JPH05507843A - キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素をコードするｄｎａ配列を含む組換え酵母株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素をコードするＤＮＡ配列を含 む組換え酵母株 発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に本発明は、キシロース還元酵素およ び／またはキシリトール脱水素酵素のそれぞれの遺伝子を導入した新規な組換え 酵母株に関する。 キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株は、キシロースをキシリトールに還 元することができ、その結果キシリトールをｉｎマｉｖｏで製造することができ る。両遺伝子が酵母株に導入されると、導入された酵母株は、キシロース含有培 地を用いる発酵でエタノールを製造することができる。 更に、この新規な酵母株は、上記２種の酵素を発現することができる。これらの 菌から生産されたキシロース還元酵寿は、酵素を用いるキシリトールのｉｎマｉ ｔｒ番な製造方法で使用できる。 発明の背景 キシロースの資化 キシロースは天然に遍く存在する。キシロースはリグノセルロース系素材の４０ ％を構成し得る（Ｌａｄｉｓｃｈ　ら）　１９＋１３゜発酵によってキシロース は、液体燃料または化学原料として使用されるエタノールに変換できる。キシロ ースは、酵素の作用によってまたは発酵の副産物として、虫歯を減少させる特性 を有する天然甘味料として将来有望なキシリトールに変換できる。またキシリト ールは糖尿病患者にも使用できる。 安価なエタノール生産のためには、原料はなるべく前処理を省いて直接発酵でき ることが重要である。人間の消費に供するキシリトールの製造には、製造方法に 一般安全性承認（Ｇｅｎａｒａｌ１７　Ｒｅｃｏｇｎｔｚｅｄ　ａｓ　５ａｆｅ ）生物が包含されることが重要である。 天然キシロースを資化するものとして、バクテリア、酵母、菌類がある。すべて の生物において、キシロースはキシルロースに変換され、キシルロースはキシル ロースーゼによってキシロース−５−リン酸に変換される。そして、キシロース −５−リン酸はベントースリン酸回路を経てエムデンーマイヤーホフ経路（解糖 系）に入る。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｉ　ｃｏｌｉ、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｓｐ、）、ストレプトミセス（＄　ｓｐ、）、及びアクチノプラネス（紅旦旦ム ■旦ｓｐ、）のようなバクテリアは、キシロース異性化酵素によって、キシロー スを直接キシルロースに変換する。これらのバクテリアはキシリトールをキシロ ース資化の中間生成物としては生産しない。発酵によりキシロースをエタノール にするこれらのバクテリアは、同時に多くの副産物を生産するので、収率が低い （ＳｋｏｏｇとＨａｈｎ−ＨＭｇｅｒｄａｌ、　１９８８）。ピアスティビティ ス（Ｐ　ｉ　Ｃｂ　ｉ　ａ　［）、カンシイラス（ｈ並■■■Ω」ｎ工匡旺）等 のキシロース資化酵母において、この反応は二段階で行われる。最初に、キシロ ース還元酵素によって、キシロースがキシリトールに還元され、次にキシリトー ルがキシリトール脱水素酵素によって酸化されキシルロースになる。 とピアスティビティス、カンジダシェハテおよびパキシレンタノフィラス等のキ シロース資化酵母は純粋なキシロース溶液を発酵し、高収率且つ良好な生産性を 示す（ＳｌｉｎｉｎｇｅＩ　ら１９８７；　Ｐｒ１ｏｒら１９８９）。しかしな がら、ソレラノ酵母は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前処理し、酸で加水分解 した麦藁等の、菌にとって不利であるような未処理の原料中では通常生存できな い（ＬｉｎｄｅｎとＨａｈｎ−Ｈｉｉｇｅｔｄａｌ　１９８９）。 ひとつの例外はパキシレンタノフィラスで、このような環境に対応して、主とし てキシリトールおよびグリセロールを生産する。このような原料をビヒアスティ ビティス種カンジダシェハテおよびパキシレンタノフィラス等のキシロース資化 酵母によって効率的に発酵させるために、これらの原料にイオン交換樹脂（Ｃ１ ｉｒｋとＭａｃｋｉｅ　１９８４）または水蒸気蒸留（Ｙｕら１９８７）といっ た費用のかかる前処理を加えなくてはならない。 パン酵母サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｅｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｅｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）は、亜硫酸廃液またはフッ化水素で前処理し、酸で加水分解した麦 藁を発酵し、エタノールにする（ＬｉｎｄｅｎとＨａｈｎ−Ｈ’ｊｇｅｒｄａ１ ．１９８９）。サツカロミセスセレビシェはキシロースを効率的に資化できない し、キシロースを単独炭素源として生育することはできない。しかしながら、サ ツカロミセスセレビシェはキシロースをキシルロースに変換するバクテリア由来 キシロース異性化酵素存在下で、純粋なキシロース溶液（Ｈａｈｎ−Ｈ’ｉｇｅ ｒｄａＩ　ら１９８６）のみならず未処理の原料（ＬｉｎｄｅｎとＨｘｈｎ−Ｈ −ｊｌｉｅｒｄａｌ、１９８９ａ、ｂ）も発酵し、ヘキソース発酵で得られるの と同等な収率および生産性で、エタノールを生産する。同様の結果がシゾサツカ ロミセスボンベ（旦ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　阻用）でも得られ た（Ｌａｓｊｉｅｋら１９８９）。このように、サツカロミセスセレビシェおよ びシゾサツカロミセスボンベは機能的なキシロキナーゼを有している。 また、サツカロミセスセレビシェはキシロースを資化することも知られている（ Ｂａｉｔ　ら１９８６；ｖａｎ　Ｚｙｌ　ら１９８９；　５ｅｎａＣとＨａｈｎ −Ｈｉｉｇｅｒｄａｌ　１９９０）。 ゴング（Ｇｏｎｇ、　１９８５）はキシロース発酵酵母変異株を用いてエタノー ルを直接Ｄ−キシロースから得る方法を開示した。 ゴングによると、本来Ｄ−キシロースを資化することができる親酵母株（たとえ ば、カンジダ種、またはサツカロミセスセレビシェ）を選別し、例として紫外線 照射して変異を誘発した。しかしながら、なぜキシロースを資化できる変異種が 得られるかについて、参考となる説明はされていない。さらにゴングは、キシロ ース発酵の効率を上げる為に、遺伝子工学技術によって新規なコード配列および ／または調節遺伝子配列を該菌に導入することはなかった。 キシリトールは現在、工業的にヘミセルロースの加水分解物の化学的還元によっ て製造されている。この方法では大きな問題として、還元段階で使用される高価 な触媒の毒性と、最終生成物から単離が困難な副産物が生成することである。 文献には純粋なキシロースからキシリトールを製造するための微生物学的方法の 例が多くみられる（例えば、大面および鈴木、１９６６；　Ｂａｒｂｏｓａら１ ９８ｇ）。この方法において、最良の生産菌は特にカンジダ種に属している酵母 である。またエンテロバクタ−（Ｅｌｅｒｏｂａｃ＋ｅｒ）　（古風ら、１９７ ３ａ）およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｅ＋ｅｒｉｕｍ）種（古風 ら、＋９７３ｂ）等のバクテリア、およびペニシリウムクリソゲナム（ガニ虹ｃ 　ｉ　ｌ　Ｉ　ｉｕｍ　旦」と１咀咀）　（Ｃｈ　ｉａｎｇとＫｎｉｇｂ４１９ ６０）等のある種のカビも純粋なキシロースからキシリトールを生産する。 キシリトール生産の最高収率を記載している微生物学的方法（Ｏｊａｍｏら１９ ８７）では、カンジダギリアーモンジ（箪コントロールされた通気下で、バッチ 式またはフェトバッチ式のどちらかで培養する。キシリトールが収率５０〜６５ ％で得られたが、培養培地にフルフルアルデヒドを添加することにより７６％ま で増加した。 薄膜反応器で９０％変換率でキシリトールを生産するために、カンジダベリクロ サ（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｊ■）（キシロース還元酵素含有）、メサノバクテリウム 種（Ｍｅ＋ｈａｎｏｂａｃ！ｅｒ且ｍ　ｓｐ、）　（脱水素酵素、Ｆ４２０．Ｎ ＡＤＰＩＦ４２゜／ＮＡＤＰ酸化還元酵素含有）からの無細胞抽出物をか使用す る（Ｋｉｔｐｒｅｅｃｈａｖｉｎｉｅｈ。 １９８５）。コリネバクテリウム種（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｔｉｕｍ　ｓｐ、 ）からの無細胞抽出物を使用すると、グルコン酸−６−リン酸が補助因子の再生 に使用された場合、６９％の変換率でキシリトールが得られる。 バシラスメガテリウム（旦工肚■江■■）由来のグルコース脱水素酵素はＮＡＤ ＰＨ再生酵素として適切な性質を有することが知られている（Ｋｕｌｂｅら１９ ８７）。このように、酵素を用いるキシリトールの製造方法では、グルコースか らグルコン酸がキシリトールと同時に製造される。酵素と補助因子の保持のため には、限外濾過膜が使用できる。