EP1137784A1 - Methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie - Google Patents

Methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie

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Publication number
EP1137784A1
EP1137784A1 EP99958292A EP99958292A EP1137784A1 EP 1137784 A1 EP1137784 A1 EP 1137784A1 EP 99958292 A EP99958292 A EP 99958292A EP 99958292 A EP99958292 A EP 99958292A EP 1137784 A1 EP1137784 A1 EP 1137784A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
appropriate
derivatives
hmtbs
methionine
dna sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99958292A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Favre-Bulle
Jérôme PIERRARD
Nadine Batisse Debitte
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adisseo France SAS
Original Assignee
Aventis Animal Nutrition SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9815849A external-priority patent/FR2787120A1/fr
Application filed by Aventis Animal Nutrition SA filed Critical Aventis Animal Nutrition SA
Publication of EP1137784A1 publication Critical patent/EP1137784A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the isolation and / or selection of genes coding for enzymes involved in the bioconversion of a substrate into methionine or its derivatives, such as 2-hydroxy 4- (methylthio) butanoic acid or its salts, in particular hydrolyzing amide groups into carboxylic acids, or involved in the bioconversion of nitrile groups into corresponding carboxylic acids, by means of an appropriate selection screen, and the
  • the enzymes catalyzing the hydrolysis of nitrile groups into corresponding carboxylic acids and ammonium ions are nitrilases (Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 1992, ISBN3-540-55762-8). However, this bioconversion of the nitrile groups into
  • corresponding carboxylic acids the final balance of which consists in hydrolysis of the nitrile groups can also be carried out in two stages, the first stage consisting in the conversion of the nitriles into corresponding amides by a nitrile hydratase, the second stage consisting in hydrolizing the amides obtained into corresponding carboxylic acids by amidases.
  • Nitrilases 25 characterized in thermophilic bacteria (Cramp et al, 1997, Microbiology. 143: 2313-2320). Nitrilases have specificities of various substrates but can be grouped into three groups according to their specificity: nitrilases specific for aliphatic nitriles, those specific for aromatic nitriles or those specific for arylacetonitriles (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl Salt Academy
  • Nitrilases are of interest in biocatalysis because many synthetic processes involve hydrolysis of nitrile groups (Lévy- Schil et al.).
  • the nitrilase from Alcaligenes faecalis ATCC9750 and that from Comamonas testosteroni can be used to access the hydroxy analogue of methionine (FR9411301, WO9609403, FR9613077).
  • microbiological isolation of microorganisms from specific biotopes using a screen selection based on the presence of the desired enzymatic activity ii) search for an enzymatic activity in microorganisms by culture of the strains and assay of the activity in question, iii) search, in cultivable microorganisms, of silent and homologous genes to a gene of interest then cloning and expression of this gene in a model microorganism, iv) engineering of proteins to improve the characteristics of an available enzyme and finally v) cloning by expression of directly isolated genes of various biotopes without prior microbiological isolation.
  • in vivo selection screen is meant a medium and / or growth conditions which allow growth only of microorganisms harboring the desired enzymatic activity.
  • strategies iv) and v) are particularly interesting for making better use of biodiversity by targeting the biodiversity available but not accessible by microbiological isolation (strategy v) or by creating more diversity from cultivable strains (strategy iv). It is particularly for these two strategies that the possibility of having an in vivo selection screen which is simple to implement represents a definite advantage which leads to screening a large number of clones in a short time and if necessary with means.
  • the invention consists of a simple, rapid and inexpensive method for isolating and / or selecting DNA sequences coding for enzymes involved in the bioconversion of a substrate into methionine salt (AMTBS) or its derivatives such as 2-hydroxy 4- (methyl thio) butanoic acid (hereinafter HMTBS), in particular the ammonium salt, and in particular involved in the bioconversion of 2-amino 4- (methyl thio) butyronitrile (AMTBN) or its derivatives, such as 2-hydroxy 4- (methyl thio) butyronitrile (hereinafter HMTBN) in methionine or its derivatives such as HMTBS, either directly or via 2-amino 4-methyl thio butanamide or its derivatives , such as 2-hydroxy 4-methyl thio butanamide (hereinafter HMTBAmide).
  • ATBS methionine salt
  • HMTBS 2-hydroxy 4- (methyl thio) butanoic acid
  • HMTBN 2-hydroxy 4- (methyl thio) butyronit
  • the enzymes are involved in the bioconversion of an appropriate substrate into HMTBS, the suitable substrates being HMTBN or HMTBAmide.
  • HMTBS HMTBN or HMTBAmide
  • the indications relating to HMTBS, HMTBN or HMTBAmide also apply to methionine or its derivatives, and the corresponding substrates, 2-amino 4- (methyl thio) butyronitrile or its derivatives and 2-amino 4-methyl thio butanamide or its derivatives.
  • the present invention therefore relates to a method of selecting and / or isolating DNA sequences coding for enzymes involved in the bioconversion of an appropriate substrate into methionine and its derivatives, such as HMTBS, said method comprising the following steps of 1) cloning of DNA sequences into a vector allowing their expression in an appropriate host microorganism,
  • the appropriate substrate 2-hydroxy 4- (methylthio) butyronitrile (hereinafter HMTBN) which is converted into 5 HMTBS, either directly by a nitrilase, or via 2 -hydroxy 4- (methylthio) butanamide (hereinafter HMTBAmide), this second route involving a first conversion of HMTBN to HMTBAmide by a nitrile hydratase, followed by a conversion of HMTBAmide by an amidase.
  • HMTBN 2-hydroxy 4- (methylthio) butyronitrile
  • HMTBAmide 2 -hydroxy 4- (methylthio) butanamide
  • the suitable substrate is HMTBAmide, which is converted into HMTBS by an amidase, coded by the DNA sequence isolated and / or selected by the method according to the invention.
  • isolation is essentially meant according to the invention the separation of a particular sequence from a set of varied sequences.
  • selection is essentially meant according to the invention the choice of the best sequence having a particular property.
  • microorganism suitable auxotrophic for methionine is meant according to the invention any microorganism auxotrophic for methionine capable of being transformed and capable of growing on a methionine-free medium comprising HMTBS. It can be a yeast, a fungus or a bacteria.
  • the appropriate microorganism is a bacterium, preferably E. coll.
  • the appropriate microorganism useful according to the invention can be naturally auxotrophic for methionine. or modified so as to induce this auxotrophy by mutagenesis.
  • the various methods for obtaining auxotrophic mutants are well known to those skilled in the art and widely described in the literature (in particular Roberts CJ, Selker EU.
  • the appropriate microorganism transformed with a vector comprising a DNA sequence coding for an enzyme involved in the bioconversion of HMTBN into the corresponding carboxylic acid is capable of converting HMTBN into HMTBS, allowing the auxotrophic microorganism to methionine to develop.
  • the microorganism ensures the bioconversion of HMTBS into methionine to allow the strain to grow.
  • the transformed with a vector suitable microorganism comprising a DNA sequence encoding an enzyme involved in the bioconversion del 'HMTBAmide corresponding carboxylic acid, is able to convert the HMTBAmide in HMTBS, allowing the microorganism auxotrophic for methionine to develop oneself.
  • the microorganism suitable auxotrophic for methionine also comprises a gene coding for an enzyme involved in the bioconversion of HMTBAmide into HMTBS, and when this microorganism is transformed with a vector comprising a DNA sequence coding for an enzyme involved in the bioconversion of HMTBN into HMTBAmide, it is capable of converting HMTBN into HMTBS, allowing it to develop.
  • the isolated and / or selected enzyme involved in the bioconversion of HMTBN into HMTBS is a nitrilase allowing the conversion of HMTBN into HMTBS necessary for the growth of microorganisms modified.
  • the isolated and / or selected enzyme involved in the bioconversion of HMTBN into HMTBS is a nitrile hydratase allowing the conversion of HMTBN into HMTBAmide.
  • the appropriate microorganism also comprising a natural or heterologous gene coding for a complementary amidase ensuring the bioconversion of HMTBAmide into HMTBS necessary for the growth of the modified microorganisms.
  • the isolated and / or selected enzyme involved in the bioconversion of HMTBN into HMTBS is an amidase, the appropriate microorganism also comprising a natural or heterologous gene coding for a complementary nitrile hydratase.
  • the gene for the complementary enzyme if it is heterologous, is either integrated into the genome of the appropriate microorganism, or carried by a plasmid.
