are determined by the phenol / sulfuric acid method [DUBOIS et al. , Analytical Chemistry, 28, 350-356, (1956)].
  • EXAMPLE 2 CLONING OF THE PGM GENE OF STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS AND CONSTRUCTION OF MUTANTS IN WHICH THIS GENE IS INACTIVE.
  • the pgm gene of Streptococcus thermophilus can be obtained by reverse PCR [OCHMAN et al. , Biotechnology
  • thermophil us is digested with restriction enzymes (BamHI, EcoRI, HindI I I, Ncol, Psi, Xhl) then the cleavage products are circularized then amplified by PCR using the primers complementary to the opposite strand OST15, OST16,
  • the bands obtained are extracted from the gel and sequenced.
  • the sequence of the cloned fragment, comprising the pgm gene and its flanking regions is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1.
  • the size of the open reading frame for the pgm gene from Streptococcus thermophil us is 1350 bp.
  • thermally sensitive replication plasmids containing fragments internal to the pgm gene were constructed from the thermally sensitive replication vector pG + host [BISWAS et al. , J. Bacteriol., 175, 11, 3628-3635, (1993); PCT application WO / 181164].
  • the 650 bp fragment carried by pST28 is central to the gene, it is therefore expected that its insertion will produce a total inactivation of the gene.
  • the 835 bp fragment carried by pST29 contains the 5 ′ part of the gene with the translation start codon, but in the absence of its ribosome binding site. It is expected that the insertion of pST29 into the chromosome causes a very significant decrease in the translation of pgm by allowing only a very weak basic expression.
  • the plasmids pG + host, pST28 and pST29 were introduced by transformation into the strains of S. thermophil us JIM7446 and JIM7459 at 30 ° C, then integrated by simple crossing-over as shown schematically in Figure 3.
  • Streptococcus thermophil us strains containing the plasmid pG + host or its derivatives are grown overnight at 30 ° C in the presence of erythromycin, then diluted 50 times in the same medium. They are then transferred to 42 ° C for 6 hours. The samples are then diluted and spread on the one hand at 42 ° C on M17 dishes containing erythromycin to detect integration events, and on the other hand at 30 ° C on M17 dishes without antibiotics to detect the total number of viable cells. The integration frequency per cell is calculated by reporting these counts.
  • the integration frequencies of these plasmids are respectively 3.5 x 10 "3 , 3 x 10 " 3 and 10 "2 for pG + host, PST28 and pST29. Clones from each of these integrations were isolated to give the strains STJ3, STJ1 and STJ2 respectively. STJ1 (pST28), STJ2 (pST29) and STJ3 strains
  • the STJ1 and STJ2 clones therefore do not grow on glucose or galactose alone, but normally on lactose or on a glucose and galactose mixture. This shows that the metabolism of glucose and galactose has indeed been decoupled in this strain and that the gene whose activity has been affected is indeed pgm.
  • the EPS assay is carried out as described in Example 1 above.
  • EPS of the strain affected in the expression of the pgm gene is 20 mg / 1. This production, compared to the 8 mg / 1 obtained for the parental strain 7446
  • Gal ++ therefore corresponds to an increase of two and a half times.
  • EXAMPLE 3 PRODUCTION OF EPS BY MUTANTS OF THE pgm GENE DERIVATIVES OF INDUSTRIAL STRAINS
  • the plasmid pST29 described in Example 2 above was used to transform the industrial strains (DANONE collection) Ext 1.1 (JIM7455) and Ext 1.10. (JIM7464). These strains produce EPS of different composition (1- glu: 2-gal: 1-galNac for Extl.l and 3-gal: l-rha for Extl.10), and which are also different from that produced by the strain JIM7446 (3-glu: 4-gal).
  • the cells are spread at 30 ° C for 12 hours and then the dishes are set at 42 ° C in order to force the integration of the plasmid pST29 into the pgm gene by homologous recombination between the pgm sequences present on the plasmid and those present on the chromosome.
  • Colonies of mutated bacteria capable of growing at 42 ° C in the presence of erythromycin were obtained. These bacteria are also capable of growing on MCD (chemically defined medium), in the presence of glucose and galactose, but not in the presence of glucose alone or galactose alone.
  • the strains transformed or not were cultured in 10 ml of MCD lactose 2%, casitone 1.5%, urea 10 M, in the presence of erythromycin (5 ⁇ g / ml) for the strains transformed by the plasmid pST29.
  • the EPS produced by the different strains were assayed after 67 h 30 min of culture at
  • strains whose pgm gene is inactivated in accordance with the invention produce, at equal biomass, 2 to 2.5 times more EPS than the original strains.
  • a vector called pSTJ ⁇ containing a pgm gene inactivated by internal mutation, was constructed by reverse PCR amplification using the plasmid pST29 as template, and the following primers, derived from the sequence of the pgm gene by point mutations, inducing in particular the creation of 'an Nsil site:
  • the PCR product is cleaved by Nsil and religated on itself to give the vector pSTJ ⁇ .
  • This vector is introduced by transformation into strain JIM7446 of S. thermophilus.
  • the colonies are spread at 30 ° C for 12 H, then grown at 42 ° C for 24 H, in order to force the integration of the vector into the chromosome by a first crossing-over by recombination between the pgm sequences present on the plasmid and those present on the chromosome.
  • the colonies thus obtained, resistant to erythromycin and capable of growing at 42 "C, are then grown at 30 ° C in order to promote the excision of the sequences of the plasmid pG + host by a second crossing-over by recombination between the pgm sequences present on either side of the pG + host sequences pG + host is then eliminated from the cell by a growth step at 42 ° C. in the absence of selection by erythromycin.
  • the strain thus obtained does not contain more sequences of the pG + host vector, and in particular, it does not contain an antibiotic resistance gene.
  • the mutated strain has the phenotype characteristic of the pgm mutants, described in Examples 2 and 3 above. It is able to grow on MCD in the presence of glucose and galactose but not in the presence of glucose alone or galactose alone.
  • the increase in EPS production by this strain compared to the parental strain is comparable to that observed in the case of strains transformed with pST29, described in Examples 2 and 3.
  • the entire gal U gene can be obtained by reverse PCR [OCHMAN et al. , (1990), publication cited above] from the chromosomal DNA of S. thermophil us, using primers complementary to the opposite strand (OST13,
  • the bands obtained are extracted from the gel and sequenced.
  • sequence of the cloned fragment, comprising the gal U gene is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 3.
  • the size of the gal U gene is 914 bp.
  • the gal U gene (with its terminator and its ribosome binding site) was amplified with the oligonucleotides OST44 and OST45 (Table VI) and cloned downstream of the promoter p45 [SIBAKOV et al. , Appl. About. Microbiol.,
  • the plasmid pGKV259 [VAN DER VOSSEN et al. , Appl. About. Microbiol., 53, 2452-2457, (1987)] expressing the gal U gene under the control of the p45 promoter is called pSTJ4 ( Figure 4).
  • This plasmid is introduced by transformation into the strain S. thermophil us JIM7446, JIM7459 or in the strain containing a mutation in the pgm gene (STJ2).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention a pour objet des mutants de bactéries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides à la suite d'une mutation dans le gène codant l'α-phosphosglucomutase. Ces mutants sont utilisables notamment pour la préparation de produits fermentés ou la production d'exopolysaccharides.