補助因子の保持のために十分な高分子量を有す るように作製された補助因子（Ｋｕｌｂｅ　ら１９８７）かまたは負に荷電した 限外濾過膜（Ｋｕｌｂｅら１９８９）を使用することにより、補助因子の保持が 達成できる。 酵素的方法を使用する魅力は、微生物学的方法ならば使用する微生物の代謝を阻 害するような素材を含有する、不純なキシロースを使用できることにある。また 、キシリトールの収率は天然の菌株による微生物学的方法よりも酵素的方法のほ うが高い。しかし、大規模生産では、現在のところ微生物学的方法の方がより簡 易な方法である。 ビヒアステイビテイス種、カンジダジェノ１テ種およびパキシレンタノフィルス 種等の天然のキシロース資化酵母は、いくつかの理由で、エタノール生産および キシリトール生産に適さない。エタノール発酵においては原料の前処理をしなけ ればならないので、エタノールのような安価な最終生産物にしてはコスト高とな る。これら上記の種はまた一般安全性承認資格がない。従って、キシロース資化 については一般安全性承認資格を有するパン酵母の使用を基本とすることがもっ とも好都合であろう。 キシリトールおよびエタノール生産のために効率的なキシロース資化菌であるサ ツカロミセスセレビシェを作製するために、キシロースをキシリトールとキシル ロースに変換する効率的な酵素システムを本酵母に導入すべきである。キシロー スからエタノールを生産する為には、大腸菌（Ｓａｒｊｂｙら１９８７）バシラ スサチリス（Ｂ、　５ｕｂｊｉｌｉｓ）、およびアクチノプラネス　ミズーリエ ンシ７．　（Ａｃｊｉｎｏ　１ａｎｅｓ　ｍ１ｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉす（Ａｍｏ 　ｒ　ｅ　ら１９８９）由来のキシロース異性化酵素遺伝子をクローン化しサツ カロミセスセレビシェに導入する。サツカロミセスセレビシェ中で作られるキシ ロース異性化酵素蛋白質は非常に活性が低い（バクテリアで生産される酵素の十 分の−）かまたは酵素活性を示さない。このように、バクテリア由来の酵素は酵 母中では作用しない。・サツカロミセスセレビシェに導入できる遺伝子として、 もうひとつは別の酵母由来のキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素 をコードする遺伝子が考えられる。ビヒアステイビテイスの酵素は上述した純粋 なキシロース溶液の効率的な資化という観点からみて適した候補である。別の酵 母由来の酵素は酵母の中で発現する時、バクテリア由来の酵素より活性が高いと 期待される。さらに、キシリトールおよびエタノールは同一のシステムで生産さ れ、このシステムはビヒアステイピティスがキシロースを有効に資化し、阻害因 子に対する抵抗性とサツカロミセスセレビシェの使用が可能であるという点を兼 ね備えるものである。 発明の要旨 本発明はキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素をコードするそれぞ れの遺伝子を有するある種の酵母からそれらの遺伝子を単離すること、それら遺 伝子の特徴、サツカロミセスセレビシェへの導入、及び該酵母株中での発現につ いて開示している。 本発明はこのように、キシロース還元酵素および／またはキシリトール脱水素酵 素を！！現する新規な組換え酵母株を提供する。 本発明によると、キシロース還元酵素遺伝子を導入した本酵母株はｉｎ　ｖｉｖ ｏでキシロースからキシリトールに還元を行なうことができる。また本発明によ ると１．この新規な酵母株によって生産されるキシロース還元酵素はキシリトー ルを、郵られる新規な酵母株を提供する。これらの遺伝子が共に発現することに より、純粋なキシロース溶液またはリグノセルロース系加水分解物等のキシロー ス含有溶液を用いて酵母株にキシロースを発酵させ、エタノールを生成させるこ とができる。 図面の簡単な説明 Ｆｉｇ、１はキシロース還元酵素遺伝子（ｘｒｄ）をプラスミドｐＭＡ９１、ｐ Ｒ３３０５にそれぞれ導入して構築したプラスミドＰＵＡ１０３．ｐＵＡ１０７ を示す。 Ｆｉｇ、２はキシリトール脱水素酵素陽性を示す１ｇｌｌｌクローンのプレート 活性分析の結果を示す。 Ｆｉｇ、３はキシリトール脱水素酵素遺伝子（ＸＤＨ）を担持するプラスミドＰ ＪＨＸＤＨ５０の図を示す。 Ｆｉｇ、４はキシリトール脱水素酵素を生産する組換えサツカロミセスセレビシ ェ株ＶＴＴ−Ｃ−９１１８１の、オリジナル形質転換菌プレート（Ａ）および形 質転換菌から得られた単一コロニー（Ｂ）についてのプレート活性分析の結果を 示す。 Ｆｉｇ、５はキシロース還元酵素遺伝子をＢＳ＋ベクターに導入して構築したベ クターｐＪＨＸＲ２２において、リポソームのコード配列ではさんだキシロース 還元酵素遺伝子の、発現カセットを示す。 Ｆｉｇ、６は下記プラスミドを有するサツカロミセスセレビシェから、およびビ ヒアスティビティスから生産されたキシロース還元酵素のウェスタンプロット分 析の結果を示す。 レーン１　基準分子量（ＬＭＷ、ファーマシア社製）レーン２　ｐＲ５３０５゜ レーン３　ＰＵＡ１０７ レーン４　空きレーン レーン５　ｐＭＡ９１゜ レーン５　ｐＵＡ１０３゜ レーン７　精製したキシロース還元酵素レーン８　ＬＭＷ レーン９　ビヒア　ステイビテイス レーン２．３．５．６および９のサンプルはフレンチプレスにより破砕した細胞 溶出物 Ｆｉｇ、７は補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのどちらかを使用し、プ ラスミドｐＵＡ１０３およびｐＵＡ１０７が導入されたサツカロミセスセレビシ ェ、および、ベクターｐＲ３３５またはｐＭＡ９１を担持するコントロール株の それぞれのキシロース還元酵素活性を示す。 Ｆｉｇ、８はキシリトール脱水素酵素遺伝子（ＸＤＨ）をｐＫＢ１０２に導入し て構築したプラスミドｐＪＨＸＤＨ６０を示す。 発明の詳細な説明 本発明で使用されるキシロース還元酵素（Ｘ　ｒ　ｄ）遺伝子およびキシリトー ル脱水素酵素（ｘｄｈ）遺伝子は、これらの遺伝子を含有するピヒアステイビテ イス等の酵母から単離する。 またパキシレンタノフィラス、フライベロミセス種（５且■ｅｒｏｍ…■ｓｐｐ 、）、ペトロミセスアルベルテンシス（ム立μ旺ｃｅｓ　ａｌｂｅｒｊｅｎｓｉ ｓ）およびカンジダ種等の他の適切な酵母および菌類も使用できる。 これらの遺伝子を導入する酵母としては、キシリトール生産のために適切な酵母 株ならば何でも使用でき、サツカロミセスセレビシェ酵母株（例えば、ＤＢＹ７ ４６．ＡＨ２２，３１５０−２Ｂ　ＧＰＹロミセス種類またはシゾサツカロミセ スボンベ種等の一般安全性承認資格を有する株が望ましい。遺伝子のこれら酵母 への導入は、例えばこれらの生物体について記載のある公知の方法で行なうこと ができる。ここで注目すべきことは、遺伝子発現の増加または調節を行うために 、必要ならば、ビヒア自身にこれらの遺伝子を導入できることである。本発明の 目的にはサツカロミセス七しビシエ種が好ましい。 キシロース還元酵素をニードするＤＮＡ配列は公知の方法によってビヒア　ステ ィビティスより単離する。好ましい態様としては、ｍ　ＲＮ　Ａから合成したｃ ＤＮＡを、λｇｉｌｌベクターを用いてクローニングする。キシロース還元酵素 の特異的抗体を用いる免疫学的スクリーニングにより、陽性クローンを単離し、 シークエンスシングするためにＢＳ＋ベクターにサブクローンする。ビヒア　ス テイビテイスのキシロース還元酵素をコードする遺伝子はイントロンを全く含ん でいないので、サツカロミセスセレビシェ中で発現することによっても、クロー ン化できる。また、この酵素のアミノ酸配列をもとにして作製したオリゴヌクレ オチドを使用し、／’ｉイブリダイゼーションにより遺伝子バンクから単離する 方法もある。 酵母への導入に適したプラスミドを構築するために、キシロース還元酵素をコー ドする遺伝子を、適切な酵母遺伝子調節領域を含むｐＭＡ９１（Ｍｅｌｌｏｒら 、　１９＋１３）等の適切な酵母発現ベクターを用いてクローニングする。これ らの調節領域は、例えばＰＧＫＩ、ＡＤＨＩ、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ，ＣＵＰＩ 、ＧＡＰ、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５等の酵母株の遺伝子から得る。また、キシロース 還元酵素をコードするビヒア種の遺伝子の調節領域は、サツカロミセスセレビシ ェにおけるキシロース還元酵素遺伝子の発現に使用できる。 キシロース還元酵素をコードするｘｒｄ遺伝子を有するプラスミドは、受容酵母 株に導入されると自己複製できる。キシロース還元酵素をコードする遺伝子は、 また、適切な酵母の調節領域と共にｐＲ３３０５等の単独コピー酵母ベクターを 用いてクローニングできる（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ　とＨｉｅｌｓｒ、　１９８９） 。 また、キシロース還元酵素をコードする遺伝子は酵母の染色体、例えばリポソー ムＲＮＡの遺伝子座に導入できる。この目的のために、プラスミドｐｌＲＬ９等 の適切なプラスミドのリポソーム配列を取り出し、ＢＳ＋ベクターを用いて適宜 クローニングする。適切な酵母プロモーターとターミネータ−領域の間に挿入さ れたキシロース還元酵素をコードする遺伝子は、前段階で得られた遺伝子を含有 するプラスミドとキシロース還元酵素をコードする遺伝子を含むハイブリッドベ クターから取り出す。