  • the isolated and / or selected enzyme involved in the bioconversion of HMTBamide into HMTBS is an amidase, and the appropriate culture medium contains HMTBAmide.
  • the DNA sequence is a DNA sequence isolated from one or more genomes, by total or partial restriction of said one or more genomes.
  • the DNA sequence can also be a DNA sequence isolated from a part of the genome by total or partial restriction of said part of the genome.
  • restriction is meant any means, enzymatic or not, capable of fragmenting DNA, specifically or not.
  • the method according to the invention is in this case particularly suitable for the selection of new enzymes according to strategies i) and v) defined above.
  • the DNA sequence can also be a DNA sequence isolated from a construct by PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • the DNA sequence can also be obtained by random or targeted mutagenesis of a sequence coding for a reference enzyme defined above.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the selection of new enzymes according to strategy iv) defined previously.
  • the DNA sequence can also be an isolated DNA sequence having determined homology with a reference enzyme defined above. This determined degree of homology is advantageously greater than 50%, preferably greater than 60%, more preferably greater than 70%.
  • the method according to the invention constitutes a rapid screen to be implemented to identify to what extent a nucleic acid sequence having a certain level of homology with a reference sequence, has the same function and / or o the same activity as the reference sequence.
  • reference enzyme is meant according to the invention a known enzyme involved in the bioconversion of the appropriate substrate into HMTBS, in particular HMTBN into HMTBS or in the bioconversion of HMTBAmide into HMTBS, preferably a nitrilase, a nitrile hydratase or an amidase, defined above, which will serve as a reference for evaluating the function and activity of the new enzymes isolated and / or selected by the process according to the invention, in particular the enzymes for which new mutants are sought and / or those with a certain degree of homology defined previously.
  • the culture of the microorganisms transformed for the isolation and / or selection process according to the invention is carried out by any suitable means known to those skilled in the art. It is in particular a mass culture (batch), in particular by successive cultures, or by continuous cultures, in particular cultures in chemostat (Seegers JF & al., Plasmid, 1995 Jan 33: 1 71 -7; Weikert C & al., Microbiology, 1997 May 143 (Pt 5): 1567-74; Tsen SD & al, Biochem Biophys Res Commun, 1996 Jul 16 224: 2 351-7; Tsen SD, Biochem Biophys Res Commun , 1990 Feb 14 166: 3 1245-50; Berg OG, J Theor Biol, 1995 Apr 7 173: 3 307-20).
  • appropriate culture medium comprising a sufficient amount of suitable substrate
  • any culture medium suitable for the growth of the microorganism transformed auxotrophic for methionine said medium being substantially free of methionine, and comprising a sufficient amount of suitable substrate to allow the growth of said microorganism transformed after bioconversion of said suitable substrate into HMTBS.
  • medium substantially free of methionine is meant a medium free of methionine or optionally comprising an amount of methionine insufficient to allow the growth of the microorganism suitable auxotrophic for methionine.
  • the sufficient amount of HMTBN is advantageously between 0 and 60 g / 1 (equivalent of approximately 400 mM), more preferably between 3 mg / 1 and 17 mg / 1 (equivalent of approximately 20 ⁇ M and approximately 100 ⁇ M) , more preferably between 6 mg / 1 and 10 mg / 1 (equivalent of approximately 40 ⁇ M and approximately 60 ⁇ M).
  • the sufficient amount of HMTBAmide is advantageously between 0 and 60 g / 1 (equivalent of approximately 400 mM), more preferably between 3 mg / 1 and 17 mg / 1 (equivalent of approximately 20 ⁇ M and approximately 100 ⁇ M), more preferably between 6 mg / 1 and 10 mg / 1 (equivalent of approximately 40 ⁇ M and approximately 60 ⁇ M).
  • the essential source of HMTBS necessary for the growth of the transformed microorganisms is constituted by the HMTBS produced by the conversion of the appropriate substrate, in particular HMTBN or HMTBAmide, by the enzyme encoded by the DNA sequence introduced into the transformed microorganism.
  • the medium according to the invention may also initially comprise (before and at the time of inoculation with the transformed microorganisms) an appropriate quantity of HMTBS, in particular to allow the growth of microorganisms to be initiated, this quantity of HMTBS being replaced as the microorganisms grow with HMTBS resulting from the conversion of the appropriate substrate, in particular HMTBN or HMTBAmide.
  • the HMTBS is present in the medium at a concentration lower than the concentration sufficient to allow the growth of the microorganisms transformed according to the invention.
  • This concentration can be determined according to the appropriate culture medium, in particular its form (bacth, continuous liquid, solid, etc.), and will preferably be less than 350 ⁇ g / 1 (equivalent to approximately 2 ⁇ M) more preferably less than 250 ⁇ g / 1 (equivalent of approximately 1.5 ⁇ M), more preferably between 130 ⁇ g / 1 and 170 ⁇ g / 1. (equivalent to approximately 0.8 ⁇ M and approximately 1 ⁇ M).
  • the appropriate medium comprises a source of organic nitrogen not comprising traces of methionine.
  • the organic nitrogen source is a yeast extract, in particular from Yeats Nitrogen Broth w / o Amino Acids (YNB, Yeats Nitrogen
  • the content of organic nitrogen source is between 0 and 15 g / 1, more preferably between 2 and 10 g / 1, even more preferably between 3 and 8 g / 1.
  • the appropriate medium according to the invention comprises M9fru described below as the minimum medium.
  • the suitable medium according to the invention comprises as carbon source a compound chosen from glucose, fructose, galactose, trehalose, mannose, melibiose, sucrose, raffinose, maltotriose, maltose, lactose , lactulose, arabinose, xylose, rhamnose, fucose, mannitol, sorbitol, malate, saccharate, mucate, mesotartrate. glucuronate. galacturonate and their mixtures in all proportions.
  • the carbon source is chosen from glucose or fructose, and their mixtures in all proportions, more preferably fructose.
  • the culture medium according to the invention can be liquid or solid, and in this case can contain agar or agarose.
  • Figure 1 shows the plasmid RPA-BIOCAT41.
  • the sites in parenthesis are sites that were eliminated during cloning.
  • Ptrp tryptophan promoter
  • nitB nitrilase gene
  • TrrnB transcription terminators
  • end ROP end of the gene coding for the protein ROP (Chambers et al., 1988. Gene 68: 139-149);
  • ORI origin of replication;
  • RNAI / II RNA involved in replication (Chambers et al., Cited above); Te: tetracycline resistance gene.
  • Figure 2 shows the growth at 37 ° C, 200 rpm and in a 50 ml hermetically closed tube, of the two strains RPA-BIOCAT 610 and 842 by reading the optical densities in microplates at 630nm.
  • FIG. 3 shows the growth of the RPA-BIOCAT 841 and 842 strains in selective medium: A. with a limiting HMTBS concentration of 0.8 ⁇ M; B. with a limiting HMTBS concentration of 1 ⁇ M.
  • the selective media are constituted by the minimal medium M9YNBfru + IPTG 0.5 mM supplemented with: HMTBS 0.8 ⁇ M (S0.8) or in HMTBS 1 ⁇ M (SI), or in HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 0.8 ⁇ M (NS0.8) or else in HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 1 ⁇ M (NSI).
  • FIG. 4 shows the growth of the RPA-BIOCAT 841 and 960 strains in selective medium: A. in the presence of 0.8 ⁇ M HMTBS; B. in the presence of 1 ⁇ M HMTBS.
  • the selective media are constituted by the minimal medium M9YNBfru + IPTG 0.5 mM supplemented with: HMTBS 0.8 ⁇ M (S0.8) or in HMTBS 1 ⁇ M (SI), or in HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 0.8 ⁇ M (NS0.8) or else in HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 1 ⁇ M (NSl).
  • the minimal medium M9fru has the following composition: Na 2 HPO 4 7g / l, KH 2 PO 4 3g / l, NaCl 0.6 g / 1, NH 4 C1 1 g / 1, fructose, 4 g / 1, MgSO 4 1 mM , CaCl 2 0.1 mM, thiamine 10 ⁇ g / ml.
  • the minimal medium M9YNBfru corresponds to the medium M9fru supplemented with YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco) at a final concentration of 5 g / 1.
  • This medium is prepared from the following mother solutions previously sterilized: M9 salts xlO (Na 2 HPO 4 70g / l, KH 2 PO 4 30g / l, NaCl 6 g / 1, NH 4 C1 10 g / 1, autoclave) , fructose 20% filtered, YNB 20% filtered, MgSO 4 100 mM autoclave. CaCl 2 10 mM autoclave, 1% thiamine filtered.
