FI104636B - Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat - Google Patents

Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat Download PDF

Info

Publication number
FI104636B
FI104636B FI924461A FI924461A FI104636B FI 104636 B FI104636 B FI 104636B FI 924461 A FI924461 A FI 924461A FI 924461 A FI924461 A FI 924461A FI 104636 B FI104636 B FI 104636B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
xylose
xylitol
transformed
yeast
yeast strain
Prior art date
Application number
FI924461A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI924461A0 (fi
FI924461A (fi
Inventor
Heikki Ojamo
Merja Penttilae
Ulla Airaksinen
Sirkka Keraenen
Johan Hallborn
Mats Walfridsson
Baerbel Hahn-Haegerdal
Original Assignee
Xyrofin Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xyrofin Oy filed Critical Xyrofin Oy
Priority to FI924461A priority Critical patent/FI104636B/fi
Publication of FI924461A0 publication Critical patent/FI924461A0/fi
Publication of FI924461A publication Critical patent/FI924461A/fi
Priority to FI992153A priority patent/FI112250B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104636B publication Critical patent/FI104636B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

104636
Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymcjä koodaavia DNA-sckvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat . Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Tämä keksintö koskee erityisesti 5 uusia rekombinanttihiivakantoja, jotka on transformoitu ksyloosireduktaasi- ja/tai ksylitolidehydrogenaasi-entsyymien geeneillä. Hiivakanta, joka on transformoitu ksyloosireduktaasigeenillä, pystyy pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi ja on siten kykenevä tuottamaan ksylitolia in vivo. Jos molemmat näistä geeneistä transformoidaan hiivakantaan, tuloksena oleva kanta kykenee tuottamaan etanolia ksyloosia sisältävään 10 kasvualustaan fermentaation aikana.
Mainitut uudet hiivakannat pystyvät lisäksi ilmentämään kyseiset kaksi entsyymiä. Näiden kantojen tuottamaa ksyloosireduktaasia voidaan käyttää entsymaattisessa prosessissa ksylitolin tuottamiseksi in vitro.
15
Ksyloosia esiintyy runsain määrin luonnossa. Se voi muodostaa jopa 40 % lignosellu-loosamateriaalista (Ladisch et ai., 1983). Fermentoimalla ksyloosi voidaan muuttaa 20 etanoliksi, jota voidaan käyttää nestemäisenä polttoaineena tai kemiallisena raaka-aineena. Entsymaattisesti tai fermentoinnin sivutuotteena ksyloosi voidaan myös muuttaa ksylitoliksi, joka on lupaava luonnollinen makeutusaine, jolla on hammas-kariesta vähentäviä ominaisuuksia. Diabeetikot voivat myös käyttää ksylitolia. Etanolin tuottamisen kannalta, joka on halpa tuote, on tärkeätä, että raaka-aine voidaan 25 fermentoida suoraan niin vähäisellä esikäsittelyllä kuin mahdollista. Ihmisen käyttöön tarkoitetun ksylitolin tuotannossa on tärkeätä, että prosessiin osallistuvat GRAS-organismit.
« · · - - - ....
Luonnollisia ksyloosin käyttäjiä tavataan bakteerien, hiivojen ja sienten joukosta.
• 30 Kaikissa organismeissa ksyloosi muutetaan ksyluloosiksi, joka fosforyloidaan ksyluloosi-5-fosfaatiksi (X5P) ksylulokinaasin avulla. X5P etenee sen jälkeen Embden-Meyerhof-reitille (glykolyysi) pentoosi-fosfaatti-kiertorcitin kautta (shunt).
2 104636
Bakteerit kuten Escherichia coli. Bacillus sp., Streptomvces sp. ja Actinoplanes sp. muuttavat ksyloosin suoraan ksyluloosiksi ksyloosi-isomeraasin (XI) avulla. Siten bakteerit eivät tuota ksylitolia välituotteena, kun ne käyttävät ksyloosia. Ne bakteerit, jotka fermentoivat ksyloosia etanoliksi, tekevät niin huonoilla saannoilla, koska 5 samalla muodostuu lukuisia sivutuotteita (Skoog ja Hahn-Hägerdal, 1988). Ksyloosia käyttävillä hiivoilla kuten Pichia stipitiksellä. Candida shehataella. ja Pachvsolen tannophiluksella tämä reaktio tapahtuu kahdessa vaiheessa: ksyloosi pelkistetään ensiksi ksylitoliksi ksyloosireduktaasin (XR) avulla, ja ksylitoli hapetetaan ksylitolide-hydrogenaasilla (XDH) ksyluloosiksi.
10
Ksyloosia käyttävät hiivat kuten E. stipitis. £. shehatae ja E- tannophilus (Slininger et ai., 1987; Prior et ai., 1989) fermentoivat puhtaita ksyloosiliuoksia korkeilla saannoilla ja hyvillä tuottavuuksilla. Ne eivät kuitenkaan yleensä säily hengissä käsittelemättömästä raaka-aineesta johtuvassa torjuvassa ympäristössä, kuten esimerkiksi sul-15 fiittijäteliemessä tai fluorivedyllä esikäsitellyssä ja happohydrolysoidussa vehnän oljessa (Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989). Yksi poikkeus, E. tannophilus. tuottaa pääasiassa ksylitolia ja glyserolia vasteena tälle ympäristölle. Sellaisten raaka-aineiden fermentoimiseksi tehokkaasti ksyloosia käyttävien hiivojen avulla, kuten E· stipitiksel-lä, £. shehataella ja E. tannophiluksella. raaka-aineen on läpikäytävä kalliita 20 esikäsittelyjä ioninvaihtohartsien avulla (Clark ja Mackie, 1984) tai höyrystrippauksen avulla (Yu et ai., 1987).
Saccharomyces cerevisiae. leivinhiiva, fermentoi sulfiittijätelientä tai fluorivedyllä esikäsiteltyä ja happohydrolysoitua vehnän olkea etanoliksi (Linden ja Hahn-Hägerdal, 25 1989). S· cerevisiae ei kykene käyttämään ksyloosia tehokkaasti eikä voi kasvaa ksyloosi ainoana hiilenlähteenä. Bakteeriperäisen entsyymin, ksyloosi-isomeraasin, läsnäollessa, joka entsyymi muuttaa ksyloosin ksyluloosiksi, S· cerevisiae voi kuitenkin fermentoida sekä puhtaita ksyloosiliuoksia (Hahn-Hägerdal et ai., 1986) että käsittelemättömiä raaka-aineita (Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a,b) etanoliksi, 30 saantojen ja tuottavuuksien ollessa samaa suuruusluokkaa kuin heksoosifermentoin-neissa saadut. Samanlaisia tuloksia on saatu Schizosaccharomyces pombella (Lastick et ai., 1989). Sekä S· cerevisiaella että Sch. pombella on siten toimiva ksylu- 3 104636 lokinaasientsyymi. On myös havaittu, että S- cerevisiae voi kuluttaa ksyloosia (Batt et ai., 1986; van Zyl et ai., 1989; Senac ja Hahn-Hägerdal, 1990).
t
Gong (1985) esittää menetelmän etanolin saamiseksi suoraan D-ksyloosista ksyloosia 5 fermentoivien hiivamutanttien avulla. Gongin mukaan valitaan parentaali hiivakanta (esim. Candida sp. tai Saccharomyces cerevisiae). jolla voi alun perin olla kyky käyttää D-ksyloosia, ja tämä parentaali kanta altistetaan sen jälkeen esim. UV-säteilylle mutaation indusoimiseksi. Viitteessä ei kuitenkaan anneta mitään tietoa syystä, miksi saadut mutantit kykenevät käyttämään ksyloosia. Lisäksi, Gong ei 10 siirtänyt uusia koodittavia ja/tai sääteleviä sekvenssejä mainittuihin kantoihin geenitekniikan avulla ksyloosifermentaation tehostamiseksi.
Ksylitolia valmistetaan teollisesti tällä hetkellä hemiselluloosahydrolysaattien kemiallisen pelkistämisen kautta. Pelkistysvaiheessa käytettävän kalliin katalysaattorin 15 myrkyttyminen ja lopputuotteesta vaikeasti erotettavien sivutuotteiden muodostuminen ovat tämän menetelmän pääongelmia.
Kirjallisuudessa on lukuisia esimerkkejä mikrobiologisista menetelmistä ksylitolin tuottamiseksi puhtaasta ksyloosista (esim. Onishi ja Suzuki, 1966; Barbosa et ai., 20 1988). Parhaat tuottajat tässä menetelmässä ovat hiivoja, jotka kuuluvat erityisesti
Candida-sukuun. Myös jotkut bakteerit kuten Enterobacter (Yoshitake et ai., 1973a) ja Corynebacterium-lajit (Yoshitake et ai., 1973b) ja jotkut homeet esim. Penicillium chrvsogenum (Chiang ja Knight, 1960) tuottavat ksylitolia puhtaasta ksyloosista.
25 Mikrobiologisessa menetelmässä (Ojamo et ai., 1987), Candida guilliermondii -hiivaa viljellään tarkasti säädellyssä ilmastuksessa ksyloosia sisältävässä alustassa joko panos- (batch) tai panossyöttöprosessina (fed-batch). Ksylitolisaannoiksi saatiin 50-65 %. Saantoa voitiin lisätä 76 %:iin lisäämällä furfuraldehydiä viljelyalustaan.
30 Candida pelliculosan (ksyloosireduktaasi) ja Methanobacterium sp.:n (hydrogenaasi, F420, NADP, F42(/NADP-oksidoreduktaasi) soluvapaita uutteita on käytetty ksylitolin tuottamiseksi membraanireaktorissa konversion ollessa 90 % (Kitpreechavanich, 4 104636 1985). Corynebacterium-lajin soluvapaalla uutteella on saatu 69 %:n konversio, kun 6-fosfoglukonaattia käytettiin kofaktorin regeneroimiseksi.
