CN115976005A - 一种基于祖先序列构建方法获得的木糖异构酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于祖先序列构建方法获得的木糖异构酶及其应用，这些木糖异构酶是基于祖先序列构建方法获得，它们具有ID NO.1～SEQ ID NO.4中任一氨基酸序列，它们的单独表达或组合表达能够赋予酵母细胞转化木糖为木酮糖的能力，进而赋予宿主细胞将木糖转化为其他产物的能力。本发明还涉及此四种木糖异构酶在酵母利用木糖为底物生产乙醇等化学品上的应用。当该木糖异构酶在酿酒酵母等酵母细胞中被表达时，能够使原来不具备转化木糖为木酮糖能力的宿主获得该转化能力，并赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液等富含木糖的原料生产乙醇等化学品的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于祖先序列构建方法获得的木糖异构酶及其应用，这种木糖异构酶的氨基酸序列并不来自于自然界，而是根据已知木糖异构酶氨基酸序列通过计算机算法重构获得。
背景技术
木糖是自然界中储量最丰富的五碳糖，是秸秆等木质纤维原料中除葡萄糖外最主要的糖组分。通过微生物代谢途径将木糖有效地转化为乙醇、油脂等化学品是玉米秸秆等木质纤维素原料炼制的一个重要方向。许多微生物，例如酿酒酵母，具有完整的木酮糖代谢系统，木酮糖在木酮糖激酶的作用下生成5-磷酸木酮糖，进入非氧化磷酸戊糖途径，进而可以继续转化为多种化学品。因此，如何将木糖转化为木酮糖则成为了木糖利用的关键。自然界中主要存在两种木糖代谢途径，第一种是存在于毕赤酵母等真菌中的木糖还原酶-木糖醇脱氢酶途径，NADPH偏好性的木糖还原酶(xylose reductase，XR)将木糖还原为木糖醇，NAD+依赖的木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase，XDH)将木糖醇氧化为木酮糖(Bioprocess and biosystems engineering,2020,43(8):1509-1519)。第二种是存在于细菌和少数真菌中的木糖异构酶途径，木糖异构酶(xylose isomerase，XI)可以直接将木糖异构生成木酮糖(Critical Reviews in Biotechnology,2022,42(5):693-712)。
酿酒酵母等酵母菌株是重要的一类工业微生物菌株。自上世纪九十年代起，就有大量在酿酒酵母中表达木糖异构酶的研究。然而，初期表达的木糖异构酶均没有活性，可能是因为蛋白质错误折叠、翻译后修饰、二硫键形成和不适的胞内pH等原因。直到1996年，来自Thermus thermophilus的木糖异构酶(TheXI)第一次在酿酒酵母中活性表达，但其最适温度为85℃，在30℃时仅保持4％活性，限制了进一步应用(Applied and Environmental Microbiology,1996,62(12):4648-51)。2003年，Kuype等报道了来自厌氧真菌Piromycessp.E2的木糖异构酶(PirXI)，在酿酒酵母中表现出高活性，此后被大量用于木糖代谢酵母的构建(FEMS Yeast Research,2003,4(1):69-78)。至今，也仅有少量在酿酒酵母中活性表达的木糖异构酶被发现。
目前常使用的木糖异构酶发现方法主要有两种。第一种为从自然界中的木糖代谢微生物或富含这种微生物的环境中直接扩增木糖异构酶基因，然后将获取的基因在酿酒酵母中表达、筛选，从而得到活性木糖异构酶。例如，目前已经从瘤胃真菌Orpinomyces、厌氧细菌Bacteroides stercoris HJ-15和Bifidobacterium longum MG1、黄色瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens、木聚糖降解微生物Prevotella spp.、哺乳动物肠道Bacteroidetes group中扩增得到在酿酒酵母中存在活力的OrpXI(Applied Microbiology and Biotechnology,2009,82(6):1067-78)、BasXI(Applied Microbiology and Biotechnology,2011,92(1):77-84)、RumXI(Journal of Industrial Microbiology& Biotechnology,2012,39(11):1597-604)、PreXI(Biotechnology for Biofuels,2013,6: 84)、BavXI(Microbial cell factories,2015,14(1):1-14)。另一种方法是对可能存在木糖异构酶基因序列的环境宏基因组进行测序，根据测序结果推测出可能的木糖异构酶，然后对相关基因序列进行体外合成和酵母体内表达筛选。例如，对黄牛的粪便和帕萨利甲虫(Ordontotaenius disjunctus)的肠道微生物宏基因组测序，分别推测得到92、182个假定的XI，从中筛选到在酿酒酵母中存在活性的LacXI(Applied Microbiology and Biotechnology,2019,103(23):9465-9477)和PasXI(Scientific Reports,2021,11(1): 4766)。但是这种依赖木糖代谢微生物或依赖富含这种木糖代谢微生物的环境样品的方法限制了更多的木糖异构酶发现速度以及高活性的木糖异构酶发现。