  • the precultures are carried out in 3 ml of LB rich medium (tryptone 10 g / 1, yeast extract 5 g / 1, NaCl 10 g / 1, pH 7.0) in the presence of the appropriate antibiotics, if necessary, by seeding from a glycerol stock of the strain concerned.
  • the preculture is incubated at 37 ° C, 200 rpm for 6 to 7 hours.
  • the activities are expressed in kg of HMTBS produced / hour / kg of dry cells
  • Example 1 Construction of the pRSP-BCAT41 piasmid.
  • the 1.27 kb fragment containing the Ptrp promoter, the binding site of the ⁇ phage cili gene (RBScII) ribosome and the alkaligenes faecalis ATCC8750 (nitB) nitrilase gene was extracted from the plasmid pRPA-BCAT6 (Request FR 96/13077) using the restriction enzymes EcoRI and Xbal to be cloned into the vector pXL642 (described in application CIP No. 08 / l 94,588) opened with the same restriction enzymes.
  • pRPA-BCAT15 was opened by enzymes Stul and Bsml and the 4.3 kb fragment was ligated with the 136 bp Stul-Bsml fragment purified from pRPA-BCAT4 (Application FR 96/13077) to yield the plasmid pRPA-BCAT19.
  • the partial sequencing of pRPA-BCAT19 confirmed the replacement of the codon of the residue Asp279 of nitrilase by the codon of a residue Asn279.
  • the vector pRPA-BCAT28 was obtained by ligating the 3.9 kb Sspl-Scal fragment of pXL642 (CIP application N ° 08 / l 94.588) with the 2.1 kb Smal fragment of pHP45 ⁇ Tc (Fellay et al, 1987, Gene 52: 147-154) in order to replace the ampicillin resistance marker with the tetracycline resistance marker.
  • the plasmid pRPA-BCAT41 was obtained, a map of which is shown in FIG. 1.
  • the sequence of the expression cassette is represented by the sequence identifier No. 1 (S ⁇ Q ID NO 1) .
  • nitB gene was amplified by PCR using as matrix the plasmid pRPA-BCAT41, the primers PCRAF1 described in application FR96 / 13077 and NitB 160 described below and the enzyme Pfu (Stratagene).
  • NitB 160 5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3 'The program used included a 5 min cycle at 95 ° C, 5 cycles of 1 min at 95 ° C; 1 min at 60 ° C; 1 min at 72 ° C, 30 cycles of 30 sec at 95 ° C; 30 sec at 60 ° C; 30 sec at 72 ° C and a 5 min sequence at 72 ° C.
  • the fragment of approximately 0.495 bp thus amplified was digested with the enzymes NdeI and Rs / HKAI (New England Biolabs).
  • the vector pRPA-BCAT72 was obtained by eliminating from the vector pRPA-BCAT41, by digestion Xcm 1 and religation, the fragment Xcml of approximately 0.55 kb.
  • the plasmid resulting from this cloning was called pRPA-BCAT77.
  • Example 3 Construction of a strain of E. auxotrophic coli expressing the nitrilase A' ⁇ lcaligenes faecalis from the P lac promoter.
  • the alkaligenes faecalis ATCC8750 nitrilase gene was amplified by PCR using, as template, the plasmid pRPA-BCAT77, the primers nitBMN1 and nitBMN2 described below and the polymerase Pfu (Stratagene).
  • nitBMNl 5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3 'nitBMN2: 5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3'
  • the program used included a 5 min cycle at 95 ° C, 5 cycles of 1 min at 95 ° C; 1 min at 50 ° C; 1 min at 72 ° C, 30 cycles of 30 sec at 95 ° C; 30 sec at 50 ° C; 30 sec at 72 ° C and a 5 min sequence at 72 ° C.
  • the approximately 1.2 kb fragment obtained was then digested with the enzyme Xbal to be cloned into the vector pbsll ks- (Stratagene) opened by the enzymes EcoRV and Xbal.
  • the plasmid obtained, pRPA-BCAT105 was then introduced into the E. coli strain RPA-BIOCAT610.
  • This strain contains a deletion in the metA gene and corresponds to the ⁇ 180 strain described in Richaud et al. (J. Biol. Chem. (1993) 268: 26827-26835).
  • a clone was selected and cultivated in 3 copies in LB under the conditions of expression described above.
  • the nitrilase activity was measured on the cell pellets obtained as described above and found after average at 2.5 kg / h.kg CS against 0 kg / h.kg CS for the strain RPA-BIOCAT 842 described in Example 4 and grown under the same conditions.
  • This new strain expressing an active nitrilase was named RPA-BIOCAT 841.
  • Example 4 Construction of a strain of E. auxotrophic coli expressing nitrilase ⁇ ' ⁇ lcaligenes faecalis inactive from the P lac promoter.
  • the gene for a nitrilase variant NitB was amplified as described in Example 3 using the plasmid pRPA-BCAT69 as a template.
  • the plasmid pRPA-BCAT69 corresponds to the vector pRPA-BCAT41 but contains a mutation in the nitB gene which leads to the replacement of the Cysteine 163 residue of the nitrilase NitB with an Alanine residue.
  • Plasmid pRPA-BCAT69 was obtained as follows.
  • Example 6 Growth of E. mutants auxotrophic coli for methionine in a minimum medium supplemented with HMTBS.
  • the RPA-BIOCAT 610 and 842 strains were precultivated in LB medium supplemented, only for the strain 842, with 0.5 mM IPTG and carbenicillin 100 ⁇ g / ml, washed in M9YNBfru medium and taken up in an equal volume of this same medium. The two cultures were then diluted to 1/100 in 10 ml of the following media supplemented with carbenicillin 100 ⁇ g / ml and 0.5 mM IPTG only for the RPA-BIOCAT 842 strain: i) M9YNBfru + HMTBN 50 ⁇ M ii) M9YNBfru + 5 HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 10 ⁇ M. . These cultures were carried out in a hermetically sealed 50 ml tube at 37 ° C. with stirring at 200 rpm and the growth of the strains, measured by optical density of the culture at 630 nm read in microplate, is reported on the figure 2.
  • HMTBS can be used as a source of o methionine by strains of E. coli auxotrophs for methionine.
  • Example 7 Influence of YNB, HMTBN and HMTBS on the growth, in minimum medium, of a strain of E. coli auxotroph for methionine expressing active nitrilase of ⁇ lcalîgenes faecalis
  • the RPA-BIOCAT 841 and 842 strains were precultivated in the presence of 5 carbenicillin 100 ⁇ g / ml and 0.5 mM IPTG, washed as described in Example 6 and diluted to l / 1000 emc in 5 ml media listed in Table 1, all supplemented with carbenicillin 100 ⁇ g / ml and IPTG 0.5 mM. Their growth was estimated after 5 days of incubation at 37 ° C., 200 rpm, in a 50 ml tube hermetically closed, by visual observation of the turbidity of the cultures. These results are collated in Table 1.
  • HMTBN of 50 ⁇ M is too low to provide a sufficient source of methionine for the growth of E. coli.
  • Example 8 Determination of the minimum concentration of HMTBS allowing the growth of the auxotrophic strains
  • the RPA-BIOCAT 841 strain was precultured in the presence of carbenicillin 100 ⁇ g / ml and IPTG 0.5 mM, washed as described in Example 6 and diluted to l / 1000 ee in 5 ml of the media mentioned in table 2, all supplemented with carbenicillin 100 ⁇ g / ml and IPTG 0.5 mM. Their growth was estimated after 5 days of incubation at 37 ° C, 200 rpm. in a 50 ml hermetically sealed tube, by visual observation of the turbidity of the cultures. These results are collated in Table 2. Table 2: Growth of the RPA-BIOCAT 841 strain in the presence of HMTBS at low concentration.
  • Example 9 Development of a selective medium allowing the growth of a strain of E. coli auxotrophic for methionine expressing the active nitrilase of callcaligenes faecalis.
  • the RPA-BIOCAT 841 and 842 strains were precultivated in the presence of carbenicillin 100 ⁇ g / ml and 0.5 mM IPTG, washed under the conditions described in Example 6 then diluted to l / 100 th in 10 ml of selective medium M9YNBfru + 0.5 mM IPTG containing 0.8 or 1 ⁇ M HMTBS and 50 ⁇ M HMTBN.
