DE4009676A1

DE4009676A1 - Dna-sequenz, umfassend ein fuer xylosereduktase und/oder xylitoldehydrogenase codierendes strukturgen

Info

Publication number: DE4009676A1
Application number: DE4009676A
Authority: DE
Inventors: Alexander W M Dr Strasser; Cornelis P Prof Dr Hollenberg; Michael Von Pr Ciriacy-Wantrup; Peter Koetter; Rene Amore; Michael Piontek; Jutta Hagedorn
Original assignee: RHEIN BIOTECH GESELLSCHAFT fur NEUE BIOTECHNOLOGISCHE PROZESSE und PRODUKTE MBH 4000 DUESSELDORF DE; Rhein Biotech GmbH
Current assignee: Artes Biotechnology GmbH
Priority date: 1990-03-26
Filing date: 1990-03-26
Publication date: 1991-10-02
Also published as: JP2000139486A; CA2039021A1; DE69126632D1; JP3122153B2; JP2001103988A; EP0450430A3; ES2104626T3; CA2039021C; ATE154829T1; JPH06339383A; DK0450430T3; DE69126632T2; JP3193917B2; DE4009676C2; EP0450430B1; EP0450430A2; GR3024409T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, eine Kombination von DNA-Sequenzen, einen Vektor, einen Mikroorganismus, ein Verfahren zum Erzeugen von Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase sowie die Proteine Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase; die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen von Ethanol, ein Verfahren zum Herstellen von Biomasse und ein Verfahren zum Wiedergewinnen von NADP⁺ aus NADPH.

D-Xylose ist eines der am häufigsten vorkommenden Kohlenhydrate in pflanzlicher Biomasse und Holz. Im Verfahren der Celluloseherstellung wird es als Abfallprodukt bei der Hydrolyse von Xylan, dem Hauptbestandteil von Hemicellulose, gebildet. Um die Verwendung von erneuerbaren Kohlenstoffquellen zu optimieren, ist es wünschenswert, Xylose in Ethanol oder Biomasse umzuwandeln. Es gibt verschiedene Hefearten, beispielsweise Candida (Gong et al., 1981, Jeffries, 1983), Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pachysolen, Paecilomyces (Wu et al., 1986) und Pichia (Maleszka und Schneider, 1982), die zur Assimilation von Pentosen, einschließlich von D-Xylose und D-Ribose fähig sind, wenngleich nur aerob.

Im allgemeinen müssen von Hefen (z. B. Pichia stipitis) Pentosen zu Pentulosen isomerisiert worden sein, um phosphoryliert werden zu können. Diese Isomerisierung geschieht mittels einer NAD(P)H-abhängigen Reduktion (Reduktase) zu Pentitolen, gefolgt von einer NAD⁺-abhängigen Oxidation (Dehydrogenase) der Pentitole zu den korrespondierenden D-Pentulosen (Barnett, 1976). S. cerevisiae, die hauptsächlich bei der Bioethanolproduktion verwendete Hefeart, kann Xylulose verwenden, jedoch kann diese Hefe Pentosen nicht fermentieren (Jeffries, 1988). Es ist nicht auszuschließen, daß auch S. cerevisiae entsprechende Gene enthält, die jedoch nicht exprimiert werden.

Eine Pentosefermentation durch S. cerevisiae könnte möglich sein, wenn ihr ein Xylose verwendender Abbauweg von einem Xylose metabolisierenden Organismus zur Verfügung gestellt wird. Obwohl jedoch viele Versuche unternommen worden sind, bakterielle Xyloseisomerasegene in S. cerevisiae zu exprimieren, konnte keine signifikante Xylosefermentation erzielt werden, was wahrscheinlich auf einer ineffizienten Expression des fremden Genes in Hefe beruht (Sarthy et al., 1987, Amore et al., 1989, Chan et al., 1986 & 1989).

Hauptsächliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Gene für die in den Xyloseabbau involvierten Proteine bereitzustellen, um in der Lage zu sein, diese Gene zu manipulieren und beispielsweise diese Sequenzen mit geeigneten regulierenden Sequenzen zu kombinieren.

Diese Aufgabe ist durch eine DNA-Sequenz gelöst worden, die ein für eine Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase kodierendes Strukturgen umfaßt und zur Expression des Polypeptides bzw. der Polypeptide in einem Mikroorganismus fähig ist.

Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung, die Beispiele und die Figuren offensichtlich.

In dieser Schrift wird auf verschiedene Publikationen durch Nennung des Erstautors Bezug genommen. Die vollständigen Zitate dieser Literaturstellen werden am Ende der Beschreibung in einem Anhang wiedergegeben. Die Offenbarungen dieser Publikationen werden insgesamt in diese Anmeldung einbezogen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen stammen bevorzugt aus einer Hefe. Bevorzugte Hefestämme werden aus den Gattungen Schwanniomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia, Pachysolen und Paecilomyces ausgewählt. Von allen diesen Hefegattungen ist bekannt, daß sie unter Verwendung von Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase Xylose in Ethanol umwandeln können.

Eine bevorzugt als Quelle für die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zu verwendende Gattung ist die Hefe Pichia. Diese Gattung umfaßt verschiedene Arten, deren jede für die Ausführung der vorliegenden Erfindung herangezogen werden könnte. Die bevorzugte Art ist jedoch Pichia stipitis. Die Erfinder haben für die Isolierung der DNA-Sequenzen, die ein für Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase kodierendes Strukturgen enthalten, Pichia stipitis CBS5773 verwendet. (Der Stamm ist am 21.03.1990 bei der DSM hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer DSM 5855 erhalten).

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten DNA-Moleküle isolieren, die die für Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase kodierenden Strukturgene enthielten. Auf dem Umweg über die DNA-Sequenz, die nach Standardverfahren bestimmt wurde, konnte die Aminosäuresequenz beider dieser Proteine das erste Mal bestimmt werden. Die vollständigen Aminosäuresequenzen sowie die Nukleotidsequenzen beider Proteine sind in den Fig. 2A und 2B gezeigt. Wie dem Fachmann bekannt ist, können Proteine mit den in den Fig. 2A und 2B gezeigten Aminosäuresequenzen nicht nur von DNA-Sequenzen, wie sie in Pichia stipitis CBS5773 gefunden worden sind, kodiert werden, sondern ebenso unter Verwendung alternativer Codons auf der Grundlage der Degeneration des genetischen Codes. Die Erfindung beschränkt sich daher nicht auf die in Fig. 2 gezeigte DNA-Sequenz, sondern umfaßt jede Modifikation, die zu den gleichen Aminosäuresequenzen führt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können nicht nur durch Anwendung des unten gezeigten Verfahrens erhalten werden, d. h. durch Isolieren von cDNA-Klonen, die später verwendet werden, um eine genomische Bank zu screenen, sondern können ebenso durch andere Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie aus einer anderen natürlichen DNA oder cDNA oder chemisch synthetisierten DNA oder durch eine Kombination von zwei oder mehreren dieser DNAs hergestellt werden. Es kann beispielsweise versucht werden, einen chemisch synthetisierten 5′-Bereich mit einer cDNA zu kombinieren, die für den 3′-Bereich kodiert, oder jede andere Kombination der drei DNA-Quellen, der oben erwähnt worden ist, anzuwenden.