从已知的现存蛋白质序列中推导出古代/祖先蛋白质序列相对合理的近似值的设想最初是在1963年左右提出(Acta chem scand,1963,17:S9-S16)。然而，长期以来祖先序列构建一直是一个理论概念。近年来，随着生物信息学的进步，蛋白质序列的日益增加和分子生物学的进步使得祖先序列编码的蛋白质能够在实验室中分子克隆，逐渐成为研究酶序列、结构和功能关系的有力手段。目前祖先酶构建通常可分为以下几个步骤：依次为现代酶的核酸/氨基酸序列收集、多序列比对、系统发育树构建、祖先酶序列的计算机推测、基因克隆、酶学性质表征。该方法广泛应用于研究分子在行星时间尺度上对环境条件不断变化的适应性和进化机制。随着酶在生物催化领域中扮演越来越重要的角色，该方法逐渐成为研究酶序列、结构和功能关系的有力手段(Current Opinion in Structural Biology,2021, 69:131-141；Briefings in bioinformatics,2021,22(4):bbaa337)。已知在酿酒酵母中有活性的木糖异构酶大部分来自厚壁菌门和拟杆菌门，它们位于木糖异构酶系统进化树的两个不同分支。厚壁菌门和拟杆菌门的祖先可能具有在酿酒酵母中转化木糖为木酮糖的能力，但随着时间的推移，在基因扩增和转移的过程中不断产生各种突变，导致氨基酸序列发生变化，可能提高、降低或消除XI在酿酒酵母中表达时的活性。通过祖先序列构建的方法人工构建出厚壁菌门和拟杆菌门的XI祖先序列，这些人工构建的XI祖先序列很可能可以在酿酒酵母中表现出活性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于祖先序列构建方法获得的木糖异构酶及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种人工构建的木糖异构酶，其特征在于，其氨基酸序列为以下氨基酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的任一者所示的氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列。
进一步地，其核苷酸序列为以下核苷酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个核苷酸的核苷酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中任一者所示的核苷酸序列具有70％以上的同一性的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的核苷酸序列。
进一步地，所述木糖异构酶的氨基酸序列并不来自于自然界，而是根据已知木糖异构酶氨基酸序列通过计算机算法重构获得。
进一步地，所述木糖异构酶的表达均能够赋予宿主细胞转化木糖为木酮糖能力，从而赋予宿主细胞同化木糖的能力,所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞Saccharomyces、耶氏酵母Yarrowia、假丝酵母Candida、毕赤酵母Pichia、裂殖酵母Schizosaccharomyces、汉逊酵母Hansenula、克鲁维酵母Kluyveromyces。
进一步地，所述木糖异构酶在宿主的表达方式为以下方式之一：
(1)木糖异构酶基因连接到宿主的游离质粒上，在宿主中进行游离表达；
(2)木糖异构酶基因整合到宿主细胞的染色体上，在宿主中进行整合表达；
(3)木糖异构酶基因在宿主中同时进行游离表达和整合表达。
进一步地，所述木糖异构酶可以单独在宿主菌株中表达，也可以共同在宿主细胞中表达。其中共同表达的形式包括SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.5+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.8、SEQIDNO.7+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.5+SEQ IDNO.6+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6+SEQ IDNO.7+SEQID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8。
进一步地，所述酵母细胞是野生菌株或是进行了一个或多个遗传修饰的酵母细胞。
一种上述木糖异构酶的应用，该应用具体为：所述木糖异构酶赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液生产多种发酵产品，包括木酮糖、果糖、乙醇、丁醇、微生物油脂、游离脂肪酸、糠醛、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙酸、己二酸、木酮糖-5-磷酸、异戊二烯、聚羟基脂肪酸酯、赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、香草酸、香草醛。
本发明的有益效果是，本发明公开了四种新的可以在酵母细胞中高活性表达的木糖异构酶的氨基酸序列和核苷酸序列。这四种木糖异构酶均来自人工构建，它们的单独表达或组合表达能够赋予酵母细胞转化木糖为木酮糖的能力，进而赋予宿主细胞将木糖转化为其他产物的能力。本发明还涉及此四种木糖异构酶在酵母利用木糖为底物生产乙醇等化学品上的应用。当该木糖异构酶在酿酒酵母等酵母细胞中被表达时，能够使原来不具备转化木糖为木酮糖能力的宿主获得该转化能力，并赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液等富含木糖的原料生产乙醇等化学品的能力。