Description

MUTANTS DE BACTERIES LACTIQUES SURPRODUCTEURS D' EXOPOLYSACCHARIDES L' invention est relative à la régulation de la production d' heteropolysaccharides exocellulaires par des bactéries lactiques.
De manière générale, les polysaccharides sont très utilisés comme additifs dans l'alimentation, mais aussi dans les cosmétiques et les produits pharmaceutiques, par exemple en tant qu'agents épaississants et/ou gélifiants, stabilisateurs de texture, succédanés de matière grasse, etc. Parmi les polysaccharides utilisés de la sorte, on citera notamment ceux produits par des microorganismes en particulier des bactéries, tels que des dextranes, les xanthanes, les gellanes, pullulanes etc. De nombreuses espèces de bactéries lactiques, notamment des lactocoques tels que Lactococcus lactis, des Leuconostoc tels que Leuconostoc mesen teroide, des streptocoques tels que Streptococcus thermophilus, et des lactobacilles tels que Lactobacillus casei , Lactobacillus sake, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, La ctobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus, Lactobacillus helveticus, etc . produisent des polysaccharides.
Ceux-ci peuvent être regroupés en 2 catégories : les homopolysaccharides, tels que les dextranes, qui résultent de la polymérisation d'un seul sucre, et les heteropolysaccharides, de structure complexe, associant des unités de base constituées de 2 ou plusieurs sucres différents (fréquemment le D-galactose, le D-glucose et le L- rhamnose) . Les heteropolysaccharides des bactéries lactiques sont habituellement désignés sous le terme général d' EPS (pour exopolysaccharides), qui sera également utilisé ci- après. Ils jouent un rôle majeur dans l'élaboration de la texture, de la perception en bouche et de la rhéologie des produits laitiers fermentes. En outre, il a été observé que certains d'entre eux possédaient des activités biologiques par lesquelles ils pourraient exercer divers effets bénéfiques sur la santé, [pour revue, cf. DE VUYST, et DEGEEST, FEMS Microbiology Reviews, 23, 153-177, (1999)].
Toutefois, la quantité d' heteropolysaccharides produits par les bactéries lactiques est en général faible (de l'ordre de 10 à 200 mg par litre de produit fermenté). Pour améliorer la texture, les fabricants de produits fermentes rajoutent d'autres agents texturants comme des stabilisateurs (amidons modifiés, carragheen, guar, pectine, gélatine...). Cependant, ces ajouts ne sont pas toujours autorisés (par exemple dans le yaourt nature) , et affectent généralement le goût et l'arôme du produit. Une production optimisée d' heteropolysaccharides exocellulaires (EPS) dans le produit est donc préférable.
Etant donné l'importance des EPS dans les industries agro-alimentaires, évoquée précédemment, de nombreux travaux ont porté sur des méthodes permettant d'augmenter leur production par optimisation des procédés biotechnologiques en agissant sur la température, le pH et la composition du milieu. Ces approches sont cependant parfois difficiles à appliquer dans le cadre de certains procédés agro-alimentaires comme la fabrication de produits laitiers fermentes pour lesquels le milieu et les conditions de fermentation sont propres à chaque type de produit. Ces contraintes de fabrication limitent donc l'utilisation des méthodes classiques d'optimisation des procédés pour améliorer la production des EPS. Une alternative à ces méthodes serait d'utiliser des souches adaptées à ces procédés, c'est-à-dire capables de produire des EPS en plus grande quantité, et/ou dont la production d'EPS puisse être contrôlée dans les conditions de production des produits fermentes .
L'une des limitations principales de la production d'EPS par les bactéries lactiques pourrait provenir d'une compétition entre la biosynthèse de ces EPS et d'autres voies métaboliques pour l'utilisation des sucres disponibles. En effet, alors que les homopolysaccharides sont principalement produits par des enzymes extracellulaires spécifiques à partir de substrats présents dans le milieu, la synthèse des heteropolysaccharides s'effectue au moins en partie à l'intérieur de la cellule. En particulier la formation des précurseurs (sucres nucléotidiques) des heteropolysaccharides, constitués par des sucres activés par réaction avec des nucleotides triphosphate pourrait faire intervenir des enzymes intracytoplasmiques qui participent également à d'autres voies métaboliques, et notamment à la glycolyse. Or, du fait du métabolisme fermentaire des bactéries lactiques, les réactions de la glycolyse sont plus actives que celles ayant trait à la synthèse des EPS.
Les Inventeurs se sont fixé pour but l'obtention de mutants de bactéries lactiques dont on puisse contrôler et notamment augmenter la capacité à utiliser des sucres disponibles dans le milieu, et en particulier le galactose, pour produire des EPS.
Dans ce but, ils ont recherché les gènes impliqués dans la synthèse des sucres nucléotidiques précurseurs des EPS, et/ou les gènes intervenant au carrefour des voies de la glycolyse et de la biosynthèse des EPS. Parmi ces derniers, ils se sont intéressés plus particulièrement aux gènes de la phosphoglucomutase (PGM), qui intervient dans la transformation des dérivés métaboliques du galactose en intermédiaires de la glycolyse, et de la glucose-1-phosphate uridyl transférase, qui catalyse la formation des sucres nucléotidiques, précurseurs des EPS.
DE VUYST, et DEGEEST, (publication précitée) émettent l'hypothèse que la phosphoglucomutase pourrait jouer un rôle important de liaison entre la glycolyse et la biosynthèse des EPS, et que le détournement vers cette enzyme d'une partie du flux carboné pourrait permettre d'augmenter la production d'EPS. Toutefois, ils soulignent également qu'il reste à savoir si ceci est effectivement réalisable.
Il a été récemment rapporté [HARDY et al . , J Bacteriol., 1854-1863, (2000)] que l' inactivation chez Streptococcus pneumoniae d'un gène [GENBANK AF165218] codant une phosphoglucomutase entraînait une diminution drastique de la production des EPS formant la capsule bactérienne, et était en outre fortement préjudiciable à la viabilité cellulaire, bien que cette bactérie possède un autre gène pgm .