このようにして得られたリポソーム配列ではさんだプラス ミド発現カセットは取り出すことができる。 この断片を、形質導入の適切なマーカーを担持する自己複製型プラスミドと共に 酵母に導入する。そしてそのプラスミドを、細胞を無選択条件で培養することで 染色体に組み込んだｘｒｄ遺伝子を含む細胞から除去する。このようにして、バ クテリアのベクター配列等の異種外部ＤＮＡを担持しない組換え株が得られる。 ＹＴＴ−Ａ−６３０１５等の倍数体の酵母株を使用すると、キシロース還元酵素 遺伝子はＰＧＫＩまたはＡＤＩ（１遺伝子座等の必須遺伝子座にも導入される。 従って、本発明の目的は特定のキシロース還元酵素遺伝子を提供することにある 。ｘｔｄ遺伝子の配列は、例えば２重鎖ジデオキシヌクレオチドシーケンス法Ｃ Ｚａｇｕｒｓｋｙ　ら、　１９８Ｂ）を使用することによって、その遺伝子を担 持するプラスミドから決定できる。ピヒア　スティビティスのキシロース還元酵 素をコードする遺伝子の配列を、配列表の配列番号２に示す。 本発明の他の目的はｘｒｄ遺伝子を含む特定の酵母ベクターを提供することにあ る。このようなベクターとは、上述したように、自己複製した複数または単独の 複製コピーのプラスミドまたは酵母の染色体に組み込むことが可能なベクターの いずれかである。 本発明の更に他の目的は、キシロース還元酵素をコードするＤＮＡ配列を含み、 この酵素を発現することが可能な酵母株を提供することにある。 従って、キシロース還元酵素の製造方法も提供される。この方法は、 （ａ）キシロース還元酵素をコードするＤＮＡ配列を適切な供与体生物から単離 し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列を担持する酵母ベクターを構築し、（ｃ）得られたベクター を適切な宿主酵母に導入して組換え宿主株を得、 （ｄ）該キシロース還元酵素が発現できる条件下で該組換え宿主株を培養し、そ して （ｅ）該キシロース還元酵素を回収することを包含する。 一般安全性承認資格を有する生物体由来の酵素はキシリトールの酵素的生産に好 ましい。ビヒア　スティビティス由来のキシロース還元酵素はチオール保護化学 薬品等の特別な安定剤を使用しなくても、活性は一定であり６、安定な酵素とし て優れた特徴を有する。現在、この酵素の生産は一般安全性承認資格を有する酵 母において可能である。形質転換した酵母細胞を適切な培地で培養する。培地と しては、キシロースが酵素の誘導に必要とされない時は、本来キシロースを資化 する酵母用上聞じ、糖密をベース、とする安価な培・地７が使用される。細胞内 キシロース還元酵素を持つ酵母はフエドバッチ工程で良好な収率で生産される。 生産された酵母を遠心分離等により濃縮、洗浄しそしてキシロース還元酵素を高 圧ホモジナイゼーションまたはガラスピーズ粉砕法等の細胞破砕法によって溶液 中に遊離させる。 濾過または遠心分離によってホモジネートを精製した後、キシロース還元酵素を さらにクロマトグラフィー法で精製する。 キシリトールのｉｎ　ｖＨｒｏ生産の為に、酵素反応器中で粗ホモジネートまた は精製したキシロース還元酵素を、補助因子（ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ ／ＮＡＤＰＨ）、およびグルコース脱水素酵素、フォルメート脱水素酵素または 、十分な安定性があり、キシロース還元酵素の環境条件を満たし、更に適切な活 性特性を備えた他の酵素等の補助因子再生用酵素と共に反応させる　（Ｂｉｉｃ ｋｍａｎｎ、　１９７９；Ｗａｎｄｒｅｙ　ら、　１９８１；１９８２；Ｋｕｌ ｂｅ　ら、１９８９）。酵素および補助因子は、概して限外濾過膜、特に負に荷 電した膜によって反応システム中に保持される。これらの補助因子はまた、補助 因子再生用酵素と共に固定し得る（Ｒｅｓｌｏｗら、　１９１１８）。反応混合 物を反応器からポンプで汲み出し、基質および生成物を膜を通じて濾過する。生 成物はクロマトグラフィーまたは結晶化による方法で基質から単離し、基質は反 応器に再循環できる。 更に、本発明はキシリトールの微生物学的な製造方法にして、 （ａ）キシロース含有培地で、キシロース還元酵素コードするＤＮＡ配列を担持 する組換え酵母株を培養し、 （ｂ）生成するキシリトールを培地から回収することを含む方法が提供される。 組換え酵母株による微生物学的なキシリトールの製造において６補助・因子ｌ＃ ｊ（また４２　ＮＡＤ）Ｉのｉｎ　ｖ＋７０再生はなんらかの方法で確保しなけ ればならない。キシロース還元酵素遺伝子のみを含有しキシリトール脱水素酵素 遺伝子を含有しない酵母の構築においては、グルコース、グリセロール、リボー スまたはエタノール等の、同じく炭素を持つ物質を添加することで補助因子再生 が行なわれる。このシステムでは、キシロースからのキシリトールの生成が９５ 〜１００％の収率で得られる。さらに、サツカロミセスセレビシェを使用するこ のシステムでは、キシリトールは代謝されない。結果として天然のキシリトール 産生生物における場合よりも高収率でキシリトールが得られる。酵母がキシリト ール脱水素酵素遺伝子。 （以下を参照）を有する場合、補助因子再生は、代謝中でキシリトールのわずか な流出を通して行なわれる。この流出は、キシロース還元酵素およびキシリトー ル脱水素酵素の相対的な発現の量によるか、あるいは酸素転移率によるかあるい はヨードアセテート等の酵素阻害剤を培養培地に添加して代謝を制御することに よって、制御できる。 本発明の好ましい態様において、ビヒアステイビテイスのｘｄｂ遺伝子の単離の ために、最初に大腸菌を用いて、コスミドＰ３０３０（Ｐｅｎｔｔｉｌｉｉら、 　１９８４）または別の酵母ベクター中で染色体遺伝子パンクが作製され、組換 えプラスミドが単離され、酵母中に導入される。ｘｄｈ遺伝子は酵母中での発現 によって見分けることができ、プレート活性分析によって検出できる。ｘｄｈ遺 伝子のｃＤＮＡコピーは大腸菌中で作成されるλｇＮｌ　ｃＤＮＡ発現ライブラ リーからプレート活性分析によって、同様に単離される。 ビヒアスティビティスからｘｄｂ遺伝子を単離する他の方法としては、次のよう なものがある。キシリトール脱水素酵素を供与体酵母よりクロマトグラフィー法 で精製し、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定する。このキシリトール脱水素酵素 蛋白のＮ−末端アミノ酸配列をベースとしてオリゴヌクレオチドの混合物を合成 する。このオリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子バンクのハイブリダイゼーシ ョンに使用するかまたはオリゴｄＴ−プライマーと一緒にＰＣＲ反応によって、 ｍＲＮＡ群からｘｄｈの特異的配列を増幅するために使用する。 その結果得られる遺伝子またはｃＤＮＡをＢＳ＋ベクターまたは同様のベクター を用いてクローニングし、公知の方法によってｘｄｈ遺伝子の配列を得られる。 また特異的なキシリトール脱水素酵素遺伝子を提供することも本発明の目的であ る。 ｘｄｂ遺伝子は酵母中で酵母コスミドＰ３０３０（ＰｅｎＮｉｌｉら、１９８４ ）を用いてクローン化された染色体のコピーから発現できる。このようなｘｄｈ 遺伝子を有する酵母にｘｒｄ遺伝子を担持するプラスミドを導入する。 また、ｘｄｈ　ｃＤＮＡの全長は、ｐＭＡ９１またはＰＫＢ１０２（Ｂｌｏｍｑ ｖｉｓｊ　ら、　１９９１）等の適切な発現ベクターの酵母遺伝子調節領域の間 に、好ましくは酵母ＰＧＫＩまたはＡＤＨＩのプロモーターおよびターミネータ −の間に挿入することによってクローニングできる。ｐＫＢ１０２に構築された 発現カセットは、プラスミドから取り出し、複数コピーを自己複製する酵母ベク ターまたは酵母の形質転換用にＵＲＡ３あるいはＨＩ３３等の適切なマーカーを 担持する単一コピーを自己複製する酵母ベクターを用いてクローニングできる。 そしてクローンされたプラスミドは、適切な宿主株またはキシロース還元酵素を コードする遺伝子を担持する株に導入できる。 ｘｄｈ遺伝子はまたｘｒｄ遺伝子について上述したの方法と同様にして酵母遺伝 子に組み込むことができる。 このように、本発明の更に他の目的は、キシロース還元酵素またはキシリトール 脱水素酵素を発現させることができるか、あるいはキシロース還元酵素およびキ シリトール脱水素酵素を共に発現させることができる新規な酵母株を作製するた めの方法にして、 （ａ）キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素をそれぞれコードする ＤＮＡ配列を適切な供与体生物から単離し、 （ｂ）それぞれのＤＮＡ配列のどちらか一方を担持する酵母ベクターを構築し、 そして （Ｃ）得られたベクターのどちらか一方または両方のベクターを適切な宿主酵母 に導入することを包含する方法を提供する。 従って、本発明は、活性なキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素を 酵母株中で共に発現させるための方法にして、 （ａ）適切な供与体生物より、キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵 素をそれぞれコードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）それぞれのＤＮＡ配列をそれぞれ担持する酵母ベクターを構築し、。 （Ｃ）得られたそれぞれのベクターを適切な宿主酵母に導入して組換え酵母株を 得、 （ｄ）該組換え酵母株を、該組換え酵母株中の各遺伝子を発現できる培地か、ま たはキシロース含有培地にて培養し、そして （ｅ）培地中に産生ずる各目的生成物を単離精製する ことを包含する方法を提供する。 本発明によれば、キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素を共に発現 する組換え酵母株は、亜硫酸廃液などの森林工業におけるリグニンセルロース加 水分解物の副生成物中のキシロース留分か、あるいは二酸化硫黄等の化合物の存 在下か非存在下で、酸かまたは酵素加水分解と組み合わせて、温度を上げながら 処理することによって上記のキシロース留分を発酵に使用できるように前処理し て、得られた原料に含まれるキシロース留分を発酵することにより、キシロース からエタノールを有効に生成することができる。キシロースの消費および生産物 （エタノール、キシリトール、酢酸等）の生成は、例えばＨＰＬＣで分析する（ Ｈａｈｎ−）１ｉｇｅｒｄａｌ　ら。 １９８６；　Ｌｉｎｄｅｎ　ａｎｄ　Ｈａｈａｎ−１（ｉｇｓｒｄａｌ、　１９ ８９ｉ、ｂ）。 実施例１ ビヒア　スティビティス由来キシロース還元酵素の精製ビヒア　スティビテイス を、１リツトル容の発酵器を用いてキシロース含有培地（０，３％酵母抽出物、 ０．３％麦芽抽出物、０．５％ペプトン、１．９％リン酸二水素カリウム、０． ３％リン酸酸水素二アモモニウム０．１％硫酸マグネシウムおよび５％キシロー ス、ｐＨ５）で育生し、対数増殖期後期に回収した。湿重量３０ｇの細胞ペース トを凍結圧縮０［−ｐｒｅｓｓ）により粉砕し、加速度１，５００ｇで１０分間 遠心分離して無細胞抽出物を得た。 粗抽出物を２倍に濃縮して、１３７ａ＋ＩのセファデックスＧ−２００（ファー マシア社製、ウプサラ市、スウェーデン）カラムに入れた。流速毎時６ｍｌで蛋 白が溶出し、キシロース還元酵素活性を示す分画９１をプールした。 プールした分画をｐＨ６の０．０２Ｍリン酸アンモニウム緩衝液で平衡化した３ ７ｍ１のＤＥＡＥ−セファロース（ファーマシア社製）カラムに入れた。０．０ ２Ｍのリン酸アンモニウム緩衝液中において、流速毎分１２ｍ１で、２５０ｍ１ の０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度匂配を用いて溶離した。キシロース還元 酵素活性を示す分画６ｍｌをプールし、１ｍｌに濃縮した。濃縮したサンプル１ ｍＩを、ｐＨ６の０．０２Ｍのリン酸アンモニウム緩衝液で平衡化した１ｍｌの ＨＰＬＡＣカラム（ｃｉｂｉｃｒｏｎ　ｂｌｕｅ　Ｆ３６−Ａ；パーストーブバ イオリテイカ（Ｐｒｅｓ＋ｏｒｐ　Ｂｉｏ１７＋１ｃａ）社製、ルンド市、スウ ェーデン）に入れた。キシロース還元酵素の溶出は、リン酸アンモニウム緩衝液 中において、流速毎分１ｍｌで、０〜２Ｍ塩化ナトリウムの濃度匂配を用いて行 なった。キシロース還元酵素活性を示す分画６ｍｌをプールし、４℃で一晩透析 した。 精製度および分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（７８，８〜２１．３％ 、Ｃ２，６％）濃度勾配電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０）および無変性 ポリアクリルアミドゲル（ファーマシア社製プリメイドゲル、４／３０）濃度勾 配電気泳動（ファーマシア社製垂直電気泳動システム）で分析した。この場合フ ァーマシア社製の低分子量、高分子量標準を使用した。２５％メタノールおよび １０％酢酸中に溶解した０、１％クーマシープルーＲ−２５０（シグマ社製）で ゲル染色を行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよび無変性ポリアクリルア ミドゲルにおいて、ＨＰＬＡＣ後のキシロース還元酵素分画が単一バンドとして 現われた（データは無表示）。ザイモグラム技術によるキシロース還元酵素の特 異染色でも、無変性ポリアクリルアミドゲルにおける単一バンドがキシロース還 元酵素のものであることがわかった（データは無表示）。ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル（図６参照）および無変性ポリアクリルアミドゲルにおけるサブユニッ トの推定分子量は３８，０００±１０００、本体蛋白質の推定分子量は７６．０ ００±１０００であった。 精製した酵素はポリクローナル抗体の作製および酵素のＮ−末端アミノ酸配列を 作製するために使用した（マークバウマン（Ｍｉｒｅ　Ｂａｕｍａｎ）医科化学 教室、ヘルシンキ大学）　（配列番号１）。 実施例２ ビヒア　スティビティス由来のキシロ−、ス還元酵素をコードする遺伝子のクロ ーニング １リツトルのビヒア　スティビティス培養物をキシロースした。回収した細胞は ザイモラーゼでスフェロプラストにし、チオシアン酸グアニジウム溶液６０ｍ１ に懸濁して、ＲＮＡをキルゲインら（Ｃｂｉｒｇｖｉｎ　ｅｔ　ｓｌ、、　１９ ７９）の方法によって単離した。次に、ＲＮＡをオリゴ（ｄｌ）セルロースアフ イニテイクロマトグラフィーカラムに通した。溶出緩衝液のイオン強度を低下さ せることによって、Ｐｏ１Ｙ　（Ａ＋）　ｍＲＮＡを溶出した。 アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製ｃＤＮＡ合成キットを使用しｃＤＮＡを ｍ　ＲＮ　Ａから合成し、ｃＤＮＡクローニングキットと、１ｇ１１ベクターを 用いてクローニングした。３〜４時間生育した後、プラークをイソプロピル−β −Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）に浸析したニトロセルロース膜にレプリカ 平板法で移し取り、−晩培養した。キシロース還元酵素に対するラビットの抗血 清およびアルカリフオスフオターゼと結合した山羊の抗ラビット抗体を用いて、 組換えベクター（ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｅｓ、　１９８３）の免疫的スクリーニ ングを上記ニトロセルロース膜を用いて行なった。陽性のクローンをシャーレか ら釣菌し、ベクター特異プライマーを使用し、挿入したＤＮＡをＰＣＲ法（Ｇ’ ｄｓｓｏｖとＣｌ１ｃｋｓｏｎ、　１９８９）で増幅した。得られたＤＮＡ断片 について制限酵素分析し、さらにＢａｍ旧で切断後、その切断片をＢａｍＨＩで 切断したＢＳ十ベクター（ストラテジーン（Ｓ＋ｒａｔａｇｅｎｅ）社製）を用 いてクローニングした。 最長のｃＤＮＡクローンｐＪＨＸＲ２０について２本鎖ジデオキシヌクレオチド 法（Ｚａｇｕｒｓｋｙら、　１９８６）によるシーフェンシングを行なった。 キシロース還元酵素をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの全長がクローニングされたか の検証はキシロース還元酵素蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列とシーフェンシング した遺伝子（配列番号１、および２）を比較することで行った。 ｘｒｄ遺伝子の複製染色体コピーは、コード領域の５′末端（ＧＣＧＧＡＴＣＣ ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧ）に対応 し、コード領域の３′末端（ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＣＧＡＡ ＧＡＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴＣＣＣ）にそれぞれ対応し、且つ、それぞれＢｉ ｍＨｒおよびＸｂ＋＋１制限部位を有する各プライマーを使用し、ビヒアステイ ビテイスＣＢ５−６０５４（Ｐｒｉｏｔら、１９８９）から単離した全染色体Ｄ ＮＡ　（Ｃｒｙｅｒ　ら、１９７９）のＰＣＲ反応によって得た。ＰＣＲ反応物 を、ＢａｍＨＩで分解し、プラスミドｐＭＡ９１（Ｍｅｌｌｏｒ　ら、１９８３ ）のＢｇ！ｎ部位に挿入してｐＵＡ１０３を得た（図１参照）。染色体コピーの ＤＮＡ配列をプラスミドのｐＪＨＸＲ２０のｃＤＮＡ配列と比較した結果、イン トロンを有さないことが判った。 実施例３ ピヒアスティピティス由来のキシリトール脱水素酵素の精製 ビヒアスティピティスを（実施例１）に記載のキシロース含有培地で育生し、湿 重量３０ｇの細胞ペーストを凍結圧縮（Ｘ−ｐｒｅｓｒ）により粉砕し、加速度 １，５００ｇで、１０分間遠心分離して無細胞抽出物を得た。 遠心分離した無細胞抽出物を３倍に濃縮し、２５％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ 、１ｍＭＥＤＴ＾を含むｐＨ６の０．０５Ｍリン酸アンモニウム緩衝液で平衡化 した１３７ｍ１のセファロース６Ｂカラム中において流速毎時６！Ｉｌ＋で、上 記濃縮物５ｍｌをゲル濾過した。Ｓｍ１ｌｅ７とＢｏｌｅｎ　（１９８２）によ る方法で測定したキシリトール脱水素酵素活性を示す分画をプールし、２５％グ リセロール、１ｍＭのＤＴＴ、　１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，０，０５Ｍの リン酸アンモニウム緩衝液で平衡化した３７ｍ１イオン交換クロマトグラフカラ ム（ＤＥＡＥ−セファロース）に入れた。キシリトール脱水素酵素含有分画は、 流速毎分１２ｍ１で、２５０１のθ〜０．５Ｍ塩化ナトリウム濃度匂配で溶出し て、貯えられた。一部端製した酵素はポリアクリルアミドゲルを通し、ＰＶＤ膜 上にプロットした。キシリトール脱水素酵素に対応するバンドを切り出し、Ｎ− 末端アミノ酸配列を直接膜から決定した。 実施例４ キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子のクローニングおよびサツカロミセ スセレビシェ種牛での発現実施例２で記載し、得られたと同様のλｇ