附图说明
图1是基于祖先序列构建方法获得木糖异构酶的展示图，其中图中①②③④分别代表四种计算机推测的具有祖先序列的木糖异构酶，编号为AncXI-1、AncXI-2、AncXI-3、AncXI-4，其蛋白质序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；
图2是四种木糖异构酶在酿酒酵母中游离表达时，重组酿酒酵母CRD3A1、CRD3A2、CRD3A3、CRD3A4以初始40g/L木糖为碳源发酵96小时后的发酵液成分柱状图；
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的核苷酸序列，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，其均不能脱离本发明的精神和思路。除特别指出以外，实施例中的百分比为质量百分比。
本申请通过搜集同源序列集、序列集多序列比对、系统发育树构建和计算机工具推测祖先序列可以构建出了木糖异构酶的四条人工祖先序列，这四条木糖异构酶在氨基酸序列上和目前所有已公布的木糖异构酶(NCBI数据库中目前已公布了20万条可能的木糖异构酶序列，这些木糖异构酶序列均为对环境或微生物样品测序获得的)在序列上都呈现出很大差异。并通过基因合成、基因表达、酶活力测试和发酵实验证明构建的四条木糖异构酶序列在酿酒酵母中均能够赋予酿酒酵母菌株较高的木糖利用能力。
本申请提供一种人工构建的木糖异构酶，其氨基酸序列为以下氨基酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的任一者所示的氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列。
具体地，其核苷酸序列为以下核苷酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个核苷酸的核苷酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中任一者所示的核苷酸序列具有70％以上的同一性的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的核苷酸序列。
具体地，所述木糖异构酶的氨基酸序列并不来自于自然界，而是根据已知木糖异构酶氨基酸序列通过计算机算法重构获得。
具体地，所述木糖异构酶的表达均能够赋予宿主细胞转化木糖为木酮糖能力，从而赋予宿主细胞同化木糖的能力,所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞Saccharomyces、耶氏酵母Yarrowia、假丝酵母Candida、毕赤酵母Pichia、裂殖酵母Schizosaccharomyces、汉逊酵母Hansenula、克鲁维酵母Kluyveromyces。
具体地，所述木糖异构酶在宿主的表达方式为以下方式之一：
(1)木糖异构酶基因连接到宿主的游离质粒上，在宿主中进行游离表达；
(2)木糖异构酶基因整合到宿主细胞的染色体上，在宿主中进行整合表达；
(3)木糖异构酶基因在宿主中同时进行游离表达和整合表达。
具体地，所述木糖异构酶可以单独在宿主菌株中表达，也可以共同在宿主细胞中表达。其中共同表达的形式包括SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6(组合1)、SEQ ID NO.5+SEQ IDNO.7(组合2)、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.8(组合3)、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7(组合4)、SEQID NO.6+SEQ ID NO.8(组合5)、SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8(组合6)、SEQ ID NO.5+SEQ IDNO.6+SEQ ID NO.7(组合7)、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.8(组合8)、SEQ IDNO.5+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8(组合9)、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8(组合10)、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8(组合11)。
具体地，所述酵母细胞可以是野生菌株，也可以是进行了一个或多个遗传修饰的酵母细胞。
本申请还提供一种上述的木糖异构酶的应用，该应用具体为：所述木糖异构酶赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液生产多种发酵产品，包括木酮糖、果糖、乙醇、丁醇、微生物油脂、游离脂肪酸、糠醛、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙酸、己二酸、木酮糖-5-磷酸、异戊二烯、聚羟基脂肪酸酯、赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、香草酸、香草醛。