Erfindungsgemäß werden weiterhin Kombinationen von DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die eine DNA-Sequenz der bereits diskutierten Art umfaßt, d. h. eine DNA-Sequenz, die ein für eine Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase kodierendes Strukturgen enthält, und zusätzlich eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die zur Regulation der Expression des erwähnten Strukturgens in einem späteren Wirtsorganismus fähig sind. DNA-Sequenzen, die die Regulation der Expression von Strukturgenen steuern, sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise können die oben diskutierten DNA-Sequenzen mit Promotoren kombiniert werden, die mit den Strukturgenen so verbunden werden, daß eine effiziente Expression stattfindet. Weiterhin können die zur Regulation der Expression fähigen DNA-Sequenzen Enhancer, Terminationssequenzen und Polyadenylierungssignale umfassen. Beispiele für die bestbekannte Art von regulierenden Sequenzen werden durch die folgenden Beispiele gegeben.

Um die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und/oder Kombination von DNA-Sequenzen effizient zu exprimieren, können geringfügige Modifikationen der DNA-Sequenzen vorgenommen werden, solange diese ihre Fähigkeit zur Expression eines funktionellen Enzyms mit der gewünschten Xylosereduktase oder Xylitoldehydrogenaseaktivität beibehalten. Diese Modifikationen können entweder Variationen des genetischen Codes, wie oben bereits diskutiert, oder weitere Substitutionen der Aminosäuresequenz sowie Deletionen und Insertionen, die keinen nachteiligen Einfluß auf die entsprechende Enzymaktivität haben, umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die zur Regulation der Expression des Strukturgenes fähige DNA-Sequenz von einem endogenen Gen des Mikroorganismus, in dem die Expression der DNA-Sequenz beabsichtigt ist. Da, wie im folgenden detailliert beschrieben werden wird, Saccharomyces cerevisiae einer der erfindungsgemäß bevorzugt zu verwendenden Mikroorganismen ist, ist bereits eine Vielzahl möglicher regulierender Sequenzen bekannt. Einige dieser gut bekannten Sequenzen sind zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet worden; dies wird in den Beispielen gezeigt. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Kombination von DNA-Sequenzen induzierbare Promotoren. In diesem Fall kann die Expression der Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase solange, wie gewünscht, verhindert werden; die Expression kann nach Gabe eines geeigneten Induktors gestartet werden.

In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die folgenden Saccharomyces cerevisiae-Promotoren zur Regulation der Expression von Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase verwendet: ADH1, ADH2, PDC, GAL1/10.

In Abhängigkeit von der Wahl des entsprechenden Promotors ist es möglich, Expressionsraten zu erzielen, die die der natürlichen Expression der beiden Proteine in ihrem früheren Wirtsorganismus übertreffen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sowie die Kombinationen von DNA-Sequenzen können in Vektormoleküle eingefügt werden. Diese Moleküle können Plasmide sein, die zur Replikation im gewünschten Wirtsorganismus geeignet sind, und enthalten in diesem Fall einen funktionellen Replikationsorigin. Alternativ ist es ebenso möglich, lineare DNA-Fragmente, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder Kombination von DNA-Sequenzen tragen, oder zirkuläre DNA-Moleküle ohne einen funktionierenden Replikationsorigin zu verwenden. In diesem Fall wird der zur Replikation nicht fähige Vektor entweder durch homologe oder nichthomologe Rekombination in das Wirtschromosom integriert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiter Mikroorganismen, die die erfinderischen DNA-Sequenzen oder Kombinationen von DNA-Sequenzen, die für Xylosereduktase oder Xylitoldehydrogenase kodieren, mittels rekombinanter DNA-Technologie erhalten haben.

Bevorzugte Mikroorganismen werden aus den Hefen der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia, Pachysolen oder Paecilomyces oder Bakterien der Gattung Zymomonas umfassenden Gruppe ausgewählt.

Die bevorzugtesten Mikroorganismen aus der obenbeschriebenen Gruppe sind Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Zymomonas.

Eine der möglichen Verwendungen der obenbeschriebenen genetisch veränderten Hefestämme ist die Herstellung von Biomasse. Da die Hefestämme mit der neu erhaltenen Fähigkeit, Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase zu exprimieren, gute Fermentationsfähigkeiten beibehalten haben, kann die Biomasse hoch effizient unter Verwendung der erfinderischen Hefestämme hergestellt werden. Die Verfahren zum Herstellen der Biomasse sind dem Fachmann bekannt.

Die genetisch manipulierten Stämme, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, sind außerdem für die Herstellung von Ethanol geeignet. Bevorzugte Mikroorganismen für die Herstellung von Ethanol durch Fermentation sind die Hefen Saccharomyces cerevisiae und/oder Schizosaccharomyces pompe und/oder das Bakterium Zymomonas und das bevorzugte Kohlehydrat für die Ethanolherstellung ist Xylose. Daher sind zur Fermentation von Xylose fähige Saccharomyces cerevisiae-, Schizosaccharomyces pombe- und/oder Zymomonas-Stämme für die Herstellung von Ethanol höchst vorteilhaft. Die Herstellung trinkbaren oder industriellen Ethanols unter Verwendung der erfindungsgemäßen genetisch manipulierten Mikroorganismen kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die erfinderischen Stämme haben die Fähigkeit, konzentrierte Kohlenhydratlösungen zu fermentieren, weisen Ethanoltoleranz und die Fähigkeit zur Produktion erhöhter Konzentration von Ethanol auf; sie besitzen eine hohe Zellebensfähigkeit für wiederholte Wiederverwendung und sind sehr pH- und temperaturtolerant. Im Verfahren der Celluloseherstellung wird Xylose als Abfallprodukt bei der Hydrolyse von Xylan gebildet, das ein Hauptbestandteil von Hemicellulose ist. Aus diesem Grund ist es von großem Vorteil, Xylose für die Herstellung von Ethanol und/oder Biomasse zu verwenden. Die Erfindung ist weiterhin für die Herstellung und Isolierung der NAD(P)H-abhängigen Xylosereduktase geeignet. Infolge der Reduktionsreaktion ist dieses Enzym geeignet, das korrespondierende Coenzym (von NADPH zu NADP⁺) zu regenerieren, was insbesondere in Bioreaktionen, beispielsweise bei der Herstellung von Aminosäuren, von Bedeutung ist.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen der Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase durch Kultivieren eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen und Gewinnen des Enzymes oder beider Enzyme in an sich bekannter Weise. Das Verfahren umfaßt daher die Expression einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einer Kombination von DNA-Sequenzen in einem geeigneten Mikroorganismus, Kultivieren dieses Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen und Isolieren des Enzymes.

Es konnte gezeigt werden, daß die Expression der gewünschten Proteine im erfindungsgemäßen Mikroorganismus gesteigert ist, wenn der Mikroorganismus so ausgewählt ist, daß er effizient Xylulose fermentiert. Es ist daher bevorzugt, das Verfahren zum Herstellen eines oder beider der Proteine unter Verwendung von Mikroorganismen durchzuführen, die dementsprechend für eine effiziente Fermentation von Xylulose selektiert worden sind.