On osoitettu, että B- megateriumin glukoosidehydrogenaasilla on sopivia ominai-5 suuksia NADPH:ta regeneroivana entsyyminä (Kulbe et ai., 1987). Glukonihappoa voidaan siten tuottaa glukoosista samassa entsymaattiscssa prosessissa kuin ksylitolia. Entsyymien ja kofaktorin pidättämiseksi voidaan käyttää ultrasuodatusmembraaneja. Kofaktorin retentio voidaan saada aikaan käyttämällä kofaktorijohdannaista, jonka molekyylipaino on riittävän suuri retention kannalta (Kulbe et ai., 1987) tai paremmin 10 käytettäessä negatiivisesti varattuja ultrasuodatusmembraaneja (Kulbe et ai., 1989).
Mieltymys entsymaattisen menetelmän käyttöön perustuu mahdollisuuteen käyttää epäpuhtaita ksyloosia sisältäviä raaka-aineita, jotka mikrobiologisissa menetelmissä inhiboisivat käytettävän mikrobin aineenvaihduntaa. Ksylitolisaannot ovat myös 15 korkeampia kuin mikrobiologisissa menetelmissä käytettäessä luonnollisia kantoja. Toisaalta mikä tahansa mikrobiologinen menetelmä on yksinkertaisempi suurimittaisessa toiminnassa tällä hetkellä.
Luonnolliset ksyloosia hyväksikäyttävät hiivat kuten E. stipitis, Candida sp. ja E. 20 tannophilus eivät ole sopivia etanolin eivätkä ksylitolin tuotantoon useasta syystä. Fermentointi etanoliksi edellyttää raaka-aineen esikäsittelyä, mikä on kustannusten kannalta liikaa halvalle lopputuotteelle kuten etanoli. Näiltä lajeilta puuttuu myös GRAS-status. Ksyloosin hyväksikäyttö perustuisi siten sopivimmin leivinhiivan käyttöön, jolla on GRAS-status.
25 S- cercvisiaen muokkaamiseksi tehokkaaksi ksyloosin käyttäjäksi ksylitolin ja etanolin tuottamista varten, tehokas entsyymisysteemi ksyloosin muuntamiseksi ksylitoliksi ja ksyluloosiksi tulisi siirtää tähän hiivaan. Etanolin tuottamiseksi ksyloosista, XI-geenit E- colista (Sarthy et ai., 1987), B- subtiliksesta ja Actinoplanes missouriensiksestä 30 (Amore et ai., 1989) on kloonattu ja transformoitu S- cerevisiaehen. S- cerevisiaessä valmistetulla XI-proteiinilla oli hyvin alhainen (1/1000 bakteereissa tuotetusta entsyymistä) tai ei yhtään entsymaattista aktiivisuutta. Joistakin syistä johtuen 5 104636 bakteerientsyymiä ei siis voi tehdä toimivaksi hiivassa. Toinen mahdollisuus olisi siirtää S. cerevisiaehen XR- ja XDH-geenit toisesta hiivasta. E. stipitiksen entsyymien pitäisi olla hyviä ehdokkaita puhtaiden ksyloosiliuosten käytön valossa, jota edellä on käsitelty. Voidaan ennustaa, että toisen hiivan entsyymit toimisivat paremmin kuin 5 bakteeriperäiset entsyymit, kun niitä ilmennetään hiivassa. Ksylitolia ja etanolia voitaisiin lisäksi tuottaa samalla systeemillä, ja systeemissä yhdistyisivät E. stipitiksen hyvä ksyloosin käyttö S. cerevisiaen inhibitioresistenssin ja yleisen hyväksyttävyyden kanssa.
10 Tässä keksinnössä kuvataan ksyloosireduktaasia (XR) ja ksylitolidchydrogenaasia (XDH) koodatavien geenien eristäminen tietyistä hiivoista, joilla on nämä geenit, geenien karakterisointi ja geenien siirto ja ilmentäminen Saccharomvces cerevisiaessä.
Tämän keksinnön mukaisesti esitetään siten uusia rekombinanttihiivakantoja, jotka 15 ilmentävät ksyloosireduktaasi- ja/tai ksylitolidehydrogenaasientsyymejä.
XR-geenillä transformoidut keksinnön mukaiset hiivakannat kykenevät pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi in vivo. Keksinnön mukaisten uusien hiivakantojen tuottamaa ksyloosireduktaasia käytetään myös entsymaattisessa prosessissa ksylitolin tuot-20 tamiseksi in vitro.
Tässä keksinnössä esitetään edelleen uusia hiivakantoja, jotka on transformoitu kummallakin edellä määritellyllä kahdella geenillä. Näiden geenien yhteisilmentyminen antaa kannalle kyvyn fermentoida ksyloosia etanoliksi puhtaasta ksyloosiliuoksesta tai 25 ksyloosia sisältävistä liuoksista, kuten lignoselluloosahydrolysaateista.
Lyhyt kuvaus piirustuksista ’ Kuvio 1 esittää ksyloosireduktaasigeeniä integroituna pMA91:een ja pRS305:een, 30 jolloin saadaan plasmidit pUA103 ja vastaavasti pUA107.
Kuvio 2 esittää XDH-positiivisen λgtll-klooπin aktiivisuusmaljamääritystä 6 104636
Kuvio 3 on kuva xdh-geenin sisältävästä plasmidista pJHXDH50
Kuvio 4 esittää XDH:ta tuottavan S. cerevisiae -yhdistelmäkannan VTT-C-91181 5 aktiivisuusmaijamääritystäalkuperäisellätransformointimaljalla(A)jayksittäisinä tästä transformantista saatuina pesäkkeinä (B).
Kuvio 5 esittää ksyloosireduktaasin ekspressiokasettia, jonka vieressä on ribosomaa-lisia sekvenssejä integroituna BS+:aan, jolloin saadaan vektori pJHXR22.
10
Kuvio 6 esittää XR:n Westem-analyysiä, kun se on tuotettu S.cerevisiaella seuraavilla plasmideilla, tai P. stipitiksellä. Kaistat: 1 molekyylipainostandardit (LMW, Pharmacia); 2 pRS305; 3 pUA107; 4 tyhjä kaista 5 pMA91; 6 pUA103; 7 puhdistettu XR-entsyymi; 8 LMW; 9 Pichia stipitis. Kaistoja 2, 3, 5, 6 ja 9 varten näytteet 15 otettiin French press -solulysaatcista.
Kuvio 7 esittää pUAI03:11a ja pUA107:Ilä transformoitujen S. cerevisiae -kantojen XR-aktiivisuutta, käyttäen kofaktorina joko NADH:ta tai NADPHrta, ja vektorin pRS305 tai pMA91:n sisältävien kontrollikantojen XR-aktiivisuutta 20
Kuvio 8 esittää ksylitolidehydrogenaasigeeniä integroituna pKB102:een, jolloin , - - saadaan plasmidi pJHXDH60.
Ksyloosireduktaasi- (xrd) ja ksylitolidehydrogenaasi (xdh) -geenit, joita käytetään 2 5 tämän keksinnön mukaisesti, eristetään hiivasta, joka sisältää nämä geenit, esim. Pichia stipitiksestä. Myös muita sopivia hiivoja ja muita sieniä, kuten Pachvsolen tannophi-lusts, Kluyvgromyccs spp., Petromyces albertensis ja Candida spp. voidaan käyttää.
Näillä geeneillä transformoitava hiiva voi olla mikä tahansa hiiva, ksylitolituotantoa 30 ajatellen mieluiten sellainen, jolla on GRAS-status, esim. jokin Saccharomvces cerevisiae -hiivakanta (esim. DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15Ba, VTT-A-63015, VTT-A-85068, VTT-C-79093), jokin Kluyveromyces sp. tai Schizosaccharomyces 7 104636 ! pombc. Geenien transformointi näihin hiivoihin voidaan saada aikaan esimerkiksi käyttämällä tavanomaisia näille organismeille kuvattuja menetelmiä. On huomattava, että myös Pichia itse voidaan transformoida näillä geeneillä, jotta saataisiin aikaan näiden geenien lisääntynyt tai muuttunut ekspressio. Saccharomvces cerevisiae -kannat 5 ovat edullisia tämän keksinnön tarkoituksiin.
DNA-sckvenssi, joka koodittaa XR-entsyymiä, eristetään £. stipitiksestä tavanomaisilla menetelmillä. cDNA-syntetisoidaan mRNArsta ja kloonataan Xgtll-vektoriin.
Käyttäen immunologista seulontaa XR-spesifisten vasta-aineiden avulla, positiiviset 10 kloonit eristetään ja subkloonataan BS+-vektoriin sekvensointia varten. E. stipitiksen XR:ää koodittava geeni voidaan kloonata myös ekspressoimalla S- cerevisiaessa. koska se ci sisällä lainkaan introneita. Toinen mahdollisuus on käyttää oligonukleotideja, jotka on laadittu entsyymin aminohapposekvenssin perusteella, geenipankin hybridisaatiossa.
15
Plasmidin konstruoimiseksi, joka on sopiva transformoitavaksi hiivaan, XR:ää koodittava geeni kloonataan sopivaan hiivan ekspressiovektoriin, kuten pMA91:een (Mellor et ai., 1983), joka sisältää sopivat hiivan säätelyalueet. Näitä säätelyalueita voidaan saada hiivageeneistä, kuten esimerkiksi PGK1, ADH1, GAL1, GAL10, CUP1, 20 GAP, CYC1 ja PH05. Vaihtoehtoisesti myös XR:ää koodittavaa Pichia-geeniä voidaan käyttää geenin ekspressoimiseksi S- cerevisiaessa. XR:ää koodittava plasmidi, joka • sisältää xrrf-geenin, kykenee itsenäisesti replikoituinaan transformoituna vastaanotta vaan hiivakantaan. XR:ää koodittava geeni voidaan myös kloonata yhtenä kopiona esiintyvään hiivavektoriin, kuten pRS305:een (Sikorski ja Hieter, 1989).