本申请公开了四种新的可以在酵母细胞中高活性表达的木糖异构酶的氨基酸序列和核苷酸序列。这四种木糖异构酶均来自人工构建，它们的单独表达或组合表达能够赋予酵母细胞转化木糖为木酮糖的能力，进而赋予宿主细胞将木糖转化为其他产物的能力。本发明还涉及此四种木糖异构酶在酵母利用木糖为底物生产乙醇等化学品上的应用。当该木糖异构酶在酿酒酵母等酵母细胞中被表达时，能够使原来不具备转化木糖为木酮糖能力的宿主获得该转化能力，并赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液等富含木糖的原料生产乙醇等化学品的能力。
以下结合实施例进行具体说明。
实施例1：木糖异构酶序列的构建
1.1、木糖异构酶数据的获得
使用NCBI中的BLAST功能，以来自Piromyces sp.E2的XI氨基酸序列作为模板，对NCBI数据库中的氨基酸序列进行BLAST，下载其中得分大于300、长度为370-470的氨基酸序列。使用CD-HIT对获得的氨基酸序列进行聚类分析，同一性阈值设定为73％，获得非冗余的氨基酸序列。
1.2、木糖异构酶系统进化树构建
使用MEGA 11软件加载筛选的氨基酸序列、文献中报道可以在酿酒酵母中活性表达的XI序列，通过ClustalX功能进行多序列比对。保留氨基酸位点保守的序列(金属结合残基H102、D105、E233、K235、E269、H272、D297、D308、D310、D340以及底物口袋周围残基W50、F61、F146、W140、W189(氨基酸位置根据来自Piromyces sp.E2的XI氨基酸序列标出))。使用Fastree进行系统发育树构建，使用的模型为最大似然法，bootstrap值为1000。利用iTOL对得到的系统发育树进行优化(https://itol.embl.de/)，XI序列的种属、长度信息从NCBI数据库中获得。
1.3、人工构建木糖异构酶
选择目前已知木糖异构酶序列构建的系统进化树中指定节点进化形成的所有现存XI，将氨基酸序列信息加载到MEGA 11软件。通过ClustalX功能进行氨基酸序列比对，删除比对结果中的Graps，通过最大似然法构建处理后的氨基酸序列的系统进化树。使用pamlX的CodeML功能进行祖先序列推测，首先加载处理后的氨基酸序列比对结果文件和系统进化树文件，修改软件参数(ncatG：8、Small Diff：5e-6、amino acid rate file：Pamltest\paml4.9j\dat\wag.dat、fix blength：2：fixed、model：3：Empirical+F、RateAncestor)。运行软件，得到生成的系统进化树中各个节点的祖先序列。
结果1：
从NCBI数据库的250000个氨基酸序列中得到了867个序列，使用这867个XI和16个已报道的在酿酒酵母中具有高活性的XI建立系统发育树。如图1所示，获得的系统发育树具有9个主要的进化分支，16个文献中报道的在酿酒酵母中有活性的XI大多来自拟杆菌(第IX分支)和厚壁菌(第IV分支)。构建图1系统进化树中指定节点的祖先序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。为了比较这些推测的氨基酸序列与现存XI的相似度，使用NCBI的BLAST功能，发现它们与各自最相似XI的最大Per.Ident为82.15％-90.14％(表1)。其氨基酸序列已完全不同于现在已知的XI。
表1四种木糖异构酶的氨基酸序列与目前已知蛋白氨基酸序列的比对结果
| 祖先序列 | 和已知蛋白最大相似度 | 已知蛋白质的NCBI登录号 | 已知蛋白质的来源 |
| AncXI-1 | 90.14％ | OUM58912.1 | Piromyces sp.E2 |
| AncXI-2 | 83.03％ | WP_028668460.1 | Runella zeae |
| AncXI-3 | 82.15％ | WP_092638076.1 | Acetanaerobacterium elongatum |
| AncXI-4 | 82.31％ | WP_094546057.1 | Petroclostridium xylanilyticum |
实施例2：四种木糖异构酶基因在酿酒酵母中游离表达
2.1、游离表达载体的构建
委托金斯瑞生物科技股份有限公司对SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的木糖异构酶核苷酸序列分别进行合成。之后将合成的四条核苷酸大分子分别插入酿酒酵母游离表达载体，具体步骤为：将G418抗性基因插入至酿酒酵母游离表达载体pESC-URA的SmaI-SalI位点，获得G418_pESC-URA质粒；然后将酿酒酵母启动子TDH3序列插入至G418_pESC-URA质粒的KpnI-NheI位点，获得TDH3_G418_pESC-URA质粒；最后分别将合成的SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8对应的大分子核苷酸片段插入TDH3_G418_pESC-URA质粒的NheI位点，获得木糖异构酶游离表达载体pESC-Anc1、pESC-Anc2、pESC-Anc3、pESC-Anc4。在获得这些酿酒酵母游离表达载体中木糖异构酶基因5’侧为TDH3启动子，3’侧为CYC1终止子。
2.2、游离表达载体的转化及转化子的筛选
将具有木糖异构酶基因的质粒pESC-Anc1、pESC-Anc2、pESC-Anc3、pESC-Anc4转化至双倍体酿酒酵母CRD3(ATCC 26603,MATa/α,△Gre3，pho13::TPI1p-XKS1-ADH1t-FBA1p-TKL1-FBA1t-PGK1p-RKI1-GAL2t，pyk2::TEF1p-GAL2N376F-TEF1t-TDH3p-TAL1-PGI1t)，转化子在YPD平板(400μg/mLG418)筛选，未转化的细胞不能在这些平板上生长。以平板上的单菌落为模板，PCR扩增相应的木糖异构酶基因并测序，鉴定含有相应木糖异构酶基因质粒的转化子，分别命名为CRD3A1、CRD3A2、CRD3A3、CRD3A4。