Da die vorliegende Erfindung die klonierten Gene und ihre Sequenzen bereitsteht, können die Genprodukte in anderen Mikroorganismen, beispielsweise in Hefen der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia, Pachysolen oder Paecilomyces oder Bakterien der Gattung Zymomonas überexprimiert werden. Die Verfahren zur Expression des XYL1-(Xylosereduktase-) und/oder XYL2-(Xylitoldehydrogenase-) Genes und die Isolierung aktiven Genproduktes beruhen auf dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise Promotorfusionen, Transformationen, Integration und Selektion und Techniken der Proteinisolierung. Im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Mikroorganismen die DNA-Sequenz oder Kombination von DNA-Sequenzen via Transformationsverfahren erhalten. Für jeden der möglichen Mikroorganismen, d. h. die verschiedenen Hefegattungen und Bakterien der Gattung Zymomonas, sind Transformationsverfahren bekannt. Die Transformation wird bevorzugt unter Verwendung eines Vektors durchgeführt, der entweder ein lineares oder zirkuläres DNA-Molekül sein kann. Weiterhin kann das Verfahren sowohl unter Verwendung autonom replizierender als auch integrierender Moleküle durchgeführt werden. In dem Fall, daß das Molekül in das Wirtsgenom integrieren soll, ist es bevorzugt, einen Vektor zu verwenden, der zur DNA des beabsichtigten Wirtsmikroorganismus homologe DNA-Sequenzen enthält. Diese Maßnahme erleichtert die homologe Rekombination.

Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die nach dem obenbeschriebenen Verfahren hergestellten Enzyme. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können in Ethanolherstellungsverfahren verwendet werden. Da Xylose ein leicht verfügbarer Rohstoff ist, der normalerweise als Abfall betrachtet wird, stellt das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen von Ethanol eine Möglichkeit zur Ethanolherstellung von hohem Interesse unter ökologischen und ökonomischen Gesichtspunkten dar.

Das Verfahren zum Herstellen von Ethanol kann für eine Herstellung alkoholhaltiger Getränke oder zur Erzeugung von Einzelzellproteinen aus Substraten, die freie Xylose enthalten, angepaßt werden, wobei die Xylose beispielsweise durch Xylanase- und/oder Xylosidaseaktivität aus Xylan freigesetzt wird. Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins in Pichia stipitis bereitgestellt, bei dem ein für ein gewünschtes Protein kodierende Strukturgen unter der Kontrolle des 5′ regulierenden Bereichs des XYL1- und/oder XYL2-Genes aus Pichia stipitis und/oder des ADH1-Promotors aus S. cerevisiae und/oder des Glucoamylase-Promotors aus Schwanniomyces occidentalis exprimiert wird. Bevorzugt ist die Verwendung der 5′ regulierenden Bereiche des XYL1- oder XYL2-Genes, da diese Promotoren durch Zusatz von Xylose induzierbar sind. Pichia stipitis hat als Wirtsorganismus den großen Vorteil, über ein effizientes Sekretionssystem zu verfügen. Dies ermöglicht eine effiziente Expression nicht nur von im Zellinneren verbleibenden Proteinen, sondern darüber hinaus von solchen, die kontinuierlich in das Medium abgegeben werden. Ein weiterer Vorteil des Pichia stipitis Expressionssystems ist die Möglichkeit, Xylose als Substrat einzusetzen. Xylose ist ein relativ preiswerter, leicht verfügbarer Nährstoff.

Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung.

Figurenbeschreibung

Fig. 1A Restriktionskarte des für das Xylosereduktasegen (XYL1) kodierenden DNA-Fragmentes
E. EcoRI, H: HindIII, B: BamHI, N: NcoI, P: PvuII, Ps: PstI.

Fig. 1B Restriktionskarte des für das Xylitoldehydrogenasegen (XYL2) kodierenden DNA-Fragmentes
Ba: BamHI, B: BglII, E: EcoRI, X: XbaI, S: SalI.

Fig. 2A Diese Figur zeigt die Nukleotidsequenz des XYL1-Strukturgenes einschließlich seiner 5′- und 3′-flankierenden Sequenzen und die korrespondierende Aminosäuresequenz im Bereich des offenen Leserasters.

Fig. 2B Diese Figur zeigt die Nukleotidsequenz des XYL2-Strukturgenes einschließlich seiner 5′- und 3′-flankierenden Sequenzen und die korrespondierende Aminosäuresequenz im Bereich des offenen Leserasters.

Fig. 3 zeigt einen S. cerevisiae und S.pombe-Expressionsvektor. Das Plasmid pRD1 enthält sowohl das Xylosereduktasegen als auch das Xylitoldehydrogenasegen unter Kontrolle ihrer eigenen ursprünglichen Promotoren.

Fig. 4 Diese Figur zeigt eine Fermentationskurve von in YNB mit 2% Xylose gezüchtetem PK4. Die Kultur wurde mit 10⁸ Zellen/ml aus einer mit Xylose inkubierten Vorkultur inokuliert. Die Figur zeigt den Xyloseverbrauch und die Umwandlung in Ethanol mit der theoretischen Maximalausbeute.

Fig. 5(1,2) zeigt die Konstruktion des Vektors pBRPGAM. Hierfür wurde das 3,8 kb EcoRI-PvuII-Fragment von pBRSwARSGAM, welches den funktionellen GAM-Promotor und die ersten 208 bp der kodierenden GAM-Sequenz enthält, mit dem kleinen EcoRI-PvuII-Fragment von pBR322 ligiert.

Fig. 6(1,2) zeigt die Konstruktion des Vektors pBRGC1. Hierfür wurde das 3,4 kb PvuII-Fragment von pCT603, welches das Strukturgen des Cellulase von der bp Position +122 enthält, in die PvuII-Stelle des Vektors pBRPGAM ligiert.

Fig. 7(1,2) zeigt die Konstruktion des Vektors pMPGC1-2. Hierfür wurde das 4,8 kb BamHI-PstI-Fragment von pBRGC1, welches das Cellulasegen unter Kontrolle des GAM-Promotors enthält, mit dem großen BamHI-PstI- Fragment von pCJD5-1 ligiert.

Beispiele Material und Methoden I. Mikroorganismen und deren Kultivierung Hefestämme

1. Saccharomyces cerevisiae:
- a) XJB3-1B (MATα, met6, gal2) wurde aus dem "Yeast genetic stock center" bezogen (Katalog des Yeast Genetic Stock Center′s, 6. Auflage, 1987).
- b) GRF18 (MATα, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15) wurde von G. R. Fink zur Verfügung gestellt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer 3797 hinterlegt.
- c) AH22 (MATa, can1, his4-519, leu2-3, leu2-112) wurde von A. Hinnen zur Verfügung gestellt und bei der DSM mit der Hinterlegungsnummer 3820 hinterlegt.
2. Schizosaccharomyces pombe (leu1-32, his5-303); hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnummer 3796.
3. Pichia stipitis CBS5773 wurde vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, Yeast Division, Delft, Niederlande, bezogen.

Die Hefestämme wurden bei 30°C in YP-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton) oder in 0,67% Difco Yeast nitrogen base (YNB) ohne Aminosäuren, das gegebenenfalls mit geeigneten Aminosäuren supplementiert wurde, gezüchtet. Die Medien wurden mit entweder 2% Xylose oder 2% Glucose versetzt. Hefetransformationen wurden nach dem Protokoll von Dohmen et al. (1989) durchgeführt.

E.coli-Stämme

1. DH5 α F′ wurde von BRL bezogen (BRL, Eggenstein, FRG)
2. HB101 (Bolivar et al., 1977) wurde bei der DSM mit der Nummer 3788 hinterlegt.