  • FIG. 3 shows the growth of these two strains at 37 ° C., 200 rpm in hermetically sealed 50 ml tubes, growth measured by reading the optical densities in microplates at 630 nm. The results show that the selective medium M9YNBfru + IPTG 0.5 mM +
  • HMTBN 50 ⁇ M + HMTBS 0.8 or 1 ⁇ M makes it possible to differentiate a strain of E. coli expressing an active nitrilase of a strain of E. coli expressing an inactive nitrilase.
  • Example 10 Growth of E. strains. coli auxotrophs for methionine expressing active nitrilases on hydroxy-methyl-thio-butyronitrile.
  • the RPA-BIOCAT 841 and 960 strains were precultivated in the presence of carbenicillin 100 ⁇ g / ml and 0.5 mM IPTG, washed under the conditions described in Example 6 and then diluted to 1/100 in the selective growth media described. in Example 9.
  • FIG. 4 describes the growth of these two strains at 37 ° C., 200 rpm in hermetically sealed 50 ml tubes, growth measured by reading the optical densities in microplates at 630 nm.
  • Example 9 The results show that the medium described in Example 9 is selective for auxotrophic strains for methionine expressing nitrilases of two different origins in the expression system using the promoter R / ⁇ c -

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Abstract

La présente invention concerne donc un procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en méthionine et ses dérivés, comme l'HMTBS, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de: 1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié; 2) transformation d'un micro-organisme approprié auxotrophe pour la méthionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié; 3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, et; 4) sélection des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et 5) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.

Description

METHODE D'ISOLEMENT ET DE SELECTION DE GENES CODANT POUR DES ENZYMES, ET MILIEU DE CULTURE APPROPRIE
La présente invention concerne un nouveau procédé d'isolement et/ou de 5 sélection de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat en methionine ou ses dérivés, comme l'acide 2-hydroxy 4-(methylthio) butanoïque ou ses sels, en particulier hydrolysant des groupements amides en acides carboxyliques, ou impliqués dans la bioconversion de groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants, au moyen d'un crible de sélection approprié, et le
10 milieu de culture approprié pour la mise en œuvre dudit procédé.
Les enzymes catalysant l'hydrolyse de groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants et ions ammoniums sont les nitrilases (Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag, Berlin Heidelberg , 1992, ISBN3-540-55762-8). Toutefois, cette bioconversion des groupements nitriles en
15 acides carboxyliques correspondants, dont le bilan final consiste en une hydrolyse des groupements nitriles peut aussi être réalisée en deux étapes, la première étape consistant en la conversion des nitriles en amides correspondants par une nitrile hydratase, la deuxième étape consistant à hydroliser les amides obtenus en acides carboxyliques correspondants par des amidases.
20 Les nitrilases furent découvertes d'abord chez les plantes (Thimann and
Mahadevan. 1964, Arch. Biochem. Biophys. 105 : 133-141) puis isolées chez de nombreux représentants de la micro flore du sol (Kobayashi et Shimizu. 1994, FEMS Microbiology Letters 120 : 217-224) : Pseudomonas, Nocardia, Arthrobacter, Fusarium, Rhodoccocus, Alcaligenes. Plus récemment, des nitrilases ont été
25 caractérisées chez des bactéries thermophiles (Cramp et al, 1997, Microbiology. 143 : 2313-2320). Les nitrilases ont des spécificités de substrats variées mais peuvent être regroupées en trois groupes en fonction de leur spécificité: les nitrilases spécifiques des nitriles aliphatiques, celles spécifiques de nitriles aromatiques ou celles spécifiques d'arylacétonitriles (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sel
30 USA 90 : 247-251 ; Kobayashi et Shimizu, 1994, précité ; Lévy-Schil et al, 1995, Gène 161 : 15-20). Les nitrilases ont un intérêt en biocatalyse car de nombreux procédés de synthèse mettent en jeu des hydrolyses de groupements nitriles (Lévy- Schil et al.). En particulier, la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC9750 et celle de Comamonas testosteroni peuvent être utilisées pour accéder à l'hydroxy-analogue de la methionine (FR9411301, WO9609403, FR9613077).
Il est courant, lorsque l'on cherche de nouvelles enzymes, d'utiliser plusieurs stratégies (Dalboge et Lange, 1998, TibTech 16 : 265-272) : i) isolement microbiologique de micro-organismes à partir de biotopes spécifiques en utilisant un crible de sélection basé sur la présence de l'activité enzymatique recherchée, ii) recherche d'une activité enzymatique dans des micro-organismes par culture des souches et dosage de l'activité en question, iii) recherche, dans des micro-organismes cultivables, de gènes silencieux et homologues à un gène d'intérêt puis clonage et expression de ce gène dans un micro-organisme modèle, iv) ingénierie de protéines pour améliorer les caractéristiques d'une enzyme disponible et enfin v) clonage par expression de gènes directement isolés de biotopes variés sans isolement microbiologique préalable. Les stratégies i), iii), iv), et v) sont considérablement accélérées et simplifiées si un crible de sélection in vivo est disponible. Par crible de sélection in vivo, on entend un milieu et/ou des conditions de croissance qui ne permettent la croissance que des micro-organismes hébergeant l'activité enzymatique recherchée.
De plus, compte tenu de la très faible proportion de micro-organismes cultivables en laboratoire (Amann et al., 1995, Microbiol Rev., 59, 143), les stratégies iv) et v) sont particulièrement intéressantes pour tirer un meilleur parti de la biodiversité en ciblant la biodiversité disponible mais non accessible par isolement microbiologique (stratégie v) ou en créant plus de diversité à partir de souches cultivables (stratégie iv). C'est particulièrement pour ces deux stratégies que la possibilité de disposer d'un crible de sélection in vivo simple à mettre en œuvre représente un avantage certain qui conduit à cribler un nombre de clones important en un court délai et le cas échéant avec des moyens limités (Minshull, 1998, « Evolution of enzyme activities and substrate préférences by DNA shuffling », IBC 's second International Symposium on Directed Evolution oflndustrial Enzymes, Sept 14-15, San Diego ; Grayling, 1998, « Concepts and Stratégies in high throughput screening for improved enzyme variants », IBC 's second International Symposium on Directed Evolution of Industrial Enzymes, Sept 14-15, San Diego). L'invention consiste en une méthode simple, rapide et peu coûteuse permettant d'isoler et/ou sélectionner des séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat en en sel de methionine (AMTBS) ou ses dérivés comme l'acide 2-hydroxy 4-(methyl thio) butanoïque (ci- après HMTBS), en particulier le sel d'ammonium, et notamment impliquées dans la bioconversion du 2-amino 4-(méthyl thio) butyronitrile (AMTBN) ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-(methyl thio) butyronitrile (ci-après HMTBN) en methionine ou ses dérivés comme l'HMTBS, soit directement, soit par l'intermédiaire du 2- amino 4-méthyl thio butanamide ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-méthyl thio butanamide (ci-après HMTBAmide).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les enzymes sont impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en HMTBS, les substrats appropriés étant l'HMTBN ou l'HMTBAmide.
Par souci de clarté, le reste de la description a été rédigée avec l'HMTBS, l'HMTBN ou l'HMTBAmide. Toutefois, dans la description qui suit, les indications relatives à l'HMTBS, l'HMTBN ou l'HMTBAmide s'applique également à la methionine ou ses dérivés, et les substrats correspondants, le 2-amino 4-(méthyl thio) butyronitrile ou ses dérivés et le 2-amino 4-méthyl thio butanamide ou ses dérivés.
En clonant de telles séquences dans un plasmide permettant l'expression de ces nitrilases chez un mutant d'un micro-organisme auxotrophe pour la methionine, on peut alors sélectionner les seules souches qui ont intégré une enzyme active impliquée dans la bioconversion du substrat en HMTBS, le micro-organisme auxotrophe pour la methionine étant capable de croître en présence d'HMTBS, obtenu par bioconversion, en l'absence de methionine dans le substrat. Cette stratégie conduit donc à des cultures enrichies en clones exprimant des enzymes actives, voire à des cultures enrichies en clones exprimant des enzymes dont les propriétés catalytiques ont été améliorées par mutagenèse dirigée ou aléatoire.