【１１のｃ ＤＮＡライブラリーを育生し、プラークをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト シド（ＩＰＴＧ）に浸析したニトロセルロース膜上にレプリカ平板法で移し取り 、３時間培養した。その膜を１０ｍ１のザイモグラム溶液（０，１Ｍ、　ｐＨ７ のリン酸緩衝液、１．５ｍＭ　ＮＡＤ、０．２５ｍＭのニトロブルーテトラゾリ ウム（Ｎｉ＋ｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｊｒａｚ。 ＋ｉｕｍ）、６５μＭフェナジンメトスルフェート、０．４Ｍキシリトール）に 浸析することで、特異的なキシリトール脱水素酵素活性（ザイモグラム）のスク リーニングを行った。陽性のクローン（図２）をシャーレから釣菌し、ふたつの クローンが挿入されたＤＮＡをベクターに特異的なプライマー（５′−ＧＧＴＧ ＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ、５′−ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣ ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ）を用いて、ＰＣＲ法（Ｇ石５ｓｏｖとＣ１ａｃｋｓ ｏｎ、　１９ｇ９）で増幅した。 得られた同じ長さのＤＮＡ断片は、切断酵素および不切断酵素を制限酵素分析で 調べ、Ｂａｍ旧で切断後、Ｂａｍ旧で切断されたベクターｐｓＰ７２　（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）にさらにクローニングした。プラスミドｐＪＨＸＤＨ５０は最長ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａクローンを担持する（図３）。 ｘｄｈ遺伝子の染色体コピーをクローニングするために、染色体ＤＮＡをピヒア スティピティスＣＢ５−６０５４株（Ｐｔｉｏｒら、１９８９）から単離しくＣ ｒ７ｅｒら、１９７９）、Ｓａｕ　３Ａで部分的に切断した。部分分解したＤＮ Ａをショ精密度匂配達心分離法（１５〜４０％）で３５−４５キロベースサイズ の断片に分画精製し、その断片をＢａｍＨＩで切断した９３０３０酵母コスミド ベクター（Ｐｅｎｆ＋ｉ１′ｉら、１９８４）　）に繋ぎあわせた。繋ぎ合わせ た分子をアマ−ジャム社製（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｔｄ、、（英国））のｉｎ　 ｖｉｊｒｏパッケージキットを用いて１粒子にパッケージし、大腸菌ＨＢＩＯＩ 　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）に導入した。組換えコスミドＤＮＡは得ら れた約１５０００の貯蔵遺伝子パンクのクローンから単離し、サツカロミセスセ レビシェ３１５０−２８　（ａ、ｈｉｓ３−ｄｅｌｌ、Ｉｕｅ２−３．Ｉｅｕ２ −１１２、ｔｒｐｌ−２８９，ｕｒｉ３−５２．ｃｉｒ”、Ｇａｌ”）　（Ｂｉ ｌｄａｒｉら、１９８７）株中にヒスチジン欠乏完全合成培地（Ｓｃ−ｈｉｓ） プレート上で旧Ｓ陽性形質転換ベクターをスクリーニングして導入した。ニトロ セルロースフィルター上でその遺伝子バンクのりプリ力を取り、フィルターをク ロロホルム中で５分間培養することによって、細胞を破壊し、λｇｉｌｌライブ ラリー用に上述したような活性分析を行った。数個の陽性クローン（Ｈ４９４， Ｈ４９５，Ｈ４９６、Ｈ４９７およびＶＴＴ−Ｃ−９１１８１株）を得、ＶＴＴ −Ｃ−９１１８１＜図４）株はさらに研究に供された。 ＶＴＴ−Ｃ−９１１８１株のキシリトール脱水素酵素活性をフレンチプレスで圧 縮した２５％のグリセロールを含有する全細胞溶出物でスミレイとボレン（Ｓｍ ｉｌｅｙとＢｏｌｅｎ、　１９ｇ２）の方法でテストした。ＶＴＴ−Ｃ−９１２ ８］株からＤＮＡを単離し、ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに導入することで、プラス ミドｐＭＷ２２を救済した。 プラスミドｐＭＷ２２を担持するサツカロミセスセレビシェＶＴＴ−Ｃ−９１１ ８１株はブタペスト条約により英国のザ　ナショナルコレクション　オブ　イー スト　カルチ・ヤー（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ 　Ｙｅａｓｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＮＣＹＣ））　、菌寄Ｎｏ、２３５２で１９ ９１年３月２９日に寄託した。 実施例５ サツカロミセス　セレビシェでのキシロース還元酵素の発現 ＰＧＫ遺伝子の調節領域を有す、キシロース還元酵素をコードする遺伝子はプラ スミドｐＵＡ１０３（実施例２）から旧ａｄ　ＩＩＩで取り出し、単一複製ベク ターｐＲ５３（１５（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ　とＩ（ｉｅ＋ｅｒ。 １９８９）の旧ｎｄ　１１１部位にクローニングした。酵母ＰＧＫプロモーター に対して正の方向にキシロース還元酵素をニードする遺伝子を導入してｐＵＡ１ ０７　（図１）となったプラスミドを、塩化リチウム法（伊藤ら、１９８３）に より、Ｌｅｕ陽性の形質転換ベクターを選んでサツカロミセス　セレビシェ　３ １５０−２株（実施例４参照）およびＧＰＹ５５−１５Ｂａ株（ｌｅｕ２−３． 　Ｉｅｕ２−１１２．ｕｔａ３−５２．　＋ｒｐｌ−２８９．ｈｉｓ４−５１９ ．ｐｒｂｌ、ｃｉｒ＋）に導入して、それぞれ新規組換え株サツカロミセス　セ レビシェＨ４８１およびＨ４７９とした。プラスミドｐＵＡ１０３をサツカロミ セス　セレビシェ３１５０−２株、ＧＰＹ１５Ｂα株に導入してそれぞれＨ４７ ７およびＨ４７５とした。 またキシロース還元酵素をコードする遺伝子を酵母染色体のリポソームＲＮＡ遺 伝子座に導入した。プラスミドのｐ［ＲＬ９リポソーム配列をＥｃｏＲＩにより 取り出し、平滑末端化し、ＢＳ十ベクターのＸｂａ１部位の平滑末端にクローニ ングしてベクターＰＪＨＲ２１を得た。ＰＧＫプロモーターとターミネータ−と の間に挿入されたキシロース還元酵素をコードする遺伝子はベクターｐＵＡ１０ ３からＨｉｎｄ　ＩＩ＋断片として取り出し、平滑末端化しプラスミドＰＪＨＲ ２１のリポソーム配列の平滑末端化したＸｂａ１部位にクローニングした。その 結果得られたプラスミドｐＪＨＸＲ２２（図５）から、リポソーム配列ではさん だ発現カセットをＢＳ＋のポリリンカー特有の制限酵素部位で切断することで取 り出した。この断片を形質転換のマーカーを有す自己複製プラスミドと一緒に酵 母に導入した。上述の酵素活性試験により、得られた形質導入法のキシロース還 元酵素をコードする遺伝子の存在をスクリーニングし、そして導入のパターンは サザーンプロット分析で調べた。無選択ＹＰＤ成長培地で細胞を培養することに よって自己複製プラスミドをキシロース還元酵素発現カセットを担持する細胞か ら除去した。 形質転換株を最小選択培地で育生し、キシロース還元酵素の発現をキシロース還 元酵素特異的抗体を使用するウェスタンブロッティングおよびプロメガのアルカ 、リフオスファターゼ法（図６）およびフレンチプレスで破壊した酵母細胞の粗 抽出物から酵素活性を測定する方法（ＳｍｉｌｅｙとＢｏｌｅｎ、　１９８２） で分析した（図７）。 実施例６ 組換えサツカロミセス　セレビシェ由来のキシロース還元酵素の精製 組換えサツカロミセス　セレビシェＨ４７７株を１．５リツトル容の発酵器を用 いて２０ｇ／Ｉグルコースを含有するスフルー（Ｓｃｌｅｕ）培地で培養した。 成長を比濁分析で追跡し、指数関数的増幅期後期に細胞を遠心分離によって回収 し、１．５ｍＭのフェニルメチルフッ化スルホニルを含有するＱ、ＩＭ、　ｐＨ ７，０のリン酸緩衝液で洗浄し、酵母濃度が１００ｇ（乾燥重量）／Ｉになるよ う懸濁した。高圧ホモジナイザー（フレンチプレス）を圧力１０００バールで三 回通し、細胞を粉砕した。ホモジネートを３０分、加速度１５０００ｇで遠心分 離し、一部浄化した。実施例１でビヒア　スティピティスについて記述したよう に、キシロース還元酵素を浄化したホモジネートから精製した。 実施例７ キシリトールのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生産 ０．３３Ｍのキシロース、０．