2.3、重组菌株利用木糖能力测定
将酵母CRD3A1、CRD3A2、CRD3A3、CRD3A4于YPD(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)培养基过夜培养，然后以初始OD600为1.0转接到YPX(2％蛋白胨、1％酵母提取物、4％木糖)培养基，30℃，150rpm进行培养。高效液相色谱(HPLC)测定培养基中的木糖和乙醇浓度。使用紫外分光光度计在600nm波长下测量OD600来监测酵母生长。
结果2：
如图2所示，YPX培养基初始木糖浓度为40g/L，当酿酒酵母CRD3A1、CRD3A2、CRD3A3、CRD3A4在其中培养96h后，消耗的木糖含量分别为12.43、11.80、12.70、8.84g/L，并且伴随着菌体的生长和乙醇的生成。该结果表明，本实验室中涉及的四种木糖异构酶在酿酒酵母中表达后，均赋予了酿酒酵母转化木糖为木酮糖的能力，使其可以利用木糖生长，并生成乙醇。
Claims (8)
1.一种基于祖先序列构建方法获得的木糖异构酶，其特征在于，其氨基酸序列为以下氨基酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的任一者所示的氨基酸序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的木糖异构酶，其特征在于，其核苷酸序列为以下核苷酸序列之一：(1)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列添加、缺失、取代或插入了1个或多个核苷酸的核苷酸序列；
(3)具有与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中任一者所示的核苷酸序列具有70％以上的同一性的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的木糖异构酶，其特征在于，所述木糖异构酶的氨基酸序列并不来自于自然界，而是根据已知木糖异构酶氨基酸序列通过计算机算法重构获得。
4.根据权利要求3所述的木糖异构酶，其特征在于，所述木糖异构酶的表达均能够赋予宿主细胞转化木糖为木酮糖能力，从而赋予宿主细胞同化木糖的能力,所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞Saccharomyces、耶氏酵母Yarrowia、假丝酵母Candida、毕赤酵母Pichia、裂殖酵母Schizosaccharomyces、汉逊酵母Hansenula、克鲁维酵母Kluyveromyces。
5.根据权利要求3所述的木糖异构酶，其特征在于，所述木糖异构酶在宿主的表达方式为以下方式之一：
(1)木糖异构酶基因连接到宿主的游离质粒上，在宿主中进行游离表达；
(2)木糖异构酶基因整合到宿主细胞的染色体上，在宿主中进行整合表达；
(3)木糖异构酶基因在宿主中同时进行游离表达和整合表达。
6.根据权利要求3所述的木糖异构酶，其特征在于，所述木糖异构酶可以单独在宿主菌株中表达，也可以共同在宿主细胞中表达。其中共同表达的形式包括SEQ ID NO.5+SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQID NO.7、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.7+SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6+SEQ ID NO.7+SEQ ID NO.8。
7.根据权利要求3所述的木糖异构酶，其特征在于，所述酵母细胞是野生菌株或是进行了一个或多个遗传修饰的酵母细胞。
8.一种权利要求1-7中任一项所述的木糖异构酶的应用，其特征在于，该应用具体为：所述木糖异构酶赋予宿主细胞利用木糖或木质纤维素水解液生产多种发酵产品，包括木酮糖、果糖、乙醇、丁醇、微生物油脂、游离脂肪酸、糠醛、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙酸、己二酸、木酮糖-5-磷酸、异戊二烯、聚羟基脂肪酸酯、赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、香草酸、香草醛。
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Cited By (1)
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| WO2023213294A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 南京理工大学 | 木糖异构酶及应用 |
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2023
- 2023-01-13 CN CN202310040197.0A patent/CN115976005A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023213294A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 南京理工大学 | 木糖异构酶及应用 |
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