La présente invention concerne donc un procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en methionine et ses dérivés, comme l'HMTBS, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de 1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié,
2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la methionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit
5 micro-organisme approprié,
3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, et
4) sélection des micro-organismes transformés capables de croître dans le o milieu approprié, et
5) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le substrat approprié le 2-hydroxy 4-(methylthio) butyronitrile (ci-après HMTBN) qui est converti en 5 HMTBS, soit directement par une nitrilase, soit par l'intermédiaire du 2-hydroxy 4- (methylthio) butanamide (ci-après HMTBAmide), cette deuxième voie impliquant une première conversion de l'HMTBN en HMTBAmide par une nitrile hydratase, suivie d'une conversion de l'HMTBAmide par une amidase. Dans le premier cas, la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention code pour une nitrilase. Dans le deuxième cas, la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention code pour une nitrile hydratase ou une amidase.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, le substrat approprié est l'HMTBAmide, qui est converti en HMTBS par une amidase, codée par la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention. Par isolement, on entend essentiellement selon l'invention la séparation d'une séquence particulière à partir d'un ensemble de séquences variées. Par sélection, on entend essentiellement selon l'invention le choix de la meilleure séquence présentant une propriété particulière.
Une fois les micro-organismes sélectionnés et/ou isolés, ils peuvent être cultivés sur un milieu de culture usuel pour en augmenter le nombre et faciliter l'isolement et l'identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié. Par micro-organisme approprié auxotrophe pour la methionine, on entend selon l'invention tout micro-organisme auxotrophe pour la methionine capable d'être transformé et susceptible de croître sur un milieu exempt de methionine comprenant de l'HMTBS. Il peut s'agir d'une levure, d'un champignon ou d'une bactérie. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le micro-organisme approprié est une bactérie, de préférence E. coll.
Le micro-organisme approprié utile selon l'invention peut être naturellement auxotrophe pour la methionine. ou encore modifié de manière à induire cette auxotrophie par mutagenèse. Les différentes méthodes d'obtention de mutants auxotrophes sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature (notamment Roberts CJ, Selker EU. Nucleic Acids Res, 1995 Dec 1 1 23:23 4818-26 ; McAdam RA & al., Infect Immun, 1995 Mar 63:3 1004-12 ; Manning M & al., Can J Microbiol 1984 Jan 30: 1 31-5 ; Yamagata S, J Bacteriol, 1987 Aug 169:8 3458-63 ; Wabiko H & al., J Bacteriol, 1988 Jun 170:6 2705-10 ; Frank P & al., J Biol Chem, 1985 May 10 260:9 5518-25).
Le micro-organisme approprié transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en acide carboxylique correspondant, est capable de convertir l'HMTBN en HMTBS, permettant au micro-organisme auxotrophe pour la methionine de se développer. Dans ce cas, le micro-organisme assure la bioconversion de l'HMTBS en methionine pour permettre à la souche de croître.
Le micro-organisme approprié transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion del' HMTBAmide en acide carboxylique correspondant, est capable de convertir l'HMTBAmide en HMTBS, permettant au micro-organisme auxotrophe pour la methionine de se développer.
Lorsque le micro-organisme approprié auxotrophe pour la methionine comprend également un gène codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS, et lorsque ce micro-organisme est transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBAmide, il est capable de convertir l'HMTBN en HMTBS, lui permettant de se développer. Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une nitrilase permettant la conversion de l'HMTBN en HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes modifiés. Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une nitrile hydratase permettant la conversion de l'HMTBN en HMTBAmide. le microorganisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une amidase complémentaire assurant la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes modifiés.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une amidase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une nitrile hydratase complémentaire. Dans les deux cas ci-dessus, le gène de l'enzyme complémentaire, s'il est hétérologue est soit intégré dans le génome du micro-organisme approprié, soit porté par un plasmide.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBamide en HMTBS est une amidase, et le milieu de culture approprié contient de l'HMTBAmide.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'un ou de plusieurs génomes, par restriction totale ou partielle dudit ou desdits génomes. La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée d'une partie de génome par restriction totale ou partielle de ladite partie de génome. Par restriction, on entend tout moyen, enzymatique ou non, susceptible de fragmenter de l'ADN, de manière spécifique ou non. Le procédé selon l'invention est dans ce cas particulièrement approprié pour la sélection de nouvelles enzymes selon les stratégies i) et v) définies auparavant.
La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée à partir d'une construction par PCR (Polymerase Chain Reaction).
La séquence d'ADN peut aussi être obtenue par mutagenèse aléatoire ou ciblée d'une séquence codant pour une enzyme de référence définie précédemment. Dans ce cas, la procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour la sélection de nouvelles enzyme selon la stratégie iv) définie auparavant.
La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée présentant une homologie déterminée avec une enzyme de référence définie 5 précédemment. Ce degré d'homologie déterminé est avantageusement supérieur à 50 %, préférentiellement supérieur à 60 %, plus préférentiellement supérieur à 70 %. Dans ce cas, le procédé selon l'invention constitue un crible rapide à mettre en œuvre pour identifier dans quelle mesure une séquence d'acide nucléique présentant un certain niveau d'homologie avec une séquence de référence, a la même fonction et/ou o la même activité que la séquence de référence.
Par enzyme de référence, on entend selon l'invention une enzyme connue impliquée dans la bioconversion du substrat approprié en HMTBS, en particulier de l'HMTBN en HMTBS ou dans la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS, de préférence une nitrilase, une nitrile hydratase ou une amidase, définie auparavant, qui 5 servira de référence pour évaluer la fonction et l'activité des nouvelles enzymes isolées et/ou sélectionnées par le procédé selon l'invention, notamment les enzymes pour lesquelles on cherche de nouveaux mutants et/ou celles présentant un certain degré d'homologie défini auparavant.
La culture des micro-organismes transformés pour le procédé d'isolement et/ou de sélection selon l'invention est effectuée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il s'agit notamment d'une culture en masse (batch), en particulier par des cultures successives, ou par des cultures en continu, en particulier des cultures en chemostat (Seegers JF & al., Plasmid, 1995 Jan 33:1 71-7 ; Weikert C & al., Microbiology, 1997 May 143 ( Pt 5): 1567-74 ; Tsen SD & al, Biochem Biophys Res Commun, 1996 Jul 16 224:2 351-7 ; Tsen SD, Biochem Biophys Res Commun, 1990 Feb 14 166:3 1245-50 ; Berg OG , J Theor Biol, 1995 Apr 7 173:3 307-20).
Par milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, on entend de préférence selon l'invention tout milieu de culture approprié pour la croissance du micro-organisme transformé auxotrophe pour la methionine, ledit milieu étant substantiellement exempt de methionine, et comprenant une quantité suffisante de substrat approprié pour permettre la croissance dudit microorganisme transformé après bioconversion dudit substrat approprié en HMTBS.
Par milieu substantiellement exempt de methionine, on entend un milieu exempt de methionine ou comprenant éventuellement une quantité de methionine insuffisante pour permettre la croissance du micro-organisme approprié auxotrophe pour la methionine.
La quantité suffisante d'HMTBN est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1 (équivalent d'environ 400 mM), plus préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1 (équivalent d'environ 20 μM et environ 100 μM), plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1 (équivalent d'environ 40 μM et environ 60 μM).
La quantité suffisante d 'HMTBAmide est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1 (équivalent de environ 400 mM), plus préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1 (équivalent d'environ 20 μM et environ 100 μM), plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1 (équivalent d'environ 40 μM et environ 60 μM).
Il est entendu que pour le procédé et le milieu selon l'invention, la source essentielle d'HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes transformés est constituée par l'HMTBS produit de la conversion du substrat approprié, en particulier de l'HMTBN ou de l'HMTBAmide, par l'enzyme codée par la séquence d'ADN introduite dans le micro-organisme transformé. Toutefois, en fonction du micro-organisme considéré et du niveau de sélection recherché, le milieu selon l'invention peut également comprendre initialement (préalablement et au moment de l'inoculation avec les micro-organismes transformés) une quantité appropriée d'HMTBS, notamment pour permettre d'amorcer la croissance des micro- organismes, cette quantité d'HMTBS étant remplacée au fur à mesure de la croissance des micro-organismes par l'HMTBS issu de la conversion du substrat approprié, en particulier HMTBN ou HMTBAmide. De manière avantageuse, l'HMTBS est présent dans le milieu à une concentration inférieure à la concentration suffisante pour permettre la croissance des micro-organismes transformés selon l'invention. Cette concentration pourra être déterminée en fonction du milieu de culture approprié, en particulier de sa forme (bacth, liquide en continu, solide, etc.), et sera de préférence inférieure à 350 μg/1 (équivalent de environ 2 μM) plus préférentiellement inférieure à 250 μg/1 (équivalent de environ 1,5 μM), plus préférentiellement comprise entre 130 μg/1 et 170 μg/1. (équivalent de environ 0,8 μM et environ 1 μM).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le milieu approprié comprend une source d'azote organique ne comprenant pas de traces de methionine.