３３Ｍのグルコース−６−リン酸、０゜６７ｍＭ のＮＡＤＰＨｌｏ、１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、１ｎｋｉげｍｌのキシ ロース還元酵素活性をもつ精製したキシロース還元酵素（実施例６）またはＨ４ ７５株の希釈粗ホモジネート由来の活性値１ｎｋａｔ／ｍｌキシロース還元酵素 、活性値１ｎｋａｌ／ｍｌのグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含む反応混合 物を２０℃で、５時間培養した。サンプルを一定時間毎に取り出し、ボーリンジ ャ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｔ）のキシリトールキットを使用しキシリトールを分析 した。毎時ｏ、１４ｇ／Ｉを越える一定のキシリトールの生産率が得られた。 実施例８ キシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素の同時発現 プラスミドｐＵＡ１０３およびｐＵＡ１０７をｘｄｈ遺伝子をプラスミドｐＭＷ ２２上に担持するＶＴＴ−Ｃ−９１１８１株に導入した。形質転換株をロイシン 、ヒスキシン欠乏完全合成培地（Ｓｃ−ｔａｕ−ｈｉｓ）プレート上で選択して 、プレート上に保存した。キシリトール脱水素酵素活性の保持をプレート活性分 析で、キシロース還元酵素活性測定は上述の方法で確認した。更に研究に供すプ ラスミドｐＵＡ１０３およびＰＭＷ２２を担持する両クローンをＨ４９２および Ｈ４９３と名付けた。 プラスミドｐＪＨＸＤＨ５０カら全長（７）ｘｄｈ　ｃＤＮＡを酵母ＡＤＨ１の プロモーターとターミネータ−の間にあるベクターＰＫＢ１０２（Ｂｌｃｍｑｖ ｉｓｊ　ら、１９９１）の旧ｎｄ　Ｉ＋１部位にクローニングした。 このクローニングされたプラスミドｐＪＨＸＤＨ６０（図８）から発現カセット をＢａｍ旧で取り出し、自己複製酵母ベクターｐ３０３０のｌａｍ旧部位にクロ ーンしプラスミドｐＪＨＸＤＨ７０とした。得られたプラスミドをロイシン、ヒ スキシン欠乏完全合成培地プレート上で選択したキシロース還元酵素をコードす るＨ４７７株（子の発現を酵素活性測定（ＳｍｉｌｅｙとＢｏ　ｔｅｎ、　１９ ８２）でテストした。 実施例９ 組換えサツカロミセス　セレビシェによるｉｎ　ｖｉｖｏでのキシリトール製造 Ｈ４７５およびＨ４７７酵母株を１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌバクトペブ トンおよび２０ｇ／Ｉグルコース含有培地で１．５リツトル容の発酵器を用いて 培養した。培養温度は３０℃であった。ｐＨは４．５〜８．０に制御した。撹拌 速度は４０Ｏｒｐｍ、ばつ気速度を０．５ｖｖｍにした。培養ブロスからのサン プルの分析によってグルコースが消費されると、１００ｍ１中に１ｇのグルコー ス、１９ｇのキシロースを含有する溶液の送り込みが毎分０．０９ｍ１の割合で 始まった。全培養時間８３時間後、ＨＰＬＣで分析すると培養ブロスのキシリト ール濃度が１２．５ｇ／Ｉであった。これにより、培養に投与されたキシロース からキシリトールが９５％を越える収率で得られた。ベクターｐＭＡ９１を担持 するコントロール株を使用すると、同様の実験で８％未満のキシロースが消費さ れた。 実施例１０ 組換えサツカロミセス　セレビシェによるキシロース発酵実施例９に記載のサツ カロミセス　セレビシェＨ４９２およびＨ４９３株を２０ｇ／ｌグルコースを含 むロイシン、ヒスチジン欠乏完全合成培地で回転振盪器によって培養した。回転 速度は２０されると、２０ｇ／ｌのキシロースを含むロイシン、ヒスチジン欠乏 完全合成培地中での回転振盪器による発酵の菌接橿器として培養ブロスが使用さ れた。回転速度は９０　ｔ　ｐｍであった。 発酵の間、サンプルを採取しＨＰＬＣ（Ｈａｈｎ−Ｈ’ｊｇｅｒｄａ　Ｉ　ら、 １９８６；ＬｉｎｄｅｎとＨａｈｎ−１１Ｍｇｅｒｄｓｌ、１９１１９ｉ、ｂ） によって分析することによりキシロースが消費され、次にエタノールとキシリト ールが生成した。 実施例１１ 組換えサツカロミセス　セレビシェによるキシロース含有原料の発酵 キシロースの代わりに亜硫酸廃液を使用した発酵培地で実施例１０のようにサツ カロミセス　セレビシェＨ４９２およびＨ４９３株を培養した。キシロースが細 胞、エタノールおよびキシリトールに変換した。 参考文献 著？４　文献名 １、Ｒ，アモール　Ａｐｐｌ、ＭＩｃｒａｋＩＯｌ、Ｂ＋ｌ會ｃｌ＋ｎｏ１１９ ８９．３０：３５１−３５７（Ｒ，ｋａｏｒｅ）ら ２、Ｃ，パルダリ　ＥＭＢＯＪ、１９１７；　６：ＺＺ９−２３４゜（Ｃ，ｌ１ ａｌｄａ＋ｉ）ら ３、Ｍ、Ｆ、Ｓ、パルポザ　Ｓｃ＋＊＊ａｉ＋＋ｌ　ｏｌ　７ｓｓｓｌ＋　ｌｏ ｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＠ｆ　ｘｙｌｉｔｏｌ（Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｂｓ＋ｂｏ＋ ｉ）ら　Ｉ＋・■　Ｄ−ｘ７１ａｓ＠　ｓｎｄ　Ｉｏｖａ＊　Ｉａｃ＋ｏｒｓ　 ｗｈｉｃｈ　ｓｆｌ・ｃ＋Ｂ１１１ｏｌ　７ｉ＠ｌｄ　ｉｎ　Ｃａｏｄｉｄｓ　 ｗｉ１１ｉｅ＋ｍｏ＋＋Ｉｉｉ。 Ｊ、Ｉａｄ、Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ１．１９８８；３：２４１−２５１゜４、Ｃ，Ａ 、パット　Ｍｅｌｍｋｏｌｉｃ　ｐａｌｈｖｓ７　ｉｎ　５ｓｃｃｈｓ＋ｏｍ　 ｃ＠ｓ　ｃｅｒ＠ｖｉｓｉ＊ｅ。 （Ｃ，Ａ、Ｂ１１１）らＢｉｏｎｃｂ＋＋ｏｌｏ（７■ｄＢｔｏｔｕｉｎｅｅｒ ｉｕ１９０４！ｌ：５４９−５５３゜ ５、Ｈ，Ｕ、パーグメイヤー　Ｍｅｌｈｏ４ｓ　ｏｆ　Ｅｎｓ７＋ａａ＋ｉｃ　 Ａｎ＊１ｙｓｉｓ（Ｂ會ｒ９・ｙ＊＋、Ｈ，Ｕ、。 （Ｈ，Ｕ、Ｂｕｇｍｅ７ｓ＋）ら　＊ｄ、）！＋ｄ　＠４．．ｖ６１．３．ｐｐ 、＋３２３−１３３０．７１１１８ｇ　Ｃｂ＠＠＋＠。 Ｗｅｉｉｈｅｉ園　ａＩＩｄ　Ａｃ５ｊ＊ｍｉｃ　Ｐ；・５ｓｊｎｃ、、Ｎｅｗ 　Ｙｏτｋ。 Ｌａｎ＋ｂ＋ｎ、＋９７４゜ ６、　に、プロムクピスト　Ｃｂ＋ｏｍａｓｏ＠ｉｌ　ｉｎ＋ｅ（＋ｓ＋ｉｏ、 ｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｌ　ｔｔ。 ＯＦ、ＢＩａｍｑａ…）ら　ｋｉｃｌ曹＋ｉｉｌ　ａ−ｓｃｅ＋ｏＩｘｃＩｍ＋ ＠　ｄ＊ｃ＊ｒｂｏｘｙＩｚｓ＊　ロａｓｓｉｍ　ｋｒｅｗａｔ’ｓ　７ｅｓｓ １．　Ｓｏｂｍｉｕ＠ｄ、＋９９１゜７、Ａ、Ｆ、ビニツクマン　Ｇ＠＋ｍｌａ 　Ｐａｌ＠ｎｊ　Ｎｏ−２８，４１−４１４＋＋９７９゜（Ａ、Ｆ、Ｂ’ｊｅｋ ｍｕ＋ａ） ８、Ｃ，チャン　ＭＮｌｋｌｌｌｌ＄ｌＩ　ｏｆ　Ｄ−！７１０１＠　ｂ７　ｍ ｏ＋＋Ｉｄｓ、　Ｎａｌ＋＋ｒｅ　１９６０；（Ｃ，Ｃｈｉｉｎｇｌら　１８８ ：Ｎｏ、４７４４．７９−１１゜！、Ｊ、Ｍ、チャゲイン　１ｓｏｌｓｌｉｏｎ 　ｏｆ　ｋｉｏｌｏＨｉｃａｌ１７　ａｃｔｔｖｅ　＋ｉｌ＋ｏｎ＋＋ｃｌ＊１ ｃ（Ｊ、Ｍ、Ｃｈｉ＋ｇｖｉｎ）　ａｃｉｄ　Ｉ＋ｏ＋＋＋　ｔｏｕｃｈ　ｅ＋ ＋ｒｉｃｂｗｄ　ｉｎ　＋１ｂｏｎｕｃｌｓａｓ＊。 Ｂｉｏｃｈｅ＋＋ｉ＋１＋７　Ｈ７９；Ｉ＋１：５２９４−５２９９゜１０、Ｔ 、Ａ、クラーク　Ｊ、Ｃｂｅ＋＊、Ｔｅｅｂ、Ｂｉｏ＋＠ｃｂａｏ１．１９８４ ；３４ｂ：１０１−１１０゜（Ｔ、＾、クラーク）ら ＋１．　Ｄ、Ｒ，クライヤー　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｌ　７＠ｍｓ＋　ＤＮＡ 、　ＭｅＩｈｏｄｓ　Ｃｅ１ｌ旧ｏｆ。 （Ｄ、１．Ｃｒ７＠＋）ら　１９７５；１２：３９−４４゜１２、Ｃ，−３，ゴ ング　ＵＳ　ｂｌ、４．５１１，６５６，１９８５゜（Ｃ，−５，Ｇａｎｇ） ＋３．　Ｄ、グツ−Ｄｉｒｅｃｔ　ｃｌａｎｓ　ｃｂｉｒｓｃｌ＠ｒｉｉａｌｉ ｏｏ　ｆ＋ｏｍ　ｐｌａｑｕ＊ｓ　ａｄｄ（Ｄ、ＧＭｓｘｏｖ）ら　ｃＯｌｏｎ ｉｅｓ　１７　Ｉｂｅ　ｐｏｌｙ＋ａｅ＋暑ｓｅ　ｃｈａｉ口ｎ５ｃｌｉｏｏ。 ｌｔ＋＋ｃ１．Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１９Ｂ９；１７：４Ｇ００−。 １４、　１＋、ハーンハガーデール　Ｉ＋ｓｐ＋ｏｖｅｄ　５ｌｂｓ＋＋ａｌ　 ｐｒｏｄＩＩｃＬｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｂｌｅｓｓ　ｗｉｔｈ（Ｂ、Ｈｓｂ＋＋− １１ｉｇｅ＋ｊａｌｌら　ｇｌａｅａ＋ｅ　ｉ＋ｏ＋ｕｔ＊ｓｅ　ｕ＋ｄ■ｉｎ （Ｉｂｅ　＋５ｓｐｉｒｒｌｏ＋７１ｎｈｉｋＨｏ＋　１ｚｉｄｓ、Ａｐｐｌ。 ＋５．　８．イト−Ｔ＋ａａｓｌｏ＋＋ａａ＋ｉｏｎ　ｏｒ　ｉ＋＋ＩＩｃｔ　 ７ｅ＊ｓｔ　ｃ＊目、ｓ　ＨｅＮ５ｄ（Ｈ，１ｌｏ）ら　ｗｉｔｈ　１ｌｋｓｌ ｉ　ｃｓ＋１ｏａｓ、　Ｊ、Ｂａｃｌ、　１９８３：１５３＋＋６３−１６８゜ １６、ＬキトプリーキャバニクヒＲｅ（ｅｏｅ＋ｓ目ｏｎ　＆　ｒｅｔｅｏｔｉ ｏｎ　ｏｌ　ＮＡＤＰ（Ｈ）ｌｏｔ　ｘＴＩ目０ＩＣＶ、ＫＨ１ｒｅｅｃｂ畠ｖ ａｎＩｃｈ）ら　ｐｒｏｄＩＩｃＬｉｏｎ　Ｉｎ　ｔｏ　＋ｏｎ＋ｓｅｄ　ｍｅ ｍｂｒａｎｅ　＋ｅｓｃｔｏ＋B Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ、Ｌｅ＋＋、１９８５；７：６５フー６６２゜＋７．　Ｋ 、Ｄ、クルペ　Ｅｎｓｙ＋ｏｅ−ｃｓｎｌｎ＠ｊ　ｐｒｏｄａｃ＋＋ｏｎ　ｏｌ 　ｍａｎｎ＋ｌｏｌ　暑ａｄ（Ｋ、Ｄ、ＫｍｌｂｓＪら　（ｌａｃｏｎｉｃ　５ ｃｉｄ、Ａ＋＋ｎ、Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｅｔ、　＋９８７；５０６：５！