L'existence d'une α-PGM et d'une β-PGM a été rapportée chez L . Lactis ; toutefois, seul le gène corrrespondant à la β-PGM a été isolé [QIAN et al . , Microbiology, 143, 855-865, (1997) ] . Aucun gène susceptible de coder une α-PGM de bactérie lactique n'a été caractérisé génétiquement jusqu'à présent.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à cloner et caractériser un gène pgm, codant une α-PGM de Streptococcus thermophilus .
Ce gène est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et le polypeptide correspondant est représenté sous le numéro SEQ ID NO: 2. La présente Invention a pour objet une séquence d'acide nucléique codant une α-PGM dont la séquence en acides aminés a au moins 70% d'identité ou au moins 85% de similarité, de préférence 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, avantageusement au moins 90% d'identité ou au moins 95% de similarité, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité ou au moins 99% de similarité, avec l' α-PGM représentée par la séquence SEQ ID NO: 2, ainsi que tout fragment de plus de 20 pb de ladite séquence.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence lorsque les 2 séquences sont alignées pour une correspondance maximale entre les positions des résidus. Un polypeptide dont la séquence en acides aminés possède au moins X% d' identité avec une séquence de référence peut ainsi comprendre jusqu'à 100-X modifications pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Ces modifications incluent la délétion, la substitution, ou l'insertion de résidus d'acides aminés, consécutifs ou non. Le pourcentage de similarité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence ou qui n'en diffèrent que par une substitution conservative, lorsque les 2 séquences sont alignées pour une correspondance maximale entre les positions des résidus. On entend par "substitution conservative" la substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre résidu possédant des caractéristiques physicochimiques (taille, charge, ou polarité) similaires, qui ne changent pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. Un polypeptide dont la séquence en acides aminés possède au moins X% de similarité avec une séquence de référence peut ainsi comprendre jusqu'à 100-X modifications non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Ces modifications incluent la délétion, la substitution non- conservative, ou l'insertion de résidus d'acides aminés, consécutifs ou non. Les polypeptides présentant ainsi les pourcentages d' identité ou de similarité les plus importants avec la séquence SEQ ID NO: 2, identifiés par recherche sur la base de données "GENBANK nr" en utilisant le logiciel BLASTp [ALTSCHUL et al . , Nucleic Acids Res . , 25, 3389-3402, (1997)], avec les paramètres par défaut, sont les suivants :
- la protéine ybbT de Ba cillus subtilis : 57% d'identité, et 69% de similarité ;
- la protéine femD de Staphylococcus aureus : 53% d'identité, et 69% de similarité ; - la phosphoglucomutase hypothétique de
Strepto/nyces coelicolor : 42% d'identité, et 55% de similarité ;
- l'homologue de mrsA de Pseudomonas syringae : 41% d'identité, et 54% de similarité ; - l'homologue de mrsA de Mycobacterium leprae :
41% d'identité, et 54% de similarité ;
Aucune homologie significative avec le gène pgm de L . la ctis décrit par QIAN et al . (publication précitée) n'a été observée. Le pourcentage d'identité avec le gène pgm de S . pneumoniae décrit par HARDY et al . (publication précitée) est inférieur à 31%.
Les Inventeurs ont effectué la mutagenèse dirigée du gène pgm de S . thermophil us, et ont constaté, que, de manière surprenante, l' inactivation totale ou partielle de ce gène entraînait une augmentation de la production d'EPS.
La présente invention a également pour objet un mutant de bactérie lactique surproducteur d' EPS dans lequel le gène pgm de l' alpha-phosphoglucomutase est totalement ou partiellement inactivé.
Ladite bactérie lactique sera de préférence une bactérie mésophile ou thermophile, choisie parmi les streptocoques et les lactobacilles . A titre d'exemple, il peut s'agir de La ctococcus la cti s , Streptococcus thermophil us, Leuconos toc mesen teroide, La ctoba cill us casei , La ctoba ci l l us delbrueckii , La ctoba ci ll us sake, etc.
L' inactivation du gène pgm peut être obtenue en effectuant une ou plusieurs mutations au niveau de la séquence codant pour l' α-PGM, et/ou au niveau de séquences contrôlant son expression.
On peut notamment utiliser des techniques de mutagenèse dirigée, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art, et qui permettent d'introduire dans un gène une mutation définie, à l'emplacement souhaité.
On peut ainsi, par exemple, inactiver le gène pgm en introduisant à l'intérieur de la séquence codante, ou des séquences de régulation, une séquence exogène, par exemple un transposon. Avantageusement, on peut également effectuer le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence sauvage du gène pgm par la séquence mutée. Dans ce cas on effectue à l'intérieur d'une séquence identique à celle de la région du gène que l'on souhaite muter, une ou plusieurs modification par insertion, délétion, ou substitution, d'un ou plusieurs nucleotides, consécutifs ou non.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la séquence mutée est insérée dans un vecteur permettant l'intégration par recombinaison (simple crossing-over) entre le fragment d'ADN bactérien clone dans le vecteur et la région homologue du génome bactérien. L'excision des séquences du vecteur peut s'effectuer à la suite d'un second événement de recombinaison (double crossing-over) , qui aboutit à la substitution de la forme sauvage chromosomique par la forme modifiée.
Des vecteurs permettant l'intégration d'une séquence exogène dans le chromosome d'une bactérie lactique sont connus en eux-mêmes, et disponibles pour la plupart des espèces de bactéries lactiques ; il peut par exemple s'agir de vecteurs non-réplicatifs, de vecteurs réplicatifs instables ou à réplication conditionnelle, de vecteurs portant des séquences d'insertion, etc.. On peut également, dans certains cas, effectuer la transformation directe de la bactérie avec l'ADN portant la séquence mutée que l'on souhaite insérer.
Des mutants du gène pgm conformes à l'invention peuvent aussi être obtenus par mutagenèse aléatoire (par exemple par mutagenèse chimique ou par radiations) ; il peut aussi s'agir de mutants naturels sélectionnés à partir de cultures de bactéries lactiques par criblage sur la base de leurs propriétés phénotypiques .