De manière avantageuse, la source d'azote organique est un extrait de levure, en particulier du Yeats Nitrogen Broth w/o Amino Acids (YNB, Yeats Nitrogen
Broth w/o Amino Acids, DIFCO, composition donnée dans DIFCO Manual, Tenth édition, ISBN 9-9613169-9-3, 1984, page 1 136) ou du Casamino acids (Casamino Acids, Difco, composition donnée dans DIFCO Manual, Tenth édition, ISBN 9-
9613169-9-3, 1984, page 208).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la teneur en source d'azote organique, plus préférentiellement en YNB, est comprise entre 0 et 15 g/1, plus préférentiellement comprise entre 2 et 10 g/1, encore plus préférentiellement entre 3 et 8 g/1.
Avantageusement, le milieu approprié selon l'invention comprend du M9fru décrit plus loin comme milieu minimum.
Avantageusement, le milieu approprié selon l'invention comprend comme source de carbone un composé choisi parmi le glucose, le fructose, le galactose, le trehalose, le mannose, le melibiose, le sucrose, le raffinose, le maltotriose, le maltose, le lactose, le lactulose, l'arabinose, le xylose, le rhamnose, le fucose, le mannitol, le sorbitol, le malate, le saccharate, le mucate, le mesotartrate. le glucuronate. le galacturonate et leurs mélanges en toutes proportions. De manière préférentielle, la source de carbone est choisie parmi le glucose ou le fructose, et leurs mélanges en toutes proportions, plus préférentiellement le fructose.
Le milieu de culture selon l'invention peut être liquide ou solide, et dans ce cas peut contenir de l'agar ou de l'agarose.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat.
La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook (1982).
Légende des figures
La figure 1 représente le plasmide RPA-BIOCAT41. Les sites entre parenthèse sont des sites qui ont été éliminés lors des clonages. Ptrp : promoteur tryptophane ; nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription ; fin ROP : fin du gène codant pour la protéine ROP (Chambers et al., 1988. Gène 68 : 139-149) ; ORI : origine de réplication ; RNAI/II : ARN impliqués dans la réplication ( Chambers et al., précité); Te : gène de résistance à la tétracycline.
La figure 2 montre la croissance à 37°C, 200 tours/min et en tube de 50 ml hermétiquement clos, des deux souches RPA-BIOCAT 610 et 842 par lecture des densités optiques en micro-plaques à 630nm. En A) : croissance des souches RPA- BIOCAT 610 et 842 en milieu minimum M9YNBfru + HMTBN 50 μM exempt d'HMTBS ; en B) : croissance des souches RPA-BIOCAT 610 et 842 en milieu minimum M9YNBfru + HMTBN 50 μM complémenté en HMTBS 10 μM.
La figure 3 montre la croissance des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 en milieu sélectif : A. avec une concentration limitante en HMTBS de 0.8 μM; B. avec une concentration limitante en HMTBS de 1 μM. Les milieux sélectifs sont constitués par le milieu minimal M9YNBfru + IPTG 0.5 mM supplémenté en : HMTBS 0.8 μM (S0.8) ou en HMTBS 1 μM (SI), ou en HMTBN 50 μM + HMTBS 0.8 μM (NS0.8) ou encore en HMTBN 50 μM + HMTBS 1 μM (NSI).
La figure 4 montre la croissance des souches RPA-BIOCAT 841 et 960 en milieu sélectif : A. en présence d'HMTBS 0.8 μM ; B. en présence d'HMTBS 1 μM. Les milieux sélectifs sont constitués par le milieu minimal M9YNBfru + IPTG 0.5 mM supplémenté en : HMTBS 0.8 μM (S0.8) ou en HMTBS 1 μM (SI), ou en HMTBN 50 μM + HMTBS 0.8 μM (NS0.8) ou encore en HMTBN 50 μM + HMTBS 1 μM (NSl).
Méthodes : Les techniques mises en oeuvre sont des techniques classiques de biologie moléculaire et de microbiologie, connues de l'homme de l'art et décrites par exemple par Ausubel et al., 1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and
Sons, New York), Maniatis et al., 1982, (Molecular Cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York).
Le milieu minimal M9fru a la composition suivante : Na2HPO4 7g/l, KH2PO4 3g/l, NaCl 0.6 g/1, NH4C1 1 g/1, fructose, 4 g/1, MgSO4 1 mM, CaCl2 0.1 mM, thiamine 10 μg/ml. Le milieu minimal M9YNBfru correspond au milieu M9fru supplémenté en YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco) à une concentration finale de 5 g/1. Ce milieu s'élabore à partir des solutions mères suivantes préalablement stérilisées : M9 salts xlO (Na2HPO4 70g/l, KH2PO4 30g/l, NaCl 6 g/1, NH4C1 10 g/1, autoclave), fructose 20% filtré, YNB 20% filtré, MgSO4 100 mM autoclave. CaCl2 10 mM autoclave, thiamine 1 % filtrée.
Les solutions mères d'HMTBN (59 mM), d'HMTBS (1.3 mM) et d'HTBAmide (100 mM) utilisées pour l'élaboration du milieu sélectif sont effectuées par dilutions en M9YNBfru de solutions stocks de ces produits à des concentrations respectives de 5.9 M (référence Rhône-Poulenc du lot : PHM 439 J) et 1.3 M (référence Rhône-Poulenc du lot: BFR 81). Ces solutions sont préparées selon un protocole décrit dans les brevets et demandes de brevet EP 330 521, EP 142 488, US 3 773 927 et US 4 353 924. L'HMTBamide est obtenu par hydrolyse à l'acide sulfurique de la cyanhydrine aminée (CH3SCH2CH2CHNH2CN) décrit dans les même brevets et demandes de brevet.
Les précultures sont effectuées dans 3 ml de milieu riche LB (tryptone 10 g/1, extrait levurien 5 g/1, NaCl 10 g/1, pH 7.0) en présence des antibiotiques appropriés, si nécessaire, par ensemencement à partir d'un stock glycerolé de la souche concernée. La préculture est incubée à 37°C, 200 tours/min pendant 6 à 7 heures.
Les cultures d'expression des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 sont réalisée par dilution au l/100eme d'une préculture dans 10 ml de LB + carbenicilline 100 μg/ml + IPTG 0.5 mM. Ces cultures sont incubées à 37°C, 200 tours/min en tube de 50 ml hermétiquement clos pendant 16h. Les biomasses sont estimées par mesure de la densité optique à 660 nm (DO660) en prenant comme relation biomasse en gramme de poids sec par litre de culture = DO660 x 0,35. Le dosage d'activité nitrilasique des cultures s'effectue comme suit : les cultures d'expression sont centrifugées et le culot cellulaire lavé dans du tampon phosphate 100 mM. Il est remis en suspension dans ce même tampon et 200 μl de suspension cellulaire sont incubés avec 200 μl d'HMTBN 200mM (en solution dans du tampon phosphate 100 mM) pendant 2 h à 37°C. A intervalle de temps de 0, 30, 60, 90 et 120 min, un échantillon de 5 μl du milieu réactionnel est prélevé et mélangé à 50 μl d'H3PO4 200 mM. A ces 55 μl sont ajoutés 105 μl d'une solution phénol 5.1%-NaOH 2.54 N, puis, après mélange, 40 μl d'une solution de Javel 47/50°C (Hypochloryte de sodium en solution à 12,5%, Dousselin & Geoffray Jacquet réunis, Couzon aux Monts d'Or, France), diluée au demi. Après agitation suivie d'une incubation de 10 min à température ambiante, les densités optiques sont lues à 630 nm. Le calcul de la quantité d'HMTBS libéré est réalisé par comparaison à une gamme étalon d'HMTBS préparée dans du tampon phosphate 100 mM en présence d'HMTBN selon le tableau ci dessous.
Les activités sont exprimées en kg d'HMTBS produit / heure/ kg de cellules sèches
(CS).
