FR2678637A1 - Nouvelles souches de levure pour la production de xylitol. - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à de nouvelles souches de levure ayant une aptitude réduite à métaboliser le xylitol. L'invention concerne de plus l'utilisation de ces souches pour la production du xylitol.

Description

NOUVELLES SOUCHES DE LEVURE POUR LA PRODUCTION DE
XYLITOL
La presente invention est relative au domaine de l'ingénierie métabolique. En particulier, elle concerne un procédé pour produire du xylitoi avec de nouvelles souches de levure dans lesquelles le metabolisme du xylitol est modifie. L'invention se rapporte de plus a de nouvelles souches de levure et à un procédé pour produire ces souches.

Le xylitol est habituellement préparé par des procedes dans lesquels une matie ne contenant un xylane est d'abord hydrolysée e pour produire un me lange de monosaccharides contenant du xylose. Le xylose est ensuite réduit en xylitol, généralement en presence d'un catalyseur au nickel. Plusieurs procédé de ce type ont été décrits dans la littérature concernant ce domaine. Les brevets LIS 3.784.408, 4.066.711 4075.406, 4.008.285 et 3.586.537 peuvent etre mentionnes à titre d'exemples.

Cependant tous les procédés de l'art antérieur sont des procedes à plusieurs étapes qui sont relativement coûteux et ont un rendement relativement faible. Les plus grands problemes résident dans la réalisation d'une séparation efficace et complete du xylose a partir d'autres sous-produits d'hydrolyse, La purification est tres exigeante parce que les catalyseurs utilises dans la rection de réduction du xylose sont tunes sensibles. La pureté du produit final, d'un autre côte, dépend fortement de la qualite de de séparation du xylitol des autres produits obtenus dans la réaction de reduction.

La production du xylitol par un procédé biotechnologique est extrêmement seduisante si ce procede est capable de fournir un produit de tres haute qualité par une methode efficace,de coût comparable. Cependant, pour produire du xylitol par fermentation d'une levure pour les propos ci-dessus, il faut trouver une levure qui soit non pathogène et qui satisfasse aux conditions établies par l'industrie alimentaire. De plus, pour obtenir des rendements eleves en xylitol à l'aide d'une fermentation de levure, il est essentiel d'employer une levure qui oit capabel de réduire le xylose an xylitol.De préférence, cette souche doit aussi etre relativement inefficace dans la conversion métabolique ulterieure du xyiitol,
De nombreuses souches de levure produisent des enzymes de type réductase qui catalysent la reduction de sucres en leur forme alcool correspondante. Beaucoup de levures sont capables de reduire le xylose en xylitol au cours d'une étape initiale dans leur métabolisme du xylose et plusieurs souches de levure sont capables d'utiliser le xylose en tant qu'unique source de carbone et d'énergie.Le chemin de réaction de l'utilisation du xylose pour la levure etudiee est le suivant : du xylitol est synthétisé dans la premiene retape dans laquelle le xylose est réduit en xylitol à l'aide de xylose réductase. Le xylitol est ensuite métabolisé utilise J par une série d'étapes successives. D'abord, le xylitol est oxydé en xylulose avec la xylitol déshydrogénase, le xylulose est phophrylé en xylulose-6-phosphate avec une xululose kinase [dénommée aussi xylulokinase] et ensuite, une partie du xylulose-5-phosphate est converti en pyruvate et éthanol via piusieurs étapes intermédiaires.Les principaux produits et les sous-produits resultants varient en fonction de la souche de levure et des conditions de fermentation. Les reactions ne sont pas etroitement couplées et en consequence, un peu de xylitol est toujours produit dans le milieu.

En général, la recherche dans ce domaine s'est concentrée sur des essais tentant à identifier des souches de les ure ayant une plus grande aptitude à produire de l'éthanol plutot que du xylitol. Néanmoins, la production du xylitol est une caractéristique relativement commune parmi les levures utilisant du xylose. Par exemple, sur 44 levures dans cinq genres (Candida,
Hansenula, Kluyveromyces, Pichia et Puchysolern, 42 produisent un peu de xylitol dans les milieux de culture (M.F.S. Barbosa, et al. J.

Indust. Microbiol. 5241-261 (1988) et Enzyme Microb. Technol.

10: 66-81 (1988).

Il a été suggère d'utiliser ces souches pour la production industrielle de xylitol. Par exemples l'utilisation industrielle de Candida tropicalis, Candida quilermondit et Candida parapsitosis été suggérée (demandes PCT:PCT/F190/00015, C.

tropicalis, PCT/F191/00011, C.tropicalis et PCT/F181/00162, C.

guillermondii et la demande publiée de brevet franchais 2641545, f, parapsilosis. Cependant, toutes les souches de Candida mentiionnées plus haut sont des souches pathogenes potentielles et ne satisfont pas aux conditions requises de l'industrie alimentaire. Barbosa et al., J. Industin Microbiol 3:241-261 (1988) decrivent des levures criblees pour la production de xylitol.

Cependant, les souches qui donnent des rendements acceptables sont toutes des souches pathogènes potentielles. Aucune souche non pathogène de levure utile pour la production de xylitol n'a donc été décrite qui puet être utilisée dans l'industrie alimentaire et/ou pour la production de xylitol à grande echelle.

De plus, une production industrielle valable du xylitol par conversion enzymatique du xylose n'est possible que si le rendement est tres élevé Cependant, aucune souche sauvage ne peut le fournir. Lorsque differentes souches de levure sont étudiées dans des conditions optimales de ne action, il est trouvé que certaines souches de Candida tropicalis donnent le meilleur rendement en xylitol. Cependant, comme cela est indique plus haut, les souches de cette espece de levure sont potentiellement pathogènes et ne peuvent donc pas etre utilisees dans l'industrie alimentaire. Des especes acceptables dans l'industrie alimentaire sont Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis et Kluyveromyces marvianus. Saccharomyces cerevisiae n'exxprime pas normalement des enzymes de la voie du xylose quoique J. Hallborn et aI.,
Bio/Technology 9:1090 [1991] décrivent l'utilisation du gène de la xylose réductase clonè provenant de Pichia stipitis puor la construction de souches de Saccharomyces cerevisiae capables de convertir le xylose en xylitol avec un rendement revendiqué de 95%.

Des mutants en ce qui concerne l'utilisation du xylose ont éné décrits. J. Hagéndorn et al., Corn Senet 16:27-33 [1989] decrivent qu'il a ete identifié des mutants de la levure P, stipitis qui sont incapables d'utiliser le xylose en tant qu'unique source de carbone et qui sont deficients en xylose réductase ou en xylitol déshydrogénase. A.P. James, Appl. Environ.

55:2871-2876 [1989] decrivent des mutants de la levure
Pachysolen tannophilus qui sont incapables de métaboliser le Dxylose P.E.Stevis et al., Appl. Biochem. Biotecnol 20:327-334 [1989] décrivent la construction de mutants xylulosinase de levure par des techniques d'ADN recombinant.

Les souches Candida utilis et Kluyveromyces marvisnus ont les enzymes xylose réductase, xylitol déshydrogénase et xylulose kinase puovant être induites naturellement nécessaires pour la décomposition du xylose Des essais pour ajuster l'environnement chimique et physique des levures Candida utilis et Kluyveromyces afin d'augmenter le rendement en xlitol, ont cependant echoue.