En effet, les mutants dans lesquels l' α-PGM est partiellement ou totalement inactive ont une croissance normale sur lactose, et une croissance très ralentie sur glucose ou galactose seul. De tels mutants peuvent donc, qu'il s'agisse de mutants naturels, ou qu'ils soient issus d'une mutagenèse, être sélectionnés directement sur la base de cette propriété.
La présence de mutations dans le gène pgm, et la nature de ces mutations peut être vérifiée facilement par des techniques classiques de biologie moléculaire, à l'aide d'amorces ou de sondes ou de souches d'acide nucléique dérivées de la séquence SEQ ID NO: 1.
On peut aussi si on le souhaite, augmenter ou diminuer à volonté la production d'EPS en fonction, par exemple, des conditions de culture, en plaçant le gène pgm sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur inductible. Les inventeurs ont en outre clone et caractérisé le gène gal U qui code la glucose-1-phosphate uridyl transférase de S . thermophilus . Ce gène est représenté dans la liste de séquences en annexes sous le numéro SEQ ID NO: 3. La protéine GalU codée par ce gène est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 4.
La présente Invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant une glucose-1-phosphate uridyl transférase dont la séquence en acides aminés a au moins 90% d'identité ou au moins 95% de similarité, et avantageusement au moins 95% d'identité ou au moins 99% de similarité, avec la glucose-1-phosphate uridyl transférase représentée par la séquence SEQ ID NO: 4. Les polypeptides présentant ainsi les pourcentages d' identité ou de similarité les plus importants avec la séquence SEQ ID NO: 4, identifiés par recherche sur la base de données "GENBANK nr" en utilisant le logiciel BLASTp [ALTSCHUL et al . , Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)] sont les suivants : la glucose-1-phosphate uridyltransférase de Streptococcus mutans : 87% d'identité, et 93% de similarité ;
- la protéine GalU de Streptococcus pneumoniae : 87% d'identité, et 93% de similarité ; - l' UDP-glucose pyrophosphorylase de
Streptococcus pyogenes : 84% d'identité, et 90% de similarité ;
- la protéine Cap3C de Streptococcus pneumoniae : 76% d'identité, et 88% de similarité ; - l' UDP-glucose pyrophosphorylase de Bacillus subtil is : 55% d'identité, et 74% de similarité.
La surexpression du gène gal U permet d'accroître la synthèse des EPS, en augmentant la quantité de leurs précurseurs . La présente invention a donc également pour objet un mutant de bactérie lactique surproducteur d'EPS dans lequel le gène gal U est surexprimé.
Un tel mutant peut notamment être obtenu en introduisant dans une bactérie lactique une ou plusieurs copies de ce gène, et/ou en remplaçant son promoteur par un promoteur fort. De préférence, ledit mutant est obtenu à partir d'une bactérie lactique possédant également une α-PGM partiellement ou totalement inactive. Des souches mutantes conformes à l'invention peuvent notamment être obtenues à partir de S . thermophil us , et en particulier à partir de souches de S . thermophilus sélectionnées pour leur capacité de croissance sur galactose. En effet, chez cette bactérie, un autre facteur limitant pour la synthèse d'EPS peut provenir du fait qu'un grand nombre de souches n'utilisent pas efficacement le galactose, que ce soit pour leur croissance ou la synthèse des EPS.
Les inventeurs ont constaté que des souches gal+ de S . thermophil us , sélectionnées pour leur capacité de croissance sur galactose pouvaient synthétiser une quantité plus importante d'EPS. A partir de ces souches capables d'utiliser le galactose pour leur croissance, on peut effectuer une seconde sélection des souches produisant les colonies d'aspect plus volumineux, ce qui traduit une synthèse plus importante d'EPS.
L'utilisation de ces souches gal+ de S . thermophilus , comme matériel de départ pour la production de mutants conformes à l'invention, améliore donc encore la capacité de ceux-ci à produire des EPS.
Des souches de bactéries lactiques conformes à l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour la fabrication de produits fermentes, notamment de produits alimentaires, dont on souhaite contrôler, et en particulier augmenter, la teneur en EPS, ainsi que pour la production d'EPS.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation de souches de bactéries lactiques conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 : SELECTION DE SOUCHES DE S. THERMOPHILUS UTILISANT LE GALACTOSE PLUS EFFICACEMENT POUR LA SYNTHESE DES EPS
A) Des souches capables d'utiliser efficacement le galactose ont été sélectionnées à partir de cultures de levains industriels de S . thermophil us des collections RHODIA et DANONE : RD488 (JIM7446) (collection RHODIA) et ext 1.5
(JIM7459) (collection DANONE) . Pour cela, une culture de 12 heures en milieu M17 [TERZAGHI et SANDINE, Appl . Microbiol., 29, 807-813, (1975)] contenant 1% de lactose, est déposée sur boîtes M17 agar contenant 1% de galactose et incubée à 42°C pendant 2 jours. Les colonies ainsi obtenues sont striées sur boîte M17 agar contenant 1% de galactose et incubées à 42°C pendant la nuit. Les colonies poussant ainsi sur M17 galactose sont récupérées et mises à pousser en M17 liquide contenant 1% galactose à 42°C pendant 6 heures avant d'être mises en collection. D'autres milieux comme le milieu chimiquement défini décrit par [SISSLER et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, no. 16,
8985-8990, (1999)], où la source de sucre peut être contrôlée, peuvent être aussi utilisés pour cette sélection.
Pour vérifier que les souches obtenues sont bien capables de mieux utiliser le galactose, les croissances de ces souches et de leurs parents sont comparées.
Les croissances sont réalisées comme suit : des précultures de la nuit dans 10 ml de milieu BELLIKER
(Laboratoires DIFCO) auquel est ajouté 10 g d'extrait de bœuf/1 (DIFCO) , et contenant 1% de galactose sont diluées 100 fois et mises à pousser dans 2 ml de milieu M17 contenant 2% de sucre (saccharose, lactose, glucose ou galactose) pendant 4 heures à 42°C. Elles sont ensuite inoculées à 2% dans 200 μl de milieu M17 contenant 1% de sucre. La croissance des souches est alors suivie au BIOSCREEN (LASBSYSTEMS) .