25 XR:ää koodittava geeni voidaan vaihtoehtoisesti liittää myös hiivan kromosomiin, ~ ribosomaaliseen RNA-lokuksecn. Tätä tarkoitusta varten sopivan plasmidin, esim.
plasmidin pIRL9, ribosomaaliset sekvenssit irrotetaan ja kloonataan sopivasti BS+-vektoriin. XR:ää koodittava geeni, kytkettynä sopivien hiivan promoottori- ja 30 terminaattorialueiden väliin, irrotetaan hybridivektorista, joka sisältää geenin ja kloonataan aikaisemmassa vaiheessa saatuun plasmidiin. Ekspressiokasetti, jonka vieressä molemmilla puolilla on ribosomaalisia sekvenssejä, voidaan irrottaa tästä 1046.36
O
tuloksena olevasta plasmidista. Tämä fragmentti transformoidaan hiivaan yhdessä itsenäisesti replikoituvan plasmidin kanssa, jossa on sopiva markkeri transformaatiota varten. Plasmidi voidaan jälkeenpäin poistaa soluista, jotka sisältävät xrd-geenin integroituna kromosomiin, viljelemällä soluja ei-selektiivisissä olosuhteissa. Tällä 5 tavalla voidaan saada rekombinanttikantoja, joissa ei ole lainkaan ylimääräistä vierasta DNA.ta, kuten bakteerista peräisin olevia vektorisekvenssejä. Jos käytetään poly-ploidista hiivakantaa, kuten VTT-A-63015:a, geeni voidaan integroida myös välttämättömään lokukseen, kuten PGK1- tai ,4D//7-fokukseen.
10 Tämän keksinnön kohteena on siten spesifinen ksyloosireduktaasigeeni. xrd-geenin sekvenssi voidaan määrittää sen sisältävistä plasmideista käyttämällä esim. kaksijuos-teista dideoksinukleotidisekvensointimenetelmää (Zagursky et ai, 1986). E. stipitiksen XR:ää koodittavan *rd-geenin sekvenssi annetaan Sekv. n:o 2:na.
15 Tämän keksinnön toisena kohteena ovat spesifiset hiivavektorit, jotka sisältävät xrd-geenin. Sellainen vektori on joko itsenäisesti replikoituva useana kopiona tai yhtenä kopiona esiintyvä plasmidi tai vektori, joka pystyy integroitumaan hiivan kromosomiin, kuten edellä on kuvattu.
20 Vielä eräänä tämän keksinnön kohteena ovat hiivakannat, jotka sisältävät XR:ää koodittavan DNA-sekvenssin ja kykenevät ilmentämään tätä entsyymiä.
Näinollen esitetään myös menetelmä ksyloosireduktaasientsyymin tuottamiseksi. Tässä menetelmässä: 25 (a) ksyloosireduktaasia koodittava DNA-sekvenssi eristetään sopivasta luovuttajaorganismista; (b) konstruoidaan mainitun DNA-sekvenssin sisältävä hiivavektori; (c) transformoidaan saatu vektori sopivaan hiivaisäntään rekombinantti-isäntäkannan saamiseksi; 30 (d) viljellään mainittua rekombinantti-isäntäkantaa olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun ksyloosireduktaasin ilmentämisen; ja (e) otetaan talteen mainittu ksyloosireduktaasi.
g 104636
Ksylitolin entsymaattiseen tuotantoon ovat edullisia entsyymit GRAS-statuksen omaavista organismeista. Pichiastipitiksen ksyloosireduktaasilla on erinomaiset entsy-maattiset ominaisuudet, kuten kineettiset vakiot ja pysyvyys ilman erityisiä stabiloivia 5 aineita kuten tiolia suojaavia kemikaaleja. Tämän entsyymin tuottaminen on nyt mahdollista hiivassa, jolla on GRAS-status. Transformoituja hiivasoluja viljellään sopivassa alustassa. Viljelyalustana voidaan käyttää halpaa alustaa kuten melassipoh-jaista alustaa, koska ksyloosia ei tarvita induktioon niin kuin luonnollisesti ksyloosia käyttävillä hiivoilla. Intrasellulaarista ksyloosireduktaasia sisältävää hiivaa muodostuu 10 hyvällä saannolla panossyöttöprosessissa (fed-batch).
Hiiva konsentroidaan ja pestään esim. sentrifugoimalla, ja ksyloosireduktaasi vapautetaan liuokseen solunhajotusmenetelmien avulla kuten korkeapainehomo-genisaatiolla tai lasihelmijauhatuksella. Suodattamalla tai sentrifugoimalla tapahtuvan 15 homogenaatin kirkastuksen jälkeen ksyloosireduktaasi puhdistetaan edelleen kromatografisilla menetelmillä.
Ksylitolin tuottamiseksi in vitro, puhdistettua ksyloosireduktaasia käytetään entsyymireaktorissa yhdessä kofaktorin kanssa (NAD/NADH tai NADP/NADPH) ja 20 kofaktoria regeneroivan entsyymin kanssa kuten glukoosidehydrogenaasin, formiaatti-dehydrogenaasin tai jonkin muun entsyymin kanssa, jolla on riittävän hyvä pysyvyys, — vaatimukset ympäristöolojen suhteen, jotka vastaavat ksyloosireduktaasin vaatimuksia, ja sopivat kineettiset ominaisuudet (Biickmann, 1979; Wandrey et ai, 1981; 1982;
Kulbe et ai., 1989). Entsyymejä ja kofaktoria pidätetään tavallisesti reaktorisysteemissä 2 5 ultrasuodatusmembraanien avulla, erityisesti negatiivisesti varautuneiden membraanien avulla. Kofaktorit voidaan myös immobilisoida yhdessä kofaktoria regeneroivien entsyymien kanssa (Reslow et ai., 1988). Reaktioseosta pumpataan reaktorin läpi, ja substraatit ja tuotteet suotautuvat membraanin läpi. Tuotteet voidaan erottaa Γ substraateista esim. kromatografisilla menetelmillä tai kiteytysmenetelmillä, ja subst-30 raatteja voidaan kierrättää uudelleen reaktioseokseen.
ίο 104636 Tämän keksinnön mukaisesti esitetään lisäksi mikrobiologinen menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, jossa menetelmässä (a) viljellään ksyloosireduktaasientsyymiä koodittavan DNA-sekvenssin sisältävää rekombinanttihiivakantaa ksyloosia sisältävässä alustassa; ja 5 (b) otetaan talteen alustassa muodostunut ksylitoli.
Mikrobiologisessa ksylitolituotannossa rekombinanttihiivalla, kofaktorin NADPH regenerointi in vivo on varmistettava tavalla tai toisella. Hiivakonstruktiolla, joka sisältää vain ksyloosireduktaasigeenin eikä ksylitolidehydrogenaasigeeniä, kofaktorin 10 regenerointi voidaan saada aikaan lisäämällä rinnakkaishiilisubstraattia kuten glukoosia, glyserolia, riboosia tai etanolia. Sellaisessa systeemissä voidaan ksyloosista saada 95-100 %:n ksylitolisaanto. Tällä systeemillä S. cerevisiaessa ksylitoli ei metaboloidu edelleen ja siten saadaan suurempia ksylitolisaantoja kuin luonnollisesti ksylitolia tuottavilla organismeilla. Kun hiiva sisältää myös ksylitolidehydro-15 genaasigeenin (ks. jäljempänä), kofaktorin regenerointi voi tapahtua vähäisen ksylitoli-virtauksen avulla jäljempänä aineenvaihdunnassa. Tätä virtausta voidaan kontrolloida ksyloosireduktaasi-jaksylitolidehydrogenaasientsyymiensuhteellistenekspressiomää-rien avulla tai kontrolloimalla hiivan aineenvaihduntaa hapensiirtonopeuden avulla tai lisäämällä viljelyalustaan entsyymi-inhibiittoreita, kuten jodiasetaattia.
20
Edullisessa suoritusmuodossa xdh-geenin eristämiseksi E. stipitiksestä kromosomaa-lincn geenipankki tehdään ensin E. coliin kosmidissa p3030 (Penttilä et ai, 1984) tai jossain muussa hiivavektorissa, ja rekombinanttiplasmidit eristetään ja transformoidaan hiivaan, xdh-geeni voidaan löytää sen hiivaekspression avulla, mikä voidaan ilmaista 25 aktiivisuusmaljamäärityksellä. Tämän geenin cDNA-kopio voidaan eristää samalla tavalla aktiivisuusmaljamäärityksellä E- coliin tehdystä Xgtll-cDNA:n ekspressiokir-jastosta.
Vaihtoehtoinen menetelmä xdh-geenin eristämiseksi E· stipitiksestä on puhdistaa 30 XDH-entsyymi donorihiivasta kromatografisilla menetelmillä ja määrittää sen N-ter-minaalinen aminohapposekvenssi. Voidaan konstruoida oligonukleotidiseos, joka perustuu saatuun XDH-proteiinin N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin. Tätä n 104636 oligonukleotidiseosta voidaan sitten käyttää geenipankin hybridisaatiossa tai yhdessä oligo-dT- alukkeenkanssaxdÄ-spesifistensekvenssien monistamiseksi PCR-reaktiolIa mRNA-populaatiosta. Tuloksena oleva geeni tai cDNA kloonataan BS+-vektoriin tai sen kaltaiseen vektoriin, ja xdh-geenin sekvenssi saadaan sitten tavanomaisilla 5 menetelmillä.