On a maintenant trouve que le métabolisme du xylitol des levures peut etre modifié si bien qu'on a mis au point de nouvelles souches de levure qui produisent du xylitol avec des rendements eieves.

La presente invention concerne donc d'abord de nouvelles souches de levure, lesquelles souches de levure sont capables de réaliser la synthèse du xylitol à partir du xylose > mais ont déficientes en l'une ou plusieurs des enzymes du métabolisme du xylitol, si bien que le xylitol s'accumule dans le milieu de culture et peut etre recupere a partir de celui-ci.

L'invention se rapporte aussi à des méthodes pour la production de xylitol avec de telles souches de levure.

L'invention fournit aussi une méthode pour construire des souches de levure modifiées qui sont capables de réduire le xylose, et sont incapables ou déficientes en ce qui concerne leur expression d'une activité xylitol déshydrogénase et/ou xylulose kinase.

Les souches de levure modifiées de la presente invention peuvent synthetiser le xylitol à partir du xylose{ mais sont déficientes en l'une ou plusieurs des enzymes de l'utilisation du xylitol, si bien que le xylitol s'accumule dans le milieu lorsque la levure hôte modifiee est cultivez sur du xylose. Dans les nouvelles levures, l'activité xylose reductase est donc presente, mais le métabolisme du xylitol est remarquablement reduit. II en resulte que les nouvelles souches ne sont pas capables d'utiliser le xylose en tant que leur unique source de carbone{ quoique le xylose induise l'activité d'une xylose réductase et donc la conversion du xylose en xylitol.

La voie de raction de la reduction du xylose est montrée ci-après.

Une x.ylose reductase catalyse la reaction:

<tb> xylose
<tb> <SEP> Ir <SEP> Nn13131
<tb> <SEP> NAI)Y
<tb> Iilo1
<tb>
La premiere enzyme de l'utilisation du xylitol la xylitol déshydrogénase, catalyse la réaction:

<tb> xylitol
<tb> <SEP> 1 <SEP> )Nnr,
<tb> <SEP> I <SEP> 5
<tb> xyiulosc
<tb>
Les nouvelles souches de levure produites selon le procédé de l'invention produisent du xylitol à partir du xylose lorsqu'il est ajouté au milieu de croissance, une autre source de carbone et d'énergie pour la croissance et l'entretien de la souche de levure Dans les conditions de culture dans lesquelles on cherche à produire du xylitol à partir du xylose, les hôtes de la pressente invention sont génétiquement incapables d'utiliser le < Hlose en tant qu'unique source de carbone parce qu'ils sont génétiquement incapables de métaboliser complètement le xylitol.

Comme les souches ne sont pas capables de me-taboliser le xylitol, le xylitol s'accumule dans le milieu de croissance. Par "génétiquement incapable", on entend que l'ADN de la levure naturelle a été altéré de façon à aboutir a une levure hôte modifiée possédant une mutation desiree ou une autre modification génétique qui est acquise de faucon stable.

Les souches de levure modifiées de la pressente invention ont donc un taux eleve de métabolisme de glucose et de réduction de xylose, mais en meme temps, un taux remarquablement reduit d'oxydation du xylitol en xylulose. Les nouvelles souches sont donc des producteurs très efficaces de xylitol. On connait beaucoup de souches de levure qui utilisent le xylose, telles que par example, C. frareli (comme FTI-20038); C.

guilliermondii (comme FTI-20037, IZ-1739, IZ-1231, IZ-1231, IZ1322, IZ-1239, IZ-1422, C-138, 17-07 et IZ-1735); C. intermedia (comme AJ-245); C. pseudotropicalis (comme IZ-431 et 1006); C.

tropicalis (comme 1004, IZ-1824, IZ-1958 et 63-51), C. utilis (comme FTI-20039, 74-64, 1009, EQ2, IZ-1166, IZ-1840 et IZ1841); H, anomala (comme IZ-1420, IZ-229, IZ-781, IZ-1033, RJ510, IZ-271, IZ-1224, IZ-1260 et FTPTAT-106; K. fragilis (comme
FTI-20066); K. marvidanus (comme IZ-1821, 145, IZ-1339, 276 et IZ619); Pach. tannophilus (comme NAAl Y2460); P. butonii (comme 68-1111) et P. stipitis (comme 79-261). Une telie levure peut être obtenue à partir d'une wariete de sources. comme par exemple
ATTC, NRRI, Agronomic Institute (UNICAMP, Campinas, Brésil);
Foundation for Industrial Tehnology (FTI, Sao Paulo, Brésil);
Microbiology Institute (UFRJ, Rio de Janeiro) et Zymotechnic
Institute (ESALQ, Piracicaba). Toutes peuvent être entretenues sur des cultures liclinées ou des plaques de gélose comme cela est decrit dans fart. par example, dans un milieu contenant 10 g/l d'extrait de levure, 20g/l de peptone et 20 g/l D-glucose (M.F.S.

Barbosa, et al., J. Indust. Microbiol. 3:241-261 (1988).

Lorsque des souches originales non pathogenes sont utilise-es pour la production de nouvelles souches, les mutants résultants satisfont aussi aux conditions spéciales établies par l'industrie alimentaire concernant à la fois la qualité et le rendement. Une levure de l'espèce Candida, Hansenula, kluyveromyces, Pachysolen est de préférence utilisée, et en particulier, Candida utilis ou Kluyveromyces marwianus Selon un mode de realisation hautement préfèrè, une souche de
Kluyveromyces marwanus var marwanus (comme la souche
CBSC12) ou de kluyveromyces marwanus var. bulgarycus (comme la souche ATCC 16046) ou de Kluyvermoyces marwanus var.

laetis est utilisèe. Les methodes de la presente invention sont applicables a la modification d'une quelconque levure dans laquelle il est désiré construire ou indentifier une levurg qui est capable de produire du xylitol, mais qui est beficlente en l'une ou plusieurs des enzymes pour l'utilisation du xylitol Les methodes telles que décrites à titre d'exemple ci-apres, dans lesquelles Kluyvaromyces marwanus est employee comme modèle et matière de depart, peuvent etre etendues et sont applicables a la modification d'autres especes de levure pour attendre les levures hôtes modifiees de l'invention.

Kluyveromyces marwanus est une levure non pathogène bien connue, largement utilisez dans l'industrie alimentaire. La levure a été decrite, par example, dans The Yeasts,
A Taxonomic Stody ed. N.J.W. Kreger- van Rij, Elsevier Science
Publishers B.V.Amsterdam (1984), dans lequel des synonymes de
cette levure sont aussi cotes a la page 234 Cette publication et les autres documents cités sont incorporés par référence à la présente description. La souche sauvage utilise normalement du glucose comme source d'énergie, mais est aussi capable de métaboliser le xylose. D'autres levures satisfaisant aux conditions requises par l'industrie alimentaire, comme certaines souches candida, peuvent aussi être utilisées dans le cadre de l'invention.