４− ５６８゜ １８、Ｋ、Ｄ、クルベ　ｌ＠ｊｅｃｔｉｏａ　ｍｌＩ４　Ｃｕ＋ｔｉ＋＋＠ｏａ ｓ　＋Ｂｅａ＠Ｉａｌｉ６ｆｉ　ａｌ（Ｋ、Ｄ、ｌｌｌ１ｂ＠）ら　ｎａｔｉｖ ｅ　ｃｏｕ＋ｔ７ｍｓｓ　ＭＡＤ（Ｈ）／ＮＡＤＰ（Ｈ）　ｉｎ　ａ　ｃｂｃｎ ｅｄ＋＋ＩＩ＋ｓｌ＋ＩＩｒＮ＋ｏｎ　ｍ＠ｍｂｒａｎｅ　＠ａｘｒｍｅ　ｒ＊ 暮Ｃ＋ｏｔ。 ＰａＮ５＋５ｌｔｈｅｌｏｔｈＥ＋＋ｘ７＋ｓ＠Ｅｎｇｉｎ＊ａ＋１ｎ（Ｃｏａ Ｉｅｔ−＠ｎＣｅ、Ｓｅｐ＋、２４−１９１９８９．Ｋｓｓｈｉｋｏｉｉ＋ｕ、 ＪｍＰａｎ。 ＋９．　１．Ｒ，ラディシｚ　Ｅ＋＋ｓ７＋ｕ　Ｍｉｃｔｅｂ、Ｔｓｃｋ＋＋ｏ １．１９８３；５：８２−１０２゜（Ｍ、Ｒ，Ｌｓｄｉｓｈｌら ２０、Ｕ、に、ラムリ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｌ　ｓｌ＋ｗｃｊｗ＋ａｌ　ｐｅ ｏｎｉｎｓ　ｄａｔｉＩＩｇ　ｔｈｅ（Ｕ、に、Ｌａｅ＋ａｍｌｉ）　ａ＊５ｅ ｖａｌｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂ＠ａｄ　ｏｌ　ｂ慮ｃ＋ｅｒｉａｐｂｓ！ｅ　Ｔ ４゜Ｎｓｌ＋＋＋＠１９７０；２２７：ｔｏｏ−６８５゜２＋、Ｓ、Ｍ、ラスチ ック　Ａｐｐｌ、Ｍｉｅ＋ｏｌ＋ｉｏ１．Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ、　１９８９； ３０：５７４−５７９、（Ｓ、ｉｌルｓｓ＋１ｃｋ）ら ２２、Ｔ、リンデン　Ｅｎｔ７＋ａｅ　Ｍｉｃｔｅｂ、Ｔ＠ｅｈｎｏ１．１９Ｂ ９ｓ　１１：５ｇ３−５８９゜（Ｔ、Ｌｔ＋＋ｄ／＋）ら ２３、Ｔ、リンデン　Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ、丁ｅｃｂ＋＋ｉ（＋ｅｓ　１９８ ９ｂ；！：１８９−１９Ｌ（Ｔ、Ｌｉ＋＋＋１ｉｏＪら ２４、Ｔ、マニアテイス　Ｍｏ１ｅｃ＋＋１ｍ＋　ｅｌｏｎｉ＋＋！、　Ａ　１ ｍｂｏ＋ｍｔｏ＋７　ｍ５ｎｕａ１．　Ｃａ１ｌ（Ｔ−１旧ｌｌ１ｌｌら　５ｐ ｒｉＢ　Ｈｓｒｂｏｒ　Ｌｓｌ＋ｏ＋ｊ＋ｏｒ７．Ｎｅｔ　Ｙｏｌｋ　１９０゜ ２５、Ｊ、クラ＋　ＥＩｆｉｃｉｅｎ＋　＋７＋＋ｂｓｓｉｓ　ｏｆ　ｅロｘ７ ｍｓｊｉｃｍｌ１７　ａｃｔｔｖｅ（Ｊ、Ｍｅｌｌｏ＋）ら　ｅ＊ＩＩ　ｅｂ７ ｍｏｓｉ＋＋　Ｉｎ　５ｓｅｃｈａ＋ｏａ　ｃｐｓ　ｃｅｒｅｖｆｆｅ。 Ｇ＠１１ｅ　１９０；２４：１−１４゜２６、Ｈ，オジャモ　Ｆｉｎｎｉｓｈ　 ＰａＬ＠ｎ＋　７ｆ４７７．１９８７゜（Ｈ，Ｏｔａｍｏｌら ！７．　Ｈ，オーニジ　Ｔｈ＠ｐｒｏｊｍｃｌｉ＋＋＋＋　ｅｌ寡７１ｉＨ＋Ｉ 、Ｌ−ａτｄｉＩ１ｍａｌ　５ｍ４（）１．ｏｎｉｓｂｉ）　ｒｉｋｉｊｓｌ　 珈７　１ｏａｔｈ、ＡＢ、Ｂｉｏｌ、Ｃｂａｍ、＋！６５；コＯ：】１コ９−１ １４４゜ ２８、Ｍ、！、ベンティラ　１ｌｏ１．Ｇｕ＋、Ｇ＊ｎ＠＋、　＋０４：１９４ ：４９４−４９９゜（Ｍ、に、Ｐｅａｌｌ＋ｌａ）ら ！！、１．Ａ、プリオアー　？’＋＠ｃｓｓｓ　ｌｉｏｃｂｅｍｉｓｔ＋７１！ ｇ！；！：Ｈ−３２゜（Ｂ、Ａ、Ｐｒ１ｏｒ）ら ３０、Ｍ、　Ｌ／Ｘ　ｏ　−Ｅｍｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｌ、１９０；１７７：Ｈ ｌ−０１（ＭＪｅｓｌｏｖ）ら ３１、＾、ｖ、サースイー　Ｅｘｐｎ＊５ｉｏｎ　ｏｌ　＋ｂｅ　Ｅ、ｃｏ■ｚ ７１ｏｏｌ１０１１１暑＄＠　ｇｓ＋ｕ（ＡＪ、Ｓｓ＋１ｂｒ）　ｉｎ　Ｓａｃ ｃｈｓｒａｍ　ｔｅｘ　ｅｅｒｅｖｒｘｔａｅ、　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖ：ｔｏｎ。 Ｍｉｔ＋ｏｋｉｏ１．　＋９８７：５３：１９９６−２０００゜３２、Ｔ、セナ ク　＾Ｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｅ＋ｏｋｉａ１．（ｔ＋＋　２ｒ＊５ｎ）１ ９９０゜（Ｔ、５ｅｎｓｃ）ら ３３、Ｒ，Ｓ、シコルスキー　＾ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｔｈａｔ目＠　ｖｅｅ＋ ａｔＫ　ｇｉｌｄ　７ｅａｔ＋　ｂａｇ＋（Ｒ，Ｓ、５ｒｋｒｒｒｓｋυら　５ ｔｒａｉＩＩｊ＋ｌｕｉｇｏ＠ｄ　ｌｏ＋・Ｈｉｅｉｅ＋＋＋　＋ａ寡ｏｉｐａ ｌｓｌｔｏｎ　ｏｆＤＮＡ　ｉｎ　５Ｉｃｃｈａ＋ｏｍ　ｅｅ＋　ｔｅｌｅｖｉ ｓｉｎｇ、Ｇ＊ｎｓ＋ｉｃ＋　１９８９；１２２：１９−２７゜ ３４、Ｋ、スクーグ　Ｅ＋＋ｕｍｅ　Ｍｉｃ＋ｏｂ、Ｔｓｃｂ＋＋ｏ１．１９８ ８；１０：６６−７８゜（Ｋ、Ｓｋｏａｇ）ら ３５、Ｐ、Ｊ、スリニンジャ−！＋＋ｉ７＋ｓｓ　Ｍｉｃ＋ｏＬＴｅｃｂ＋＋ｏ １．１９８７；９：５−１５゜（Ｐ、１．５Ｉｉｎｉｏｅ＋）ら ３６、Ｋ、Ｌ、スマイリー　Ｄ自ｍａａＩＩｒａｔｉｏｎ　＠ｌ　Ｄ−ｘｙｌｏ ｓｅ　＋會ｄｗｃｔｓｓ＊　ｏｎ４　Ｄ−０［、Ｌ、Ｓ自１１Ｂ）らｚＦＩｉｌ ｏｌｄａｈＦ４ｒａＨａａａｓａｉａＰａｔｈ＋ａＩａｎ＋５ｎｎｏ−社■■、 　Ｂｉｏｌ＊ｃｂａｏ１．Ｌ＠ｌ＋、　１９８２；４：６０７゜３ｒ、Ｃ，バン ザイル　トＢｌａｓｔ　＋＋Ｌｉ１ｊｉａ目ａａ　ｋｒ　７（ＣＪＩＯ２７１） ら　Ｃｕ＊ｖｉ＋４ｓｓ、Ｊ、Ｇ＊ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９１９；１３ ５，２７９１−３８、Ｃ，ヴｙンドリー　ＵＳ　Ｆａ＋ｕｕ　Ｎｏ、４．３０４ ．１１５８，１９８１゜（Ｃ，Ｖ富ｎｄ＋・Ｙ）ら ３９、Ｃ，ヴ７ントリ−−ＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ−４，３２６，０３＋、１ ９８２゜（ＣＪｓ＋＋＋ｌ＋ｅ７） ４０、　１．ｓシタケ　！Ｆｌｉｌａｌ　ｐｒｏｄｕｃｅ：ｏｎ　ｋ７　ｓｎ　 ＥｎＩ＊ｔａｂ＊ｔ＋ｅｒ　ｘｐｅｅｉ春ｓ。 （１，Ｙｏｓｈｉｌ薯に＠）ら　＾Ｉ＋、Ｂｉａ１．Ｃｈ豐ｍ、　＋９７ｂ；３ ７４２６１−２２６７゜４１、Ｊ、ヨシタケ　ＸｒｌＨｅｌ　ｐ＋ｃｄｌＩｃ＋ １ｏｌＩｋｙ　ａ　７（Ｊ、Ｙｏ＋ｈｉ＋ａｋｅｌら　５Ｐｅｃｉ＠ｓ、　Ａｒ １．Ｂｉｏｌ、Ｃｈ＠ｍ、１９７３ｂ；３７．Ｚ２５１−２２５９゜４２、Ｒ， ＾、ヤング　Ｙｅｚｕ　ＲＮＡ　ｐａｌｌｍａｒａｓｅ　ＩＩ　ｆｆｅｎｅｓ： １ｓｏｌａｌＬｏａ　ｙｉｌｂ（Ｒ，Ａ、Ｙｏｓｕ）　＠ｏ＋１ｋａｄ７　ｐｒ ｏｂｅｓ、　５ｃｉｕ＋ｃ＠１９０；２２２ニア７８−７８２゜４３、Ｓ、ニー 　１１ｉｏ＋＠ｃｂｎａ１．Ｂｉｏｌｕ＋１．　Ｉ！１８７：２９：１１４４− １１５０゜（Ｓ、Ｙｕ） ４４、Ｒ，Ｊ、ザグルスキー　Ｒ５１ｄ　ｓａｄ　ｔａｇ　ｓｅ４＋＋ｅ＋＋ｃ ｉｌ　ｏｆ　１ｉｔ（ｅ　１ｉｎｅａｒ（１，Ｊ、ＺＢＩＩｒｓｋ７）ｄｏｍｋ ｌ＠＄ＩＩｌｆｉｄｌｄＤＮＡｓｏ４ｓｍＰｅ＋ｃｏｉｌｓｊｐｌｓ＋ａｉｄＤ ＮＡ、Ｇａｖｅ　Ａｏｓｌ、Ｔ＠ｃｂ＋、１９８６；！：８９−９４゜配列 配列番号＝　１ 配列の型：　ペプチド 配列の長さ：　９個のアミノ酸 トポロジー：　直鎖状 起ｇ：　ビヒアステイピテイスＣＢ５−６０５４直接実験情報：　蛋白質精製お よびＮ−末端シーフェンシング 特徴：　完全な蛋白質の１番目から９番目のアミノ酸特質：　キシロース還元（ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ）酵素のＮ−末端ペプチド Ｐｔｏ　Ｘａｉ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅａ　Ａｓｎ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ配 列番号：　２ 配列の型：　蛋白に対応するヌクレオチド配列の長さ：　９５４塩基対 鎖の数：　−重鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の型：　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ、　ｇｅｎｏａ＋ｉｃ　ＤＮＡ起源：　ビヒア スティビティスＣＢ５−６０５４直接実験情報：　ｃＤＮＡライブラリーＩｅｎ ｏｍｉｃ　ＤＮＡからのＰＣＲ増幅増幅機特徴完全な蛋白質の１〜９５４番目ま での塩基対特質：　生産物のキシロース還元酵素（ＮＡＤＨＰ／ＮＡＤＨ）活性 ＧＧＴＴｉＣＧ心Ｃ’ｌ’Ｃテ〒ＣＯＡＡＡ　ＣＴＣＧＡＣσＴＣＧ＾Ｃ＾ＣＣ Ｍ〒↑ＣＯＧ＾＾ｃｈａ　ｓ。 Ｇ１ｙＦ？ｎＧｌｙＣｙｍＴｒｐＬ、ｙｍＶａｌＡｓｐｖａｌＡＪＰ丁ｈｒｅｙ ｇｓｓｒｄｌｕａ１ｎ２ｏ　２％　）６ ＾〒Ｃ〒八ＣＣＣへＣＣＴ＾丁Ｃ＾＾ＧＡＣＣＧσＴ丁＾Ｃ＾Ｃ＾τｒａｔｒｃ ＣＡＣｃσＴＧＣＣＪコ５Ｘｌ＠　丁ｙｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｘｌ＠　ＬＹＩＩ 　Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　ＴＹｒ　ｘｒｑ　ｔａｕ　ＰｂＳ　＾ｇｐ　Ｇｌｙ　＾１− コ９４０４％ ＧＡＡ　ＧｋＴ　ＴＡＣＧＣＣＡＡｅ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　１＋ｒＡ　Ｇ〒ＴＣＧ 〒Ｇｅｅ　ＣＣＴ　ＣＴＣＡＡＣＡ＾ａ　１１１１ＧＬｕ＾ａｐ　ＴＹｒ　Ａｌ ａ　Ａｇｎ　＋：ｌｕ　Ｌｙｅ　！