Tämän keksinnön kohteena on siten spesifinen ksylitolidehydrogenaasigeeni.
10 x<//i-geeni voidaan ekspressoida hiivassa kromosomaalisesta kopiosta, joka on kloonattu esimerkiksi hiivakosmidiin p3030 (Penttilä et ai, 1984). Tällaiseen hiivaan, joka sisältää xdh-geenin, voidaan transformoida xrd-geenin sisältävä plasmidi.
Täyspitkä xdh-cDNA voidaan myös kloonata sopivaan ekspressiovektoriin, kuten 15 pMA91:een tai pKB102:een (Blomqvist et ai, 1991) sopivien hiivan säätelyalueiden väliin, käyttäen edullisesti hiivan PGK1- tai ADH1-promoottoria ja -terminaattoria. :
Ekspressiokasetti, joka on liitetty pKB102:een, voidaan irrottaa tuloksena olevasta plasmidista ja kloonata itsenäisesti repii koituvaan hiivan useana kopiona esiintyvään vektoriin tai yhtenä kopiona esiintyvään hiivavektoriin, jotka sisältävät sopivan 20 markkerin, esim. URA3:n tai HIS3:n hiivan transformaatiota varten. Nämä tuloksena olevat plasmidit voidaan sitten transformoida sopiviin isäntäkantoihin tai kantoihin, jotka sisältävät geenin, joka koodittaa XR:ää.
xdh-geeni voidaan liittää myös hiivan genomiin samalla tavalla kuin edellä on 25 kuvailtu xrd-geen\n osalta.
• Tämän keksinnön kohteena on siten lisäksi menetelmä uusien hiivakantojen konstruoimiseksi, jotka kykenevät ilmentämään ksyloosireduktaasia tai ksylitolide-hydrogenaasia tai ilmentämään sekä ksyloosireduktaasia että ksylitolidehydrogenaasia, 30 jossa menetelmässä: (a)ksyloosireduktaasiajaksylitolidehydrogenaasiakoodittavatDNA-sekvenssit eristetään sopivasta luovuttajaorganismista; 104636 12 (b) konstruoidaan jomman kumman mainituista DNA-sekvensseistä sisältävä hiivavcktori; ja (c) transformoidaan jompi kumpi tai kumpikin saaduista vektoreista sopivaan hiivaisäntään.
5
Esillä olevan keksinnön kohteena on siten menetelmä aktiivisen ksyloosireduktaasin ja ksylitolidehydrogenaasin ilmentämiseksi rinnakkain hiivakannassa, jossa menetelmässä: (a) eristetään ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodittavat 10 DNA-sekvenssit sopivasta luovuttajaorganismista; (b) konstruoidaan hiivavektoreita, joista kukin sisältää yhden mainituista DNA-sekvensseistä; (c) transformoidaan saadut vektorit sopivaan isäntään rekombinanttihiivakannan saamiseksi; 15 (d) viljellään mainittua rekombinanttihiivakantaa ksyloosia sisältävässä alustassa; ja (e) eristetään ja puhdistetaan alustaan muodostuneet tuotteet (etanoli, ksylitoli, etikkahappo).
20 Tämän keksinnön mukaiset rekombinanttihiivakannat, jotka yhteisilmentävät ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä, ovat tehokkaita etanolin tuottajia, fermentoimalla ksyloosia sisältävän fraktion lignoselluloosahydrolysaateista, kuten metsäteollisuuden sivutuotteista, esim. sulfiittijäteliemestä, tai raaka-aineista, jotka on saatu esikäsittelyllä, ksyloosin saamiseksi käymiskelpoiseksi, käsittelemällä 25 kohonneissa lämpötiloissa kemikaalien kuten rikkidioksidin läsnäollessa tai niiden puuttuessa ja yhdessä happohydrolyysin tai entsymaattisen hydrolyysin kanssa. Ksyloosin kulutus ja tuotteiden muodostus (etanoli, ksylitoli, etikkahappo jne.) analysoidaan esim. HPLC:n avulla (Hahn-Hägerdal et ai., 1986; Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a ja b).
30 13 104636
Esimerkki 1
Ksyloosircduktaasin puhdistaminen Pichia stipitiksestä P. stipitistä viljeltiin 1 litran fermentorissa ksyloosia sisältävässä alustassa (0,3 % 5 hiivauutetta, 0,3 % mallasuutetta, 0,5 % peptonia, 1,9 % KH2P04:a, 0,3 % (NH4)2HP04:a, 0,1 % MgS04:a ja 5 % ksyloosia, pH 5) ja kerättiin talteen myöhäislogaritmisessa kasvuvaiheessa. 30 g märkäpainoista solumassaa hajotettiin käyttäen jäädytyspuristusta (X-puristin) ja sentrifugoitiin 1500 g, 10 min. ajan soluva-paan uutteen saamiseksi.
10
Raakauute väkevöitiin kaksinkertaisesti ja pantiin Sephadex G-200 (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) -pylvääseen (137 ml). Proteiinit eluoitiin virtausnopeudella 6 ml/h, ja fraktiot (9 ml), jotka sisälsivät XR-aktiivisuutta, kerättiin yhteen.
15 Yhtccnkoottu fraktio pantiin DEAE-Sepharose (Pharmacia) -pylvääseen (37 ml), joka 011 tasapainotettu 0,02 M ammoniumfosfaattipuskurilla pH 6,0, ja eluoitiin 250 ml:n gradientilla 0-0,5 M NaCka 0,02 M ammoniumfosfaattipuskurissa virtausnopeudella 12 ml/min. Fraktiot, jotka sisälsivät XR-aktiivisuutta, yhdistettiin (6 ml) ja väkevöitiin 1 mk.ksi. 1 ml väkevöityä näytettä sijoitettiin 1 mk.n HPLAC-kolonniin (cibacrom blue 20 F36-A; Perstorp Biolytica, Lund, Ruotsi), joka oli tasapainotettu 0,02 M ammonium fosfaattipuskurilla pH 6,0. XR:n eluointi suoritettiin 0-2 M NaCl-gradientilla ammoniumfosfaattipuskurissa virtausnopeudella 1 ml/min. XR-aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin (6 ml) ja dialysoitiin yli yön 4°C:ssa.
25 Puhtaus ja molekyylipaino määritettiin SDS-polyakryyliamidigradienttigeeli (T 8,8- 21,3 %, C 2,6 %)-elektroforeesilla (Laemmli, 1970) ja natiivilla polyakryyliamidi-, gradienttigeeli (Pharmacia esivalmisteltu geeli, 4/30) -elektroforeesilla (Pharmacian vertikaalielektroforeesisysteemi). Pharmacian pienimolekyylipainoisia ja suurimo-lekyylipainoisia standardeja käytettiin. Geelin värjäys suoritettiin 0,l%:isella 30 Coomassie Blue R-250:llä (Sigma) 25%:isessa metanolissa ja 10%:isessa etikkaha-possa. SDS-PAGE-geelissä ja natiivissa PAGE-geelissä XR-fraktio HPLACrn jälkeen ilmeni yksinkertaisena vyöhykkeenä (tuloksia ei ole esitetty). XR:n spesifinen 14 104636 värjäys zymogrammitekniikalla osoitti, että natiivin PAGE-geelin yksinkertainen vyöhyke oli XR:ää (tuloksia ei ole esitetty). Molekyylipainon estimointi SDS-PAGEdla (ks. kuvio 6) ja natiivilla PAGE:lIa osoitti molekyylipainoksi 38000 ± 1000 alayksikköjen osalta, ja 76000 ± 1000 natiivin proteiinin osalta.
5
Puhdistettua entsyymiä käytettiin polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja entsyymin N-terminaalisen aminohapposekvenssin valmistamiseksi (Marc Bauman, Lääketieteellisen kemian laitos, Helsingin Yliopisto) (Sekv. n:o 1).
10 Esimerkki 2
Pichia stipitikscn XR:ää koodittavan geenin kloonaus 1 litra E. stipitis -viljelmää kasvatettiin ksyloosia sisältävässä alustassa (esimerkki 1) ja kerättiin talteen myöhäisessä log-vaiheessa. Talteenotetut solut muutettiin 15 sferoplasteiksi Zymolyasem avulla, suspendoitiin 60 ml:aan GuSCN-liuosta, ja RNA eristettiin Chirgwinin et ai, (1979) mukaan. RNA ajettiin sen jälkeen oligo(dT)-selluloosa-affiniteettikromatografiakolonnin läpi. Poly (A+)(mRNA) eluoitiin alentamalla eluointipuskurin ionivahvuutta. cDNA:ta syntetisoitiin mRNA:sta käyttäen Amershamin cDNA-synteesipakkausta ja kloonattiin kgt 11-vektoriin käyttäen 20 Amershamin cDNA-kloonauspakkausta. 3-4 tunnin kasvatuksen jälkeen, plakit toistomaljattiin nitroselluloosamembraanille, joka oli kastettu IPTGrhen, ja inkuboitiin yli yön. Membraaneja käytettiin sen jälkeen transformanttien immunologiseen seulontaan (Young ja Davies, 1983) käyttäen kanin antiseerumia XR:ää vastaan ja vuohen anti-kani-vasta-aineita kytkettynä alkaliseen fosfataasiin. Positiiviset kloonit 25 poimittiin maljoilta, ja DNA-insertti monistettiin PCR:n avulla (Giissow ja Clackson, 1989) käyttäen vektorispesifisiä alukkeita. Saatuja DNA-fragmentteja käytettiin restriktioentsyymianalyysiin ja jatkokloonaukseen BamHI-katkaisun jälkeen BamHI-katkaistuun BS+ (Stratagene) -vektoriin. Pisin cDNA-klooni pJHXR20:stä sekvensoi-tiin käyttäen kaksijuosteista dideoksinukleotidimenetelmää (Zagursky et ai., 1986).