De préférence, les gènes dont on cherche a inactiver l'expression, sont ceux qui codent pour la xyliltol dèshydrogénase et ia xylulose kinase dans la levure hôte naturelle. Ces gènes sont préférés parce qu'ils sont gene-ralement la seule voie du métabolisme du dans l'hôte.Le blocage de l'expression de l'une et/ou l'autre enzyme bloque finalement l'utilisation du xylitol et permet l'accumulation du xyiitol dans le ,ilieu lorsque l'hôte est développe en présence de xyiose,
Les hôtes de l'invention peuvent etre produits par une quelconque méthode qui va ttisquer ie me-tabolisme du xylitol de la fanon décrite ci-apres.Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention pour produire de nouvelles souches de levure est caractérisé en ce que la souche de départ est cultivée dans un milieu de croissance contenant des sources assimilables de carbone et d'énergie, un traitement avec un agent mutagène et àventuellement un traitement avec un agent interférant avec la division chromosomique ou la formation des microtubules sont réalisés sur la culture, les mutants sont enrichis avec un antibiotique,et les souches de levure deficientes en ce qui concerne le me-tabolisme du xylitol sont criblées et récoltees.

Par exemple, dans ce mode de réalisation, on effectue une mutagénèse par un traitement chimique ou physique. Des exemples d'agents mutagènes chimiques convenables sont des analogues de bases tels que 5'-bromouraclie, 2'-aminopurine et 5'désoxyuridine, des agents désaminants comme l'acide nitrique et l'hydroxylamine, des agents alkylants comme le methane sulfonate d'ethyle et la nitrosoguanidine et des derives d'acridine comme l'acriflavine et le bromure d'éthidium Les protocoles pour l'utilisation de ces agents sont connus dans l'art
Des exemples de méthodes physiques de mutagénèse comprennent par exemple, une irradiation par des UV et des rayons X.Les protocoles pour l'utilisation de ces agents sont aussi connus dans l'art.

Eventuellement, la leuvre peut être traitée avec un agent qui interfère avec la division chromosomique ou la formation de microtubules dans le cycle mitotique. L'utilisation de bénomyle est un mode de réalisation préféré. Par ce traitement le chromosome ayant la mutation désirée est séparé des chromosomes homologues présents. Ce traitement n'est pas nécessaire pour les souches de levure haploïdes.

Enfin, les levures modifiees par une me-thode chimique ou physique comme cela est décrit plus haut, sont criblées pour déterminer celles dans lesquelles se trouvent les caracte-ristiques desirees des levures hotes modifiees de la presente invention.

L'enrichissement des cellules auxotrophes avec un antibiotique, comme la nystatine, qui ne tue que des cellules ayant un me-tabolisme actif, peut etre utilise. Le traitement est effectué en presence de xulose. Le milieu de culture peut etre analyse directement pour déterminer la quantite de xylose selon des me-thodes connues dans l'art, afin de detecter les levures
meilleures productrices.

Les nouvelles souches peuvent donc etre produites par culture de la souche de départ dans un milieu de croissance convenable de façon classique Un traitement mutagène peut etre conduit sur la culture résultante par des methodes chimiques ou physiques, par exemples avec un agent mutagène produisant une insertion ou une délétion, comme l'acriflavine ou la proflavine, un mutagène produisant une mutation ponctuelle, le me-thanesulfonate d'éthyle, une irradiation UV ou e-quivalent Après le traitement éventuel par du bénomyle, les mutants peuvent etre enrichis par exemple par traitement avec la nystatine et enfin, les souches de levure sont criblées par cuiture sur un agar riche en xylose et pauvre en glucose. Les minuscules colonies deficientes en ce qui concerne le métabolisme du xylose sont prélevées et des cultures pures de celles-ci sont formées par des techniques classiques.

L'avantage de l'utilisation des méthodes chimiques ou physiques pour construire un hôte de l'invention est que ces méthodes fonctionnent facilement avec une quelconque espece de levure de départ et que les méthodes de sélection (essai pour déterminer la production de xylitol dans le milieu) sont aussi facilement appliquées à une quelconque espèce de levure. Par exemple, les méthodes décrites dans les exemples devraient fournir des hôtes de l'invention non seulement avec les espèces citées a titre d'exemple, mais aussi avec une quelconque levure hôte qui possède naturellement l'aptitude à métaboliser le xylose.

Une autre procédure pour la construction des hôtes de l'invention implique l'utilisation de techniques d'ADN recombinant Dans un premier mode de réalisation, une séquence d'ADN codant pour une enzyme du métabolisme du xylitol est modifiee de façon a détruire l'information codant dans ce gène et le gène modifie est insere dans le chromosome de la levure à la place du gene de la levure naturelle, au moyen de techniques de recombinaison homologue ou de rupture du genre. Des exemples de gènes qui peuvent etre cibles de cette façon comprennent les gènes codant pour la xylitol déshydrogénase et la xylulose kinase.

De préférence, la xylitol déshydrogénase est ciblée pour être inactivée parce qu'il s'agit de la première enzyme de l'utilisation du xylitol. L'inactivation de la xylulose kinase est suffisante pour assurer un fort rendement en xylitol parce que l'équilibre de la réaction réversible catalysée par la xylitol déshydrogénase est déplacé tres fortement en faveur du xylitol dans les conditions qui existent à l'intérieur de la cellule de levure. Si les gènes codant pour les deux enzymes sont ciblés pour etre inactives, un éventuel faible taux d'expression restant d'une forme active (ou d'un fragment) de xylitol déshydrogénase est ensuite compensé dans l'hôte par l'absence d'activité xylulose kinase.

Les méthodes pour réaliser le clonage de ces gènes à partir d'une levure sont connues dans l'art loir les exemples). Les gènes codant pour la xylitol déshydrogénase ou la xylulose kinase peuvent etre clones. par exemple, par complementation des mutations correspondantes dans Escherichia coli ou une levure.

Les gènes clonés sont modifiés par insertion d'une séquence d'ADN pouvant etre sélectionée dans une levure dans la région codante du gène cloné, de préférence à une distance d'au moins plusieurs centaines de paires de bases de chaque extrémité du gene clone. Le marqueur pouvant etre selectionne [de preference un marqueur dominant conférant un phénotype de résistance à un antibiotique) peut etre insere dans un site de restriction convenable, ou manipulé pour se substituer à un fragment du gène rompu. La construction de plasmide résultante est amplifiée dans des bactéries.Des enzymes de restriction convenables sont ensuite utilisées pour exciser un fragment d'ADN qui a les séquences du gène de la xylitol déshydrogénase (ou de la xylulose kinase) à ses deux extrémités et un marqueur de levure pouvant etre sélectionné dans la réglon du milieu. Ce fragment d'AON est ensuite utilise pour transformer une souche de levure pour lui conférer une resistance à l'antibiotique. Des clones transformants individuels sont évalués pour leur aptitude à se développer sur des plaques contenant du xylose en tant qu'unique source de carbone.

Une rupture de gene réussie peut finalement etre confirmée par la mesure de l'activité enzymatique correspondante dans la souche transformée et/ou par analyse de la structure de la region correspondante du chromosome de levure par une méthode connue telle que l'hybridation Southern.

Par exemple, une modification convenable comprend la substitution d'un fragment interne du gene clone avec un marquer de sélection dominant pour la leuvre. L'ADN codant pour le gène bactérien de résistance à la kanamycine ou le gène de résistance à la bléomycine sont des exemples d'utiles marqueurs sélectifs dominants pour la levure. De telles constructions peuvent etre liées de façon opérationnelle à des séquences promoteurs de levure ou peuvent utiliser un promoteur de levure present au site de recombinaison homologue.Lorsque le promoteur du gène dont la séquence codante est rompue est utilisé, seuls les transformants qui inserent la séquence codante en phase avec le cadre de lecture de traduction désiré sont sélectionnés. il est donc souvent plus commode de fournir une séquence promoteur déjà liée de facon opérationnelle à la construction.De quelconques autres gènes qui permettent le criblage des cellules contenant 'ADN transformant peuvent être utilises à la place d'un gène pour la résistance à un antibiotique, par exemple un gène codant pour une protéine essentielle
La transformation des cellules de levure avec un fragment d'ADN linéaire qui a les sequences partielles de la cible désirée (comme une séquence partielle du gène de la xylitol déshydrogénase ou de la xyluose kinase) aux deux extrémités d'ADN et le marqueur sélectif à l'intérieur du fragment peut être effectuée. On sait que cette transformation aboutit à une forte proportion de transformants ayant une mutation par deletion dans le gène correspondant.