Ｊｕνａｌ　（ｆｌｙ　Ａｌｍ　Ｃ１ｙ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｍ　Ｌｙｍｓｏ　ｓｓ　ｇ。 ＧＣＣＡ′ｒｒ　ＧｋＣＧ＆ＡＧＣＴ　＾ＴＣｃ？ＣＡＡＧ　ＣｅＨτＧ入ＡＧ ＾ｃ　ｒｙｅ　’ｒｒｃ　ｃ丁〒ＡＣｅ　２２５＾１ａ　Ｘｉｓ　ｋ龜ｐ　にＧ ｌｕ　ＯＩＹ　Ｘｉ＠　ＶａＩ　ＬｙＩＩＡｒｇ　Ｇｌｕ　ｈｐ　ｔａｕ　ＰＭ し１笥【ｉｓ　ｔｏ　）Ｓ 丁ＣＣＭＧＴｉＣ丁０ＯＡＡＣＡＡｅＴｋＣＣＡＣｅＡＣＣＣＪｋＧ＾ｅＡＡｅ ＧＴＣＧｋＡＡＡＣ３７０ｍａｒＬｙ１１ｔａｕ丁ｒｐ＾ｌｌｌ’ｌ＾−ｎｔｙ ｒＭｉｘｌ１１ｓＰｒＤ＾ｓｐ＾５ｎＶａｌ（ｆｌｕＬｙｅＳロ　・ｓ　９゜ ＴＴＣ？ｒｅＴｉＧＡ？ｅ（Ｊ（：ｆｆｃ（：ｅＡ（ＹＣＡＣｅ丁丁ｅｋｋＧ？ ？ｅＣＴＴｅｃＡＴＴＡコロ０ＬａｕＰｈ＊Ｃｊｌｕ！１ｓＮ１ｇＰｈ＊１’ｒ ＯＶａｎ丁ガｒ？ガ１１Ｌｙ１１Ｐｈ＠Ｖａｌ’ＰｒｏｔａｕＧｋＡ　ＡＡＣＴ ＴＣにＴｅ　ｋｋＧ　ＧＣＣ００丁　ＡＡＧ　Ａｒｃ　ＡＧＡ　丁ＣＴ　Ａｒｃ 　Ｃ；にＴ　ＧＴテ　丁Ｃ？　４９％Ｃ１ｕＬｙｓＬ＊ｕＶａｌＬｙｓＡｌａＣ １ｙＬｙｍＸｉｓ＾ｒ９Ｓ＠ｔＸｉｓＧ１ｙＶ畠１５＋＋ｒｘｓｓ　ｚｉｏ　ｕ ｓ ＾τＣＡＡＧ　ＣｅＡ　ＴＣＴ　Ｃ；ＴＣ↑Ｔｌ：　ｅＡＡ　ｃＴ′ｒ　ＧＡＡ 　Ｃ＾ＣＣ＾ＣＣＣ＾　ＴＡＣＴＴＣＣ入＾　５寥５■ｌ・　しｙｓ　ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｌａｕ　ａλｎ　シーＩ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｈｌｇ　Ｐｒｏ　 丁ｙｒ　Ｌａｕ　Ｃ１ｎｘｓｓ　ｔｗｏ　ｉｔｓ 図１ ＨｉｎｄＩＩＩ 図２ 図３ 図４ 図５ °）口・ｅ・−平滑末端 図６ Ｋ　１　２　３４５６７８　９ 図７ ＮＡＤＰＨによるキシロース還元酵素活性時間（分） ｐＬＩＡＩｏ３　＝　ｐ閾１　−１’−ｐｕＡ＋０７　＝　ｐＲ５ＸＩｓＮＡＤ Ｈによるキシロース還元酵素活性時間（分１） ｐＬＩＡＩｏ）４ｐＷＩ＝ｐｕ＾１０７−ｇシーｐ＊５５０ｓ明８ 要約書 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に本発明は、キシロース還元酵素およ び／またはキシリトール脱水素酵素のそれぞれの遺伝子を導入した新規な組換え 酵母株に関する。 キシロース還元酵素遺伝子を導入した酵母株は、キシロースをキシリトールに還 元することができ、その結果キシリトールをｉｎ　ｖｉｖｏで製造することがで きる。両遺伝子が酵母株に導入されると、導入された酵母株は、キシロース含有 培地を用いる発酵でエタノールを製造することができる。 更に、この新規な酵母株は、上記２種の酵素を発現することができる。これらの 菌から生産されたキシロース還元酵素は、酵素を用いるキシリトールのｉｎ　ｖ ｉｊｔｏな製造方法で使用できる。 国際調査報告 ｌ１１−自一−＾−１ｅｍｗ−亀Ｐ口／ＦＩ９１１００１０３１＋ｍｒａｍｍ＠ ｌ＾−−−醜Ｐ口／Ｆｌ　９１１００１０３Ｉｎｌｅ＋＋ｖ１ｍ−＾−＠ｌ１ｕ ｌｌ＊ＡＮ＠ＰＬ：Ｉ／）　Ｉ’１１１０口１０３国際調査報告 ＰＣＴ／ＦＩ　９１１００１０３ ＰＣＴ／ＦＩ９　ｊ　７００１０３

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母株に導入すると該酵母株がキシロースをキシリトールに還元することを 可能にする、キシロース還元酵素をコードするＤＮＡ配列。
2. ２．配列番号２で示されるアミノ酸配列を本質的に含むポリペプチドまたはその 断片、但し該ポリペプチドまたはその断片はキシロース還元酵素活性を呈する、 をコードする請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. ３．酵母株に導入すると該酵母株のキシリトール資化を可能にする、キシリトー ル脱水素酵素をコードするＤＮＡ配列。
4. ４．請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む酵母ベクター。
5. ５．請求項３に記載のＤＮＡ配列を含む酵母ベクター。
6. ６．酵母株に導入すると自己複製が可能な請求項４または５に記載の酵母ベクタ ー。
7. ７．酵母株に導入すると酵母株の染色体中に組み込むことが可能な請求項４また は５に記載の酵母ベクター。
8. ８．該ＤＮＡ配列が酵母遺伝子の調節領域のもとで発現する請求項４または５に 記載の酵母発現ベクター。
9. ９．該酵母遺伝子調節領域が、キシロース還元酵素遺伝子のプロモーター領域、 キシリトール脱水素酵素遺伝子、酵母株アルコール脱水素遺伝子ＡＤＨ１、酵母 株ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子ＰＧＫ１、及びそれらの作用部分領域から なる群から選ばれる請求項８に記載の酵母発現ベクター。
10. １０．ｐＵＡ１０３，ｐＵＡ１０７およびｐＪＨＸＲ２２からなる群から選ばれ る請求項４に記載の酵母ベクター。
11. １１．ｐＭＷ２２，ｐＪＨＸＤＨ６０およびｐＪＨＸＤＨ７０からなる群から選 はれる請求項５に記載の酵母ベクター。
12. １２．請求項１に記載のＤＮＡ配列を担持し、キシロース還元酸素を発現する組 換え酵母株。
13. １３．サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）Ｈ４７５，Ｈ４７７，Ｈ４７９およびＨ４８１からなる群から選ばれ る請求項１２に記載の組換え酵母株。
14. １４．請求項３に記載のＤＮＡ配列を担持し、キシリトール脱水素酵素を発現す る組換え酵母株。
15. １５．サッカロミセスセレビシエＶＴＴ−Ｃ−９１１８１，Ｈ４９４，Ｈ４９５ ，Ｈ４９６またはＨ４９７である請求項１４に記載の組換え酵母株。
16. １６．請求項１および３に記載のそれぞれのＤＮＡ配列を有し、キシロース還元 酵素およびキシリトール脱水素酸素を発現する組換え酵母株。
17. １７．サッカロミセスセレビシエＨ４９２およびＨ４９３からなる群から選ばれ る請求項１６に記載の組換え酵母株。
18. １８．キシロース還元酵素またはキシリトール脱水素酸素を発現させることがで きるか、あるいはキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素を共に発現 させることができる新規な酵母株を作製する方法にして、（ａ）キシロース還元 酸素およびキシリトール脱水素酵素をそれぞれコードするＤＮＡ配列を適切な供 与体生物から単離し、 （ｂ）それぞれのＤＮＡ配列のどちらか一方を担持する酵母ベクターを構築し、 そして （ｃ）得られたベクターのどちらか一方または両方のベクターを適切な宿主酵母 に導入する ことを包含する方法。
19. １９．ベクターを導入する宿主が、サッカロミセスセレビシエ種、クライベロミ セス種類、シゾサッカロミセスボンベ種およびピヒア種類からなる群から選ばれ る請求項１８に記載の方法。
20. ２０．該宿主がサッカロミセスセレビシエ種である請求項１９に記載の方法。
21. ２１．キシロース還元酵素の製造方法にして、（ａ）キシロース還元酵素をコー ドするＤＮＡ配列を適切な供与体生物から単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列を担持する酵母ベクターを構築し、（ｃ）得られた心外を適 切な宿主酵母に導入して組換え宿主株を得、 （ｄ）該キシロース還元酵素が発現できる条件下で該組換え宿主株を培養し、そ して （ｅ）該キシロース還元酵素を回収することを包含する方法。
22. ２２．請求項２１に記載の方法によって生産されるキシロース還元酸素。
23. ２３．酵素を用いるキシリトールの製造方法にして、（ａ）補助因子再生系を有 する反応器中で、請求項２１記載の方法により生産されるキシロース還元酵素を 使用して、（ｂ）生成するキシリトールを単離精製することを包含する方法。
24. ２４．微生物学なキシリトールの製造方法にして、（ａ）キシロース含有培地で 、請求項１２または１６に記載の組換え酵母株を培養し、 （ｂ）生成するキシリトールを培地から回収することを包含する方法。
25. ２５．該培地に補足的な炭素源を添加して、キシロース還元酵素が必要とする補 助因子の再生を促進する請求項２４に記載の方法。
26. ２６．請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法によって生産されるキシリトー ル。
27. ２７．活性なキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素を酵母株中で共 に発現させる方法にして、（ａ）適切な供与体生物より、キシロース還元酵素お よびキシリトール脱水素酵素をそれぞれコードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）それぞれのＤＮＡ配列をそれぞれ担持する酵母ベクターを構築し、 （ｃ）得られたそれぞれのベクターを適切な宿主酵母に導入して組換え酵母株を 得、 （ｄ）該組換え酵母株を、該組換え酵母株中の各遺伝子を発現できる培地か、ま たはキシロース含有培地にて培養し、そして （ｅ）培地中に産生する各目的生成物を単離精製することを包含する方法。
28. ２８．生成物がエタノールである請求項２７に記載の方法。
29. ２９．請求項２８に記載の方法により生産されるエタノール。