Die E.coli-Stämme wurden bei 37°C in Vollmedium (LB-Medium, Maniatis et al., 1982) gezüchtet, das gegebenenfalls für die Selektion von Transformanten mit 100 µg/ml Penicillin G versetzt wurde.
E.coli-Transformationen wurden wie von Maniatis et al. (1982) beschrieben, durchgeführt.

II. Reinigung der Proteine Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase aus Pichia stipitis

Die Zellen wurden unter Induktionsbedingungen bis zur exponentiellen Wachstumsphase inkubiert. Zur Herstellung zellfreier Zellextrakte wurden sie zentrifugiert und mit Glasperlen in einem Braun Homogenisator unter Verwendung von 0,1 M Tris-HCl Puffer (pH 7,0) aufgebrochen. Der nach einer Stunde Zentrifugation des Rohextraktes (150 000×g) erhaltene Überstand wurde auf eine Affinitätschromatographiesäule (Affi-Gel Blue, 60×50 mm), aufgetragen, die zuvor mit 5 mM NaPO₄ Puffer (pH 6,8) equilibriert worden war, und mit 1,5 mM NAD eluiert. Die die Xylosereduktase- und Xylitoldehydrogenaseaktivität enthaltenden Fraktionen wurden jeweils gesammelt und vereinigt und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend auf eine DEAE-Sephacel-Anionenaustauschersäule aufgetragen, die zuvor mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) equilibriert worden war. Die Proteine wurden mit einem linearen Gradienten (20-250 mM Tris-HCl, pH 7,5) eluiert. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden vereint, konzentriert und auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 0,1 M KCl angefärbt und die Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase- Proteinbanden ausgeschnitten, beide Proteine wurden getrennt durch Dialyse gegen 20 mM NaPO₄ (pH 8,0), 0,1% SDS aus dem Gel eluiert; das Dialysat wurde anschließend konzentriert.

Alle Puffer enthielten 0,2 mM DTT (Dithiothreit) und 0,4 mM PMSF (Phenylmethansulfonsäurefluorid).

III. Herstellung der Antiseren

Antiseren gegen Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenase wurden in Mäusen erzeugt, indem diese intraperitoneale Injektionen mit jeweils 2-5 µg des entsprechenden Proteins in Freund′s vollständigem Adjuvants erhielten. 2 Wochen später wurde die gleiche Menge Protein in Freund′s vollständigem Adjuvants verabreicht; eine dritte Injektion wurde weitere 2 Wochen später ohne Freund′s Adjuvants vorgenommen. Die Antiseren wurden 6 Wochen nach der ersten Injektion gewonnen.

IV. Antikörperscreening

Die gegen gereinigtes Pichia stipitis Xylosereduktase und Xylitoldehydrogenaseprotein in Mäusen erzeugten Antiseren wurden für das Screening einer cDNA-Bank nach dem Verfahren von Huynh et al. (1985) verwendet. Die Antiseren wurden 1 : 10 000 verdünnt. Gebundene Antikörper wurden mittels eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers sichtbar gemacht, indem eine Farbreaktion mit dem Phosphatasesubstrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in Verbindung mit Nitroblautetrazoliumsalz (NBT) durchgeführt wurde.

V. RNA-Isolierung

Alle Schritte wurden bei 0 bis 4°C durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. Alle Lösungen und Materialien wurden, so möglich, sterilisiert. Pichia stipitis-Zellen wurden in Gegenwart von Xylose bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit Puffer 1 (20 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6) gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert (1,25 ml/g Zellen). Der Suspension wurden 1/10 Volumen Phenol, 200 µg/ml Heparin, 100 µg/ml Cykloheximid und 0,4% SDS zugefügt. Die Zellen wurden aufgebrochen, indem sie mit Glasperlen (0,45-0,5 mm) in einem Verhältnis von 1 : 1 (v/v) in einem Braun Homogenisator (Braun, Melsungen) geschüttelt wurden. Dem Homogenat wurden zwei Volumen Puffer 2 (Puffer 1, inclusive 100 µg/ml Heparin, 50 µg/ml Cykloheximid, 2% SDS) zugefügt und Zelldebris wurde durch Zentrifugation (10 000×g, 10 min) entfernt. Die Lösung wurde drei bis fünfmal mit Phenol/Chloroform (1 : 1), einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die Nukleinsäuren wurden über Nacht bei -20°C mit 2,5 Vol. Ethanol in Gegenwart von 0,2 M CaCl aus der wäßrigen Phase ausgefällt. Der Niederschlag wurde in Puffer 3 gelöst (0,1 m NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5); anschließend wurden SDS und LiCl bis zu einer Endkonzentration von 0,1% bzw. 4 M zugefügt. Die RNA wurde über Nacht bei +4°C ausgefällt. Der Niederschlag wurde zweimal mit 70% Ethanol gewaschen und vor der weiteren Verwendung in sterilem Wasser resuspendiert. Die RNA wurde bei -70°C als Ethanolniederschlag gelagert.

VI. Enzymtests

Die Aktivitäten der Xylosereduktase (EC. 1.1.1.21) und Xylitoldehydrogenase (EC. 1.1.1.9) wurden wie von Bruinenberg et al. (1983) beschrieben, gemessen. Die Proteinmenge wurde mit dem Mikrobiuretverfahren nach Zamenhoff (1957) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.

VII. Gelelektrophorese

Die SDS-Gelelektrophorese wurde mit 10%igen Polyacrylamidgelen nach Laemmli (1970) durchgeführt.

VIII. Immunblotten

Der Nachweis des Proteins wurde entsprechend Towbin et al. (1979) unter Verwendung der in Mäusen erzeugten Antiseren durchgeführt. Die Proteine wurden auf eine mikroporöse Polyvinyliden-Difluoridmembran (Millipore, Immobilon PVDF) übertragen und mittels einer phosphatasegekoppelten Farbreaktion (Blake et al., 1984) sichtbar gemacht. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziege-Anti-Maus IgG wurde von Jackson Immunoresearch Lab. (Avondale, USA) bezogen.

IX. DNA-Sequenzanalyse

Die genomische XYL1 und XYL2 DNA sowie die entsprechenden cDNAs wurden in pT7T3-18U (Pharmacia) subkloniert. Die nach Partialverdau unter Verwendung von Exonuklease III (Henikoff, 1984) erhaltenen Fragmente wurden analysiert und nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung des T7-Sequenzierkits (Pharmacia) sequenziert. Die Nukleotidsequenzen beider Stränge wurden durch Überlappungen an jeder Verbindung vollständig bestimmt.

X. Konstruktion einer cDNA-Bank von Pichia stipitis CBS5773 (DSM 5855)

Nach dem obenbeschriebenen Verfahren wurde zunächst Gesamt-RNA extrahiert. Daraus wurde Poly (A)⁺-RNA durch Chromatographie mit einer Oligo(dT)-Cellulosesäule im wesentlichen nach dem von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die cDNA-Bank in λgt11 wurde nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (1983) unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (Pharmacia) und in vitro Verpackung der rekombinanten λgt11-DNA nach Hohn und Murray (1974) unter Verwendung eines in vitro Verpackungskits (Boehringer, Mannheim) hergestellt.

XI. Herstellung eines Rohextraktes

Die Zellen wurden bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase inkubiert und zweimal in Puffer (10 mM KPO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol) gewaschen. Die Zellen wurden in einem Braun Homogenisator mit einem gleichen Volumen Glasperlen aufgebrochen. Der nach 5 Minuten Zentrifugation bei 10 000 g resultierende Überstand wurde für die Enzymtests eingesetzt. Extrakte für Westernblotanalysen wurden in 1% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 10 mM KPO₄, pH 7,0 und 10% Glycerin gekocht.

Beispiel 1 Isolierung der Xylosereduktase (XYL1)- und Xylitoldehydrogenase (XYL2)-Gene

Eine mit Poly (A)⁺-RNA von Pichia stipitis hergestellte λgt11 cDNA-Bank wurde mit polyklonalen Mausantikörpern, die gegen gereinigte Xylosereduktase (XR) und Xylitoldehydrogenase (XDH) Proteine erzeugt worden waren, gescreent. Unter den 110 000 rekombinanten Klonen der amplifizierten cDNA-Bank, die ungefähr 55 000 Primärklone enthielt, wurden sieben identische XYL1-Klone und drei identische XYL2-Klone gefunden und isoliert. Die Analyse der Insertgrößen zeigte, daß die XYL1-Klone zwei EcoRI-Fragmente (0,6 kb und 0,4 kb) enthalten, während die XYL2-Klone ein 0,55×kb EcoRI-Fragment enthalten. Die entsprechenden EcoRI- Fragmente der λgt11-Klone wurden in die einzelne EcoRI-Restriktionsstelle des Plasmids pT7T3-18U (Pharmacia) kloniert, was zur Bildung von pXRa (enthaltend das 0,6 kb EcoRI-Fragment des XYL1-Klones), pXRb (enthaltend das 0,4 kb EcoRI-Fragment des XYL1-Klones) und pXDH (enthaltend das 0,55 kb EcoRI-Fragment des XYL2-Klones) führte.

Diese Plasmide wurden als radioaktive Proben zum Screenen der Pichia stipitis genomischen DNA-Bank verwendet. Diese Bank war durch Ligation von partiell Sau3A gespaltener P. stipitis DNA in die einzelne BamHI Schnittstelle des S. cerevisiae - E. coli Shuttlevektors YEp13 (Broach et al., 1979) und anschließende Transformation von E. coli HB101 hergestellt worden. Sie umfaßt 60 000 unabhängige Klone.

Auf diese Weise konnten zwei Plasmide, die mit pR1 und pD1 bezeichnet wurden, isoliert werden. Sie wurden für die Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18 eingesetzt. In Rohextrakten von mit pR1 transformierten Zellen konnte daraufhin Xylosereduktaseaktivität beobachtet werden, während in Extrakten von Transformanten, die pD1 enthielten, Xylitoldehydrogenase (XDH)-Aktivität nachgewiesen wurde. In einem Test zur Bestimmung der mitotischen Stabilität (Beggs, 1978) coseggregierten der LEU2-Marker und die Xylosereduktase (XR)- bzw. XDH-Aktivität, was darauf hinweist, daß pR1 und pD1 die funktionellen XYL1- und XYL2-Gene enthalten. Mit den Plasmiden pR1 und pD1 wurden Restriktionsanalysen durchgeführt, die zu den in Fig. 1 gezeigten Restriktionskarten für XYL1 (Fig. 1A) und XYL2 (Fig. 1B) führten.

Weitere Subklonierungsexperimente zeigten, daß das XYL1-Gen auf einem 2,04 kb BamHI-Genomfragment liegt. Eine dieser BamHI-Schnittstellen ist im ursprünglichen Plasmid pR1 nicht enthalten. Sie muß im Verlauf der Subklonierung entstanden sein. Das XYL2-Gen liegt auf einem 1,95 kb BamHI-XbaI-Fragment. Das 2,04 BamHI- Fragment und das 1,95 kb BamHI-XbaI-Fragment wurden in die "multiple cloning site" von pT7T3-18U subkloniert, was zur Bildung von pR2 (enthaltend das 2,04 kb BamHI- Fragment) und pD2 (enthaltend das 1,95 kb BamHI-XbaI- Fragment) führte. Diese Plasmide wurden für die DNA- Sequenzanalyse verwendet. Die DNA-Sequenzen der Strukturgene und der 5′- und 3′-nichtkodierenden Bereiche des XYL1- und XYL2-Genes sind in den Fig. 2A und 2B wiedergegeben.

Die DNA-Sequenz des XYL1-Genes enthält ein offenes Leseraster von 954 bp, entsprechend 318 Aminosäuren, während das XYL2-Gen ein offenes Leseraster von 1089 bp, entsprechend 363 Aminosäuren, umfaßt.

Die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen führen zu einem Xylosereduktasepolypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 35 922 D sowie einem Xylitoldehydrogenasepolypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 38 526 D.

Beispiel 2 Expression der Xylosereduktase- und Xylitoldehydrogenasegene in Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae wurde gleichzeitig mit pR1 und pD1 transformiert. Die höchsten meßbaren Aktivitäten von XR und XDH in so transformierten S. cerevisiae-Zellen entsprechen 50% der für beide Enzyme meßbaren Aktivität in P. stipitis-Rohextrakten. In S. cerevisiae wurden die Gene in YNB-Medium mit 2% Glucose als einziger Kohlenstoffquelle exprimiert, während die Expression beider Gene in P. stipitis durch Glucose reprimiert und durch Xylose induziert wird. Unter Berücksichtigung der Kopienzahl 10 für YEp13 in S. cerevisiae und bei Annahme einer Gendosis-abhängigen Expression kann daraus abgeleitet werden, daß die Pichia-Promotoren in S. cerevisiae 20mal weniger effizient arbeiten als in P. stipitis.

Darüber hinaus wurde ein Plasmid konstruiert, das sowohl das XYL1- und XYL2-Gen einschließlich der jeweiligen ursprünglichen Pichia-Promotoren enthielt (Fig. 3). Dieses Plasmid, das als pRD1 bezeichnet wurde, wurde zur Transformation von S. cerevisiae GRF18 verwendet; die Transformanten wurden auf leucinhaltigen Platten selektiert. Eine der resultierenden Transformanten, PK1, wurde näher untersucht; es wurde festgestellt, daß die Expression bei Verwendung dieses Stammes im Vergleich zu mit separaten Plasmiden cotransformierten Zellen nicht verbessert war.

Beispiel 3 Konstruktion eines Integrationsvektors für das XYL2-Gen unter Kontrolle verschiedener Promotoren

Für die Expression und Integration des XYL2-Genes in S. cerevisiae wurden verschiedene Expressionvektoren mit verschiedenen Promotoren konstruiert. Beispielsweise wurde das XYL2-Gen mit dem ADH1-Promotor fusioniert, gefolgt von homologer Integration in den HIS3-Locus von S. cerevisiae. Es wurde wie folgt vorgegangen:

Das das Xylitoldehydrogenasegen XYL2 enthaltende 1,5 kb XbaI/EcoRI-Fragment wurde in die "multiple cloning site" von pT7T3-18U (Pharmacia) inseriert. Um die Promotorregion des XYL2-Genes zu eliminieren, wurde das Plasmid mit XbaI, dessen Schnittstelle 318 bp oberhalb des Translations-Initiationskodons ATG liegt, linearisiert und anschließend mit PstI geschnitten, um das 3′-Ende der Plasmid-DNA zu schützen. Das lineare Plasmid wurde mit Exonuklease III und anschließend mit S1-Nuklease behandelt, um die DNA zwischen der XbaI-Schnittstelle und dem XYL2-Strukturgen zu entfernen. Die deletierten DNA-Moleküle wurden rezirkularisiert, in E. coli kloniert und das Ausmaß der jeweiligen Deletion durch Didesoxysequenzierung bestimmt. In einem der so modifizierten Plasmide waren der 5′-untranslatierte Bereich und die vier N-terminalen Aminosäuren deletiert. Ein neues ATG-Initiationskodon im Raster des offenen Leserahmens wurde durch die SphI-Schnittstelle von der "multiple cloning site" bereitgestellt. In die HindIII-Schnittstelle der "multiple cloning site" wurde ein BamHI-Linker inseriert. Anschließend wurde ein 1,5 kb BamHI-EcoRI-Fragment, das das XYL2-Gen enthielt, in dem Vektor pT7T3-18U subkloniert, was zu zusätzlichen Restriktionsschnittstellen vor dem ATG-Initiationskodon führte. Der so neu geschaffene 5′-Bereich hat die folgende Sequenz: ATG CCT TGG TGT . . . (Deletion der ursprünglichen Aminosäuren 2, 3 und 3).

Um den 3′-untranslatierten Bereich des XYL2-Genes zu vervollständigen, wurde ein 440 bp EcoRI-Fragment in die einzelne EcoRI-Schnittstelle des wie oben beschrieben in pT7T3-18U subklonierten 1,5 kb Fragmentes inseriert. Dieses 440 bp-Fragment wurde erzeugt, indem das 440 Basenpaar EcoRI-BamHI-Fragment (siehe Fig. 1B) in einen weiteren pT7T3-18U subkloniert wurde und die BamHI-Stelle durch Schneiden mit BamHI und anschließendes Auffüllen mit Klenow-Polymerase entfernt wurde. Der 3′-untranslatierte Bereich konnte daher als ein 440 pb-EcoRI-Fragment isoliert werden. In die einzelne BamHI-Schnittstelle am 5′-Ende des XYL2-Genes, die durch die Polylinkerregion bereitgestellt wird, wurde das 1,8 kb BamHI-Fragment mit dem S. cerevisiae HIS3-Gen, das aus dem Plasmid YEp6 (Struhl et al., 1979) stammte, inseriert. Um eine der beiden BamHI-Schnittstellen zu entfernen, wurde das resultierende Plasmid mit SalI und XhoI geschnitten und anschließend rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid pXDH-HIS3 enthält eine geeignete BamHI-Schnittstelle vor dem ATG-Translations- Initiationskodon, in die das ebenfalls 1,5 kb große BamHI-Fragment, das den ADH1-Promotor aus S. cerevisiae enthält (Ammerer, 1983), inseriert werden kann.

Da dieses Plasmid keine autonom replizierenden Sequenzen für S. cerevisiae enthält, kann es für homologe Integration (Orr-Weaver et al., 1981) in den HIS3-Locus jedes S. cerevisiae-Stammes verwendet werden. Für die Integrationsexperimente wurde mutagenisierter XJB3-1B-Stamm mit der Bezeichnung PUA6-1 verwendet, der nach dem Protokoll von Porep (1987) und Ciriacy (1986) isoliert wurde. Die resultierende Integrante PK2 exprimiert das XYL2-Gen unter Kontrolle des ADH1-Promotors und führt zu einem aktiven Genprodukt.

Beispiel 4 Konstruktion von S. cerevisiae und S. pombe-Integranten, die das XYL1- und XYL2-Gen exprimieren

Um die Promotorregion des XYL1-Genes zu eliminieren, wurde das Plasmid pR2, das das XYL1-Gen auf einem 2,04 kb BamHI-Fragment enthält, mit XbaI (Schnittstelle 362 bp oberhalb des Translationsinitiationskodons) linearisiert und außerdem mit SphI gespalten, um das 3′-Ende der Plasmid-DNA zu schützen. Das lineare Plasmid wurde mit Exonuklease III und anschließend mit S1-Nuklease behandelt, um die DNA zwischen der XbaI-Schnittstelle und dem XYL1-Strukturgen zu entfernen. Die deletierten DNA-Moleküle wurden rezirkularisiert, in E. coli kloniert und das Ausmaß der Deletion wurde durch Didesoxysequenzierung bestimmt. In einem der modifizierten pR2-Plasmide war der 5′-untranslatierte Bereich exakt deletiert worden.

Das Strukturgen wurde als ein HindIII-BamHI-Fragment in die korrespondierenden Restriktionsstellen des Plasmides YIp366 (Myers et al., 1986) subkloniert. Zusätzlich wurde der ADH1-Promotor in die HindIII-Stelle durch "blunt end ligation" subkloniert, was zur Bildung des Plasmides pR2-LEU2 führte. Da dieses Plasmid keine autonom replizierenden Sequenzen für S. cerevisiae enthält, kann es für homologe Integration in den LEU2-Locus jedes S. cerevisiae-Stammes, beispielsweise Stamm PK2, verwendet werden. Die resultierende Integrante PK3 exprimiert sowohl das XYL1- als auch das XYL2-Gen unter Kontrolle des ADH1-Promotors und bildet aktive Genprodukte. Zum Zwecke von Expressionsstudien in Schizosaccharomyces wurde S. pombe mit beiden Plasmiden pXDH-HIS3 und pXR-LEU2 transformiert und Transformanten durch Histidin- und Leucinsynthese identifiziert. Nach gründlicher Untersuchung der Transformanten auf Wachstum auf Xylose wurde eine AS1 genannte Transformante isoliert, die sowohl das XYL1- als auch das XYL2-Gen unter Kontrolle des ADH1-Promotors exprimierte.

Auf die gleiche Weise führten andere S. cerevisiae-Promotoren, beispielsweise der Pyruvatdecarboxylase (PDC)-Promotor (Kellermann & Hollenberg, 1988) der Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2)-Promotor (Russel et al., 1983) und der Galactokinase (GAL1/10)-Promotor aus Plasmid pBM272, das von Plasmid pBM150 (Johnston and Davis, 1984) abgeleitet ist, indem eine HindIII-Schnittstelle unmittelbar nach der BamHI-Schnittstelle eingeführt wurde, zur Expression aktiven XYL1- und XYL2-Genproduktes in S. cerevisiae.

In einem anderen Satz von Experimenten wurden zwei geeignete Restriktionsschnittstellen, nämlich BamHI (Position -9) und SalI (Position -15) unmittelbar vor dem XYL1- und XYL2-Strukturgen eingefügt.

XYL1: 5′attcttttctaGTCGACGGATCCAAGATGCCTTCTATT . . . TAA Terminator3′
XYL2: 5′cccctaatactGTCGACGGATCCAAGATGACTGCTAAC . . . TAA Terminator3′.

Diese Modifikationen wurden mit stellenspezifischer Mutagenese im 5′-Bereich der jeweiligen Gene unter Verwendung des Kits für stellenspezifische Mutagenese von Amersham und den Instruktionen dieser Firma folgend durchgeführt. Die Restriktionsstellen bieten die Möglichkeit, jeden Promotor unmittelbar vor dem Translationsinitiationskodon zu fusionieren. Außerdem kann das von einem gewünschten Promotor kontrollierte Gen als ein Fragment isoliert werden und anschließend können Sequenzen, die für homologe Integration in einem gewünschten Wirt geeignet sind, inseriert werden.

Für industrielle und kommerzielle Zwecke ist es vorteilhaft, stabile Produktionsstämme von S. cerevisiae und/oder S. pombe zu konstruieren. Daher wurden beide Gene unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors ohne irgendeine bakterielle Sequenz in das Chromosom des S. cerevisiae-Stammes PUA6-1 via homologe Integration integriert. Bevorzugt sind dabei die Integration in das HO-Homothallismusgen (Russel et al., 1986), in die ARS-Bereiche (Stinchcomb et al., 1978) oder in das ADH4-Gen (Paquin et al., 1986) durch Cotransformation mit pJW6 (Fogel and Welch, 1982). Die resultierenden Stämme sind PK3(HO), PK3(ARS) und PK3(ADH4). Im Falle von S. pombe verläuft die Integration hauptsächlich via illegitime Rekombination. Daher weisen nur einige wenige der S. pombe-Integranten XR und/oder XDH-Aktivitäten bei gleichzeitigem Erhalt der Fermentations- und Wachstumseigenschaften des Wildtyps auf.

Die S. cerevisiae-Integranten PK3, PK3(HO), PK3(ARS) und PK3(ADH4) können für eine effizientere Assimilation von Xylose verbessert werden.

Beispiel 5 Isolierung von effizient Xylulose assimilierenden S. cerevisiae-Mutanten

Der S. cerevisiae-Stamm XJB3-1B wächst auf Medien mit Xylulose als einziger Kohlenstoffquelle relativ langsam (Verdoppelungszeit: 10 Stunden). Unter Befolgung eines bei Porep (1987) beschriebenen Protokolls wurde eine Mutante, PUA3, isoliert, die Xylulose effizienter als Wildtype S. cerevisiae-Stämme abbaute, so daß dieser Stamm auf Xylulose als einziger Kohlenstoffquelle mit einer Verdoppelungszeit von ungefähr 4 Stunden wächst.

Der Mutantenstamm PUA3 wandelt darüber hinaus Xylulose anaerob in Ethanol um (Porep, 1987). Um den PUA-Genotyp in Kombination mit einem für Hefetransformationen nützlichen Hilfsmarker (LEU2) zur Verfügung zu haben, wurde Stamm PUA3 mit AH22 (leu2 his4) gekreuzt. Aus einer sporulierenden Kultur des diploiden AH22×PUA3 wurden meiotische Sporenabkömmliche isoliert, die leu2 waren und die Fähigkeit zur effizienten Xyluloseverwertung, wie sie in der ursprünglichen Mutante PUA3 beobachtet wurde, aufwiesen. In einem analogen Experiment wurde der PUA-Genotyp mit leu2 und his3 Hilfsmarker durch Kreuzen von Stamm GRF18 mit einem PUA-Stamm und anschließender meiotischer Sporenisolierung kombiniert. Dies führte zu Stamm PUA6-1 mit dem Genotyp PUA leu2 his3.

Beispiel 6 Isolierung einer effizient Xylose in Ethanol umwandelnden S. cerevisiae-Mutante

Stamm PUA6 mit chromosomal integrierten XYL1- und XYL2-Genen (s. Beispiele 3 und 4) war zum Wachstum auf Xylose als einziger Kohlenstoffquelle in der Lage, während der untransformierte PUA6-1-Stamm vollständig negativ auf YNB-Xylosemedium war. Die Verdoppelungszeit des Transformantenstammes PK3 betrug 4 Stunden auf YNB mit 1% Xylose (zum Vergleich die Verdoppelungszeit auf YNB 1% Glucose: 2 Stunden). Da die Ethanolproduktion in diesem Stamm bei Wachstum auf Xylose ineffizient war und ohne Atmung kein Xylosewachstum beobachtet wurde, wurde ein Mutantenstamm mit verbesserter Umwandlungsfähigkeit von Xylose in Ethanol wie folgt selektiert:

10⁸ PK3-Zellen wurden mit UV-Licht (Wellenlänge: 254 nm) unter Bedingungen, die zu 20 bis 40% überlebenden Zellen führten, bestrahlt. Die überlebenden Zellen wurden ungefähr 30 Generationen in YNB Flüssigmedium mit 2% Xylose inkubiert. Nach dem Ausstreichen auf xylosehaltigem Festmedium wurden Isolate erhalten, die signifikant schneller als der Elternstamm PK3 wuchsen. Eines der Isolate wurde weiter propagiert und führte zur Selektion einer Mutante, die zum Wachstum auf YNB-Platten mit 2% Xylose und 2 mg/l Antimycin A (Respirationshemmer) fähig war. Mit diesem Verfahren wurde eine Mutante, PK4, erhalten, die Xylose signifikant effizienter in Ethanol umwandeln kann als der ursprüngliche Transformantenstamm PK3. Ein typisches Xylose-Fermentationsprotokoll ist in Fig. 4 wiedergegeben. Die Ethanolausbeute betrug etwa 40% des anfänglichen Xylosewertes. Diese Ausbeute entspricht ungefähr 80% der theoretischen Maximalausbeute an Ethanol, die aus Xylose erhalten werden kann.

Beispiel 7 Expression heterologer Gene in Pichia stipitis

Nach UV-Mutagenese des Pichia stipitis-Stammes CBS5773 wurde eine trp5-Mutante isoliert. Die trp5-Mutation wird durch Untersuchungen der Indol-Akkumulation bestimmt (s. Hagedorn und Ciriacy, 1989).

Für die Expression in P. stipitis wurden Plasmide konstruiert, die ein Replikon aus Schwanniomyces occidentalis (SwARS1), das TRP5-Gen aus S. cerevisiae (Dohmen et al., 1989) als Selektionsmarker und zusätzlich eine Glucoamylase (GAM)-Cellulase (celD)- Genfusion unter Kontrolle des Glucoamylase-Promotors enthielten. In einem ersten Schritt wurde das 3,8 kb EcoRI-PvuII-Fragment aus dem Plasmid pBRSwARSGAM (Fig. 5, beschrieben in EP 8 91 07 780.2) isoliert und in das 2296 bp EcoRI-PvuII-Fragment aus pBR322, das das Amplicillin-Resistenzgen und den bakteriellen Replikationsorigin enthält, insertiert. Das resultierende Plasmid wurde pBRPGAM genannt (Fig. 5). Zusätzlich zu der pBR322-Sequenz trägt dieses Plasmid 3,6 kb aus dem 5′ nicht-kodierenden Bereich des Glucoamylasegenes aus Schwanniomyces occidentalis sowie die ersten 208 bp, die für den N-terminalen Teil einschließlich der Signalsequenz der Glucoamylase kodieren. Anschließend wurde ein 3,4 kb PvuII-Fragment aus dem Plasmid pCT603 (Joliff et al., 1986), das die kodierende Region des celD-Genes aus Clostridium thermocellum enthält, der jedoch am 5′-Ende 120 bp (40 Aminosäuren) fehlen, in die PvuII-Stelle von pBRPGAM insertiert. Das gebildete Plasmid wurde pBRGC1 genannt (Fig. 6). Zur Konstruktion eines P. stipitis Expressionsvektors wurde das Plasmid pCJD5-1 (EP 8 71 10 370.1) mit BamHI/PstI geschnitten und mit dem 4,8 kb BamHI-PstI-Fragment aus pBRGC1 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pMPGC1-2 (Fig. 7) genannt. Die obenerwähnte P. stipitis trp5-Mutante wurde mit pMPGC1-2 transformiert und die Transformanten durch prototrophes Wachstum auf tryptophanfreiem Medium identifiziert und mittels des Kongorot-Testes (Teather & Wood, 1982: Hofbildung auf Carboxymethylcellulose- Agarplatten) auf Cellulaseaktivität untersucht. Die Transformanten exprimierten konstitutiv aktive Clostridium thermocellum Cellulase (Endoglucananse D), die in das Medium sezerniert wurde, was darauf hinweist, daß der Promotor und die vom Glucoamylasegen kodierte Signalsequenz die Expression eines fremden Genes und die Sekretion des Genproduktes in das Medium steuern können.

