DE60223377T2

DE60223377T2 - Veränderung von pilzen zur verwendung von l-arabinose

Info

Publication number: DE60223377T2
Application number: DE60223377T
Authority: DE
Inventors: John Londesborough; Merja Penttilä; Peter Richard
Original assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Current assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Priority date: 2001-02-16
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2022-02-16
Also published as: ZA200207945B; US20090209016A1; AU2002233382B2; FI20010308A0; WO2002066616A3; CA2405883A1; CN1520457A; ATE377643T1; EP1409641A2; DK1409641T3; PL370063A1; WO2002066616A2; EP1409641B1; US7527951B2; US20030186402A1; JP2004532008A; DE60223377D1; CN1520457B

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine genetisch modifizierte Hefe sowie deren Nutzung zur Herstellung nützlicher Produkte aus Stoffen, die den Pentosezucker L-Arabinose enthalten.
Hintergrund der Erfindung
L-Arabinose stellt einen Hauptbestandteil von Pflanzenmaterial dar. Die L-Arabinose-Fermentation ist daher potentiell auch von biotechnologischem Interesse.
Pilze, die L-Arabinose und D-Xylose nutzen können, sind nicht zwangsläufig geeignet für die industrielle Anwendung. Zum Beispiel zeigen viele Pentose verwendenden Hefearten eine geringe Ethanol-Toleranz, weshalb sie für eine Ethanolproduktion ungeeignet sind. Ein Ansatz wäre die Verbesserung der industriellen Eigenschaften dieser Organismen. Ein anderer besteht darin, einem geeigneten Organismus die Fähigkeit der Nutzung von L-Arabinose und D-Xylose zu verleihen. Es gibt Stoffwechselwege für D-Xylose und L-Arabinose, von denen bekannt ist, dass sie in Bakterien aktiv sind. Für den D-Xylose-Katabolismus ist es eine Xyloseisomerase, welche D-Xylose in D-Xylulose umwandelt, und eine Xylulokinase zur Produktion von D-Xylulose-5-Phosphat. Für den L-Arabinose-Katabolismus besteht der Weg aus einer Isomerase, einer Kinase und einer Epimerase, die L-Arabinitol zu L-Ribulose, L-Ribulose-5-Phosphat und D-Xylulose-5-Phosphat umwandeln, mit D-Xylulose-5-Phosphat als Intermediat des Pentosephosphat-Weges (Stryer, 1988). Es wurde versucht, diesen bakteriellen Stoffwechselweg in der Hefe S. cerevisiae zu überexprimieren, welcher aber nicht funktionell aktiv war. Die drei Enzyme des L-Arabinose-Stoffwechselweges wurden exprimiert und zeigten Aktivität. Allerdings wurde kein Wachstum auf L-Arabinose als alleiniger Kohlenstoffquelle berichtet (Sedlak und Ho, 2001). Auch die Expression der Xyloseisomerase in einem Pilz als Wirt war nicht erfolgreich (Sarthy et al. 1987, Chan et al. 1989, Kristo et al. 1989, Moes et al. 1996, Schründer et al. 1996). Der Grund dafür ist nicht geklärt. Es könnte sich um eine Speziesbarriere handeln, die die bakterielle Isomerase an der Funktion in Pilzen hindert. Es könnten auch metabolische Ungleichgewichte im Wirt sein, die im Spender durch einen unbekannten Mechanismus gelöst werden.
Es gibt außerdem einen hypothetischen eukaryotischen, d. h. pilzlichen, Stoffwechselweg, bei dem L-Arabinose auch zu D-Xylose-5-Phosphat umgewandelt wird, aber über einen anderen Weg (siehe 1). Es wurde angenommen, dass dieser Weg 2 Reduktasen, 2 Dehydrogenasen und eine Ki-kinase nutzt (Chiang und Knight, 1961, Witteveen et al., 1989). Während die Gene des bakteriellen Weges seit Jahrzehnten bekannt sind, ist nur sehr wenig über diesen hypothetischen Weg in Pilzen bekannt.
Ein Stoffwechselweg in Pilzen für die Nutzung von L-Arabinose wurde von Chiang und Knight (1961) für Penicillium chrysogenum und von Witteveen et al. (1989) für Aspergillus niger beschrieben. Er besteht aus einer NADPH-abhängigen Reduktase, welche L-Arabinitol bildet, einer NAD-abhängigen Dehydrogenase, welche L-Xylulose bildet, einer NADPH-abhängigen Reduktase, die Xylitol bildet, einer NAD-abhängigen Dehydrogenase, die D-Xylolse bildet und einer Xylulokinase. Das Endprodukt ist D-Xylulose-5-Phosphat, wie beim bakteriellen L-Arabinose-Stoffwechselweg (siehe 1). Dieser Weg wurde nur für filamentöse Pilze beschrieben, aber es gibt Hinweise, dass er auch in Hefen auftreten kann. Shi et al. (2000) beschrieben eine Mutante von Pichia stipitis, die nicht auf L-Arabinose wachsen konnte. Eine Überexpression der NAD-abhängigen Xylitoldehydrogenase konnte das Wachstum auf L-Arabinitol wieder herstellen, was darauf hinweist, dass Xylitol möglicherweise ein Intermediat des L-Arabinose-Stoffwechselweges ist. Zudem produzierten Hefestämme, die L-Arabinose als alleinige Kohlenstoffquelle hatten, L-Arabinitol und kleine Mengen an Xylitol (Dien et al., 1996), was darauf hinweist, dass Hefen möglicherweise diesen Stoffwechselweg nutzen. Die Möglichkeit der L-Arabinose-Fermentation ist keine allgemeine Eigenschaft von Hefen. Viele Hefearten akkumulieren hauptsächlich L-Arabinitol, welches aus L-Arabinose gebildet wird (McMillan und Boynton, 1994). Erst in letzter Zeit wurden Hefearten identifiziert, die L-Arabinose fermentieren konnten (Dien et al., 1996).
Der hypothetische pilzliche L-Arabinose-Weg hat Ähnlichkeiten mit dem pilzlichen D-Xylose-Stoffwechselweg. Bei beiden Wegen durchlaufen die Pentosezucker Reduktions- und Oxidationsreaktionen, bei denen die Reduktionen NADPH-abhängig und die Oxidationen NAD-abhängig sind. D-Xylose durchläuft zwei Reaktionen, eine Reduktions- und eine Oxidationsreaktion, und L-Arabinose durchläuft zwei dieser Reaktionspaare. Der Prozess ist redoxneutral, aber verschiedene Redox-Cofaktoren, d. h. NADPH und NAD, werden verwendet, welche separat in anderen Stoffwechselwegen regeneriert werden müssen. Im D-Xylose-Weg wandelt eine NADPH-abhängige Reduktase D-Xylose in Xylitol um, welches danach durch eine NAD-abhängige Dehydrogenase in D-Xylulose und durch eine Xylulokinase in D-Xylulose-5-Phosphat umgewandelt wird. Die Enzyme des D-Xylose-Weges können alle im L-Arabinose-Weg genutzt werden. Das erste Enzym in beiden Wegen ist eine Aldosereduktase (EC 1.1.1.21). Die entsprechenden Enzyme in Saccharomyces cerevisiae (Kuhn et al., 1995) und Pichia stipitis (Verduyn, 1985) wurden charakterisiert. Sie sind unspezifisch und können sowohl L-Arabinose als auch D-Xylose nutzen, um mit annähernd derselben Geschwindigkeit L-Arabinitol bzw. Xylitol zu produzieren. Die Gene, die für dieses Enzym codieren, sind bekannt, z. B. für Pichia stipitis (Amore et al., 1991), Saccharomyces cerevisiae (Kuhn et al., 1995, Richard et al. 1999), Candida tenius (Hacker et al., 1999), Kluyveromyces lactis (Billard et al., 1995) und Pachysolen tannophilus (Solen et al., 1996).