Exemples
Exemple 1 : Construction du piasmide pRPA-BCAT41. Le fragment de 1.27 kb contant le promoteur Ptrp, le site de fixation du ribosome du gène cil du phage λ (RBScII) et le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 (nitB) a été extrait du plasmide pRPA-BCAT6 (Demande FR 96/13077) à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et Xbal pour être clone dans le vecteur pXL642 (décrit dans la demande CIP N°08/l 94,588) ouvert par les mêmes enzymes de restriction. Le plasmide résultant, pRPA-BCAT15 a été ouvert par les enzymes Stul et Bsml et le fragment de 4,3 kb a été ligaturé avec le fragment Stul- Bsml de 136 bp purifié de pRPA-BCAT4 (Demande FR 96/13077) pour conduire au plasmide pRPA-BCAT19. Le séquençage partiel de pRPA-BCAT19 a confirmé le remplacement du codon du résidu Asp279 de la nitrilase par le codon d'un résidu Asn279. Le fragment de 1,2 kb EcoRl-Xbal de pRPA-BCAT19 contenant la fusion Ptrp : :RBScII : :nitB a été ensuite clone dans le vecteur pRPA-BCAT28 ouvert par les mêmes enzymes pour conduire au plasmide pRPA-BCAT29 de 6,2 kb. Le vecteur pRPA-BCAT28 a été obtenu en ligaturant le fragment de 3,9 kb Sspl-Scal de pXL642 (demande CIP N°08/l 94,588) avec le fragment de 2,1 kb Smal de pHP45ΩTc (Fellay et al, 1987, Gène 52 : 147-154) afin de remplacer le marqueur de résistance à l'ampicilline par le marqueur de résistance à la tétracycline. En détruisant le site Ndel proche de l'origine de réplication du plasmide pRPA-BCAT29 par digestion partielle Ndel et action de la polymérase I d'E. coli (Fragment de Klenow), le plasmide pRPA-BCAT41 a été obtenu dont une carte est représentée sur la figure 1. La séquence de la cassette d'expression est représentée par l'identificateur de séquence n° 1 (SΕQ ID NO 1).
Exemple 2 : Construction du plasmide pRPA-BCAT77.
Une portion du gène nitB a été amplifié par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pRPA-BCAT41, les amorces PCRAF1 décrite dans la demande FR96/13077 et NitB 160 décrite ci dessous et l'enzyme Pfu (Stratagene).
NitB 160 : 5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3' Le programme utilisé comprenait un cycle de 5 min à 95°C, 5 cycles de 1 min à 95°C ; 1 min à 60°C ; 1 min à 72°C, 30 cycles de 30 sec à 95°C ; 30 sec à 60°C ; 30 sec à 72°C et une séquence de 5 min à 72°C. Le fragment d'environ 0,495 bp ainsi amplifié a été digéré par les enzymes Ndel et Rs/HKAI (New England Biolabs). Il a ensuite été ligaturé au fragment de 0,261 kb BsiHKAl-Slul purifié d'une digestion du plasmide pRPA-BCAT41 et au fragment Ndel-Stul de 5,43 kb purifié d'une digestion de pRPA-BCAT72. Le vecteur pRPA-BCAT72 a été obtenu en éliminant du vecteur pRPA-BCAT41, par digestion Xcm 1 et religature, le fragment Xcml d'environ 0,55 kb. Le plasmide résultant de ce clonage a été appelé pRPA-BCAT77. Il correspond au plasmide pRPA-BCAT41 mais permet d'exprimer une nitrilase NitB portant une substitution du résidu Alanine en position 160 par un résidu glycine Exemple 3 : Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe exprimant la nitrilase A'Αlcaligenes faecalis à partir du promoteur Plac.
Le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 a été amplifié par PCR en utilisant, comme matrice, le plasmide pRPA-BCAT77, les amorces nitBMNl et nitBMN2 décrites ci-dessous et la polymerase Pfu (Stratagene). nitBMNl : 5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2 : 5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3'
Le programme utilisé comprenait un cycle de 5 min à 95°C, 5 cycles de 1 min à 95°C ; 1 min à 50°C ; 1 min à 72°C, 30 cycles de 30 sec à 95°C ; 30 sec à 50°C ; 30 sec à 72°C et une séquence de 5 min à 72°C. Le fragment d'environ 1,2 kb obtenu a ensuite été digéré par l'enzyme Xbal pour être clone dans le vecteur pbsll ks- (Stratagene) ouvert par les enzymes EcoRV et Xbal. Le plasmide obtenu, pRPA- BCAT105, a ensuite été introduit dans la souche E. coli RPA-BIOCAT610. Cette souche contient une délétion dans le gène metA et correspond à la souche βl 80 décrite dans Richaud et al. (J. Biol. Chem. (1993) 268: 26827-26835). Un clone a été sélectionné et cultivé en 3 exemplaires en LB dans les conditions d'expression décrites ci-dessus. L'activité nitrilase a été mesurée sur les culots cellulaires obtenus comme décrit ci-dessus et trouvé après moyenne à 2.5 kg/h.kg CS contre 0 kg/h.kg CS pour la souche RPA-BIOCAT 842 décrite dans l'exemple 4 et cultivée dans les mêmes conditions. Cette nouvelle souche exprimant une nitrilase active a été nommée RPA-BIOCAT 841.
Exemple 4: Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe exprimant la nitrilase ά'Αlcaligenes faecalis inactive à partir du promoteur Plac. Le gène d'un variant de la nitrilase NitB a été amplifié comme décrit dans l'exemple 3 en utilisant comme matrice le plasmide pRPA-BCAT69. Le plasmide pRPA- BCAT69 correspond au vecteur pRPA-BCAT41 mais contient une mutation dans le gène nitB qui conduit au remplacement du résidu Cystéine 163 de la nitrilase NitB par un résidu Alanine. Le plasmide pRPA-BCAT69 a été obtenu comme suit. Après amplification par PCR sur la matrice pRPA-BCAT41 avec les amorces PCRAF1 décrite dans la demande FR96/13077 et NitBl décrit ci-dessous, le produit amplifié a été digéré par Ndel et Banl pour obtenir un insert d'environ 0,476 kb. NitBl : 5'-GCAGCACAGG GCACCGACGC-3' De même, après amplification par PCR sur la matrice pRPA-BCAT41 avec les amorces NitB2 et SR décrites ci-dessous, le produit amplifié a été digéré par Banl et Stwl pour obtenir un insert d'environ 0,34 kb. NitB2 : 5'-CGCGTCGGTG CCCTGTGCGC CTGGGAGC-3' SR : 5'-CGGCAATGAT CAGGCCTTCG GC-3'
Après digestion du vecteur pRPA-BCAT72 par Ndel et Stwl, le fragment de 5,43 kb a été ligaturé aux inserts de 0,476 kb Ndel-Banl et de 0,34 kb Banl-Stul décrits ci- dessus pour former le vecteur pRPA-BCAT69. Le produit d'amplification obtenu avec les amorces amorces nitBMNl et nitBMN2 et la matrice pRPA-BCAT69 a ensuite été clone dans le vecteur pbsll ks- (Stratagene) comme décrit dans l'exemple 3. Le plasmide résultant, nommé pRPA-BCAT107, a été introduit dans la souche RPA-BIOCAT610 pour obtenir la nouvelle souche RPA-BIOCAT 842. Exemple 5 : Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la methionine exprimant la nitrilase active de Comamonas testosteroni à partir du promoteur Plac..
L'amplification par PCR d'un fragment de 1.35 kb contenant le gène nitA de Comamonas testosteroni a été réalisée à l'aide du plasmide matrice pXL2158 (FR9613077), des amorces NitAl et NitA2 décrites ci-dessous et l'ADN polymérase Pfu. NitAl : 5'-GGGCATACAT TCAATCAATT G-3' NitA2 : 5'-AGGTGGGACC CAAGCTTGCA-3'
Après purification au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 :24 : 1), dessalage à l'aide du kit QIAΕX II (QIAGΕN) et digestion par l'enzyme Hindlll, le fragment PCR a été ligué au plasmide pbsll ks- préalablement digéré par les enzymes Hindlll et Hincll pour conduire au plasmide pBCAT145. Ce dernier a été introduit selon la méthode de Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 86 : 2172-2175) dans la souche RP-BIOCAT 610. La nouvelle souche ainsi obtenue a été nommée RPA- BIOCAT 960.
Exemple 6 : Croissance de mutants d'E. coli auxotrophes pour la methionine en milieu minimum supplémenté en HMTBS.