Plasmid pMPGC1-2 wurde im folgenden so modifiziert, daß der Glucoamylase-Promotor zum einen durch den S. cerevisiae ADH1-Promotor sowie die in dieser Anmeldung beschriebenen 5′-Bereiche des XYL1- bzw. XYL2-Genes ersetzt wurde. Es zeigte sich, daß die von XYL1- bzw. XYL2-Promotorbereichen abhängige Expression durch Xylose induziert werden konnte, während sie durch Glucose reprimiert wurde.

Claims

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz ein für eine Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase kodierendes Strukturgen umfaßt und zur Expression dieses Polypeptides bzw. dieser Polypeptide in einem Mikroorganismus fähig ist.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus einer Hefe stammt, bevorzugt aus einer Hefe, die aus der die Gattungen Schwanniomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia und Pachysolen umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe Pichia stipitis ist, bevorzugt Pichia stipitis CBS5773 (DSM 5855).

4. DNA-Sequenz nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz das für eine Xylosereduktase mit der folgenden Aminosäuresequenz kodierende Strukturgen umfaßt:

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 4, umfassend die folgende Nucleotidsequenz:

6. DNA-Sequenz nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz das für eine Xylitoldehydrogenase mit der folgenden Aminosäuresequenz kodierende Strukturgen umfaßt:

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, umfassend die folgende Nucleotidsequenz:

8. DNA-Sequenz nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch rekombinante DNA-Technologie aus natürlicher und/oder cDNA und/oder chemisch synthetisierter DNA erhalten wird.

9. Kombination von DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination eine erste DNA-Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 und eine oder mehrere zusätzliche DNA-Sequenzen, die zur Regulation der Expression eines Strukturgenes, das durch die erste DNA-Sequenz kodiert wird, in einem Mikroorganismus fähig sind, umfaßt.

10. Kombination von DNA-Sequenzen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination alle Modifikationen der DNA-Sequenzen umfaßt, bei denen deren Fähigkeit, ein funktionelles Enzym mit Xylosereduktase- oder Xylitoldehydrogenaseaktivität zu exprimieren, erhalten bleibt.

11. Kombination von DNA-Sequenzen nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen von dem für Xylosereduktase oder Xylitoldehydrogenase kodierenden Strukturgen abgeleitete DNA-Sequenzen enthält, die zur Modifikation des Proteinproduktes führen, wobei gleichzeitig seine Funktion in einer solchen Weise beibehalten wird, daß das Proteinprodukt als ein Genprodukt mit enzymatischer Aktivität exprimiert wird.

12. Kombination von DNA-Sequenzen nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Regulation der Expression des Strukturgenes in einem Mikroorganismus fähigen DNA-Sequenzen aus dem Wirtsmikroorganismus abgeleitet sind.

13. Kombination nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Regulation der Expression fähigen DNA-Sequenzen konstitutive oder induzierbare Promotoren sind.

14. Kombination nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Regulation der Expression fähigen DNA-Sequenzen aus der Gruppe der folgenden Promotoren ausgewählt sind: ADH1, ADH2, PDC, GAL1/10.

15. Kombination nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Regulation der Expression des Strukturgenes fähige DNA-Sequenz ein starker Promotor ist, der zur Überexpression des durch das Strukturgen kodierten Proteins führt.

16. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eine DNA-Sequenz nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Kombination von DNA-Sequenzen nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15 enthält.

17. Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor aus der die Plasmide pR1, pR2, pD1, pD2, pRD1, pXRa, pXRb, pXDH, pXR, pXDH-HIS3, pXR-LEU2 umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus zur Expression einer Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase infolge des Erhalts von DNA-Sequenzen, die DNA-Sequenzen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Kombination von DNA-Sequenzen nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15 umfassen, die für die Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase kodieren, fähig ist.

19. Mikroorganismus nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Hefen der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Debaryomyces, Metschnikowia, Pachysolen oder Paecilomyces oder Bakterien der Gattung Zymomonas umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

20. Mikroorganismus nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.

21. Mikroorganismus nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Schizosaccharomyces pombe ist.

22. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz oder Kombination von DNA-Sequenzen in das Genom des Mikroorganismus integriert ist.

23. Mikroorganismus nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus für die Erzeugung von Biomasse, für die Nahrungsmittelindustrie und Fermentierungsverfahren nützlich ist.

24. Mikroorganismus nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus für die Fermentation von Xylose verwendbar ist.

25. Verfahren zur Erzeugung von Xylosereduktase und/oder Xylitoldehydrogenase durch Kultivieren eines Mikroorganismus nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 22 unter geeigneten Bedingungen und Gewinnen des Enzymes bzw. der Enzyme in an sich bekannter Weise.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus für effiziente Fermentation von Xylulose ausgewählt ist.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus die DNA-Sequenzen oder die Kombination von DNA-Sequenzen durch Transformation unter Verwendung eines Vektors erhalten hat, wobei der Vektor bevorzugt ein DNA- Fragment oder ein Plasmid ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor DNA enthält, die homolog mit der DNA des Mikroorganismus ist, was zur Integration in das Genom des Mikroorganismus führt.

29. Xylosereduktase, hergestellt nach dem Verfahren mindestens eines der Ansprüche 25 bis 28.

30. Xylitoldehydrogenase, hergestellt nach dem Verfahren mindestens eines der Ansprüche 25 bis 28.

31. Verfahren zum Herstellen von Ethanol, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 24 verwendet wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Fermentierungsverfahren an die Erzeugung alkoholischer Getränke oder Einzelzellprotein angepaßt ist, das aus Substraten erzeugt wird, die freie Xylose enthalten, bevorzugt durch Xylanase und/oder Xylosidaseaktivität.

33. Verfahren zum Herstellen von Biomasse, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtsmikroorganismus nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 24 verwendet wird.

34. Verfahren zum Wiedergewinnen von NADP⁺ aus NADPH unter Verwendung von Xylosereduktase.

35. Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins in Pichia stipitis, umfassend die Expression des für das gewünschte Protein kodierenden Strukturgenes unter der Kontrolle des 5′ regulierenden Bereiches des XYL1- und/oder XYL2-Genes aus Pichia stipitis und/oder des ADH1-Promotors aus Saccharomyces cerevisiae und/oder des Glucoamylase-Promotors aus Schwanniomyces occidentalis.