30 104636 15 XR:ää koodittavan täyspitkän cDNA:n kloonauksen varmistus saatiin vertailemalla proteiinin N-terminaalista aminohapposekvenssiä sekvensoituun geeniin (Sekv. n:o 1,
Sekv. n:o 2).
5 xrd-geenin kromosomaalinen kopio saatiin £. stipitiksestä CBS-6054 (Prior et ai, 1989) eristetyn kromosomaalisen kokonais-DNA:n PCR-reaktiolla (Cryer et ai, 1979) käyttäen alukkeita, jotka vastaavat koodittavan alueen 5'—päätä (GCGGATC-CTCTAGAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGG) ja 3’-päätä (TTGGATCCT-CTAGATTAGACGAAGATAGGAATCTTGTCCC), ja joissa on BamHI- ja Xbal-10 restriktiokohdat. PCR-tuote digestoitiin BamHIdlä ja kloonattiin plasmidiin pMA91 (Mellor et ai, 1983) Bglll-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pUA103 (Kuvio 1). Kromosomaalisen kopion DNA-sekvenssiä verrattiin plasmidin pJHXR20:n cDNA:n vastaavaan, ja havaittiin, että se ei sisältänyt introneita.
15 Esimerkki 3 XDH:n puhdistaminen Pichia stipitiksestä
Pichia stipitis -hiivaa kasvatettiin ksyloosia sisältävässä alustassa kuten esimerkissä 1 on kuvattu. 30 g märkäpainoista solumassaa hajotettiin käyttäen jäädytyspuristusta 20 (X-puristin) ja sentrifugoitiin 1500 g 10 min. Sentrifugoitu soluvapaa uute väkevöitiin kolminkertaisesti, ja 5 ml geelisuodatettiin virtausnopeudella 6 ml/h 137 ml Sepharose 6B -kolonnin läpi, joka oli tasapainotettu 0,05M ammoniumfosfaattipuskurilla, pH 6, ja sisälsi 25 % glyserolia, 1 mM DTTrtä, 1 mM EDTA:ta. Fraktiot, jotka sisälsivät XDH-aktiivisuutta, mitattuna Smileyn ja Bolenin mukaan (1982), koottiin yhteen ja 25 pantiin 37 ml ioninvaihtokromatografiapylvääseen (DEAE-sepharose), joka oli tasapainotettu 0,05 M ammoniumfosfaattipuskurilla, pH 6, ja sisälsi 25 % glyserolia, , 1 mM DTT:tä, 1 mM EDTArta. XDH-fraktiot eluoitiin 250 ml:lla 0-0,5 M NaCl- ^ suolagradienttia virtausnopeudella 12 ml/min. ja koottiin yhteen. Osittain puhdistettu entsyymi ajettiin polyakryyliamidigeelillä ja blotattiin PVD-membraanille. XDH:ta 30 vastaava vyöhyke leikattiin irti, ja N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin suoraan membraanista.
104636 16
Esimerkki Λ XDH:ta koodittavan geenin kloonaus ja ekspressio S- cerevisiaessa
Sama Xgtll cDNA-kirjasto kuin saatiin ja on kuvattu esimerkissä 2 maljattiin ja 5 toistomaljattiin nitroselluloosamembraanille, joka oli upotettu IPTG:hen ja inkuboitiin 3 tuntia. Membraaneja käytettiin sitten spesifisen XDH-aktiivisuuden (zymogrammi) seulomiseksi upottamalla membraanit 10 ml:aan zymogrammiliuosta (0,1 M fosfaattipuskuria pH 7,0, 1,5 mM NAD:tä, 0,25 mM nitroblue-tetrazoliumia, 65 μΜ fenatsiinimetosulfaattia, 0,4 M ksylitolia). Positiiviset kloonit (Kuvio 2) poimittiin 10 maljoilta ja kahden kloonin insertti-DNA:ta lisättiin PCR:llä Gussow ja Clackson, 1989)käyttäenvektorispesifisiäalukkeita(5'-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG, 5'-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG). Saadut DNA-fragmentit olivat samankokoiset ja niitä käytettiin restriktioentsyymianalyysissä ei-leikkaavien ja leikkaavien entsyymien tarkistamiseksi ja kloonauksessa edelleen BamHI:llä katkaisun 15 jälkeen BamHI:llä katkaistuun pSP72-vektoriin (Promega). Plasmidissa pJHXDH50 on pisin cDNA-klooni (Kuvio 3).
-geenin kromosomaalisen kopion kloonaamiseksi kromosomaalinen DNA eristettiin (Cryer et ai, 1979) E. stipitis -kannasta CBS-6054 (Prior et ai, 1989) ja leikattiin 20 osittain Sau3A:lla. 35-45 kb:n kokoiset fragmentit puhdistettiin fraktioimalla osittain katkottu DNA sakkaroosigradientissa (15 % - 40 %), ja fragmentit ligoitiin hiivan p3030 kosmidivektoriin (Penttilä et ai, 1984), joka oli leikattu BamHI:llä. Ligoidut molekyylit pakattiin λ-partikkeleihin käyttäen Amersham Ltd.:n (UK) in vitro -pakkauspakkausta ja transfektoitiin E- coli HB101:een (Maniatis et ai, 1982). 25 Rekombinanttikosmidi-DNA eristettiin noin 15000:sta saadusta yhdistetystä geenipankkikloonista ja transformoitiin S- cerevisiae -kantaan S150-2B (a, his3-dell, .. leu2-3, leu2-112, trpl-289, ura3-52, cir\ Gal+)(Baldari et ai, 1987) selektoimalla
HisMransformanttien suhteen Sc-his-maljoilla. Geenipankki toistomaljattiin nitroselluloosasuodattimille, solut hajotettiin inkuboimalla suodattimia 5 minuuttia 30 kloroformissa ja aktiivisuusmääritys suoritettiin kuten yllä on kuvattu Xgtll-kirjastolle. Saatiin useita positiivisia klooneja (kannat H494, H495, H496, H497 ja VTT-C-91181), ja kantaa VTT-C-91181 (Kuvio 4) käytettiin lisätutkimuksiin.
17 104636
Kannan VlT-C-91181 XDH-aktiivisuus testattiin Smileyn ja Bolenin (1982) menetelmällä French-puristimella saadusta kokonaissolulysaatista, joka sisälsi 25 % glyserolia. DNA VTT-C-9118l:stä eristettiin ja plasmidi pMW22 otettiin eroon 5 transformoimalla DNA E- fioli DH5a:aan.
S. cerevisiae -kanta VTT-C-91181, joka sisältää plasmidin pMW22, talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti talletusnumerolla NCYC 2352 National Collection of Yeast cultures (NCYC) -talletuslaitokseen, Iso-Britannia, maaliskuun 29. päivänä, 10 1991.
Esimerkki 5 XR:n ilmentäminen S- cerevisiaessa 15 XR:ää koodittava geeni PGK-geenin säätelyalueineen irrotettiin plasmidista pUA103 (esimerkki 2) Hindlllrlla ja kloonattiin yhtenä kopiona esiintyvän vektorin pRS305 (Sikorski ja Hieter, 1989) Hindlll-kohtaan. Saatu plasmidi pUA107 (Kuvio 1), jossa XR:ää koodittava geeni oli oikeassa orientaatiossa hiivan PCK-promoottoriin nähden, transformoitiin käyttäen LiCl-menetelmää (Ito et ai., 1983) ja selektoitiin Leu+-20 transformanttien suhteen, S- cerevisiae -kantoihin, S150-2B (ks. esimerkki 4) ja GPY55-l5Ba (leu2-3, leu2-112, ura3-52, trpl-289, his4-519, prbl, cir+), jolloin . saatiin uudet rekombinanttikannat, S- cerevisiae H481 ja vastaavasti S. cerevisiae H479. Kun plasmidi pUA103 transformoitiin kantoihin S150-2B ja GPY55-l5Ba, saatiin H477 ja vastaavasti H475.
25 XR:ää koodittava geeni integroitiin myös hiivan kromosomiin ribosomaalisiin RNA-, lokuksiin. Plasmidin pIRL9 ribosomaaliset sekvenssit irrotettiin EcoRIdlä, tehtiin tasapäisiksi ja kloonattiin BS+:n tasapäiseen Xbal-kohtaan, jolloin saatiin vektori pJHR21. XR:ää koodittava geeni, kytkettynä PGX-promoottorin ja -terminaattorin 30 väliin, irrotettiin vektorista pUA103 Hindlll-fragmenttina, tehtiin tasapäiseksi ja kloonattiin tasapäiseen Xbal-kohtaan plasmidin pJHR21 ribosomaalisiin sekvensseihin. Tästä tuloksena olevasta plasmidista pJHXR22 (kuvio 5) irrotettiin ekspressiokasetti, 18 104636 jonka vieressä molemmilla puolilla on ribosomaalinen sekvenssi, katkaisemalla BS+-polylinkkerin tunnusomaisissa restriktiokohdissa. Tämä fragmentti transformoitiin yhdessä itsenäisesti replikoituvan plasmidin kanssa, jossa on transformaatioon sopiva markkeri. Saadut transformantit seulottiin XR:ää koodittavan geenin läsnäolon suhteen 5 entsyymiaktiivisuuskokeilla, kuten yllä on kuvattu, ja integraatioinani tarkistettiin Southem-analyysillä. Itsenäisesti replikoituva plasmidi poistettiin soluista, jotka sisälsivät XR-ekspressiokasetin, viljelemällä soluja ei-selektiivisessä YDP-kasvu-alustassa.