Die Xylitoldehydrogenase (auch bekannt als D-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.9) und die Xylulokinase (EC 2.7.1.17) sind im D-Xylose- und im L-Arabinose-Weg von Pilzen gleich. Die Gene für die D-Xylulose-Reduktase sind bekannt von Pichia stipitis (Kötter et al. 1990), Saccharomyces cerevisiae (Richard et al., 1999) und Tricoderma reesei (Wang et al., 1998). Das Gen für eine pilzliche Xylulokinase ist nur für Saccharomyces cerevisiae (Ho and Chang, 1998) bekannt.
Gene, die für eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (EC 1.1.1.12) oder L-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.10) codieren, sind nicht bekannt.
Die Erfindung zielt darauf ab, eine Expression des Stoffwechselweges zur Verwertung von L-Arabinose in Hefen zu ermöglichen. Der hypothetische pilzliche Stoffwechselweg, exprimiert in Saccharomyces cerevisiae, würde zu einem Stamm führen, der nahezu alle Zucker aus Forst- und Landwirtschaftsabfall zu Ethanol fermentieren kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird die Unfähigkeit einer Hefe L-Arabinose effektiv zu nutzen, durch eine genetische Modifizierung der Hefe gelöst, welche gekennzeichnet ist durch die Transformation des Pilzes mit einem Gen für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase oder einem Gen für L-Xylulose-Reduktase oder beiden solchen Genen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Hefe mit allen oder einigen Genen die für die Enzyme des L-Arabinoseweges codieren, z. B. Aldosereduktase, L-Arabinitol-4-Dehydrogenase, L-Xylulose-Reduktase, D-Xylulose-Reduktase und Xylulokinase, transformiert. Die entstandene Hefe ist dann in der Lage, L-Arabinose zu nutzen. Wir offenbaren Gene für L-Arabinitol-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase. Wir offenbaren, dass, wenn eine Hefe wie S. cerevisiae, die unfähig ist, L-Arabinose zu verwerten, mit Genen für Aldosereduktase, L-Arabinitol-4-Dehydrogenase, L-Xylulose-Reduktase, D-Xylulose-Reduktase und Xylulokinase transformiert wird, diese fähig wird, L-Arabinose zu nutzen. Wir offenbaren außerdem, dass, wenn eine Hefe wie beispielsweise genetisch veränderte S. cerevisiae, die D-Xylose aber nicht L-Arabinose verwerten kann, mit Genen für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase transformiert wird, diese L-Arabinose verwerten kann.
Mit dem Begriff Verwertung ist hier gemeint, dass der Organismus L-Arabinose in eine andere Verbindung umwandeln kann, welche eine nützliche Substanz darstellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 – Hypothetischer pilzlicher und bakterieller Stoffwechselweg für die L-Arabinoseverwertung.
2 – Gensequenz von L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (Sequenz-ID-Nr. 1): Die Sequenz der genomischen DNA wurde mit den cDNA-Sequenzen der N-terminalen und C-terminalen Region kombiniert. Die Intronsequenz reicht von den Nukleotiden 247 bis 315. Das Protein wird codiert von den Nukleotiden 47 bis 1246.
3 – Sequenz des cDNA-Klons und Proteinsequenz für die L-Xylulose-Reduktase (Sequenz-ID-Nr. 2) Das Protein wird von den Nukleotiden 24 bis 821 codiert.
4 – Ethanolbildung aus L-Arabinose durch Nutzung eines genetisch modifizierten Pilzes gemäß der Erfindung (Stamm H2651) im Vergleich zu einem Kontrollstamm (H2652).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die zentrale Lehre der vorliegenden Erfindung besteht darin, aufzuzeigen, wie ein pilzlicher Mikroorganismus genetisch modifiziert werden kann, um L-Arabinose zu verwerten. Mit dem Begriff Verwertung meinen wir, dass der Organismus L-Arabinose in eine andere Verbindung umwandeln kann, die eine nützliche Substanz darstellt. Einige Pilze können L-Arabinose von Natur aus verwerten, andere nicht. Es kann wünschenswert sein, die Fähigkeit zur Verwertung von L-Arabinose auf einen Organismus zu übertragen, dem diese Fähigkeit zur Verwertung fehlt, der aber andere erwünschte Eigenschaften besitzt, beispielsweise die Fähigkeit, industrielle Bedingungen zu tolerieren oder bestimmte Stoffe wie Ethanol oder Milchsäure zu produzieren. Um durch gentechnische Veränderung die Eigenschaft zur Verwertung von L-Arabinose zu übertragen, ist es wichtig, alle Gene einer Gruppe von Enzymen zu kennen, die in einer Wirtszelle benötigt werden, um L-Arabinose in ein Derivat, z. B. D-Xylulose-5-Phosphat, umzuwandeln, welches der Wirt abbauen und so nützliche Produkte erzeugen kann. Diese Gruppe von Enzymen kann dann in einem bestimmten Wirt durch Transformation dieses Wirts mit dem Gen oder den Genen, die das fehlende Enzym bzw. die fehlenden Enzyme codieren, vervollständigt werden.
Ein Beispiel stellt die genetische Veränderung von S. cerevisiae für die Verwertung von L-Arabinose dar. S. cerevisiae ist ein guter Ethanolproduzent, besitzt aber nicht die Fähigkeit zur Verwertung von L-Arabinose. Andere Beispiele sind Organismen, die ein nützliches Merkmal aufweisen, denen aber zumindest ein Bestandteil eines funktionsfähigen L-Arabinose-Stoffwechselweges fehlt.
Ein L-Arabinose-Stoffwechselweg, von dem angenommen wird, dass er in Pilzen funktionsfähig ist, ist in 1 dargestellt. Die Gene, die für die Aldosereduktase (EC 1.1.1.21), die D-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.9) und Xylulokinase (EC 2.7.1.17) codieren, sind bekannt. Um einen Stamm zu generieren, der L-Arabinose über diesen hypothetischen Stoffwechselweg nutzen kann, wären zwei zusätzliche Gene erforderlich, d. h. die Gene für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (EC 1.1.1.12) und L-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.10).