Dans une variante, si l'on désire conserver l'aptitude de la leuvre naturelle à exprimer la xylitol déshydrogénase et/ou la xylulose kinase d'autres méthodes recombinantes peuvent etre utilisées qui fournissent une inhibition sélective de l'expression d'une enzyme cible. Ces méthodes comprennent la construction d'un APN anti-sens ou de ribozyme dirige contre une cible désirée appropriée, comme l'ARNm codant pour la xylitol déshydrogénase ou la xylulose kinase.Une construction d'ADN codant pour un ARN anti-sens va posséder une sequence d'ADN qui est complémentaire de la séquence de l'ARNm de la cible et d'une longueur suffisante pour reconnaître et s'hybrider à cet ARNm de la cible, empêchant ainsi la traduction de l'ARN de la cible dans la cellule hôte.Une construction d'ADN codant pour un ribozyme approprié va aussi posséder une séquence d'ADN suffisante pour s'hydrider à l'ARNm de la cible;cependant, une fois que l'hybridation à cet ARNm est effectuée, l'activité du ribozyme catalyse la coupure de l'ARNm à un site qui détruit l'aptitude de cet ARNm à entretenir ia traduction de la proteine active codée dans celui-ci [par exemple voir EP-321.201).La construction d'ARN anti-sens ou la sequence de ribozyme peut etre liée de façon opérationnelle à une quelconque sequence promoteur appropriée de la levure par des méthodes connues dans l'art et transformée dans les levures hotes de façon génétiquement stable avec des techniques de transformation courantes comme cela est aussi connu dans l'art.

L'expression de telles constructions sera déterminée par les propriétés du promoteur de levure lie de façon opérationnelle et peut etre constitutive ou inductible ou répressible dans divers milieux de croissance en fonction de ce qui est désiré. L'avantage de telles constructions est que l'aptitude de l'hôte naturel à exprimer une enzyme cible n'est pas détruite. L'avantage de rendre régulable l'expression de telles constructions de façon qui/non est que l'aptitude de l'hôte à exprimer la cible peut etre fortement contrôlée, l'expression de la cible n'étant empêchée que lorsqu'on désire fournir la synthèse du xylitol.

Le rendement des nouvelles souches de levure construites selon la présente invention peut etre encore amélioré par surexpression de la xylose réductase clonée à partir de la meme levure ou d'une souche de levure différente. Le méthode pour le clonage du gène de la xylose réductase à partir d'une leuvre a été décrite par plusieurs auteurs (J. Hallborn et al.,
Bio/Technology 9:1090-1049 (1991); Takuma et al., Appl. Biochem
Biotechnol 28/29:327-340 (199); et Strasser et al., DE 4009676 (1991)). La méthode pour utiliser ce gène cloné pour la conversion xylose-xylitol dans une levure a ete aussi décrite (J. Hallborn et al.,
Bio/Technology 9:1090-1094 (1991)).Le gène cloné de la xylose réductase peut etre transféré dans un vecteur convenable capable de se propager dans l'espèce de levure choisie. Par exemple des vecteurs à base de pKD1 sont le type de vecteur préféré pour l'expression à un taux élevé dans K. marxianus (M.M.

Bianchi, et al., Curr. Genet. 12:185-192 (1987)). Le gène de la xylose réductase peut etre échangé avec un autre promoteur dont on sait qu'il fonctionne efficacement dans la levure choisie. Les souches de levure mutantes obtenues seion la présente invention peuvent ensuite etre utilisées en tant qu'hôtes pour la transformation avec le ou les vecteurs fournissant la surexpression du gene de la xylose réductase.

Dans tous les modes de réalisation, et quel que soit le mode de production, les nouvelles souches de levure de la présente invention sont caractérisées par une capacite notablement réduite de métaboliser le xylitol par rapport à la -ouche de levure naturelle. Ceci est dû au fait qu'une ou plusieurs des enzymes du métabolisme du xylitol comme l'activité xylitol déshydrogénase et/ou l'activité xylulose kinase ont été modifiées de telle sorte que l'expression d'une telle enzyme disparaît ou diminue (de façon permanente ou pouvant être régulée) par suite de la modification de la levure.Une quelconque source de carbone capable d'etre utilisée par l'hôte pour la production d'énergie, peut etre employee pour entretenir la croissance de la levure de l'invention et fournir les équivalents réducteurs pour la réduction du xylose. Cette fonction (fourniture) du potentiel réducteur est peut-etre plus importante pour le procédé de l'invention que l'entretien de la croissance de la cellule hote.Par exemple, du glucose est ajoute de préférence au milieu de croissance en tant que source d'énergie en des quantités connues dans l'art comme étant nécessaires pour entretenir la croissance de l'hôte. Les conditions d'aération et d'agitation pendant la croissance doivent être les conditions optimales pour l'hôte
Lorsque du xylose est fourni aux hôtes de l'invention.

le carbone du xylose est essentiellement "piégé" en tant que xylitol et n'est pas disponible pour les besoins en energie de l'hôte
Compte tenu de cette propriété, les nouvelles souches de l'invention sont extrêmement utiles dans la production du xylitol.

Lorsque les souches mutees de l'invention sont cultivées dans une solution nourricière riche en xylose elles transforment le xylose en xylitol avec un rendement élevé. Leur efficacité de conversion et utilité pour un procédé désiré peuvent être évaluées avec de quelconques solutions contenant du xylose et des hydrolysats par exemples, des solutions pures de xylose ou une liqueur constituant un sous-produit de l'industrie du traitement du bois, comme une liqueur de réduction en pulpe ou une liqueur de cuisson ou une partie riche en xylose de celles-ci. Les producteurs de xylitol les plus efficaces sont récoltés et utilisés pour la production de xylitol sur une échelle industrielle.

Les nouvelles souches métabolisant le xylose en xylitol avec des rendements élevés sont donc obtenues à la suite du ou des traitements décrits plus haut. Comme le métabolisme du xylitol des souches est déficient, les souches ne décomposent pas (ne dégradent pas, ne métabolisent pas ou n'utilisent pas) le xylitol, mais le xylitol est accumule dans le milieu de croissance et récupéré par exemple, par chromatographie, aprés élimination des cellules de levure. Toute methode connue dans l'art pour purifier le xylitol à partir du milieu de croissance peut etre utilisee (par exemple, voir US 5.081.026).

L'invention est décrite en détail dans les exemples non limitatifs suivants. # est bien établi à ce propos que le procédé n'a pas ete optimisé en ce qui concerne la production du xylitol, mais pour la mise en évidence des différences dans les souches de levure.

EXEMPLE 1
Formation de nouvelles souches de levure
Kluyveromyces marydanus ATCC 8608 est cultivé sur un milieau YDP, DYM ou DYM-tartrate à pH 6,0 et à 30 C. YDP (1.000 mli contient 10 g d'extrait de levure, 20 g de glucose et 20 g de peptone DYM (1.000 ml) contient 5,0 g de (NH2)02SO4, 1,0 g de
KH2PO4, 0,5 g de MgSO4. 7H2O, 0,1 g de NaCl et 0,1 g de CaCl2. 2
H2O. Le milieau DYM-tartrate contient 7,1 g de Na2SO4, 27,6 g de tartrate de (NH4)2 6,8 g de KH2PO4 0,5 g de MgSO4 7 H2O 0,1 g de NaCl et 0,1 g de CaCl2. 2 H2O. Les milieaux DYM et DYM-tartrate sont complétés avec une solution d'oligoéléments (1:1000), une solution de vitamines (1:100) et une source de carbone, les deux dernières étant ajoutées après traitement en autoclave.Les sucres et les sucre alcools sont autoclavés séparément en solution à 20% (poids/volume) et le mélange de vitamines est térilisé par filtration. La solution de vitamines (1000 ml) contient 100 mg de L-histidine. HCl. H2O, 0,2 mg de biotine, 40 mg de pantothénate de calcium, 0,2 ml d'acide folique, 200 mg d'inositol, 40 mg de niacine, 20 mg d'acide p-aminobenzoique, 40 mg de pyridoxine. HCl, 20 mg de riboflavine et 40 mg de thiamine. HCl. Le mélange d'oligéléments (1000 ml) comprend 500 mg de H3SO3, 40 mg de CuSO4 5 H2O, 100 mg de kI, 200 mg de FeCl3. 6 H2O, 400 mg de MnSO4. H2O, 200 mg de Na2MoO4 2 H2O et 400 mg de ZnSO4. 7
H2O
A. Traitement par un muta gène
a) 100 ml de DYM-glucose (1% en poids/volume) avec 0,001% (en poids/volume) d'acriflavine sont inoculés avec Kluyveromyces marxianus ATCC 8808 et la culture est faite sous agitation pendant 3 jours. Les cellules sont séparées par centrifugation, lavées avec 100 ml de NaCl stérile à 0,9% et remises en suspension dans 500 ml de YDP frais. Les cultures développées pendant une nuit sont ensuite transférées dans du DYM avec 2% de glucose pour être utilisées dans le traitement par le bénomyle.

b) Pour la mutagénèse par le méthanesulfonate d'éthyle (EMS), les cultures cultivées pendant une nult sur YDP sont séparées par centrifugation et concentrées à une densité de cellules de 2x109 par ml. De l'EMS est ajoute à une concentration finale de 30 mg/ml et la suspension est incubée pendant 2 heures et 15 minutes. Le traitement tue environ 70% de la levure. 2 ml de la suspension de cellules ayant subi une mutagénèse sont dilués à 100 ml de YDP frais, développés pendant 2 jours et ensuite transférés dans du DYM avec glucose pour le traitement par le benomyle.

c) De façon correspondante, une quelconque méthode de mutagénèse chimique ou physique peut etre utilisée. Le dosage est optimise de telle sorte que le taux de mortalité des microbes est compris entre 10 et 100% Après traitement, les microbes sont transférés dans un milieu de culture ou un site dans lequel la croissance est optimale. On passe ensuite à l'étape B.

B. Traitement par le bénoumule
Les cellules ayant subi une mutagénèse avec l'acriflavine ou l'EMS et ensuite développées dans du DYN avec du glucoses sont récoltées par centrifugation et ajoutées à un milieu
YDP frais pour donner une densite de cellules de 108/ml. Du bénomyle (10 mg/ml) est dissous dans du diméthylsulfoxyde, stérilisé par filtration et introduit dans la suspension de cellules pour donner une concentration finale de bénomyle de 100 g/ml.

La culture est agitée à 301C pendant 2 jours. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation, lavées deux fois avec du NaCI stérile à 0,9% et remises en suspension dans 5 volumes de
YDP frais. Apres deux jours d'incubation, la culture est transférée dans du DYM avec glucose pour etre utilisée dans l'enrichissement par la nystatine. Le rendement du traitement par le bénomyle est suivi par l'estimation au microscope de la fréquence de cellules avec 2 noyaux.Avant examen au microscope, les cellules de levure sont fixées avec de l'acide acétique-formaldéhyde-alcool et colorées avec du HCl Biemsa comme cela est decrit en detail par
Streiblova dans Yeast A Practical Approach, ed I. Campbell et JA. Duffus, lPL Press Oxford (1988). De façon correspondante, tout autre compose interférant avec la division du chromosome ou la formation des microtubules peut être utilisé.

C. Enrichissement par un antibiotique
Les cellules cultivées sur du glucose, ayant subi une mutagenèse et traitées par du bénomyle sont centrifugées, lavées avec une solution saline et remises en suspension dans du DYM sens source de carbone, pour donner une densite de cellules de
I 07/ml. Après 8 à 15 heures de privation, il est ajoute 1 g de xylose par 100 ml de la suspension de cellules. La nystatine est en suspension dans de l'éthanol (1 mg/ml) pour tuer les microorganismes (elle ne peut pas etre filtrée en raison de sa faible solubilité). La suspension est diluée à 1:10 dans de l'eau stérile et ajoutée aux cultures (10% en volume/volume) 15 heures après l'addition de xylose.Pour stimuler l'effet de destruction, une autre addition de source de carbone est faite avec la nystatine.

L'incubation dans un agitateur à est est poursuivie pendant 2 heures supplémentaires, après quoi les cellules sont récoltées et lavées avec une solution saline physiologique. Le culot lavé est ensuite remis en suspension dans le volume d'origine de milieu
YDP P. Lorsque les cellules de levures vivantes ont récupérées (1 à 3 jours, la culture est transférée dans du DYM avec du glucose en tant qu unique source de carbon e. Le taux de mortalite dans le traitement par la nystatine est surveillé par comptage de plaques (milieu yDp) avant et après le traitement: plus de 99,999% des cellules sont tuées. En l'ab
sence de source de carbone, la nystatine tue O à 40% des cellules, respectivement.De façon correspondante, un autre antibiotique dont l'effet destructeur est dirigé contre les cellules en train de Sa developper uniquement peut être mis en oeuvre.

D. Mutagénèse dirigée
La méthode pour le colange du gène de la xylitol déshydrogénase de leuvre a été décrite (P. Kötter et al., Curr
Benet 18:493-500 (1990)) ainsi qu'une méthode pour le colange du gene de la xylulose kinase provenant de différentes espèces de leuvre (Ho., N.W.Y. et al., Enzyme Microbiol Technol 11:417-421 (1989); E.P. Stavis et al., Applied and Enviromental Microbial 53:2976-2977 (1987). Une source convenable de marqueur sélectif dominant pour la transformation par intégration de la levure est, par exemple le plasmide pUT332 (A. 8atignol et al., Gene 91:35-41 (1990)).La construction d'un plasmide contenant le marqueur de résistance à la bléomycine inséré dans le gène de la xylitol déshydrogénase peut être réalisée par des méthodes classiques d'ADN recombinant De nombreuses méthodes de transformation peuvent etre utilisées pour introduire l'allèle mute du gene catabolisant le xylitol dans le chromosome de la levure, par exemple, transformation des cellules de levure traitées par du chlorure de lithium ou transformation des sphéroplastes de levure préparés par lyse de la paroi cellulaire de levure avec une préparation d'enzyme convenable (par exemple Lyticase). Pour certaines souches de levure, l'électroporation est une méthode de transformation préférée. Les transformants sont choisis sur les plaques de milieu riches, contenant 5 à 20 g de bléomycine par ml et criblés en fonction de leur aptitude à synthétiser le xylitol.