10 Transformantteja kasvatettiin selektiivisessä minimaalialustassa, ja XR:n ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella, käyttäen XR-spcsifistä vasta-ainetta ja Promegan alkalinen fosfataasi -menetelmällä (Kuvio 6), ja French-puristimella rikottujen hiivasolujen raakauutteiden entsyymiaktiivisuusmäärityksillä (Smiley ja Bolen, 1989)(Kuva 7).
15 XR:n puhdistaminen rekombinantti- S· cerevisiaestä
Rekombinantti- S- cerevisiae -kantaa H477 viljeltiin 1,5 l:n fermentorissa Sc-leu-20 alustassa, joka sisälsi 20 g/1 glukoosia. Kasvua seurattiin turbiditeettimäärityksillä ja solut kerättiinmyöhäisessä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa sentrifugoimalla, pestiin
____ ja suspendoitiin uudelleen 0,1 M fosfaattipuskuriin, pH 7,0, joka sisälsi 1,5 mM
fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, hiivakonsentraatioon 100 g kuivapainoa/1. Solut hajotettiin ajamalla ne kolme kertaa 1000 baarissa suuripaineisen homogenisaattorin 25 (French press) läpi. Homogenaatti kirkastettiin osittain 30 minuutin sentrifugoinnilla 15 000 g:ssä. XR puhdistettiin kirkastetusta homogenaatista, kuten on esitetty £. stipitikselle esimerkissä 1.
19 104636
Esimerkki 7
Ksylitolin tuottaminen in vitro
Reaktioseos, joka sisälsi 0,33 M ksyloosia, 0,33 M glukoosi-6-fosfaattia, 0,67 mM 5 NADPH, 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,0), 1 nkat/ml XR-aktiivisuutta puhdistetusta XR:stä (Esimerkki 6) tai kannan H475 laimennetusta raakahomogenaatista, ja 1 nkat/ml glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia inkuboitiin 20 °C:ssa 5 tuntia. Näytteitä otettiin ajoittain ja analysoitiin ksylitolin suhteen käyttäen Boehringerin ksylitolitesti-pakkausta. Havaittiin vakaa ksylitolintuottonopeus, joka oli yli 0,14 g h-1!'1.
10
Esimerkki 8 XR:n ja XDH:n yhteisilmentäminen
Plasmidit pUA103 ja pUA107 transformoitiin kantaan V1 l -C-91181, joka sisältää 15 xdh-geenin plasmidissa pMW22. Transformantit selektoitiin Sc-leu-his-maljoilla ja jälkeenpäin pidettiin samoilla maljoilla. XDH-aktiivisuuden säilyminen varmistettiin malja-aktiivisuusmäärityksellä ja XR-aktiivisuus entsyymiaktiivisuusmäärityksellä, kuten edellä on kuvattu. Kahdelle edelleen tutkitulle kloonille, jotka sisälsivät plasmidit pUA103 ja pMW22, annettiin nimet H492 ja H493.
20 Täyspitkä*ifA-cDNA plasmidista pJHXDH50 kloonattiin Hindlll-kohdassa vektoriin . pKB102 (Blomqvist et ai., 1991) hiivan ADH1 -promoottorin ja -terminaattorin väliin.
Ekspressiokasetti irrotettiin tuloksena olevasta plasmidista pJHXDH60 (kuvio 8) ja kloonattiin itsenäisesti replikoituvaan hiivavektoriin p3030 BamHI-kohtaan, jolloin 25 syntyi plasmidi pJHXDH70. Tämä tuloksena oleva plasmidi transformoitiin kantaan H477, jotka sisälsi XR:ää koodittavan geenin (esimerkki 5), ja selektoitiin transfor-, mäntit Sc-leu-his-maljoilla. xdh-gecnin ekspressio S- cerevisiaessa testattiin cnt- syymiaktiivisuusmäärityksellä (Smiley ja Bolen, 1982). = 20 104636
Esimerkki 9
Ksylitolin tuotanto in vivo rekombinantti- S· cercvisiaen avulla
Hiivakantoja H475 ja H477 viljeltiin 1,5 l:n fermentorissa alustassa, joka sisälsi 10 g/1 5 hiivauutetta, 20 g/Ί bacto-peptonia ja 20 g/1 glukoosia. Viljelylämpötila oli 30 °C. pH:ta kontrolloitiin siten, että se oli välillä 4,5 - 8,0. Sekoitusnopcus oli 400 rpm ja ilmastusnopcus 0,5 vvm. Kun glukoosi oli käytetty, mikä testattiin analysoimalla kasvulieminäytteitä, aloitettiin liuoksen syöttö, jossa oli 1 g glukoosia ja 19 g ksyloosia 100 ml:ssa, nopeudella 0,09 ml/min. 83 tunnin kokonaisviljelyajan jälkeen 10 ksylitolikonsentraatio liemessä oli 12,5 g/1 analysoituna HPLCrllä. Siten saatiin yli 95 %:n ksylitolisaanto viljelmään syötetystä ksyloosista. Kun käytettiin kontrollikantaa, joka sisälsi vektorin pMA91, vähemmän kuin 8 % ksyloosista kului vastaavassa kokeessa.
Ksyloosifermentaatio S· cercvisiaen avulla
Esimerkissä 9 kuvattuja S· cerevisiae -kantoja H492 ja H493, viljeltiin kiertoravis-telijassa Sc-leu-his-alustassa, joka sisälsi 20 g/1 glukoosia. Kiertonopeus oli 200 rpm. 20 Kun sekä glukoosi että muodostunut etanoli oli kulutettu, kasvuliemiä käytettiin siirroksena kiertoravistelijafermentoinnissa Sc-leu-his-alustassa, joka sisälsi 20 g/1 ksyloosia. Ksyloosin kulutusta ja etanolin ja ksylitolin muodostusta seurattiin fermentoinnin aikana ottamalla näytteitä, jotka analysoitiin HPLC:n avulla (Hahn-Hägerdal et al.f 1986; Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a, b).
25
Esimerkki 11
Ksyloosia sisältävien raaka-aineiden fermentointi S- cerevisiaen avulla.
S. cerevisiae -kantoja H492 ja H493 viljeltiin kuten esimerkissä 10 on esitetty 30 fermentointialustassa, jossa ksyloosi oli korvattu sulfiittijäteliemellä. Ksyloosi muuttui soluiksi, etanoliksi ja ksylitoliksi.
21 104636
Viitejulkaisut
Amore, R., Wilhelm, M. ja Hollenberg, C.P. (1989) Appi. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357.
5
Baldari, C, Murray, J.A.H., Ghiara, P., Cesareni, G., ja Galotti, C.L. (1987) EMBO J. 6: 229-234.
Barbosa, M.F.S., de Medeira, M.B., de Mancilha, I.M., Schneider, H. ja Lee, H. 1988.
10 Screening of yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors which affect xylitol yield in Candida Guilliermondii. J. Ind. Microbiol. 3, 241-251.
Batt, C.A., Carvallo, S., Easson, D.D., Akedo, M. ja Sinskey, A.J. 1986. Metabolic pathway in Saccharomvces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering 28,549-553.
15
Bergmeyer, H.U., Gruber, W. ja Gutmann, I. (1974), Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., toim.) 2. painos, voi. 3, ss. 1323-1330, Verlag Chemie, Weinheim ja Academic Press, Inc., New York, London.
20 Blomqvist, K., Suihko, M.-L., Knowles, J. ja Penttilä, M. Chromosomal integration and expression of two bacterial α-acetolactate decarboxylase genes in brewer's yeast.
Toim. julkaistavaksi, 1991.
Biickmann, A.F. (1979) DE-patentti n:o 28.41.414.
25
Chiang, C. ja Knight, S.G. 1960. Metabolism of D-xylose by moulds. Nature 188, No.
4744, 79-81.
Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. ja Rutter, W.J. (1979) Isolation of 30 biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.
Clark, T.A. ja Mackie, K.L. (1984) J. Chem. Tech. Biotechnol. 34b: 101-110.
35 Cryer, D.R., Eccleshall, R. ja Marmur, J. (1975) Isolation of yeast DNA. Methods Cell 1
Biol. 12: 39-44.
Gong, C-S. (1985) US-patentti 4,511,656.
, , 40 Gussow, D. ja Clackson, T. (1989) Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17: 4000-.
‘ Hahn-Hägerdal, B., Berner, S. ja Skoog, K. 1986. Improved ethanol production from
xylose with glucose isomerase and Saccharomvces cerevisiae using the respiratory J
45 inhibitor azide. Appi. Microbiol. Biotechnol. 24, 287-293.
104636 22
Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. ja Kimura, A. (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bact. 153: 163-168.
Kitpreechavanich, V., Nishio, N., Hayashi, M. ja Nagai, S. 1985. Regeneration & 5 retention of NADP(H) for xylitol production in an ionized membrane reactor. Biotechnol. Lett. 7, 657-662.
Kulbe, K.D., Schwab, U. ja Gudematsch, W. 1987. Enzyme-catalyzed production of mannitol and gluconic acid. Ann. N.Y. Acad. Sci. 506, 552-568.
10
Kulbe, K.D., Howaldt, M.W., Schmidt, K., Röthig, T.R. ja Shmiel, H. 1989. Rejection and continuous regeneration of native coenzymes NAD(H)/NADP(H) in a charged ultrafiltration membrane enzyme reactor. Posteri 10. Enzyme Engineering-konferens-sissa 24-29.9.1989, Kashikojima, Japani.