L-Arabinitol-4-Dehydrogenase: Eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase wurde für Penicillium chrysogenum und Aspergillus niger von Chiang und Knight (1960) bzw. Witteveen et al (1989) beschrieben. Dieses Enzym wandelt L-Arabinitol und NAD zu L-Xylulose und NADH um. Es wurde zudem berichtet, dass es Aktivität mit NAD und Adonitol (Ribitol) sowie NAD und Xylitol besitzt (Chiang und Knight, 1960).
L-Xylulose-Reduktase: Die L-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.10) wandelt Xylitol und NADP in L-Xylulose und NADPH um. Ein anderes Enzym, von dem berichtet wird, dass es die gleiche Reaktion katalysiert, ist die D-Iditol-2-Dehydrogenase (EC 1.1.1.15) (Shaw, 1956).
L-Xylulose-Reduktase wurde in Erwinia uredovora (Doten et al., 1985), Aspergillus niger (Witteveen et al., 1994) und Meerschweinchen (Hickman und Ashwell, 1959) entdeckt. Eine Präparation aus Meerschweinchenleber ist kommerziell verfügbar (Sigma-Aldrich). Eine einzelne Untereinheit des Enzyms aus Aspergillus niger hat eine Molekülmasse von 32 kDa, das native Enzym hat eine geschätzte Molekülmasse von 250 kDa (Witteveen et al., 1994).
Indes sind die Aminosäuresequenzen und die codierenden Gene für keine L-Arabinitol-Dehydrogenase oder L-Xylulose-Reduktase bekannt. Wir offenbaren nun solche Gene. Wir offenbaren außerdem, dass die Transformation dieser Gene in eine Hefe, welche keine L-Arabinose verwerten kann, aber Xylose verwerten kann, dem transformierten Pilz die Fähigkeit zur Verwertung von L-Arabinose verleiht.
Zur Identifikation der Gene für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase oder L-Xylulose-Reduktase sind unterschiedliche Ansätze möglich, und ein Fachmann könnte andere Ansätze nutzen. Ein Ansatz besteht darin, das Protein mit der entsprechenden Aktivität zu reinigen und Informationen über das Protein zur Klonierung des dazugehörigen Gens zu nutzen. Dies kann die proteolytische Verdauung des gereinigten Proteins, die Aminosäuresequenzierung des proteolytischen Verdaus und die Klonierung eines Teils des Gens durch PCR mit Primern, die aus der Aminosäuresequenz erhalten wurden, beinhalten. Der Rest der DNA-Sequenz kann dann auf verschiedenen Wegen erhalten werden: Eine Möglichkeit bestünde darin, eine cDNA-Bibliothek mit PCR-Primern aus dem Bibliotheksvektor und einem bekannten Teil des Gens zu verwenden. Sobald die komplette Sequenz bekannt ist, kann das Gen aus der cDNA-Bibliothek amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert und in einem heterologen Wirt exprimiert werden. Dies ist eine hilfreiche Vorgehensweise falls Screening-Strategien oder homologiebasierte Strategien nicht geeignet sind.
Ein anderer Ansatz, um ein Gen zu klonieren, besteht darin, eine DNA-Bibliothek zu durchsuchen. Dies ist eine besonders gute und schnelle Vorgehensweise, wenn eine Überexpression eines einzelnen Gens einen Phänotyp verursacht, der einfach zu detektieren ist. Da wir nun offenbart haben, dass die Transformation einer Xylose verwertenden Hefe mit Genen für die L-Arabinitol-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase die Fähigkeit zum Wachstum auf L-Arabinose verleiht, besteht eine andere Strategie zum Finden der Gene für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase in Folgendem: Eines der beiden Enzyme wird gereinigt, und das dazugehörige Gen wird kloniert. Nun sind alle Gene des Stoffwechselweges außer einem bekannt. In dieser Situation ist eine Screening- Strategie geeignet, um das letzte Gen des Stoffwechselweges zu finden. Ein Stamm mit allen Genen des Stoffwechselweges außer dem einen kann generiert werden, mit einer DNA-Bibliothek transformiert und auf ein Wachstum auf L-Arabinose hin untersucht werden. Bei dieser Vorgehensweise kann man erst die L-Arabinitol-4-Dehydrogenase reinigen und dann nach der L-Xylulose-Reduktase suchen oder erst die L-Xylulose-Reduktase reinigen und dann nach der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase suchen.
Es gibt andere Wege und Möglichkeiten, diese Gene zu klonieren:
Man kann beide Enzyme reinigen und die dazugehörigen Gene finden.
Man kann eine DNA-Bibliothek oder eine Kombination aus zwei DNA-Bibliotheken durchsuchen, um beide Gene gleichzeitig zu finden.
Man kann andere Suchverfahren nutzen, um die individuellen Gene zu finden.
Man könnte beispielsweise nach Wachstum auf L-Xylulose suchen, um die L-Xylulose-Reduktase zu finden, und danach nach Wachstum auf L-Arabinose oder L-Arabinitol, um nach L-Arabinitol-4-Dehydrogenase zu suchen.
Andere mögliche Suchverfahren könnten die Notwendigkeit von Co-Faktoren ausnutzen, z. B. könnte man unter Versuchsbedingungen, die tödlich sind, da NADPH entfernt wurde, nach der L-Xylulose-Reduktase in Gegenwart von Xylitol suchen.
Man kann bestehende Datenbanken nach Genen mit Homologien zu Genen von verwandten Proteinfamilien durchsuchen und untersuchen, ob diese die gewünschte Enzymaktivität codieren. Da wir nun die Sequenzen für die Gene offenbart haben, die L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (Sequenz-ID-Nr. 1) und L-Xylulose-Reduktase (Sequenz-ID-Nr. 2) codieren, ist es für einen Fachmann einfach, Datenbanken nach Genhomologien zu Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 zu durchsuchen. Homologe Gene können auch leicht durch technische Suchverfahren in DNA-Bibliotheken unter Nutzung von Sonden, die auf den Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 basierend, gefunden werden. Geeignete DNA-Bibliotheken beinhalten DNA, die aus Pilzen oder anderen Mikroben isoliert wurde, welche L-Arabinose oder L-Xylulose nutzen können.
Für den Fachmann gibt es verschiedene Wege, das Gen zu identifizieren, das für ein Protein mit der gewünschten Enzymaktivität codiert. Die hier beschriebenen Verfahren veranschaulichen unsere Erfindung, aber es können auch andere in der Fachwelt bekannte Verfahren genutzt werden.
Sobald alle Gene des L-Arabinose-Stoffwechselweges identifiziert wurden, kann dieser Stoffwechselweg in einen neuen Wirtsorganismus, dem dieser Stoffwechselweg fehlt, eingebracht werden. Es ist nicht immer nötig, alle Gene einzubringen. Es kann sein, dass im Wirtsorganismus bereits Teile des Stoffwechselweges vorliegen. Zum Beispiel benötigt eine Hefe, die D-Xylose verwerten kann, nur die Enzyme, die L-Arabinitol in Xylitol umwandeln. Die Expression von L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase wäre demnach ausreichend, um den L-Arabinose-Stoffwechselweg zu vervollständigen. Enzymtests für alle Stufen des pilzlichen Arabinose-Stoffwechselweges sind beschrieben worden (Witteveen et al., 1989), und diese können, falls notwendig, genutzt werden, um die fehlenden oder ineffizienten Schritte im jeweiligen Wirt identifizieren zu helfen.