La Figure 1 représente la croissance sur différents sucres, de la souche industrielle JIM7459 (1A) et d'un mutant gal+ sélectionné à partir de cette souche (1B). B) On peut effectuer une sélection supplémentaire à partir de souches déjà capables d'utiliser le galactose pour leur croissance. Il est alors recherché des clones produisant des colonies d'aspect plus volumineux sur les boîtes. Ces souches utilisent le galactose encore plus efficacement.
La Figure 2 représente la croissance sur différents sucres, d'un mutant gal+ (2A) sélectionné comme décrit en A ci-dessus, à partir d'une culture d'une souche industrielle (JIM7446, collection DANONE), et d'un mutant gal++ (2B) sélectionné à partir d'une culture de ce mutant gal+, sur la base de la taille des colonies.
Après croissance de ces différentes souches en milieu chimiquement défini, ou en milieu M17, le culot bactérien des mutants gal+ est plus filamenteux que celui des souches sauvages, ce qui peut refléter une différence dans la production d'EPS entre les mutants obtenus et leur souche parentale. La production d'EPS de ces souches a été déterminée à partir de culture dans 80 ml de milieu chimiquement défini [SISSLER et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, no. 16, 8985-8990, (1999)].
Après croissance, les cultures sont centrifugées à 16000 g pendant 10 min à 4°C. Le culot cellulaire est éliminé, et le surnageant est précipité (2 volumes d'éthanol 100% pour un volume de surnageant) pendant 24 heures à 4°C. Après précipitation, une centrifugation est effectuée à 16000 g pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 60 ml d'eau. Une dialyse est effectuée contre l'eau pendant 4 jours en changeant l'eau 3 à 4 fois par jour. Les EPS sont dosés par la méthode au phénol/acide sulfurique [DUBOIS et al . , Analytical Chemistry, 28, 350-356, (1956)].
Les résultats obtenus dans le cas de la souche
7446 Gal+, et d'un mutant de cette souche capable d'utiliser plus efficacement le galactose sont indiqués dans le Tableau
I ci-après.
Tableau i
Après croissance en présence de galactose, les souches utilisant mieux le galactose produisent des quantités accrues d'EPS. EXEMPLE 2 : CLONAGE DU GENE PGM DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS ET CONSTRUCTION DE MUTANTS DANS LESQUELS CE GENE EST INACTIVE .
Clonage du gène : Le gène pgm de Streptococcus thermophilus peut être obtenu par PCR inverse [OCHMAN et al . , Biotechnology
(NY) , 8, no. 8, 759-760, (1990)] à partir de l'ADN chromosomique de S. thermophi l us . L'ADN chromosomique de
S. thermophil us est digéré avec des enzymes de restriction ( BamHI , EcoRI , HindI I I , Ncol , Psi , Xhl ) puis les produits de coupure sont circularisés puis amplifiés par PCR en utilisant les amorces complémentaires au brin opposé OST15, OST16,
OST23 à OST26 (Tableau II) .
Tableau II
Les bandes obtenues sont extraites du gel et séquencées. La séquence du fragment clone, comprenant le gène pgm et ses régions flanquantes est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1.
La taille du cadre ouvert de lecture du gène pgm de Streptococcus thermophil us est de 1350 pb .
Construction de mutants du gène pgm
Pour diminuer l'activité du gène pgm , les Inventeurs ont adopté une stratégie d' inactivation par insertion d'un vecteur dans le gène par recombinaison homologue. La stratégie générale d' inactivation est représentée par la Figure 3. Dans un premier temps, des plasmides à réplication thermosensible, contenant des fragments internes au gène pgm ont été construits à partir du vecteur à réplication thermosensible pG+host [BISWAS et a l . , J. Bacteriol., 175, 11, 3628-3635, (1993) ; Demande PCT WO/181164] . Deux fragments PCR produits avec les oligonucléotides OST29+OST31 et OST28+OST31, et représentant respectivement 650 et 835 bp du gène pgm , ont été clones dans pG+host, générant les plasmides pST28 et pST29.
Tableau III
Le fragment de 650 bp porté par pST28 est central au gène, il est donc attendu que son insertion produise une inactivation totale du gène. Le fragment de 835 bp porté par pST29 contient la partie située en 5' du gène avec le codon de démarrage de traduction, mais en absence de son site de fixation au ribosome. Il est attendu que l'insertion de pST29 dans le chromosome provoque une diminution très importante de la traduction de pgm en ne permettant qu'une expression de base très faible.
Les plasmides pG+host, pST28 et pST29 ont été introduits par transformation dans les souches de S . thermophil us JIM7446 et JIM7459 à 30°C, puis intégrés par simple crossing-over comme schématisé sur la Figure 3.
L' intégration par simple crossing-over a été réalisée selon le protocole décrit par BIS AS et al . [publication précitée,
(1993)] avec les modifications suivantes : Les souches de Streptococcus thermophil us contenant le plasmide pG+host ou ses dérivés sont mises à pousser de nuit à 30°C en présence d' érythromycine, puis diluées 50 fois dans le même milieu. Elles sont ensuite transférées à 42°C pendant 6 heures. Les échantillons sont alors dilués et étalés d'une part à 42°C sur boîtes M17 contenant l' érythromycine pour détecter les événements d'intégration, et d'autre part à 30°C sur boîtes M17 sans antibiotique pour détecter le nombre total de cellules viables. La fréquence d'intégration par cellule est calculée en faisant le rapport de ces comptages. Les fréquences d' intégration de ces plasmides sont respectivement de 3.5 x 10"3, 3 x 10"3 et 10"2 pour pG+host , PST28 et pST29. Des clones issus de chacune de ces intégrations ont été isolés pour donner les souches STJ3, STJ1 et STJ2 respectivement. Les souches STJ1 (pST28), STJ2 (pST29) et STJ3
(pG+host) ont été mises à pousser sur boîtes de milieu chimiquement défini contenant du glucose et du galactose ou sur boîtes des mêmes milieux contenant soit du glucose seul, soit du galactose seul. Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau IV.
Tableau IV
Les clones STJ1 et STJ2 ne poussent donc pas sur glucose ou galactose seul, mais normalement en lactose ou sur un mélange glucose et galactose. Ceci montre que le métabolisme du glucose et du galactose a bien été découplé dans cette souche et que le gène dont l'activité a été affectée est bien pgm .
Ces résultats montrent que le gène inactivé code bien pour une enzyme connectant la voie des EPS et la glycolyse. Il code donc probablement pour l' α-PGM dont la séquence n'était pas encore caractérisée expérimentalement chez les bactéries lactiques.
Dosage des EPS produits par la souche de Streptococcus thermophil us STJ2 portant une mutation dans le gène pgm
Le dosage des EPS est effectué comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus.
La production d'EPS de la souche affectée dans l'expression du gène pgm est de 20 mg/1. Cette production, comparée aux 8 mg/1 obtenu pour la souche parentale 7446
Gal++ correspond donc à une augmentation de deux fois et demi .
EXEMPLE 3 : PRODUCTION D'EPS PAR DES MUTANTS DU GENE pgm DERIVES DE SOUCHES INDUSTRIELLES Le plasmide pST29 décrit à l'exemple 2 ci-dessus a été utilisé pour transformer les souches industrielles (collection DANONE) Ext 1.1 (JIM7455) et Ext 1.10. ( JIM7464 ) . Ces souches produisent des EPS de composition différente (1- glu: 2-gal: 1-galNac pour Extl.l et 3-gal:l-rha pour Extl.10), et qui sont également différents de celui produit par la souche JIM7446 ( 3-glu : 4-gal) .
Après électroporation, les cellules sont étalées à 30°C pendant 12H puis les boites sont mises à 42°C afin de forcer l'intégration du plasmide pST29 dans le gène pgm par recombinaison homologue entre les séquences pgm présentes sur le plasmide et celles présentes sur le chromosome. Des colonies de bactéries mutées capables de pousser à 42 °C en présence d' érythromycine ont été obtenues. Ces bactéries sont de plus capables de pousser sur MCD (milieu chimiquement défini), en présence de glucose et de galactose, mais pas en présence de glucose seul ou de galactose seul.
Les souches transformées ou non, ont été cultivées en 10 ml de MCD lactose 2%, casitone 1.5%, urée 10 M, en présence d' érythromycine (5 μg/ml) pour les souches transformées par le plasmide pST29. Les EPS produits par les différentes souches ont été dosés après 67H30 de culture à
42°C. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau V ci-dessous . Tableau V
Souche OD60o PH mg EPS/I mg EPS/I/OD
7455 (Ext1.1) 1 ,566 4,6 12,5 8
7455 :: pST29 0,98 4,6 14,68 16
7464 (Ext 1.10) 1 ,29 4,24 23,6 18,29
7464 :: pST29 0,99 4,2 44 44
On constate que les souches dont le gène pgm est inactivé conformément à l'invention produisent, à biomasse égale, 2 à 2,5 fois plus d'EPS que les souches d'origine.
EXEMPLE 4 : CONSTRUCTION D'UN MUTANT DU GENE pgm PAR DOUBLE CROSSING OVER
Un vecteur dénommé pSTJδ, contenant un gène pgm inactivé par mutation interne a été construit par amplification PCR inverse en utilisant le plasmide pST29 comme matrice, et les amorces suivantes, dérivées de la séquence du gène pgm par des mutations ponctuelles, induisant notamment la création d'un site Nsil :
GACAΓGCAΓCGCTTGTCGATTAGCCAGAAGGTC GCGAΓGCAΓGTCATTAAGCTGATGGGCGTCGAAG Les mutations introduites dans les amorces sont soulignées ; le site Nsil créé est indiqué en italiques.
Le produit de PCR est clivé par Nsil et religué sur lui-même pour donner le vecteur pSTJβ. Ce vecteur est introduit par transformation dans la souche JIM7446 de S . thermophilus .
Les colonies sont étalées à 30 °C pendant 12 H, puis mises à pousser à 42 °C pendant 24 H, afin de forcer 1 ' intégration du vecteur dans le chromosome par un premier crossing-over par recombinaison entre les séquences pgm présentes sur le plasmide et celles présentes sur le chromosome. Les colonies ainsi obtenues, résistantes à 1 ' érythromycine et capables de pousser à 42 "C, sont ensuite mises à pousser à 30°C afin de favoriser l'excision des séquences du plasmide pG+host par un deuxième crossing-over par recombinaison entre les séquences pgm présentes de part et d'autre des séquences de pG+host. pG+host est ensuite éliminé de la cellule par une étape de croissance à 42 °C en absence de sélection par 1 ' érythromycine . La souche ainsi obtenue ne contient plus de séquences du vecteur pG+host, et en particulier, elle ne contient pas de gène de résistance aux antibiotiques.
Elle ne diffère de la souche d'origine JIM7446 de S. thermophil us que par la présence des mutations dans une portion du gène pgm . La séquence initiale et la séquence mutée de cette partie du gène pgm sont indiquées ci-après ; les mutations sont soulignées. Séquence initiale : GCTGAAGGACTTGGAACGCTTGTCGATTATCCA Séquence mutée :
GCTTAATGACATGCATCGCTTGTCGATTAGCCA
La souche mutée possède le phénotype caractéristique des mutants pgm , décrit dans les exemples 2 et 3 ci-dessus. Elle est capable de pousser sur MCD en présence de glucose et de galactose mais pas en présence de glucose seul ou de galactose seul. L'augmentation de la production d'EPS par cette souche par rapport à la souche parentale est comparable à celle observée dans le cas des souches transformées par pST29, décrites dans les exemples 2 et 3.
EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION DE MUTANTS SURPRODUISANT GALU
Clonage du gène gal U codant pour la Glucose-1-phosphate Uridyl Transférase
L'ensemble du gène gal U peut être obtenu par PCR inverse [OCHMAN et al . , (1990), publication précitée] à partir de l'ADN chromosomique de S. thermophil us, en utilisant des amorces complémentaires au brin opposé (OST13,
OST14, OST21 et OST22) (Tableau VI) .
Tableau VI
Les bandes obtenues sont extraites du gel et séquencées .
La séquence du fragment clone, comprenant le gène gal U est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3.
La taille du gène gal U est de 914 pb .
Surexpression de GalU
Le gène gal U (avec son terminateur et son site de liaison des ribosomes) a été amplifié avec les oligonucléotides OST44 et OST45 (Tableau VI) et clone en aval du promoteur p45 [SIBAKOV et al . , Appl . Environ. Microbiol.,
57, 341-348, (1991)] de L . la ctis dans le site Apal.
Tableau VI
Un fragment Sma l du plasmide résultant, portant P45 suivi de gal U a été purifié et inséré dans le site Smal du vecteur pGKV259 se répliquant chez S . thermophil us . Le plasmide pGKV259 [VAN DER VOSSEN et al . , Appl. Environ. Microbiol., 53, 2452-2457, (1987)] exprimant le gène gal U sous contrôle du promoteur p45 est appelé pSTJ4 (Figure 4). Ce plasmide est introduit par transformation dans la souche S . thermophil us JIM7446, JIM7459 ou dans la souche contenant une mutation dans le gène pgm (STJ2) .

Claims

REVENDICATIONS 1) Mutant de bactérie lactique surproducteur d' exopolysaccharides, dans lequel le gène pgm de l'alpha- phosphoglucomutase est totalement ou partiellement inactivé. 2) Mutant selon la revendication 1, dans lequel le gène ga l U est surexprimé.
3) Mutant selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite bactérie lactique est Streptococcus thermophilus . 4) Mutant selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'une souche de Streptococcus thermophil us capable d'utiliser le galactose.
5) Utilisation d'un mutant de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 4 pour la fabrication d'un produit fermenté.
6) Utilisation d'un mutant de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 4 pour la production d'un exopolysaccharide .
7) Acide nucléique codant une α-phosphoglucomutase dont la séquence en acides aminés a au moins 70% d'identité ou au moins 85% de similarité avec 1' α-phosphoglucomutase représentée par la séquence SEQ ID NO: 2.
EP01928002A 2000-04-18 2001-04-18 Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides Withdrawn EP1274836A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0004971 2000-04-18
FR0004971A FR2807764B1 (fr) 2000-04-18 2000-04-18 Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides
PCT/FR2001/001198 WO2001079476A1 (fr) 2000-04-18 2001-04-18 Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1274836A1 true EP1274836A1 (fr) 2003-01-15

Family

ID=8849365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01928002A Withdrawn EP1274836A1 (fr) 2000-04-18 2001-04-18 Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides

Country Status (12)

Country Link
US (1) US7241610B2 (fr)
EP (1) EP1274836A1 (fr)
JP (1) JP2004500832A (fr)
CN (1) CN1425063A (fr)
AU (1) AU2001254881A1 (fr)
BR (1) BR0110128A (fr)
CA (1) CA2406566A1 (fr)
FR (1) FR2807764B1 (fr)
HU (1) HUP0301029A3 (fr)
MX (1) MXPA02010337A (fr)
NO (1) NO20025008L (fr)
WO (1) WO2001079476A1 (fr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0606433A2 (pt) * 2005-01-06 2009-06-30 Chr Hansen As bactérias do ácido láctico resistentes a bacteriófagos
EA028250B1 (ru) 2009-09-01 2017-10-31 Кр. Хансен А/С Новая молочнокислая бактерия, обладающая сверхтекстурирующим свойством с мутациями в гене galk, и способы ее получения
JP5905834B2 (ja) 2010-01-28 2016-04-20 セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ ファージ耐性に基づいて選択された食品に質感を加えるための乳酸菌
US9453231B2 (en) 2010-10-22 2016-09-27 Chr. Hansen A/S Texturizing lactic acid bacteria strains
AR107069A1 (es) * 2015-12-18 2018-03-14 Chr Hansen As Bacterias del ácido láctico para preparar productos comestibles fermentados con mayor dulzura natural y alta textura
CN108251348A (zh) * 2018-03-29 2018-07-06 上海理工大学 一种嗜热链球菌感受态细胞的制备及转化方法
CN109182186B (zh) * 2018-09-19 2022-02-01 内蒙古大学 一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69737125T3 (de) 1996-10-31 2015-02-26 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe
CA2396040A1 (fr) * 1999-12-30 2001-07-12 Bristol-Myers Squibb Company Nouveaux genes bacteriens et proteines qui sont essentielles pour la viabilite cellulaire et leurs utilisations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEVANDER F ET AL, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 68, no. 2, February 2002 (2002-02-01), pages 784 - 790 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001254881A1 (en) 2001-10-30
US20050164354A1 (en) 2005-07-28
US7241610B2 (en) 2007-07-10
CA2406566A1 (fr) 2001-10-25
NO20025008D0 (no) 2002-10-17
FR2807764B1 (fr) 2004-09-10
WO2001079476A1 (fr) 2001-10-25
FR2807764A1 (fr) 2001-10-19
CN1425063A (zh) 2003-06-18
HUP0301029A3 (en) 2004-10-28
JP2004500832A (ja) 2004-01-15
NO20025008L (no) 2002-12-12
BR0110128A (pt) 2003-02-11
HUP0301029A2 (hu) 2003-07-28
MXPA02010337A (es) 2004-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2493638C (fr) Nouvelles souches de mutants de pseudomonas fluorescens et variants de celles-ci, procedes de production de celles-ci et utilisations de celles-ci dans la production d'alginate
EP0759469B1 (fr) Bactériocine
JPWO2005118812A1 (ja) カロテノイドケトラーゼ及びカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子を利用したアスタキサンチンまたはその代謝物の製造法
JP3862776B2 (ja) 乳酸菌産生エキソポリサッカライド
FR2851575A1 (fr) Nouveau gene de la lysine decarboxylase et procede de production de la l-lysine
KR101091138B1 (ko) 류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법
EP0875579B1 (fr) Production de L(+)-Lactate
FR2822163A1 (fr) Molecules d'acides nucleiques codant une dextrane-saccharase catalysant la synthese de dextrane portant des ramifications de type alpha-1,2 osidiques
EP0750043B1 (fr) Bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides
EP1274836A1 (fr) Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides
WO1999054475A2 (fr) Identification de genes de bacteries lactiques dans la biosynthese des exopolysaccharides
FR3016888A1 (fr) Synthetases de la colistine et cluster de genes correspondants
CN116670295A (zh) 用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株
FR2736652A1 (fr) Levures et bacteries transformees pour operer la fermentation malolactique dans les vins
Bourel et al. Métabolisme sucre-citrate chez Leuconostoc mesenteroides
KR101153400B1 (ko) 신규 리포산 합성효소와 리포산 단백질 리가제를 이용한 알파-리포산의 생산방법
WO2009138323A1 (fr) Cellule recombinante hyperproliférative
EP0957168A1 (fr) Identification de gènes de Streptococcus thermophilus Sfi39 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides
EP1137784A1 (fr) Methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie
WO2001079500A2 (fr) Operons de streptococcus thermophilus impliques dans la synthese des exopolysaccharides (eps)
EP0957170A1 (fr) Identification de gènes de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lfi5 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides
EP0663955B1 (fr) Acide nucleique codant pour une alpha-acetolactate decarboxylase et ses applications
KR101124617B1 (ko) 신규 리포산 합성효소와 리포산 단백질 리가제를 이용한 알파-리포산의 생산방법
CN116601300A (zh) 阿魏酸生物转化为香草醛
EP0957169A1 (fr) Identification de gènes de Lactobacillus helveticus LH59 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20021018

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: BESANCON-YOSHPE, IRIS

Inventor name: HAGEGE, JULIETTE

Inventor name: CHAILLOU, STEPHANE

Inventor name: ANBA, JAMILA

Inventor name: FREMAUX, CHRISTOPHE

Inventor name: MENGAUD, JEROEME

Inventor name: RENAULT, PIERRE

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: COMPAGNIE GERVAIS DANONE

Owner name: RHODIA CHIMIE

Owner name: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INR

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20090224