Les souches RPA-BIOCAT 610 et 842 ont été précultivées en milieu LB additionné, uniquement pour la souche 842, d'IPTG 0.5 mM et de carbenicilline 100 μg/ml, lavées en milieu M9YNBfru et reprises dans un égal volume de ce même milieu. Les deux cultures ont ensuite été diluées au l/100eme dans 10 ml des milieux suivants supplementes en carbenicilline 100 μg/ml et IPTG 0.5 mM uniquement pour la souche RPA-BIOCAT 842 : i) M9YNBfru + HMTBN 50μM ii) M9YNBfru + 5 HMTBN 50 μM + HMTBS 10 μM. . Ces cultures ont été réalisées en tube de 50 ml hermétiquement clos, à 37°C sous agitation de 200 tours/min et la croissance des souches, mesurée par densité optique de la culture à 630 nm lue en micro-plaque, est reportée sur la figure 2.
Les résultats montrent que l'HMTBS est utilisable comme source de o methionine par des souches d'E. coli auxotrophes pour la methionine.
Exemple 7 : Influence du YNB, de l'HMTBN et de l'HMTBS sur la croissance, en milieu minimum, d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la methionine exprimant la nitrilase active d'Αlcalîgenes faecalis
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 842 ont été précultivées en présence de 5 carbenicilline 100 μg/ml et d'IPTG 0.5 mM, lavées comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluées au l/1000emc dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 1, tous supplementes en carbenicilline 100 μg/ml et IPTG 0.5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37°C, 200 tours/min, en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Croissance des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 en présence et absence de YNB
- : absence de croissance ; T : croissance.
Ces résultats montrent que le YNB constitue un supplément essentiel à la croissance de la souche d'E. coli auxotrophe pour la methionine dans les conditions décrites en exemple.
Ces résultats montrent également que les milieux sélectifs testés ne permettent pas de différencier une souche d'E. coli ΔmetA exprimant une nitrilase active d'une souche exprimant cette enzyme sous forme inactive. La concentration en
HMTBN de 50 μM est trop faible pour fournir une source de methionine suffisante pour la croissance d'E. coli.
Exemple 8 : Détermination de la concentration minimum en HMTBS permettant la croissance des souches auxotrophes
La souche RPA-BIOCAT 841 a été précultivée en présence de carbenicilline 100 μg/ml et d'IPTG 0.5 mM, lavée comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluée au l/1000e e dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 2, tous supplementes en carbenicilline 100 μg/ml et IPTG 0.5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37°C, 200 tours/min. en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 2. Tableau 2 : Croissance de la souche RPA-BIOCAT 841 en présence d'HMTBS à faible concentration.
- : absence de croissance ; T : croissance.
Ces résultats montrent que la concentration en HMTBS minimale nécessaire pour la croissance de la souche RPA-BIOCAT 841 est supérieure ou égale à 2 μM. Exemple 9 : Mise au point d'un milieu sélectif permettant la croissance d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la methionine exprimant la nitrilase active d "Αlcaligenes faecalis.
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 842 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 μg/ml et d'IPTG 0.5 mM, lavées dans les conditions décrites à l'exemple 6 puis diluées au l/100éme dans 10 ml de milieu sélectif M9YNBfru + IPTG 0.5 mM contenant 0,8 ou 1 μM HMTBS et 50 μM HMTBN. La figure 3 montre la croissance de ces deux souches à 37°C, 200 tours/min en tubes de 50 ml hermétiquement clos, croissance mesurée par lecture des densités optiques en microplaques à 630 nm. Les résultats montrent que le milieu sélectif M9YNBfru + IPTG 0.5 mM +
HMTBN 50 μM + HMTBS 0.8 ou 1 μM permet de différencier une souche d'E. coli exprimant une nitrilase active d'une souche d'E. coli exprimant une nitrilase inactive. Exemple 10 : Croissance de souches d'E. coli auxotrophes pour la methionine exprimant des nitrilases actives sur hydroxy-methyl-thio-butyronitrile . Les souches RPA-BIOCAT 841 et 960 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 μg/ml et d'IPTG 0.5 mM, lavées dans les conditions décrites à l'exemple 6 puis diluées au l/100ème dans les milieux sélectifs de croissance décrits dans l'exemple 9. La figure 4 décrit la croissance de ces deux souches à 37°C, 200 tours/min en tubes de 50 ml hermétiquement clos, croissance mesurée par lecture des densités optiques en microplaques à 630 nm.
Les résultats montrent que le milieu décrit à l'exemple 9 est sélectif pour des souches auxotrophes pour la methionine exprimant des nitrilases de deux origines différentes dans le système d'expression utilisant le promoteur R/αc-

Claims

Revendications
1. Procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion substrat approprié en methionine et ses dérivés, comme l'HMTBS, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de
1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié,
2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la methionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié,
3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante
4) de substrat approprié, 5) sélection et/ou isolement des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et 6) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le substrat approprié est le 2-amino 4-(méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme le 2- hydroxy 4-(methylthio) butyronitrile (HMTBN).
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat approprié est converti directement en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, par une nitrilase.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrilase.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le 2-amino 4-
(méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN, est converti en methionine ou ses dérivés, comlme l'HMTBS par l'intermédiaire du 2-amino 4- (méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-(methylthio) butanamide (HMTBAmide), par une première conversion du 2-amino 4-(méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN en 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide par une nitrile hydratase, suivie d'une conversion du 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, par une amidase.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrile hydratase ou une amidase.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrile hydratase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une amidase complémentaire.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une amidase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une nitrile hydratase complémentaire.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat approprié est le 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme le l'HMTBAmide, qui est converti en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS par une amidase.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée est une amidase.
1 1. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le micro-organisme approprié auxotrophe pour la methionine, est un micro-organisme auxotrophe pour la methionine capable d'être transformé et susceptible de croître dans un milieu exempt de methionine comprenant de l'HMTBS.
12. Procédé selon la revendication 1 1, caractérisé en ce que le micro- organisme approprié est choisi parmi les levures, les champignons et les bactéries.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la bactérie est E. coli.
14. Procédé selon Tune des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'un ou de plusieurs génomes, par restriction totale ou partielle dudit ou desdits génomes.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'une partie de génome par restriction totale ou partielle de ladite partie de génome.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée à partir d'une construction par
PCR.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est obtenue par mutagenèse aléatoire.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la culture des micro-organismes transformés est une culture en masse (batch), en particulier par des cultures successives, ou une culture en continu, en particulier une cultures en chemostat.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une quantité de methionine insuffisante pour assurer la croissance du micro-organisme et comprend une quantité suffisante de substrat approprié pour permettre la croissance du micro-organisme transformé après bioconversion en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la quantité suffisante de 2-amino 4-(méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN, est comprise entre 0 et 60 g/1, préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1, plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la quantité suffisante de 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1, préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1, plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1.
22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une quantité appropriée en méthionione ou ses dérivés, comme l'HMTBS.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la quantité appropriée en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS est inférieure à la concentration suffisante pour permettre la croissance des micro-organismes transformés.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la quantité d'HMTBS est inférieure à 350 μg/1, préférentiellement inférieure à 250 μg/1, plus préférentiellement comprise entre 130 et 170 μg/1.
25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une source d'azote organique.
26. Procédé selon l'une des revendications 25, caractérisé en ce que la teneur en source d'azote organique est comprise entre 0 et 15 g/1, préférentiellement comprise entre 2 et 10 g/1, plus préférentiellement entre 3 et 8 g/1.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend du M9fru comme milieu minimum.
28. Procédé selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié est un milieu liquide ou solide.
29. Milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 19 à 28.
30. Séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion d'un substrat approprié en methionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée et/ou isolée par le procédé selon l'invention.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2822460B1 (fr) * 2001-03-26 2005-04-29 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation enantioselectif d'acides carboxyliques optiquement actifs par hydrolyse enzymatique de nitriles
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CN111944794B (zh) * 2020-08-20 2022-05-31 中国石油大学(华东) 酰胺酶xam及其编码基因和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56144092A (en) * 1980-04-14 1981-11-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-methionine by fermentation
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
CN1077599C (zh) * 1994-09-22 2002-01-09 罗纳-普朗克动物营养素公司 4－甲硫基丁腈的酶水解
FR2755143B1 (fr) * 1996-10-25 1998-11-27 Rhone Poulenc Nutrition Animal Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0036120A1 *

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