E. Criblage des mutants
Les mutants potentiels provenant du traitement par la nystatine sont étalés sur un aar de DYM contenant 100 mg de glucose et 10 g de xylose par litre. En conséquence, les mutants incapables d'utiliser le xylose en tant que source de carbone ne génèrent que de minuscules colonies. Les levures métabolisant le xylose pour leur part ne sont pas limitées en carbone et fournissent donc de grandes colonies. De petites colonies sont prélevées et recultivées sur un agar de YDP. L'aptitude des souches mutantes isolées à se développer sur du glucose, du xylose et du xylulose, est déterminée par croissance préalable de l'inoculum pendant une nuit dans un milieu liquide YDP. Une ansée culture est ensuite transférée dans 36 ml de milieau DYM-tartrate avec diverses sources de carbone (glucose xylose ou xylulose).

Apres 2 ou 3 jours2 la croissance des mutants et celle de la souche sauvage est mesurée à A600. Les mutants potentiellement utiles se développent rapidement sur le glucose, mais sont incapables d'utiliser le xylose. Les souches ayant cette propriété- sont prélevées pour etre davantage caractérisées.

Les souches mutantes sélectionnées pour une étude ultérieure sont cultivées une nuit dans un milieu YDP et ensuite transférées dans un milieu contenant 0,5 à 1,0% de glucose comme substrat de croissance et 1,0 à 5,0% de xylose pour servir de substrat pour la production de xylitol. Des échantillons des cultures sont prélevées 3 et 7 jours après l'inoculation pour l'analyse des sucres et sucre alcools.Les échantillons sont envogés à travers des filtres de 0,2 m pour éliminer les cellules et les précipités, les filtrats sont dilués et analysés par HPLC. La colonne utilisée est un échangeur de cation fort sous forme Ca2+ (longueur de 25 cm, diamètre de 8 mm) précédée de cartouches de décendrage Bio Rad MicroGuard (Richmond, CA, USA) La température de la colonne est de 85"C et elle est éluée avec de l'eau a un débit de 0,6 ml/mn. Le volume d'injection est de 10 ul et l'élution des composes est suivie par un détecteur PI. La méthode de l'étalon externe est utilisée.

Les souches Klugveromyces marxdanus var.

marxianus, par exemple la souche CBSC12, la souche var.

bulgaricux par exemple, la souche ATCC 16045 et la souche var.

lactis utilisant le xylose peuvent aussi servir de souches de départ. De façon correspondante, toute autre sous-espèce ou sous-souche de Klugveromyces marxianus qui se développe sur le xylose peut être utifisee pour la production de mutants.D'abord, la réalisation de la mutagénèse de la souche de levure est optimisee avec un quelconque mutagène En modifiant la durée du traitement ou l'intensité du traitement (par exemple, !a concentration de l'agent mutagène chimique9 l'intensité ou la distance pour l'irradiation UV), on détermine une dose tuant plus de 10% mais moins de 100% des organismes Les levures ayant subi une mutagenèse sont développées en presence de bénomyle ou d'un autre compose perturbant la formation des microtubules concentration sub-létale). Les souches de levure haploïdes n'ont pas besoin d'un traitement par le benomyle ou un équivalent.La culture est transférée dans un milieu de croissance frais avec une source de carbone comme substrat de croissance permettant aussi aux mutants désirés de se développer. Après démarrage de la croissance, les cellules sont transférées pour être en état de privation dans un milieu dépourvu de source de carbone.Du xylose ou du ulitol et un antibiotique (par exemple, la nystatinei tuant les cellules en cours de developpementr sont Ajoutés. La concentration de l'antibiotique et la duree du traitement sont optimisées préalablement, de telle sorte que le traitement en presence de xylose tue environ 100% des cellules n'ayant pas subi de mutagénèse, mais en l'absence de source de carbone, moins de 90% Les cellules qui se développent sur le xylose ou le xylitol sont tuées, mais les mutants desires restent vivants. Les mutants de la bonne sorte sont cribles à partir des cellules vivantes. comme cela est indiqué plus haut.

L'activité enzymatique et l'aptitude à produire du -ulitol des levures sont déterminées de la manière décrite dans les exemples 2 à 4.

EXEMPLE 2
Activité enzymatique de la nouvelle souche de levure.

Les activités des enzymes les plus significatives ayant un effet sur le métabolisme du xylose/xylitol, sont déterminées pour la souche de depart et les nouvelles souches de levure de la façon suivante.

Une souche de Klugveromyces marxianus est cultivée pendant une nuit dans 50 ml de milieu YDP pour etre utilisée comme inoculum dans un litre de milieu DYM-tartrate avec 10 g de xylose et 20 , de glucose comme sources de carbone et/ou inducteurs.

Après 2 jours de croissance, la culture est centrifugée et le culot est lavé avec un tampon au phosphate Sorensen, pH 7 pour éliminer le sucre résiduel. Les cellules sont remises en suspension dans le meme tampon et brisées par 5 passages a travers une presse X à - 20 C, De l'ADNase de type (50 mg/ml) est ajoutée à l'extrait fondu et le mélange est incubé pendant 1 heure n temperature ambiante. L'extrait brut obtenu est centrifuge a 85.000 g pendant 60 minutes. Les enzymes essayées sont solubles et restent dans le surnageant La concentration des protéines est déterminée par la méthode de Loqry (J.Biol. Chem 193:265-275 (1951)).

L'activité xylose réductase est déterminée par surveillance de l'oxudation de NADPH par voie spectro- hotometrique à 340 nm. Le mélange réactionnel contient 700 l de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 100 ul de xylose 100 mM. 100 l d'extrait de cellules dilué et 100 l de NADPH 1 mM. La reaction est démarrée par addition du nucléotide reduit et suivie pendant 2 minutes. La vitesse initiale de la reaction est utilisée dans la détérmination de l'activité xylose réductase spécifique.

L'activité xylitol déshydrogénase est déterminée par surveillance de l'oxudation de NADH en NAD, laquelle réaction est couplée à la réduction du xylulose en x.ylitol. L'essai est effectué d'un façon analogue à l'essai de la xylose réductase. sauf sue du
xylulose et du NADH sont utilises à la place de xylose et de NADPH respectivement.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 1.

EXEMPLE 3
Formation de xylitol avec les nouvelles souches de levure
Les fermentations sont effectuées de la façon décrite dans l'exemple 1 dans un flacon agité avec une solution aqueuse de xylose comme source de xylose. Du glucose est ajoute en tant que source d'énergie et de carbon au bouillon de fermentation. Les flacons sont agites et efficacement aérés.

Les résultats obtenus avec la souche de départ et les nouvelles souches de levure mutees sont fournis dans le tableau 1.

TABLEAU 1
Activité xylitol déshydrogénase des souches de Klugveromyces
marxianus cultivées dans des flacons agités
Souche Rendement en xylitol Xylitol déshydrogénase
% (XDH) nmole/mn/mg
Sauvage 42 330
II-7 84 76
II-8 51 39
II-I 60 255
II-2 52 185
II-3 54 289
II-4 57 329
II-5 55 315
II-6 57 352
Les résultats obtenus avec les mutants II-I à II-6 correspondent à une mutation dans le gène de la xylulose kinase, puisque ces hôtes conservent encore l'activité xylitol déshydrogénase.