Der L-Arabinose-Stoffwechselweg kann in S. cerevisiae eingebracht werden, um einen Stamm zu generieren, der ein guter Ethanolproduzent ist und die Pentosen L-Arabinose und D-Xylulose verwerten kann. In einem solchen Stamm können die am meisten vorkommenden Hexose- und Pentosezucker zu Ethanol fermentiert werden.
In den Beispielen 3 und 5 wurden die Gene in einen genetisch veränderten Laborstamm von S. cerevisiae kloniert. Der gleiche ansatz kann mit einem industriellen Stamm von S. cerevisiae, z. B. mit Bier-, Hochalkohol- oder Bäckerhefe, genutzt werden. Industrielle Hefen haben Verfahrensvorteile, wie hohe Ethanoltoleranz, Toleranz gegenüber anderen industriellen Belastungen und schnelle Fermentation. Sie sind meist polyploid, und ihre gentechnische Veränderung ist schwieriger im Vergleich zu Laborstämmen, aber Methoden zu ihrer gentechnischen Veränderung sind in der Fachwelt bekannt (man vergleiche z. B. Blomqvist et al., 1991; Henderson et al, 1985). Andere Hefen, die L-Arabinose nicht oder nur unzureichend verwerten können, könnten als Wirt genutzt werden, z. B. Schizosaccaromyces pombe oder Pichia spp., Candida spp., Pachysolen spp., Schwanniomyces spp., Arxula, spp., Trichosporon spp., Hansenula spp. oder Yarrowia spp..
In den Beispielen 3 und 5 wurde von uns ein TPI-Promotor von S. cerevisiae für die Expression von L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und der PGK-Promotor von S. cerevisiae für die Expression von L-Xylulose-Reduktase verwendet. Beide Promotoren werden als stark und konstitutiv erachtet. Andere Promotoren, die stärker oder weniger stark sind, können verwendet werden. Es ist auch nicht notwendig, einen konstitutiven Promotor zu verwenden. Induzierbare oder reprimierbare Promotoren können verwendet werden und haben möglicherweise Vorteile, zum Beispiel wenn eine sequentielle Fermentierung von unterschiedlichen Zuckern gewünscht wird.
In unserem Beispiel wurden zwei Plasmide für die beiden Gene der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase verwendet. Jedes Plasmid enthielt einen unterschiedlichen Selektionsmarker. Diese Gene können auch von einem einzelnen Plasmid mit oder ohne Selektionsmarker exprimiert werden, oder sie können in die Chromosomen integriert werden. Die Selektionsmarker wurden verwendet, um einfacher erfolgreiche Transformationen zu finden und um das genetische Konstrukt zu stabilisieren. Die Hefestämme wurden erfolgreich mit den verschiedenen Genen transformiert, und die Transformation in S. cerevisiae wurde mit dem Lithiumacetat-Verfahren durchgeführt (Gietz et al. 1992). Dies stellt nur ein Verfahren dar, um das gewünschte genetische Konstrukt zu erhalten. Alle benötigten Gene können gleichzeitig oder nacheinander transformiert werden Andere Transformationsverfahren sind in der Fachwelt bekannt, wobei einige für einen bestimmten Wirt bevorzugt werden, und sie können genutzt werden, um unsere Erfindung auszuführen.
In den Beispielen 2 und 4 sind die jeweiligen Nukleotidsequenzen (Sequenz-ID-Nr. 1 and 2) für T. reesei-Gene offenbart, die für die L-Arabinitol-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase codieren. Dies sind geeignete Gene zur Ausführung unserer Erfindung, wie in den Beispielen 5 und 6 offenbart ist. Es ist allgemein bekannt, dass Gene von verschiedenen Organismen, die für Enzyme mit der gleichen katalytischen Aktivität codieren, Sequenzähnlichkeiten aufweisen, und diese Ähnlichkeiten können von Fachleuten auf verschiedene Weise genutzt werden, um andere Gene von anderen Organismen mit der gleichen katalytischen Aktivität zu klonieren. Diese Gene sind ebenfalls zur Ausführung unserer Erfindung geeignet. Es ist auch allgemein bekannt, dass viele kleine Veränderungen in der Nukleotidsequenz eines Gens keine signifikante Änderung der katalytischen Eigenschaften des codierten Proteins bewirken. Beispielweise führen viele Änderungen in der Nukleotidsequenz nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des codierten Proteins, wobei viele Änderungen in der Aminosäuresequenz des codierten Proteins keine Veränderung der funktionellen Eigenschaften eines Proteins bewirken müssen, im Besonderen das Enzym nicht an der Ausführung seiner katalytischen Funktion hindern. Wir bezeichnen solche Variationen in der Nukleotidsequenz von DNA-Molekülen als "funktionell äquivalente Variationen", da sie keine signifikante Änderungen der Funktion des Gens, zum Codieren eines Proteins mit einer bestimmten Funktion, z. B. eine bestimmte Reaktion zu katalysieren, bewirken. DNA-Moleküle, die funktionell äquivalente Varianten der durch die Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 definierten Moleküle darstellen, können zur Ausführung unserer Erfindung verwendet werden.
Manchmal besitzen Organismen Gene, die unter für biotechnologisch Anwendungen günstigen Bedingungen nicht exprimiert werden. Obwohl beispielsweise früher generell angenommen wurde, dass S. cerevisiae keine Xylose verwerten kann, und daher erwartet wurde, dass S. cerevisiae keine Gene enthält, die für Enzyme codieren, die für eine Xylose-Verwertung befähigen würden, konnte dennoch gezeigt werden, dass S. cerevisiae diese Gene enthält (Richard et al., 1999). Allerdings werden diese Gene normalerweise nicht adäquat exprimiert. Daher besteht ein weiterer Aspekt unserer Erfindung darin, Gene für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase oder L-Xylulose-Reduktase oder beide in einem Wirtsorganismus selbst zu identifizieren und diese Gene im selben Organismus zur Expression zu veranlassen, und zwar unter Bedingungen, die für einen biotechnologischen Prozess wie beispielsweise die ethanolische Fermentation von L-Arabinose enthaltender Biomasse geeignet sind. Wir offenbaren ein Verfahren zur Identifizierung von Kandidaten für solche normalerweise nicht exprimierten Gene, welches darin besteht, nach Analogien zu den Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 zu suchen. Dieses Kandidatengen kann dann in einen Expressionsvektor kloniert und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, und zellfreie Extrakte aus dem Wirt können auf entsprechende katalytische Aktivität, wie in den Beispielen 1 und 6 beschrieben, untersucht werden. Wenn bestätigt wurde, dass das normalerweise nicht exprimierte oder inadäquat exprimierte Gen für das gewünschte Enzym codiert, kann das Gen danach zurück in den Originalorganismus kloniert werden, aber mit einem neuen Promotor, der eine Expression des Gens unter biotechnologisch geeigneten Bedingungen bewirkt. Dies kann auch durch gentechnische Veränderung des Promotors des Gens im intakten Organismus erfolgen.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung können nun die Gene, die L-Arabinitol-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase aus einem Pilz codieren, darunter solchen Pilzen wie filamentösen Pilzen, welche die Fähigkeit zur Verwertung von L-Arabinose aufweisen können, einfach durch Ähnlichkeiten zu den Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 identifiziert werden. Diese Gene können dann modifiziert werden, beispielweise durch Veränderung ihrer Promotoren zu stärkeren Promotoren oder Promotoren mit anderen Eigenschaften, um so die Fähigkeit des Organismus zur Verwertung von L-Arabinose zu verbessern.
Es ist möglich, dass eine Hefe nicht von Natur aus Enzyme aufweist, die für eine Milchsäureerzeugung benötigten werden, oder sie produziert möglicherweise ineffizient Milchsäure. In diesen Fällen kann die Expression des Gens, das für das Laktatdehydrogenase(LDH)-Enzym codiert, in der Hefe gesteigert oder verbessert werden, und eine Hefe kann danach Milchsäure effizienter produzieren (z. B. WO 99/14335 ). Analog kann mithilfe von in der Fachwelt bekannten Verfahren eine Hefe, die derart modifiziert wird, dass sie L-Arabinose effizienter verwertet, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, ferner auch dahingehend modifiziert werden, Milchsäure zu produzieren.
Die erfindungsgemäße transformierte Hefe kann dazu genutzt werden, Ethanol aus L-Arabinose zu produzieren. Eine Wirtshefe wird mit Genen für L-Arabinitol-4-Dehydrogenase, L-Xylulose-Reduktase oder beiden transformiert. Der Wirt kann jede Hefe ohne oder mit nur geringer Fähigkeit zur Verwertung von L-Arabinose, aber mit der Fähigkeit D-Xylose zu fermentieren, sein. Beispielsweise kann es ein Saccharomyces cerevisiae-Stamm sein, der mit Genen transformiert wurde, die die Fermentation von D-Xylose erlauben. Die Gene für die L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase können, wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben, aus T. reesei erhalten werden, aber auch andere Gene, die für Enzyme mit diesen katalytischen Aktivitäten codieren, können genutzt werden. Solche Gene lassen sich nun einfach finden, beispielsweise in Mikroorganismen, welche L-Arabinose verwerten können, da die Sequenzen, wie sie als Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 offenbart sind, auf verschiedene in der Fachwelt bekannte Weise ausgenutzt werden können, um ähnliche Gene zu klonieren. Die Verfahren, die zur Transformation der Wirtshefe und zur Selektion der Transformanden verwendet werden, können die gleichen wie in den Beispielen 3 und 5 verwendeten sein, aber auch andere in der Fachwelt bekannte Verfahren können erfolgreich angewendet werden, um eine transformierte Hefe gemäß unserer Erfindung bereitzustellen.
Die transformierte Hefe wird dann genutzt, um eine Kohlenstoffquelle zu fermentieren, beispielsweise Biomasse, die landwirtschaftliche oder Forstprodukte und Abfallprodukte umfasst, die L-Arabinose und möglicherweise auch andere Pentosen oder andere fermentierbare Zucker enthalten. Die Vorbereitung der Kohlenstoffquelle zur Fermentation und die Fermentationsbedingungen können gleich denen sein, wie sie für eine Fermentation derselben Kohlenstoffquelle durch den Wirtspilz genutzt würden. Allerdings verbraucht die entsprechend der Erfindung transformierte Hefe mehr L-Arabinose als die Wirtshefe und produziert eine höhere Ausbeute an Ethanol aus Kohlenwasserstoffen insgesamt als der Wirtspilz. Dies ist in Beispiel 7 dargestellt. Es ist allgemein bekannt, dass die Fermentationsbedingungen, darunter die Vorbereitung der Kohlenstoffquelle, der Zusatz von Co-Substraten und anderen Nährstoffen und die Fermentationstemperatur, die Umwälzung, Gaszufuhr, Stickstoffzufuhr, pH-Kontrolle, die Menge an zugesetzten fermentierenden Organismen, in Abhängigkeit von der Art des Rohmaterials, das zu fermentieren ist, und dem fermentierenden Mikroorganismus, optimiert werden können. Daher kann die verbesserte Leistung der transformierten Hefe im Vergleich zur Wirtshefe durch Optimierung der Fermentationsbedingungen im Einklang mit sehr gut etablierten Prozessen der Verfahrenstechnik weiter verbessert werden.
Die Nutzung einer entsprechend der Erfindung transformierten Hefe zur Produktion von Ethanol aus Kohlenstoffquellen, die L-Arabinose und andere fermentierbare Zucker enthalten, hat mehrere industrielle Vorteile. Diese beinhalten eine höhere Ausbeute an Ethanol pro Tonne der Kohlenstoffquelle und eine höhere Konzentration von Ethanol im fermentierten Material, was in beiden Fällen zu einer Verringerung der Produktionskosten, beispielsweise für destillierten Ethanol zur Verwendung als Treibstoff, beiträgt. Weiterhin ist die Abwasserbelastung des Abfallmaterials aus der Fermentation geringer, da der Gehalt an L-Arabinose vermindert ist, wodurch ein saubereres Verfahren gegeben ist.
Lignozelluloses Ausgangsmaterial ist in der Natur reichlich vorhanden und bietet beides, erneuerbare und kostengünstige Kohlenstoffquellen für mikrobielle Verfahren. Arabinose beinhaltendes Ausgangsmaterial sind beispielsweise verschiedene Pektine und Hemizellulosen (wie Xylane), die Mischungen aus Hexosen und Pentosen (Xylose, Arabinose) beinhalten. Wertvolles Ausgangsmaterial umfasst Nebenprodukte aus der Papier- und Zellstoffindustrie, wie Ablauge und Holz-Hydrolysate sowie landwirtschaftliche Nebenprodukten wie Zuckerbagasse, Maiskolben, Maisfasern, Hafer, Weizen, Gerste- und Reishülsen und Stroh sowie Hydrolysate von diesen. Auch Arabanan- oder Galakturonsäure enthaltendes Material kann verwertet werden.