15
Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M. ja Tsao, G.T. (1983) Enzyme Microb. Technol. 5: 82-102.
Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head 20 of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lastick, S.M., Tucker, M.Y., Beyette, J.R., Noll, G.R. ja Grohman, K. (1989) Appi. Microbiol. Biotechnol. 30: 574-579.
25 Linden, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1989a) Enzyme Microb. Technol. 11: 583-589.
Linden, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1989b) Biotechnol. Techniques 3: 189-192.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. (1982). Molecular cloning. A laboratory 30 manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T., Kingsman, A.J. ja Kingsman, S.M. (1983) Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomvces cerevisiae. Gene 24: 1-14.
35
Ojamo, H., Ylinen, L. ja Linko, M. (1987) FT-patentti 76377.
Onishi, H. ja Suzuki, T. (1966) The production of xylitol, L-arabinitol and ribitol by yeasts. Agr. Biol. Chcm. 30: 1139-1144.
- 40 : Penttilä, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. ja Knowles, J.K.C. 1984. Mol. Gen.
Genet. 194: 494-499.
Prior, B.A., Kilian, S.G. ja du Preez (1989) Process Biochemistry 2: 21-32.
Reslow, M., Adlercreutz, Mattiasson, B. (1988) Eur. J. Biochem. 177: 313-318.
45 104636 23
Sarthy, A.V., McConaughy, B.L., Lobo, Z., Sundström, J.A., Furlong, C.E. ja Hall, B.D. 1987. Expression of the E. coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae. Appi. Environ. Microbiol. 53, 1996-2000.
5 Scnac, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1990) Appi. Environ. Microbiol, (painossa)
Sikorski, R.S. ja Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122: 19-27.
10
Skoog K. ja Hahn-Hägerdal, B. (1988) Enzyme Microb. Technol. 10: 66-78.
Slininger, P.J., Bolen, O.L. ja Kurtzman, C.P. (1987) Enzyme Microb. Technol. 9: 5- 15.
15
Smiley, K.L. ja Bolen, P.L. (1982) Demonstration of D-xylose reductase and D-xylitol dehydrogenase in Pachvsolen tannophilus. Biotechnol. Lett. 4: 607.
Van Zyl, C, Prior, B.A., Kilian, S.G. ja Kock, J.L.F. 1989. D-xylose utilization by 20 Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 135, 2791-2798.
Wandrey, C., Wichmann, R., Leuchtenberger, W., Kula, M.-R. ja Buckmann, A.F.
(1981) US Patent No 4.304.858.
25 Wandrey, C., Wichmann, R., Leuchtenberger, W., Kula, M.-R. ja Buckmann, A.F.
(1982) US-patentti n:o 4,326,031.
Yoshitake, J., Shimamura, M. ja Imai, T. 1973a. Xylitol production by an Enterobacter species. Agr. Biol. Chem. 37, 2261-2267.
30
Yoshitake, J., Shimamura, M. ja Imai, T., 1973b. Xylitol production by a Corvnebac-terium species. Agr. Biol. Chem. 37, 2251-2259.
Young, R.A. ja Davies, R.W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes: isolation with 35 antibody probes. Science 222: 778-782.
Yu, S., Wayman, M. ja Parehk, S.R. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 1144-1150.
Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. ja Lomax, N. (1986) Rapid and easy . ^ 40 sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene
Anal. Techn. 2: 89-94.
104636 24
Talletetut mikro-organismit
Seuraava hiivakanta on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen 5 National Collection of Yeast Cultures (NCYC), AFRC Institute of Food Research, Norwich Laboratory, Colney Lane, Norwich, NR4 7UA, Iso-Britannia
Kanta Talletusnumero Talletuspäivä 10
Saccharomyces cerevisiae NCYC 2352 29.3.1991 VTT-C-91181, jossa on plasmidi pMW22 25 104636
Sekvenssit SEKV. N:0 1 5 SEKVENSSITYYPPI: Peptidi SEKVENSSIN PITUUS: 9 aminohappoa TOPOLOGIA: lineaarinen ALKUPERÄINEN LÄHDEORGANISMI: Pichia stipitis CBS-6054 VÄLITÖN KOELÄHDE: proteiinin puhdistus ja N-terminaalisekvcnsointi 10 YKSITYISKOHDAT: kypsän proteiinin aminohapot 1-9 OMINAISUUDET: ksyloosireduktaasientsyymin (NADPH/NADH) N-terminaalinen peptidi 15
Pro Xaa Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr » 26 1 0 4 6 3 6 SEKV. N:0 2 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi ja vastaava proteiini 5 SEKVENSSIN PITUUS: 954 emäsparia JUOSTEISUUS: yksijuosteinen TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: cDNA:sta mRNA:han, genominen DNA ALKUPERÄINEN LÄHDEORGANISMI: Pichia stipitis CBS-6054 10 VÄLITÖN KOELÄHDE: cDNA-kiijasto, PCR-tuote perimän DNA:sta YKSITYISKOHDAT: 1-954 bp, kypsä proteiini OMINAISUUDET: tuotteen ksyloosireduktaasi (NADPH/NADH) -aktiivisuus 104636 27 ATG CCT TCT ATT AAG TTG AAC TCT GGT TAC GAC ATG CCA GCC GTC 4 5
Met Pro Ser lie Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val 15 10 15 . GGT TTC GGC TGT TGG AAA GTC GAC GTC GAC ACC TGT TCT GAA CAG 90
Gly Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Clu Gin 20 25 30 ATC TAC CGT CCT ATC AAG ACC GGT TAC AGA TTG TTC GAC GGT GCC 135 • lie Tyr Arg Ala lie Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala 35 40 45 GAA GAT TAC GCC AAC GAA AAG TTA GTT GGT GCC GGT GTC AAG AAG 180
Glu Asp Tyr Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys 50 55 60 GCC ATT GAC GAA GGT ATC GTC AAG CGT GAA GAC TTG TTC CTT ACC 225
Ala Ile Asp Glu Gly He Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr 65 30 75 TCC AAG TTG TGG AAC AAC TAC CAC CAC CCA GAC AAC GTC GAA AAG 2 70
Ser Lys Leu Trp Asn Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys 80 85 90 GCC TTG AAC AGA ACC CTT TCT GAC TTG CAA GTT GAC TAC GTT GAC 315
Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ser Asp Leu Gin Val Asp Tyr Val Asp 95 100 105 TTG TTC TTG ATC CAC TTC CCA GTC ACC TTC AAG TTC GTT CCA TTA 3 60
Leu Phe Leu lie His Phe Pro Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu 110 115 120 GAA GAA AAG TAC CCA CCA GGA TTC TAC TGT GGT AAG GGT GAC AAC 4 05
Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn 125 130 135 TTC CAC TAC GAA GAT GTT CCA ATT TTA GAG ACC TGG AAG GCT CTT 450
Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro He Leu Glu Thr Trp Lys Ala Leu 140 145 150 GAA AAG TTG GTC AAG GCC GGT AAG ATC AGA TCT ATC GGT GTT TCT 4 95
Glu Lys Leu Vai Lys Ala Gly Lys He Arg Ser He Gly Val Ser 155 160 165 AAC TTC CCA GGT GCT TTG CTC TTG GAC TTG TTG AGA GGT GCT ACC 54 0
Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gly Ala Thr 170 175 180 ATC AAG CCA TCT GTC TTG CAA GTT GAA CAC CAC CCA TAC TTG CAA 585
He Lys Pro Ser Val Leu Gin Val Glu His His Pro Tyr Leu Gin 185 190 195 CAA CCA AGA TTG ATC GAA TTC GCT CAA TCC CGT GGT ATT GCT GTC 630
Gin Pro Arg Leu He Glu Phe Ala Gin Ser Arg Gly He Ala Val 200 205 210 ACC GCT TAC TCT TCG TTC GGT CCT CAA TCT TTC GTT GAA TTG AAC 67 5
Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gin Ser Phe Val Glu Leu Asn 215 220 225 CAA GGT AGA GCT TTG AAC ACT TCT CCA TTG TTC GAG AAC GAA ACT 7 20
Gin Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr 230 235 240 ATC AAG GCT ATC GCT GCT AAG CAC GGT AAG TCT CCA GCT CAA GTC 765
He Lys Ala lie Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gin Val ~ 245 250 255 TTG TTG AGA TGG TCT TCC CAA AGA GGC ATT GCC ATC ATT CCA AAG 810
Leu Leu Arg Trp Ser Ser Gin Arg Gly He Ala He He Pro Lys 260 265 270 TCC AAC ACT GTC CCA AGA TTG TTG GAA AAC AAG GAC GTC AAC AGC 855
Ser Asn Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser - 275 2B0 285 • TTC GAC TTG GAC GAA CAA GAT TTC GCT GAC ATT GCC AAG TTG GAC 900
Phe Asp Leu Asp Glu Gin Asp Phe Ala Asp He Ala Lys Leu Asp 290 295 300 ATC AAC TTG AGA TTC AAC GAC CCA TGG GAC TGG GAC AAG ATT CCT 94 5
He Asn Leu Arg Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys He Pro 305 310 315 ATC TTC GTC 954
He Phe Val

Claims (11)

104636 28 Patentti vaati mu kset
1. Menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että a) viljellään ksyloosia sisältävässä alustassa hiivakantaa, joka on transformoitu 5 ksyloosireduktaasientsyymiä koodittavalla DNA-sekvenssillä, joka transformoi tuna mainittuun hiivakantaan tekee siitä kyvykkään pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi ja b) muodostunut ksylitoli otetaan talteen alustasta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA- sekvenssi koodittaa polypeptidiä, joka sisältää olennaisesti Sekv.n:o 2:ssa esitetyn aminohapposekvenssin, tai sen osan, jolloin mainitulla polypeptidillä tai sen osalla on ksyloosireduktaasiaktiivisuutta.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transformoitu hiivakanta kuuluu lajeihin Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromy-ces spp., Schizosaccharomyces pombe tai Pichia spp.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai-20 nittu transformoitu hiivakanta kuuluu lajiin Saccharomyces cerevisiae. ... 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai nittu transformoitu hiivakanta on Saccharomyces cerevisiae H475 tai H477, jotka saadaan transformoimalla Saccharomyces cerevisiae GPY55-15Ba tai vastaavasti 25 S150-2B kuviossa 1 esitetyllä plasmidilla pUA103.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alustassa on ainakin yksi lisähii Ien lähde ksyloosireduktaasiaktiivisuuden tarvitseman kofakto-rin, joka on NADPH tai NADH, regeneration tehostamiseksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu lisähii-lenlähde on etanoli, glukoosi tai glyseroli. a 30 29 104636
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transformoitu hiivakanta lisäksi transformoidaan toisella DNA-sekvenssillä, joka mainitussa hiivakannassa ilmentää ksylitolidehydrogenaasientsyymiä, jolloin mainittu ksylitolidehydrogenaasientsyymi tekee mahdolliseksi ksyloosireduktaasiaktiivi- 5 suuden tarvitseman kofaktorin regeneration.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transformoitu hiivakanta kuuluu lajeihin Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe tai Pichia spp. 10
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transformoitu hiivakanta on Saccharomyces cerevisiae VTT-C-91181, joka sisältää plasmidin pMW22 (NCYC n:o 2352) ja joka lisäksi on transformoitu kuviossa 1 esitetyllä plasmidilla pUA103. 15
11. Entsymaattinen menetelmä ksylitolin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että a) viljellään rekombinanttihiivakantaa, joka on transformoitu ksyloosireduk-taasientsyymiä koodatavalla DNA-sekvenssillä, olosuhteissa, jotka sallivat mainitun ksyloosireduktaasin ilmentymisen, 20 b) otetaan talteen mainittu ksyloosireduktaasientsyymi, c) käytetään mainittua ksyloosireduktaasia entsyymireaktorissa, johon liittyy kofaktoria regeneroiva systeemi, ja d) eristetään ja puhdistetaan tuotettu ksylitoli. 25 w «i 30 104636
FI924461A 1990-04-06 1992-10-02 Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat FI104636B (fi)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI924461A FI104636B (fi) 1990-04-06 1992-10-02 Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat
FI992153A FI112250B (fi) 1991-04-08 1999-10-06 Menetelmä etanolin tuottamiseksi ja siihen soveltuvat rekombinanttihiivakannat

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI901771 1990-04-06
FI901771A FI901771A (fi) 1990-04-06 1990-04-06 Anvaendning av xylos hos hybridjaest.