EXEMPLE 4
Formation de xylitol à grande échelle
L'aptitude de la souche de départ et des nouvelles souches de levure à produire du xylitol dans un procede à plus grande echelle est aussi étudiée Tous les agents chimiques utilisés dans les fermentations sont de qualité technique. La liqueur de mise en pulpe provenant de procédés au sulfite effectues avec deux espèces différentes de bois dur, est utilisée comme source de xylose.

L'inoculum est cultive par transfert d'une colonie de leuvre dans un bouillon YM (100 ml) et croissance de la culture pendant un jour à 30 C dans un agitateur (200 tpm). La culture est ensuite transfenee dans 900 mi de substrat tamponne au NH4tartrate, pH 6,0, contenant 30 g/l de glucose. L'inoculum est à nouveau développé pendant un jour à 30 dans un agitateur (200 tpm) et ensuite transféré aseptiquement dans un fermenteur.

Le xylose! le xylitol, l'éthanol et le glucose sont analyses par HPLC de la façon décrite dans l'exemple 1. La masse de cellules est déterminée par mesure du poids sec. Le bouillon de fermentation est centrifugé, la masse de cellules est lavee à l'eau et séchée une nuit à 106 C.

La vitesse de production volumétrique du xylitol est deterrninee de telle sorte que le temps requis pour l'initiation de la consommation du xylose est ignoré. Le rendement en xylitol est calculé en tant que rapport du xylitol produit au xylose consomme.

tes parametres de fermentation sont les suivants pH 6,0 (NaOH à 25%), agitation à 500 tpm; aération, 4,0 Nl/mn (vvm) et température de 30 C.

La composition du milieu de croissance est la suivante:
240 g glucose
250 g CSL (liqueur de macération de mais, 45,5% d.s.J
20 g (NH4)2SO4
20 g (NH4)2HPO4
8 g KH2PO4
8 g MgSO4, 7 H2O
5 litres H2O
environ 600 g pour 5 litres de xylose (12-13%)
Les résultats sont fournis dans le tableau 2.

TABLEAU 2
Aptitude des souches de Kluyveromyces marxianus a produire du
xylitol sur une plus grande échelle
Charge de Rendement Taux de production de
Souche glucose, g/l/h % xylitol, g/l/h ou g/(g/l/h)
Sauvage - 35,0 1,6 (0,060)
Sauvage 0,80 36,7 1,9 (0,076)
II-7 0,65 68,5 2,8 (0,130)
II-7 - 55,0 1,2 (0,094)
II-8 0,70 60,0 1,6 (0,09)
II-1 0,77 67,0 2,8 (0,09)
II-4 0,80 46,0 1,7 (0,07)
II-6 0,65 40,1 2,0 (0,10)
Le taux de production spécifique du xylitol est indique entre parenthèses (g de xylitol/g de levure).

Les résultats montrent que les nouvelles souches de levure sont d'excellents producteurs de xylitol par rapport à la souche de depart.

En utilisant ie procédé de l'invention, on obtient donc plusieurs souches mutantes de Kluyveromyces marxianus qui ont des activités spécifiques xylitol déshydrogénase (XDH) ou/et xylulose kinase notablement inférieures à celles des souches de levure de l'art antérieur et qui peuvent donc produire plus de xylitol à partir du xylose que ces dernières.

EXEMPLE 5
Construction de souches de levure à ARN anti-sens par des
méthodes d'ADN recombinant
Le gène de xylitol déshydrogenase ou de xylulose kinase de levure provenant de la levure hôte désirée peut être cloné selon des methodes connues dans l'art pour le clonage de ces gènes (P. Kötter et al., Curr, Genet 18:493-500 (1990); (Ho,
N.W.Y. et al., Enzyme Microbiol, Technol 11:417-421 (1989); E.P.

Stevis et al., Applied and Environmental Microbiol 53:2975-2977 (1987)). Dans une variante, un gène cloné de xylitol déshydrogénase ou de xylulose kinase provenant d'une première espece de levure peut être utilise pour identifier et cloner ce gene provenant d'une seconde espèce de levure si de tels gènes sont suffisamment complémentaires pour permettre leur hybridation croisée, par exemple comme cela est mis en évidence dans des expériences preliminaires utilisant l'ADN clone provenant de la première levure hôte en tant que sonde pour l'hybridation contre I'AON génomique digéré par une enzyme de restriction d'une seconde levure hôte, avec une analyse Southern blot
A partir de l'ADN clone, une sequence complémentaire est prédite qui va s'hybrider à la séquence codante pour l'enzyme désirée. Cette séquence peut etre synthetisee in vitro par des moyens chimiques comme ceux qui sont décrits dans
Oligonucleotides Synthesis, A Practical Approach, M.J. Gait, eds., (A), Press, Oxford, 1984, La séquence anti-sens peut etre obtenue meme sans connaître ia séquence codante exacte provenant d'un quelconque ADN clone qui est dirige contre une séquence de gène desiree.De préférence, un tel ADN clone est sous la forme double brin dans laquelle un brin est un brin "sens" [ou codant) et un brin est le brin "anti-sens" (ou non codant). Les constructions antisens peuvent etre obtenues avec des techniques telles que décrites plus haut et comme cela est connu dans l'art, par liaison opérationnelle d'un tel ADN double brin à un promoteur de levure désiré de telle sorte qu'il en résulte une transcription d'un ARN possédant une séquence anti-sens (non codante). De préférence, l'ADN anti-sens est lié de façon opérationnelle à une séquence fournissant le promoteur de xylitol déshydrogénase de levure ou le promoteur de xylulose kinase de levure, si bien que l'expression de i'AP.N anti-sens apparaît dans des conditions dans lesquelles a lieu l'expression de l'ARNm pour l'enzyme ciblée.

Ces constructions anti-sens peuvent être fournies sur des vecteurs, transformées dans des levures hôtes, par exemple une levure de l'espèce Candida, Hansenula,
Kluyveromyces, Pichia ou Pachysolen, de préférence
Kluyveromyces marxianus et Candida utilis, et plus avantageusement Kluyveromyces marxianus var. marxianus,
Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus et Kluyveromyces marxianus var. lactis, et sont cultivées sur un antibiotique, par exemple, la nystatine comme cela est décrit plus haut Les levures sont cultivées de la façon indiquée plus haut et les souches mutantes qui sont incapables d'utiliser le xylose pour se développer ou qui se développent tres médiocrement sur le xylose, mais qui sont capables de se développer sur le glucose, sont sélectionnées pour une etude ultérieure
EXEMPLE 5
Construction de souches de levure a ribozyme par des methodes
d'ADN recombinant
Le gène de xylitol déshydrogénase ou de xylulose kinase de levure provenant de la levure hôte désirée peut etre cloné selon des methodes connues dans l'art pour le clonage de ces gènes (P.Kötter et al., Curr, Genet 18:493-500 (1990); (Ho,
N.W.Y. et al., Enzyme Microbiol, Technol 11:417-421 (1989); E.P.

Stevis et al., Applied and Enviromental Microbiol 53:2975-2977 (1987)).

Dans une variante, un gène clone de xylitol déshydrogénase ou de xylulose kinase provenant d'une première espèce de levure peut être utilise pour identifier et cloner ce gène provenant d'une seconde espèce de levure si de tels genes sont suffisamment complémentaires pour permettre leur hybridation croisée, par exemple comme cela est mis en évidence dans des expériences préliminaires utilisant l'ADN cloné provenant de la première levure hôte en tant que sonde pour l'hybridation contre l'ADN génomique digéré par une enzyme de restriction d'une seconde levure hôte, avec une analyse Southern blot.

A partir de la séquence d'ADN clone, une séquence complémentaire est prédite qui va s'hybrider à la séquence codante pour l'enzyme desiree de même qu'avec la construction d'ARN anti-sens. Cette séquence peut être synthétisée in vitre par des moyens chimiques comme ceux qui sont décrits dans Oligonucleotides Synthesis, A Practical
Approach, M.J. Gait, eds., (A). Press, Oxford, 1984, De préférence, un tel ADN est obtenu à partir d'un ADN clone sous une forme double brin dans laquelle un brin est un brin "sens" (ou codant) et un brin est un brin "anti-sens" (ou non codant).

La construction de ribozyme de la présente invention contient l'activité catalytique d'un ribozyme, comme le ribozyme
comme cela est indiqué dans EP-321.201, et une longueur suffisante d'une sequence d'APN anti-sens dirigée contre l'ARNm d'un ARNm cible désiré, de telle sorte que la construction d'ARN anti-sens de l'invention s'hybride à l'ARNm ciblé et positionne le ribozyme pour couper l'ARNm en une forme trop petite pour fournir une enzyme active.

Les constructions de ribozyme peuvent être elaborees par des techniques telles que décrites plus haut et comme cela est connu dans l'art, par liaison opérationnelle d'un tel
ADN double brin à un promoteur de levure désiré de telle sorte qu'il en résulte une transcription du ribozyme-ARN anti-sens. De préférence, le ribozyme-ADN anti-sens est lié de façon opérationnelle a une séquence fournissant le promoteur de xylitol déshydrogénase de levure ou le promoteur de xylulose kinase de levure, si bien que l'expression du ribozyme-ARN anti-sens apparaît dans des conditions dans lesquelles a lieu l'expression de l'ARNm pour l'enzyme ciblée.

Ges constructions de ribozyme peuvent être fournies sur des vecteurs, transformées dans des levures hôtes, par exemple, une levure de l'espèce Candida, Hansenula,
Kluyveromyces, Pichia ou Pachysolen de préférence
Kluyveromyces marxianus et Candida utilis, et plus avantageusement Kluyveromyces marxianus var. marxianus,
Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus et Kluyveromyces marxianus var. lactis, et sont cultivées sur un antibiotique, par exemple, Ia nystatine comme cela est décrit plus haut Les levures ont cultivées de la façon indiquez plus haut et les souches mutantes qui sont incapables d'utiliser le xylose pour se développer ou qui se développent très médiocrement sur le xylose, mais qui sont capables de se développer sur le glucose, sont sélectionneas pour une etude ultérieure.

La presente invention ayant ete maintenant complètement décrite, il est bien entendu que les spécialistes comprennent que celle-ci peut etre réalisée dans une gamme large et équivalente de conditions, paramètres et similaires, sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention ou d'un quelconque mode de réalisation de celle-ci.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la production du xylitol à partir d'une levure hôte, qui comprend:

a. la sélection d'une levure hote qui peut sgnthetiser et

métaboliser le xylitol, cette levure hôte etant choisie dans le

groupe consistant en les espèces Candida, Hansenula,

Kluyveromyces et Pichia;

b. la modification de l'expression d'une ou de plusieurs enzymes

qui participent à ce métabolisme du xylitol dans cette levure

de l'étape (a), de telle sorte que ce métabolisme du xylitol est

réduit ou éliminé;

c. la croissance de cette levure de l'étape (b) dans des

conditions qui fournissent la synthèse de ce xylitol:

d. la récupération de ce xylitol produit dans l'étape (c).

2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel cette modification de l'étape (b) elimine ou réduit l'expression du ou des gène (s) qui code(nt) pour la xylitol déshydrogénase et/ou la xylulose kinase.

3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel cette modification de l'étape (b) comprend l'exposition de cette levure à un mutagène ou à un agent qui perturbe la division chromosomique ou la formation de microtubules.

4. Procédé suivant la revendication :3, dans lequel cet agent qui perturbe la division chromosomique ou la formation de microtubules est le benomyle.

5, Procédé suivant la revendication 2, dans lequel cette modification de l'étape Ibi comprend l'exposition à un agent qui produit une insertion, une délétion ou une mutation ponctuelle dans un gène de cette levure.

6. Procede suivant la revendication 5, dans lequel cet agent est sélectionné dans le groupe consistant en acriflavine, méthanesulfonate d'éthyle, irradiation UV et irradiation par des rayons X.

7. Procédé suivant la revendication I, dans lequel cette modification de l'étape (b) comprend la modification de l'aptitude de la levure hôte à exprimer une ou plusieurs enzymes qui participent à ce métabolisme du xylitol par des methodes de génie génétique, de preference par rupture du gène,

3 Procédé suivant la revendication 7' dans lequel cette methode de génie génétique comprend la transformation de cette levure de l'étape (a) avec une construction d'ADN recombinant qui corde pour un ribozyme ou un APN anti-sens dirigé contre une enzyme de ce métabolisme du xylitol.

9. Procédé suivant la revendication 1 > dans lequel cette levure est sélectionnée dans le groupe consistant en

Kluyveromyces marxianus et Candida utilis.

10. Procédé suivant la revendication 9, dans lequel cette levure Kluyveromyces marxianus est choisie dans le groupe consistant en Kluyveromyces marxianus var. marxianus,

Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus et Kluyveromyces marxianus var. lactis.

i. Procédé suivant la revendication 10, dans lequel cette ievure est sélectionnée dans le groupe consistant en II-1, II- 2, II-3, II-4, II-5, II-6, II-7 et II-8.

12. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel il comprend de plus la croissance de cette levure de l'étampe (b) dans un antibiotique de préférence la nystatine.

13, Procédé suivant la revendication 1, dans lequel cette modification de la levure comprend de plus la croissance et a sélection dans un substrat de croissance riche en xylose et pauvre en glucose.

14. Souche de levure modifiez ayant une aptitude réduite à métaboliser le xylitol par rapport à la souche de levure correspondante de type sauvage, et produite par le procédé comprenant:

a. la sélection d'une levure hôte qui peut synthétiser et

métaboliser le xylitol, cette levure hôte etant choisie dans le

groupe consistant en les espèces Candida, Hansenula,

Kluyveromyces et Pichia;

b. la modification de llexpression d'une ou de plusieurs enzymes

qui participent à ce métabolisme du xylitol dans cette levure

de l'étape (a), de telle sorte que ce métabolisme du xylitol est

réduit ou éliminé; ;

c. la croissance de cette levure de l'étape (b) dans des

conditions qui permettent la synthèse de ce xylitol;

d. la recuperation de ce xylitol produit dans l'étape (ci.

15, Souche de levure modifiée suivant la revendication 14, dans lequel cette levure est sélectionnée dans le groupe consistant en Kluyveromyces marxianus et Candida utilis

16. Souche de levure modifiez suivant la revendication 1S, dans lequel cette levure Kluyveromyces marxinaus est choisie dans le groupe consistant en Kluyveromyces marxianus var.

marxianus, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus et

Kluyveromyces marxianus var. lactis