Beispiele
BEISPIEL 1
Reinigung und Amniosäuresequenzierung von L-Arabinitol-4-dehydrogenase:
Tricoderma reesei (Rut C-30) wurde in einem Medium aus 40 g/l L-Arabinose, 2 g/l Proteose-Pepton, 15 g/l KH₂PO₄, 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 0,6 g/l Mg₂SO₄ × 7 H₂O, 0,8 g/l CaCl₂ × 2H₂O und Spurenelementen (Mandels und Weber, 1969) bei 28°C, pH-Wert 4,0, und 30% gelöstem Sauerstoff in einem Fermenter (Chepmap CF2000) kultiviert. Die Fermentation wurde gestoppt, als die Konzentration von L-Arabinose bei 10 g/l lag. Die Zellen wurden mit einem Plastiknetzsieb geerntet und mit 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, gewaschen. 500 g der Biomasse wurden in flüssigem Stickstoff in Aliquoten zu 100 g eingefroren. Nach dem Auftauen und Ultraschall-Aufschluss mit einem Spitzen-Ultraschall-Aufschlussgerät wurde DTT bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und die Suspension zentrifugiert (Sorvall SS34, 40 min, 20000 U/min). Der Überstand wurde über Nacht gegen das 10fache Volumen des Puffers A (10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7, 5 mM DTT) dialysiert. Das Retentat wurde zentrifugiert (Sorvall SS34, 40 min, 20000 U/min). Alle Schritte wurden bei 4°C ausgeführt. Der Rohextrakt hatte einen Proteingehalt von 7 g/l und eine L-Arabinitol-Dehydrogenase-Aktivität von 0,7 nkat/mg extrahierten Proteins. 500 ml dieses Rohextraktes wurden auf eine Säule mit 200 ml DEAE geladen und mit einem linearen Gradienten von Puffer A nach Puffer A mit Zusatz von 100 mM NaCl eluiert. Die höchste Aktivität (16 nkat/mg, 5 mg/ml Protein) wurde bei rund 80 mM NaCl eluiert.
Die L-Arabinose-4-Dehydrogenase-Aktivität wurde gemessen durch Zugabe der Enzympräperation zu einem Puffer, der 100 mM TrisHCl, pH-Wert 9,0, 0,5 mM MgCl₂, 2 mM NAD enthielt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von L-Arabinitol (oder anderen Zucker, wenn spezifiziert) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gestartet. Die Aktivität wurde anhand der Änderung der NADH-Absorption bei 340 nm berechnet. Alle Enzymtests wurden bei 37°C in einem automatischen Analysator Cobas Mira (Roche) ausgeführt. Bei der Rückreaktion wurde die Aktivität durch Zugabe der Enzympräperation zu einem Puffer mit 200 mM NaPO₄, pH-Wert 7,0, 0,5 mM MgCl₂, 200 μM NADH und 2 mM L-Xylulose gemessen. Die Aktivität wurde anhand der Änderung der NADH-Absorption bei 340 nm berechnet.
Das teilweise gereinigte Enzym wurde auf Aktivität mit anderen Zuckern untersucht. Keine Aktivität konnte für D-Arabinitol gefunden werden. Eine Aktivität konnte für L-Arabinitol und Adonitol (Ribitol) gefunden werden. Die Aktivität für Ribitol betrug rund 80% der Aktivität, die für L-Arabinitol gefunden wurde. Es wurde keine Aktivität mit jeweiligen Zuckern festgestellt, wenn NADP als Co-Substrat verwendet wurde.
Bei der Rückreaktion mit L-Xylulose und NADH wurde eine Aktivität von 0,8 nkat/mg mit 2 mM L-Xylulose bei pH-Wert 7,0 festgestellt, im Vergleich zu 6,4 nkat/mg bei 10 mM L-Arabinitol und 5 nkat/mg bei 10 mM Adonitol (Ribitol).
600 μl der Fraktion mit der höchsten Aktivität nach der DEAE-Säule wurden danach einer Nativ-PAGE (12% Acrylamid, BioRad) unterzogen. Das Gel wurde dann in einer Zymogramfärbelösung aus 200 mM TrisHCl, pH-Wert 9,0, 100 mM L-Arabinitol, 0,25 mM Nitroblautetrazolium, 0,06 mM Phenazinmetosulfat und 1,5 mM NAD gefärbt.
Die einzige Bande, die nach der Färbung sichtbar wurde, wurde ausgeschnitten und über Nacht in 2 ml 100 mM TrisCl, pH-9,0, 0,1% SDS inkubiert. Danach wurde es auf etwa 80 μl mittels Centricon (Amicon) konzentriert.
Dies ergab eine fast reine Enzympräperation mit der Hauptbande bei der SDS-PAGE bei rund 38 kDa. Dieses Protein wurde dann für die Aminosäuresequenzierung des proteolytischen Verdaus genutzt. Die Resultate dieser Sequenzierung waren folgende:
Interne Peptidsequenzen der gereinigten L-Arabinitol-4-Dehydrogenase:

1: A T G A A I S V K P N I G V F T N P K
2: Y S N T P R
3: A F E T S A D P K
4: H D L W I S E A E P

BEISPIEL 2:
Klonierung der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase:
Klonierung eines Genfragmentes durch Nutzung der internen Aminosäuresequenzen:
Die internen Peptidsequenzen wurden genutzt, um degenerative Primer für die PCR zu entwickeln. Das Template in diesem ersten Ansatz war genomische DNA von Tricoderma reesei. Eine Sinnstrang-DNA-Sequenz korrespondierend zu dem Aminosäurefragment A T G A A I S V K P N I G V F T N P K (Primer 5384: ARCCIAAYATHGGIGTITTYACIAAYCC) und eine Gegenstrang-DNA-Sequenz korrespondierend zu dem Amniosäurefragment A F E T S A D P K (Primer 5285: GGRTCIGCIGAIGTYTCRAAIGC) wurden benutzt. Die PCR-Bedingungen waren: Denaturierung 30 s, 96°C, Annealing 30 s, die ersten beiden Male 37°C und danach 27-mal 42°C, Verlängerung 2 min bei 72°C, letzte Verlängerung 5 min bei 72°C. Diese Vorgehensweise ergab ein PCR-Produkt von rund einem 1 kb. Das resultierende Fragment von rund 1 kb wurde dann in einen TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert.
Dieses Konstrukt wurde danach für die Sequenzierung genutzt.
Die Sequenz des PCR-Produktes codierte auch für die beiden verbleibenden Peptidsequenzen (siehe 2).
Klonierung des N- und C-Terminus aus einer cDNA-Bibliothek:
Eine cDNA-Bibliothek in einem Hefeexpressionsvektor (Margolles-Clark et al., 1996) wurde genutzt, um die verbleibenden Teile des Gens zu klonieren. In diesem Expressionsvektor wird die cDNA zwischen dem PGK-Promotor und dem Terminator eingefügt. Um den Teil des Gens zu klonieren, der mit dem N-Terminus des Proteins korrespondiert, wurde eine PCR-Reaktion mit der cDNA-Bibliothek als Vorlage und einem Primer aus der PGK-Promotor-Region und einem Gegenstrang-Primer aus dem Genfragment der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase ausgeführt.

Primer aus der PGK-Promotor-Region: (Primer 4196: TCAAGTTCTTAGATGCTT)
Gegenstrang-Primer aus dem Genfragment: (Primer 5431: CCTTTCCTCCAAACTTGCTGG)

Der Teil des Gens, der mit dem C-Terminus des Proteins korrespondiert, wurde auf einem ähnlichen Weg kloniert, mit Primern aus dem Genfragment und einem Anti-Sense-Primer aus dem PGK-Terminator.

Gegenstrang-Primer aus der PGK-Terminator-Region: (Primer 3900: TAGCGTAAAGGATGGGG)
Primer aus dem Genfragment: (Primer 5430: CTGCATTGGGCCCATGAT)

Die PCR-Bedingungen waren wie oben bereits beschrieben, mit Ausnahme des Annealings, das 30-mal bei 50°C durchgeführt wurde.
Der N-Terminus ergab ein PCR-Produkt von rund 0,8 kb; der C-Terminus ergab ein PCR-Produkt von rund 0,9 kb. Die PCR-Produkte wurden in TOPO-Vektoren kloniert, und die resultierenden Vektoren wurden für die Sequenzierung genutzt.
Mit den Informationen über den C- und N-Terminus wurde dann der offene Leserahmen per PCR aus der cDNA-Bibliothek kloniert. Die Primer für den N-Terminus enthielt eine zusätzliche EcoRI-Restriktionsschnittstelle (Primer 5526: AGAATTCACCATGTCGCCTTCCGCAGTC). Der Primer für den C-Terminus enthielt eine zusätzliche BamHI-Restriktionsschnittstelle (Primer 5468: ACGGATCCTCTACCTGGTAGCACCTCA). Das Annealing bei der PCR wurde 30-mal bei 60,5°C durchgeführt. Ansonsten waren die Bedingungen wie oben beschrieben. Dies ergab ein Fragment von 1,1 kb, welches dann in einen TOPO-Vektor kloniert und für die Sequenzierung genutzt wurde.
Der Vergleich der aus genomischer DNA und cDNA abgeleiteten Sequenzen enthüllte ein Intron aus 69 Basenpaaren (siehe 2).
Der offene Leserahmen codiert für ein Protein mit 377 Aminosäuren und einem berechneten Molekulargewicht von 39806 g/mol.
BEISPIEL 3
Expression der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase in S. cerevisiae:
Aus dem TOPO-Vektor wurde das 1,1 kb große EcoRI, BamHI-Fragment in die entsprechenden Stellen des pYX242-Vektors (R & D Systems) ligiert. Der pYX242 ist ein Multikopien-Hefe-Expressionsvektor, mit einem Hefe-TPI-Promotor und LEU2 für die Selektion. Dieses Plasmid wurde dann in den S. cerevisiae-Stamm CEN.PK 2 (VW1b) transformiert. Die rekombinanten Hefezellen wurden auf Selektivmedium kultiviert. Die intrazellulären Proteine wurden dann aus den Hefezellen durch vortexen mit Glasperlen extrahiert. Der Extrakt wurde danach auf L-Arabinitol-Dehydrogenase-Aktivität analysiert. Wir fanden eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase-Aktivität von 0,2 bis 0,3 nkat pro mg extrahierten Proteins.
BEISPIEL 4
Suche nach der L-Xylulose-Reduktase:
Für die Suche nach einer L-Xylulose-Reduktase wurde ein S. cerevisiae-Stamm verwendet, welcher die Gene für Xylosereduktase (Aldosereduktase EC 1.1.1.21), L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (EC 1.1.1.12), D-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.9) und Xylulokinase (EC 2.7.1.17) enthielt. Die Aldosereduktase, D-Xylulose-Reduktase und Xylulokinase waren integriert. Dieser Stamm war so konstruiert, dass Uracil und Leucin immer noch zur Selektion verwendet werden konnten. Das Plasmid aus Beispiel 3 mit der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase auf einem Multikopien-Plasmid wurde in den Stamm mit der integrierten Aldosereduktase, D-Xylulose-Reduktase und Xylulokinase transformiert. In diesem Stamm war die Uracil-Auxotrophie immer noch für die Selektion vorhanden. Eine cDNA-Bibliothek aus T. reesei in einem Hefeexpressionsvektor mit Uracil- Marker (Margolles-Clark et al., 1996) wurde dann in diesen Stamm transformiert und auf Wachstum auf L-Arabinose hin untersucht. Für das Screening der Transformanden Wurden diese zuerst auf Glukoseplatten angezogen, mit Selektion. Rund 750000 Transformanden wurden dann auf Selektionsplatten mit 5% L-Arabinose als einziger Kohlenstoffquelle repliziert. Kolonien, die nach 2 bis 3 Wochen auftraten, wurden erneut auf L-Arabinose ausgestrichen. Die verbleibenden Kolonien wurden danach auf Glukose kultiviert und die Plasmide isoliert. Die Plasmide wurden in E. coli-Zellen transformiert. Da beide Plasmide, das Plasmid mit der L-Arabinitol-4-Dehydrogenase und das Plasmid aus der cDNA-Bibliothek, nur eine Ampicillin-Resistenz enthalten, nutzten wir eine Kolonie-PCR, um die E. coli mit dem Plasmid der cDNA-Bibliothek zu identifizieren. Zur Kolonie-PCR verwendeten wir Primer aus der PGK-Promotor- und -Terminator-Region. Aus 4 unabhängigen Klonen, welche im L-Arabinose-Screening auftraten, wurde ein PCR-Produkt von 0,9 kb erhalten. Die entsprechenden Plasmide wurden dann sequenziert. Die Sequenz der cDNA ist in 3 dargestellt. Der offene Leserahmen codiert für ein Protein mit 266 Aminosäuren und einer berechneten Molekülmasse von 28,428 Da.
BEISPIEL 5
Expression der L-Xylulose-Reduktase:
Der Expressionsvektor mit der L-Xylulose-Reduktase, der in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde verwendet. Er wurde in den Stamm, der ebenfalls in Beispiel 4 verwendet wurde, retransformiert, welcher die Gene für die Xylosereduktase (Aldosereduktase EC 1.1.1.21), L-Arabinitol-4-Dehydrogenase (EC 1.1.1.12), D-Xylulose-Reduktase (EC 1.1.1.9) und Xylulokinase (EC 2.7.1.17) enthielt. Als Kontrolle wurde der leere Klonierungsvektor pAJ401 anstatt des Vektors mit der L-Xylulose-Reduktase transformiert. Die Transformanden wurden zuerst auf D-Glukose-Platten kultiviert und danach auf Platten mit 5% L-Arabinose als alleiniger Kohlenstoffquelle ausgestrichen. Die Platten enthielten eine Kohlenstoffquelle und ein Selektivmedium ohne Uracil und Leucin, wie es für die Selektion erforderlich ist (Sherman et al., 1983). Auf den L-Arabinose-Platten tauchten nach 2 bis 4 Wochen Kolonien mit den Stämmen mit L-Xylulose-Reduktase auf, während keine Kolonien auf der Kontrolle auftraten.
BEISPIEL 6
Expression der L-Xylulose-Reduktase unter dem TPI-Promotor:
Die L-Xylulose-Reduktase wurde per PCR unter Verwendung des Vektors aus Beispiel 5 als Vorlage kloniert. Die Primer waren (LXR-Start EcoRI: GCCGAATTCATCATGCCTCAGCCTGTCCCCACCGCC) und (LXR-Stop HindIII: CGCCAAGCTTTTATCGTGTAGTGTAACCTCCGTCAATCAC). Die Bedingungen waren wie in Beispiel 2, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die bei 63°C lag. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und HindIII verdaut. Der Vektor pXY212 (R & D Systems), welcher einen Hefeexpressionsvektor mit einem TPI-Promotor darstellt und das URA3-Gen für die Selektion enthält, wurde mit EcoRI und HindIII verdaut. Das PCR-Produkt wurde dann in den Expressionsvektor ligiert. Der erhaltene Vektor wurde dann in den Hefestamm CEN.PK2 transformiert. Die rekombinanten Hefezellen wurden auf Selektivmedium kultiviert. Die intrazellulären Proteine wurden dann durch vortexen mit Glassperlen extrahiert. Danach wurde der Extrakt auf L-Xylulose-Reduktase-Aktivität analysiert. Die Aktivität wurde in einem Medium gemessen, welches 100 mM TrisHCl, pH-Wert 9,0, 1,6 M Xylitol und 2 mM MgCl₂ enthielt. 2 mM NADP (Endkonzentration) wurden als Startreagenz zugegeben. Die Aktivität wurde aus der Änderung der NADPH-Absorption bei 340 nm berechnet. Der Test erfolgte bei 37°C in einem automatischen Analysator Cobas Mira (Roche). Die Aktivität lag zwischen 2 und 5 nkat pro mg extrahierten Proteins.
BEISPIEL 7
L-Arabinose-Fermentation mit den rekombinanten Hefestämmen:
Ein Hefestamm, der alle Gene des L-Arabinose-Stoffwechselweges trägt, wurde hergestellt. Zu diesem Zweck wurde ein Stamm hergestellt, bei dem die Aldosereduktase und Xylitoldehydrogenase (Toivari et al., 2001) und die Xylulokinase (Richard et al., 2000) in die Chromosomen integriert waren und die L-Arabitol-Dehydrogenase und L-Xylulose-Reduktase von Plasmiden aus exprimiert wurden. Diese Plasmide sind in den Beispielen 3 und 6 beschrieben. Der resultierende Stamm, der alle Gene des L-Arabinose-Stoffwechselweges trägt, wurde H2651 genannt. Ein Kontrollstamm (H2652) wurde hergestellt, welcher gleich dem Stamm H2651 ist, mit der Ausnahme, dass er das leere Plasmid pYX212 anstatt des lxr1 enthaltenden Plasmids trug.
Die Fermentation wurde als Batch-Kultivierung in zwei separaten Fermentern ausgeführt, wobei dem der eine den Stamm H2651 und der andere den Stamm H2652 enthielt. Die Zellen wurden zuerst in Schüttelkolben auf Selektivmedien mit Glukose als Kohlenstoffquelle (SCD-leu-ura) bis zu einer OD₆₀₀ von ungefähr 8 angezogen, dann geerntet und in die Fermenter inokuliert und zwei Tage auf D-Glukose kultiviert. Nach zwei Tagen hatten die Zellen das gesamte aus der D-Glukose produzierte Ethanol verstoffwechselt. Danach wurde L-Arabinose zugegeben, und die Fermentation wechselte in den sauerstoffunabhängigen Stoffwechsel. Die OD₆₀₀ der Stämmen H2651 und H2652 nach L-Arabinose-Inokulation betrug 16,6 beziehungsweise 8,9. 4 zeigt, dass der Stamm H2651 in den ersten 50 Stunden der Kultivierung auf L-Arabinose mehr als 0,12 g/l Ethanol produzierte. In der gleichen Zeit war die Ethanolerzeugung durch den Kontrollstamm fast nicht detektierbar.
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SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung nützlicher Produkte aus L-Arabinose enthaltender Biomasse, unter Nutzung eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein genetisch modifizierter Hefepilz ist, der mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase codiert, oder mit einer DNA-Sequenz, die eine L-Xylulose-Reductase codiert, oder mit beiden DNA-Sequenzen, und dass das von dem modifizierten Hefepilz durch Umwandlung von L-Arabinose produzierte nützliche Produkt Ethanol oder Milchsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche die L-Arabinitol-4-Dehydrogenase codiert, Sequenz-ID-Nr. 1 oder eine äquivalente Variante dieser mit der gleichen katalytischen Aktivität ist, und dass die DNA-Sequenz, welche die L-Xylulose-Reductase codiert, Sequenz-ID-Nr. 2 oder eine äquivalente Variante dieser mit der gleichen katalytischen Aktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Hefepilz ein Stamm der Art Saccharomyces, der Art Schizosaccharomyces, der Art Kluveromyces, der Art Pichia, der Art Candida oder der Art Pachysolen ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm ein genetisch veränderter Stamm von S. cerevisiae ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Hefepilz ein Hefepilz ist, der vor der genetischen Modifikation in der Lage ist, D-Xylose zu nutzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt, das unter Nutzung des Hefepilzes produziert wird, Ethanol darstellt.
Verfahren zum Transformieren eines Hefepilzes, um dessen Fähigkeit zu steigern, L-Arabinose zu nutzen und L-Arabinose in Ethanol und Milchsäure umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: – Auswählen eines Hefepilzes; – falls notwendig, Identifizieren der fehlenden oder ineffizienten Schritte des L-Arabinose-Stoffwechselweges in dem Hefepilz; – Transformieren des Hefepilzes mit einer DNA-Sequenz, die eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase codiert, oder mit einer DNA-Sequenz, die eine L-Xylulose-Reductase codiert, oder mit beiden DNA-Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, welche die L-Arabinitol-4-Dehydrogenase codiert, Sequenz-ID-Nr. 1 oder eine äquivalente Variante dieser mit der gleichen katalytischen Aktivität ist, und dass die DNA-Sequenz, welche die L-Xylulose-Reductase codiert, Sequenz-ID-Nr. 2 oder eine äquivalente Variante dieser mit der gleichen katalytischen Aktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefepilz ein Stamm der Art Saccharomyces, der Art Schizosaccharomyces, der Art Kluveromyces, der Art Pichia, der Art Candida oder der Art Pachysolen ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm ein genetisch veränderter Stamm von S. cerevisiae ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hefepilz ausgewählt wird, der in der Lage ist, D-Xylose zu nutzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil des L-Arabinose-Stoffwechselweges in dem Hefepilz durch das Transformieren des Hefepilzes vervollständigt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Identifizieren der fehlenden oder ineffizienten Schritte des L-Arabinose-Stoffwechselweges in dem Hefepilz; und – Transformieren des Hefepilzes, um den L-Arabinose-Stoffwechselweg zu vervollständigen, mit einer DNA-Sequenz, die eine L-Arabinitol-4-Dehydrogenase codiert, und/oder mit einer DNA-Sequenz, die eine L-Xylulose-Reductase codiert.