US52777590A 1990-05-24 1990-05-24
US52777590 1990-05-24
PCT/FI1991/000103 WO1991015588A1 (en) 1990-04-06 1991-04-08 Recombinant yeasts containing the dna sequences coding for xylose reductase- and xylitol dehydrogenase enzymes
FI9100103 1991-04-08
FI924461 1992-10-02
FI924461A FI104636B (fi) 1990-04-06 1992-10-02 Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI924461A0 FI924461A0 (fi) 1992-10-02
FI924461A FI924461A (fi) 1992-10-02
FI104636B true FI104636B (fi) 2000-03-15

Family

ID=26158731

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI901771A FI901771A (fi) 1990-04-06 1990-04-06 Anvaendning av xylos hos hybridjaest.
FI924461A FI104636B (fi) 1990-04-06 1992-10-02 Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI901771A FI901771A (fi) 1990-04-06 1990-04-06 Anvaendning av xylos hos hybridjaest.

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0527758B1 (fi)
JP (1) JP3348215B2 (fi)
AT (1) ATE161886T1 (fi)
AU (1) AU647104B2 (fi)
CA (1) CA2090122C (fi)
DE (1) DE69128619T2 (fi)
DK (1) DK0527758T3 (fi)
ES (1) ES2113373T3 (fi)
FI (2) FI901771A (fi)
GR (1) GR3026489T3 (fi)
NO (1) NO308544B1 (fi)
WO (1) WO1991015588A1 (fi)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695329A (zh) * 2012-09-27 2014-04-02 远东新世纪股份有限公司 具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法
US9127323B2 (en) 2012-09-27 2015-09-08 Far Eastern New Century Corporation Isolated yeast strain having high xylose consumption rate and process for production of ethanol using the strain

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866382A (en) 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
FI913197A0 (fi) 1991-07-01 1991-07-01 Xyrofin Oy Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol.
US7226761B2 (en) 1992-11-05 2007-06-05 Danisco Sweeteners Oy Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
PL178040B1 (pl) * 1992-11-05 2000-02-29 Xyrofin Oy Sposób wytwarzania ksylitolu i zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy
US6723540B1 (en) 1992-11-05 2004-04-20 Xyrofin Oy Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts
EP0672161B1 (en) * 1992-11-05 1999-09-22 Xyrofin Oy Recombinant method and host for manufacture of xylitol
US5789210A (en) * 1993-11-08 1998-08-04 Purdue Research Foundation Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose
IN191596B (fi) * 1996-05-06 2003-12-06 Purdue Research Foundation
FI980551A (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia
JP2002512037A (ja) 1998-04-20 2002-04-23 フォルスカルパテント イー エスイーデー アクティエボラーグ リグノセルロース加水分解産物の効率の良い発酵のための遺伝子操作された酵母及びその突然変異体
JP2003520583A (ja) 2000-01-21 2003-07-08 ダニスコ スイートナーズ オイ 五炭糖及び糖アルコールの製造
US6894199B2 (en) 2001-04-27 2005-05-17 Danisco Sweeteners Oy Process for the production of xylitol
FI20011889A (fi) 2001-09-26 2003-03-27 Xyrofin Oy Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi
WO2007100897A2 (en) 2006-02-27 2007-09-07 Edenspace System Corporation Energy crops for improved biofuel feedstocks
TWI438274B (zh) * 2011-06-03 2014-05-21 Inst Nuclear Energy Res Atomic Energy Council 一種木糖代謝菌之製備方法及該木糖代謝菌
CN104403956B (zh) * 2013-09-05 2017-06-16 中国科学技术大学 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用
EP3559207A4 (en) 2016-12-21 2020-08-12 Creatus Biosciences Inc. XYLITOL-PRODUCING METSCHNIKOWIA SPECIES

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4009676A1 (de) * 1990-03-26 1991-10-02 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Dna-sequenz, umfassend ein fuer xylosereduktase und/oder xylitoldehydrogenase codierendes strukturgen

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695329A (zh) * 2012-09-27 2014-04-02 远东新世纪股份有限公司 具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法
US9127323B2 (en) 2012-09-27 2015-09-08 Far Eastern New Century Corporation Isolated yeast strain having high xylose consumption rate and process for production of ethanol using the strain
CN103695329B (zh) * 2012-09-27 2016-04-13 远东新世纪股份有限公司 具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2090122A1 (en) 1991-10-07
DE69128619D1 (de) 1998-02-12
FI924461A0 (fi) 1992-10-02
FI901771A (fi) 1991-10-07
NO308544B1 (no) 2000-09-25
ATE161886T1 (de) 1998-01-15
NO923880L (no) 1992-10-06
GR3026489T3 (en) 1998-07-31
WO1991015588A1 (en) 1991-10-17
AU7565791A (en) 1991-10-30
JP3348215B2 (ja) 2002-11-20
EP0527758B1 (en) 1998-01-07
DE69128619T2 (de) 1998-08-20
AU647104B2 (en) 1994-03-17
JPH05507843A (ja) 1993-11-11
FI924461A (fi) 1992-10-02
FI901771A0 (fi) 1990-04-06
DK0527758T3 (da) 1998-09-07
EP0527758A1 (en) 1993-02-24
ES2113373T3 (es) 1998-05-01
CA2090122C (en) 2002-06-18
NO923880D0 (no) 1992-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5866382A (en) Xylose utilization by recombinant yeasts
FI104636B (fi) Ksyloosireduktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä koodaavia DNA-sekvenssejä sisältävät rekombinanttihiivat
Jeffries et al. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by yeasts
DE60223377T2 (de) Veränderung von pilzen zur verwendung von l-arabinose
FI119433B (fi) Rekombinanttihiivat glukoosin ja ksyloosin tehokasta fermentointia varten
CA2728682C (en) Prokaryotic xylose isomerase for the construction of xylose-fermenting yeasts
US9150869B2 (en) Sugar transport sequences, yeast strains having improved sugar uptake, and methods of use
JP5219074B2 (ja) キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
EP2179036B1 (en) Polypeptide having nadh dependent hmf reductase activity
US7531348B2 (en) Recombinant yeast for lignocellulose raw materials
US8993301B2 (en) Vector with codon-optimised genes for an arabinose metabolic pathway for arabinose conversion in yeast for ethanol production
CN101652477A (zh) 编码木糖醇脱氢酶的dna
Meinander et al. Fed‐batch xylitol production with two recombinant Saccharomyces cerevisiae strains expressing XYL1 at different levels, using glucose as a cosubstrate: a comparison of production parameters and strain stability
FI112250B (fi) Menetelmä etanolin tuottamiseksi ja siihen soveltuvat rekombinanttihiivakannat
AU2004272775C1 (en) An NADH dependent L-xylulose reductase
Liu et al. gTME for construction of recombinant yeast co-fermenting xylose and glucose
US20040132074A1 (en) New enzyme for an in vivo and in vitro utilisation of carbohydrates
WO2020138020A1 (ja) 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired