NO308544B1

NO308544B1 - FremgangsmÕte ved fremstilling av xylitol

Info

Publication number: NO308544B1
Application number: NO923880A
Authority: NO
Inventors: Johan Hallborn; Merja Penttilo; Heikki Ojamo; Mats Walfridsson; Ulla Airaksinen; Sirkka Keronen; Borbel Hahn-Hogerdal
Original assignee: Xyrofin Oy
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1992-10-06
Publication date: 2000-09-25
Also published as: CA2090122A1; DE69128619D1; FI924461A0; FI901771A; ATE161886T1; NO923880L; GR3026489T3; WO1991015588A1; AU7565791A; JP3348215B2; EP0527758B1; DE69128619T2; AU647104B2; JPH05507843A; FI924461A; FI901771A0; DK0527758T3; EP0527758A1; ES2113373T3; FI104636B

Description

Foreliggende oppfinnelse angår mikrobiologisk fremstilling av xylitol som angitt i krav 1. En gjærstamme transformert med xylosereduktasegen er i stand til å redusere xylose til xylitol og følgelig å produsere xylitol in vivo. Dersom disse gener er transformert i en gjærstamme, er den resulterende stamme i stand til å produsere etanol fra xylose-inneholdende medium under fermentering.

Videre er de nevnte gjærstammer i stand til å uttrykke de nevnte enzymer. Xylosereduktase og eventuelt xylitoldehydrogenase produsert av disse stammer kan anvendes i en enzymatisk prosess for fremstillingen av xylitol in vitro.

Bakgrunn for Oppfinnelsen

Xvloseutnvttelse

Xylose opptrer i store mengder i naturen. Den kan utgjøre så meget som 40 % av et lignocellulosemateriale (Ladisch et al., 1983). Ved fermentering kan xylose bli omdannet til etanol som kan bli brukt som et flytede drivstoff eller et kjemisk bruksmateriale. Enzymatisk eller som et biprodukt ved fermentering kan xylose også bli omdannet til xylitol som er et lovende, naturlig søtestoff med tann-caries-reduserende egenskaper. Xylitol kan også bli brukt av diabetikere. For fremstillingen av etanol som et billig produkt er det viktig at råmaterialet kan bli fermentert direkte med så liten forbehandling som mulig. For fremstillingen av xylitol som er ment til humant forbruk er det viktig at prosessen innbefatter GRAS-organismer.

Naturlige xylosebrukere er funnet blant bakterier, gjær og sopp. I alle organismer blir xylose omdannet til xylulose som blir fosforylert til xylulose-5-fosfat (X5P) med xylulokinase. X5P kommer så inn i Embden-Meyerhof-rekken (glykolyse) via pentosefosfat-shunten.

Bakterier slik som Escherichia coli, Bacillus sp., Strep-tomyces sp. og Actinoplanes sp. omdanner xylose direkte til xylulose med en xyloseisomerase (XI). Således danner bakterier ikke xylitol som et intermediat under xylose-anvendelse. De som fermenterer xylose til etanol gjør dette med dårlig utbytte fordi et antall biprodukter også dannes (Skoog og Hahn-Hågerdah, 1988). I xyloseanvendende gjær, såsom Pichia stipitis, Candida shehatae og Pachysolen tannophilus inntreffer denne reakjsonen i to trinn: først reduseres xylose til xylitol med en xylosereduktase (XR) og xylitolen blir oksydert med en xylitoldehydrogenase (XDH) til xylulose.

Rene xyloseoppløsninger blir fermentert med høye utbytter og god produktivitet av xyloseutnyttende gjær, såsom P. stipitis, C. shehatae og P. tannophilus (Slininger et al., 1987; Prior et al., 1989). Vanligvis overlever de imidlertid ikke i det fiendtlige miljø hos et ubehandlet råmateri-ale, såsom f.eks. brukt svovelvæske eller hydrogenfluorid-forbehandlet og syre-hydrolysert kornaks (Linden og Hahn-Hågerdal, 1989). Én unntagelse, P., tannophilus, danner i hovedsak xylitol og glycerol som svar på dette miljø. For effektivt å fermentere slike råmaterialer med xyloseutnyttende gjær, såsom P. stipitis, C. shehatae og P. tannophilus må råmaterialet undergå kostbare forbehandlinger med ionutbytterharpikser (Clark og Mackie, 1984) eller damp-stripping (Yu et al., 1987).

Saccharomyces cerevisiae, bakergjær, fermenterer brukt svovelvæske eller hydrogenfluorid-forbehandlet og syrehy-drolysert stråaks til etanol (Lindén og Hahn-Hågerdal, 1989). S. cerevisiae kan ikke anvende xylose effektivt og kan ikke vokse på xylose som en eneste karbonkilde. I nærvær av det bakterielle enzym xyloseisomerase, som omfatter xylose til xylulose, kan S. cerevisiae imidlertid fermenterer både rene xyloseopøpløsninger (Hahn-Hågerdal et al., 1986) og ubehandlete råmaterialer (Lindén og Hahn- Hågerdal, 1989a,b) til etanol med utbytter og produktivi-teter som er i samme størrelsesorden som dem erholdt i heksosefermenteringer. Lignende resultater er blitt erholdt med Schizosaccharomyces pombe (Lastick et al., 1989). Således har både S. cerivisiae og Sch. pombe et funksjone-rende xylulokinaseenzym. Det er også blitt funnet at S. cerivisiae kan ta opp xylose (Batt et al., 1986; van Zyl et al., 1989; Senac og Hahn-Hågerdal, 1990).

Gong (1985) beskriver en fremgangsmåte for å erholde etanol direkte fra D-xylose med xylosefermenterende gjærmutanter. Ifølge Gong blir en opphavsgjærstamme valgt ut (f.eks. Candida sp. eller Saccharomyces cerevisiae) som opprinnelig kan ha egenskapen å anvende D-xylose, og denne opphavs-stamme blir deretter eksponert f.eks. for UV-bestråling for å indusere mutasjon. Imidlertid blir ingen informasjon om grunnen til hvorfor de erholdte mutanter er i stand til å anvende xylose gitt i referansen. Videre innførte Gong ikke noen nye kodende og/eller regulatoriske sekvenser til disse stammer ved genetisk manipuleringsteknikker for å øke xylosefermentering.

Xylitol blir industrielt fremstilt for tiden ved reduksjon av hemicellulosehydrolysater. Forgiftning av den kostbare katalysator som brukes i reduksjonstrinnet og dannelse av biprodukter som vanskelig kan separeres fra sluttproduktet er hovedproblemer i denne prosess.

I litteraturen er de tallrike eksempler på mikrobiologiske metoder for å fremstille xylitol fra ren xylose (f.eks.Onishi og Suzuki, 1966; Barbosa et al., 1988). De beste produsenter i disse metode er gjær som spesielt tilhører Candida-slekten. Også noen bakterier, slik som Enterobacter (Yoshitake et al., 1973a) og Corynebacterium arter (Yoshitake et al., 1973b) og enkelte sopp f. eks. Penicillium chrysogenum (Chiang og Knight, 1960) danner xylitol fra ren xylose.

I en mikrobiologisk metode som beskriver de beste utbytter av xylitolproduksjonen (Ojamo et al., 1987) blir Candida guilliermondii-gjær dyrket under strengt kontrollert aerelering i et xylose inneholdende medium enten som en posjon eller matet posjonsprosess. Xylitolutbytter 50-65% ble erholdt. Utbyttet kunne bli øket til 76% ved å tilsette furfuraldehyd til dyrkningsmediet.

Cellefrie ekstrakter fra Candida pelliculose (xylosereduktase) og Methanobacterium sp. (hydrogenase, F420NADP, F420/NADP oksidoreduktase) er blitt brukt for å fremstille xylitol i en membranreaktor med 90 % konversjon (Kitpreechavanich, (1985)). Med et cellefritt ekstrakt fra Coryne-bacerium-arter har 69 % konversjon blitt erholdt når 6-fos-foglukonat ble brukt for regenerering av kofaktoren.

Det er blitt vist at glukosedehydrogenase fra B. megaterium har passende egenskaper som et NADPH-regenererende enzym (Kulbe et al., 1987). Således kan glukonsyre fremstilles fra glukose samtidig med xylitol i den enzymatiske prosess. For å holde tilbake enzymene og kofaktoren kan man bruke ultrafiltreringsmembraner. Kofaktortilbakeholdelse kan erholdes ved bruk av en derivatisert kofaktor med høy nok molekylvekt for tilbakeholdelse (Kulbe et al., 1987) eller bedre ved å bruke negativt ladete ultrafiltreringsmembraner (Kulbe et al., 1989).

Attraksjonen ved å bruke en enzymatisk metode er basert på muligheten til å bruke uren xylose som inneholder råmaterialer som i de mikrobiologiske metoder ville inhibere metabolismen hos den anvendte mikrobe. I tillegg er xyli-tolutbyttene høyere enn i de mikrobiologiske metoder med naturlige stammer. På den annen side er enhver mikrobiologisk metode for tiden enklere ved utførelse i stor skala.

De naturlige xyloseutnyttende gjær, slik som P. stipitis, Candida sp. og P. tannophilus, er ikke egnet for fremstil lingen av enten etanol eller xylitol av flere grunner. Fermenteringen til etanol krever forbehandling av råmaterialet som er kostnadshemmende for et billig endeprodukt, slik som etanol. Disse arter mangler også GRAS-status. Xyloseanvendelsen ville således være mere egnet basert på bruken av bakegjær som har en GRAS-status.

For å gjøre S. cerevisiae til en effektiv xylosebruker for produksjonen av xylitol og etanol bør et effektivt enzymsy-stem for omdannelsen av xylose til xylitol og xylulose bli innført i denne gjærtype. For fremstillingen av etanol fra xylose har XI gener fra E. coli (Sarthy et al., 1987), B. subtilis og Actinoplanes missouriensis (Amore et al., 1989) blitt klonet og transformet i S. cerivisiae. XI-proteinet laget i S. cerevisiae hadde meget lav (1/1000 av enzymet, dannet i bakterier) eller ingen enzymatisk aktivitet. Således kan av en eller annen grunn det bakterielle enzym ikke bli gjort funksjonelt i gjær. En annen mulighet ville være å overføre i S. cerevisiae genene som koder for XR og XDH fra en annen gjærtype. Enzymene til P.stipitis bør være gode kandidater i lys av den effektive anvendelse av rene xyloseoppløsninger diskutert ovenfor. Det kan ventes at enzymer fra en annen gjærtype ville fungere bedre enn bakterielle enzymer når de uttrykkes i gjær. I tillegg kan xylitol og etanol fremstilles med det samme system, og systemet ville kombinere den gode xyloseutnyttelse hos P. stipitis med motstandsdyktighet overfor inhibitorer og generelt aksepterbarhet til S. cerevisiae.

Oppsummering av Oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse beskriver fremstilling av xylitol ved isolering av gener som koder for xylosereduktase (XR) og xylitoldehydrogenase (XDH) fra visse gjærtyper som har disse gener, samt karakteriseringen og deres innføring og ekspresjon i en gjærstamme såsom Saccharomyces cerevisiae. Oppfinnelsen fremskaffer således fremstilles av xylitol med nye rekombinante gjærstammer som uttrykket xylosereduktase-og/eller dehydrogenaseenzymer.

Gjærstammene som er blitt transformert med XR-genet er i stand til å redusere xylose til xylitol in vivo. Xylosereduktase fremstilt av de nye gjærstammer blir brukt i en enzymatisk fremgangsmåte for fremstilling av xylitol in vitro.

Kort Beskrivelse av Tegningene

Fig. 1 viser xylosereduktasegenet integrert i pMA91 og pRS305 som resulterer i henholdsvis plasmidene pUA103 og pUA107. Fig. 2 Aktivitetsplateassay av XDH positiv X gtll klon. Fig. 3 viser utformningen av plasmidet pJHXDH50 som bærer xdh genet. Fig. 4 viser et plateaktivitetsassay av en rekombinant S. cerevisiae stamme VTT-C-91181 som danner XDH på den opprin-nelige transformasjonsplate (A) og som enkle kolonier erholdt fra denne transformant (b). Fig. 5 viser xylosereduktaseekspresjonskassetten flankert av ribosomale sekvenser integrert i BS+, som danner vektoren pJHXR22. Fig. 6 viser Western-analyse av XR fremstilt i S. cerevisiae fra de følgende plasmider og fra P. stipitis. Brønn 1: molekylvektstandarder (LMW, Pharmacia); 2 pRS305; 3 pUA107; 4 en tom brønn; 5 pMA91; 6 pUA103; 7 renset XR enzym; 8 LMW; 9 Pichia stipitis. Prøver ble tatt fra cellelysater med fransk presse for brønnene 2, 3, 5, 6 og 9. Fig. 7 viser XR aktivitet hos S. cerevisiae stammer transformert med pUA103 og pUA107 ved å bruke som en kofaktor enten NADH eller NADPH, og av kont roi Ist ammene som bærer vektoren pRS305 eller pMA91. Fig. 8 viser xylitoldehydrogenasegenet integrert i pKB102 som danner plasmid pJHXDH60.

Detaljert Beskrivelse av Oppfinnelsen

Xylosereduktase-(xrd) og xylitoldehydrogenase-(xdh) gener som skal brukes i foreliggende oppfinnelse isoleres fra en gjærtype inneholdende disse gener, f.eks. Pichia stipitis. I tillegg kan andre egnete gjærtyper og andre sopp, slik som Pachysolen tannophilus, Kluyveromyces spp., Petromyces albertensis og Candida spp. anvendes.

Gjærtypene som skal transformeres med disse gener kan være enhver passende gjærtype for xylitolproduksjonen fortrinnsvis med GRAS-status, f.eks. enhver Saccharomyces cerevisiae gjærstamme (f.eks. DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15BO, VTT-A-63015, VTT-A-85068, VTT-C-79093) enhver Kluyveromyces sp. eller Schizosaccharomyces pombe. Overføring av genene til disse gjærtyper kan f.eks. oppnås ved å bruke konvensjonelle metoder beskrevet for disse organismer. Det skal også bemerkes at om ønsket kan også Pichia i seg selv bli transformert med disse gener for å erholde øket eller modulert ekspresjon av genene. Saccharomyces cerevisiae-stammer er foretrukket for formålene med foreliggende oppfinnelse.

DNA-sekvensene som koder for XR-enzymet isoleres fra P. stipitis ved konvensjonelle metoder. I den foretrukne utførelsesform blir cDNA syntetisert fra mRNA og klonet i Xgtll vektor. Under anvendelse av immunoutvelgelse med XR-spesifikke antistoff blir den positive klon isolert og subklonert i BS+-vektor for sekvensering. Gener som koder for XR av P. stipitis kan også bli klonet ved ekspresjon i S. cerevisiae fordi det ikke inneholder noen introner. En annen mulighet er bruken av oligonukleotider, utformet på basis av aminosyresekvensen til enzymet i hybridisering av en genbank.

For å konstruere et plasmid som er egnet for transformasjon i en gjærtype, blir genet som koder for XR klonet i en egnet gjærekspresjonsvektor, slik som pMA91 (Mellor et al., 1983), omfattende de passende gjærregulatoriske områder. Disse regulatoriske områder kan erholdes fra gjærgener slik som f.eks. PGK1, ADH1, GALI, GAL10, CUP1, GAP, CYC1, PH05. Alternativt kan også de regulatoriske områder for Pichia-genet som koder for XR brukes for å uttrykke genet i S. cerevisiae. Plasmidet som bærer xrd-genet som koder for XR, er i stand til å replikere autonomt når det transformeres i den mottagende gjærstamme. Genet som koder for XR sammen med de passende gjærregulatoriske områder, kan også klones i en enkelt kopi gjærvektor slik som pRS305 (Sikorski og Hieter, 1989).

Alternativt kan genet som koder for XR også bli integrert i gjærkromosomet, f.eks. i det ribosomale RNA-lokus. For dette formål blir de robosomale sekvenser av et egnet plasmid, f.eks. plasmid pIRL9, frigjort, og klonet passende til BS+-vektor. Genet som koder for XR, koblet mellom egnete gjærpromotor- og terminatorområder, frigjøres fra hybridvektoren som utggjør genet og klones i plasmidet erholdt ved det foregående trinn. Fra dette resulterende plasmid kan ekspresjonskassetten, flankert av ribosomale sekvenser, frigis. Dette fragment kotransformeres i en gjærtype med et autonomt replikerende plasmid som bærer en egnet markør for transformasjon. Plasmidet kan senere bli fjernet fra cellene inneholdende xrd-genet integrert i kromosomet ved å dyrke cellene under ikke-selektive betingelser. På denne måte kan rekombinante stammer erholdes som ikke bærer noen ekstra DNA, slik som bakterielle vektorse- kvenser. Hvis en polyploidg jaers tamme, slik som VTT-A-63015, anvendes, kan genet også integreres til et essentielt lokus, slik som PGK1- eller ADHl-lokuset.

Sekvensen av xrd-genet som koder for XR av P. stipitis er gitt som SEQ ID NO. 2.

En fremgangsmåte for å fremstille xylosereduktaseenzymet fremskaffet. Denne fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA sekvensen som koder for xylosereduktase fra en egnet giverorganisme; (b) å kontruere en gjærvektor som bærer nevnte DNA sekvens; (c) å transformere vektoren som er erholdt i en egnet gjærvert for å erholde en rekombinant vertsstamme ,-(d) å dyrke nevnte rekombinante vertsstamme under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte xylosereduktase; og

(e) å gjenvinne nevnte xylosereduktase.

Enzymer fra organismer med GRAS-status er foretrukne i en enzymatisk fremstilling av xylitol. Xylosereduktase fra Pichia stipitis har utmerkete enzymatiske egenskaper, slik som kinetiske konstanter og stabilitet uten spesielle stabiliserende midler slik som tiol-beskyttende kjemikalier. Produksjon av dette enzym er nå mulig i en gjær med GRAS-status. De transformerte gjærceller dyrkes i et passende medium. Som dyrkningsmediet kan et billig medium, slik som ett basert på sirup anvendes, idet xylose ikke er nødvendig for induksjon slik som i naturlig xyloseutnyttende gjærtyper. Gjær med intracellulær xylosereduktase fremstilles med godt utbytte i en matet posjonsprosess.

Gjæren konsentreres og vaskes med f.eks. sentrigufering og xylosereduktase frigis i oppløsningen ved celleødeleggel-sesmetoder, slik som høytrykkshomogenisering eller glass- kulemaling. Etter klargjøring av homogenatet ved filtrering eller sentrifugering blir xylosereduktase ytterligere renset ved kromatografiske metoder.

For fremstillingen av xylitol in vitro blir et grovhomogenat eller renset xylosereduktase brukt i en enzymreaktor sammen med en kofaktor (NAD/NADH eller NADP/NADPH) og et kofaktorregenerende enzym såsom glukosedehydrogenase, formatdehydrogenase eller ethvert annet enzym med god nok stabilitet, krav for miljømessige betingelser som tilfreds-stilller dem til xylosereduktase og egnete kinetiske egenskaper (Buckmann, 1979; Wandrey et al., 1981; 1982; Kulbe et al., 1989). Enzymene og kofaktoren holdes typisk i reaktorsystemet ved ultrafiltreringsmembraner, spesielt slike med en negativ ladning. Kof aktorene kan også koim-mobiliseres med de kofaktorregenererende enzymer (Reslow et al., 1988) . Reaksjonsblandingen pumpes gjennom reaktoren og substratene og produktene filtreres gjennom membranen. Produktene kan separeres fra substratene ved f.eks. kromatografiske eller krystalliseringsmetoder, og substratene kan gjeninnføres i reaksjonsblandingen.

Ytterligere fremskaffer foreliggende oppfinneln en mikrobiologisk fremgangsmåte for å fremstille xylitol, hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å dyrke i et xylose-inneholdende medium en rekombinant gjærstamme som bærer en DNA-sekvens som koder for xylosereduktaseenzym hvilken DNA-sekvens, når den transformeres inn i nevnte gjærstamme, gir til denne gjærstamme egenskapen å redusere xylose til xylitol; og (b) å gjenvinne xylitolen dannet i mediet, hvor, om ønsket, minst en ytterligere karbonkilde er tilstede i mediet for å øke regenerasjonen av en kofaktor valgt fra NADPH og NADH som er nødvendig for xylose-reduktase-aktivitet, etter hvor, om ønsket, den transformerte gjærstamme er ytterligere transformert med en andre DNA-sekvens som dirigerer ekspresjon hos nevnte gjærstamme av et xylitol-dehydrogenase-enxym, hvor nevnte xylitol-dehydrogenase-enzym gjør regenereringen av en

kofaktor som er nødvendig for xylose-reduktase-aktivitet, mulig.

I en mikrobiologisk xylitolfremstilling med en rekombinant gjærtype må in vivo regenereringen av kof aktoren NADPH eller NADH bli sikret på en eller annen måte. Med en gjærkonstruksjon som kun har xylosereduktase- og ikke xylitoldehydrogenasegen kan kofaktorregenerering erholdes ved å tilsette et ko-karbon-substrat slik som glukose, glycerol, ribose eller etanol. Med et slikt system kan 95-100 % utbytte av xylitol fra xylose erholdes. I dette system med S. cerevisiae er xylitol ikke metabolisert videre og følgelig kan høyere utbytter av xylitol erholdes enn med naturlige xylitolproduserende organismer. Når gjæren også har xylitoldehydrogenasegenet (se nedenfor) kan kofaktorregenerering inntreffe via en liten strøm av xylitol videre i metabolismen. Denne strøm kan kontrolleres ved relative ekspresjonsnivå av enzymene xylosereduktase og xylitoldehydrogenase eller ved å kontrollere metabolismen av gjærtypen ved oksygenoverføringsgraden eller ved å tilsette enzyminhibitorer, slik som jodacetat til dyrkningsmediet.

I den foretrukne utførelsesform blir, for isoleringen av xdh genet hos P. stipitis, en kromosomal genbank først dannet i E. coli i et kosmid p3030 (Penttilå, et al., 1984) eller i en annen gjærvektor, og de rekombinante plasmider isoleres og transformeres i gjærtypen. xdh-genet kan bli funnet ved sin ekspresjon i gjær som kan påvises med et aktivitetsplateassay. En cDNA-kopi av dette gen kan bli isolert på lignende måte med et aktivitetsplateassay fra et X gtll cDNA ekspresjonsbibliotek laget i E. coli.

En alternativ metode for isoleringen av xdh-genet fra P. stipitis er å rense XDH fra en donorgjærtype ved kromatografiske metoder og bestemme den N-terminale aminosyresekvens derav. En blanding av oligonukleotider basert på den erholdte N-terminale aminosyresekvens av XDH-protein kan dannes. Denne oligonukleotidblanding kan deretter brukes i hybridisering av en genbank, eller sammen med en oligo-dT-primer for å amplifikere ved PCR-reaksjon xdh-spesifikke sekvenser fra en mRNA-populasjon. Det resulterende gen eller cDNA klones i BS+-vektor, eller en lignende vektor, og sekvensen til xdh-genet blir så erholdt ved konvensjonelle metoder.

xdh-genet kan uttrykkes i gjær fra den kromosomale kopi klonet i f.eks. gjærkosmidet p3030 (Penttilå et al., 1984). Til en slik gjær som bærer xdh-genet, kan plasmidet som bærer xrd genet transformeres.

I tillegg kan xdh cDNA av full lengde klones i en passende ekspresjonsvektor, såsom pMA91 eller pKB102 (Blomq<y>ist et al., 1991) mellom passende gjærregulatoriske områder, fortrinnsvis under anvendelse av gjær PGK1- eller ADHl-promotoren og terminatoren. Ekspresjonskasetten bygget inn i pKB102 kan frigis fra det resulterende plasmid og klones i en autonomt replikerende multikopigjærvektor eller i en enkelt-kopi gjærvektor som bærer en passende markør, f.eks. URA3 eller HIS3 for gjærtransformasjon. Disse resulterende plasmider kan så transformeres i en passende vertsstamme eller i stammene som bærer genet som koder for XR.

xdh-genet kan også integreres i gjærgenomet på samme måte som beskrevet ovenfor for xrd-genet.

Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det i en gjærstamme samtidig uttrykkes aktiv xylosereduktase og xylitoldehydrogenase. For å oppnå dette kan det utføres:

(a) å isolere DNA-sekvensene som koder for xylosereduktase og xylitoldehydrogenase fra en egnet donororganisme; (b) å konstruere gjærvektorer som hver bærer én av nevnte DNA sekvenser; (c) å transformere de erholdte vektorer til en egnet vertsorganisme for å erholde en rekombinant gjærstamme; (d) å dyrke nevnte rekombinante gjærstamme i et

xyloseinneholdende medium; og

(e) å isolere og rense produktene (etanol, xylitol,

eddiksyre) dannet i mediet.

De rekombinante gjærstammer som uttrykker samtidig xylose-reduktase- og xylitoldehydrogenaseenzymer er kraftignter av etanol fra xylose ved å fermentere den xyloseinneholdende fraksjon i f.eks. lignoceluloseinneholdende hydrolysater, slik som biprodukter fra skogsproduktindustrien, f.eks. brukt sulfittvæske eller i råmaterialer som er blitt erholdt ved forbehandling for å gjøre xylosefraksjonen tilgjengelig for fermentering ved behandling ved høye temperaturer i nærvær eller fravær av kjemikalier såsom svoveldioksyd og i kombinasjon med sur eller enzymatisk hydrolyse. Forbruket av xylose og dannelsen av produkter (etanol, xylitol, eddiksyre, etc.) analyseres f.eks. med HPLC (Hahn-Hågerdal et a., 1986; Lindén og Hahn-Hågerdal, 1989a,b).

Eksempel 1

Rensing av xylosereduktase fra Pichia stipitis

P. stipitis ble dyrket i en 1 liters fermentator i xyloseinneholdende medium (0,3 % gjærekstrakt, 0,3 % maltek-strakt 0,5% pepton, 1,9% KH2P04, 0,3% (NH4)2HP04, 0,1 % MgS04og 5% xylose, pH 5) og innhøstet i senlogaritmisk vekstfase. 30 g våtvekt av cellepasta ble brutt opp ved å bruke frysepressing (X-presse) og sentrifugert 1500 g, 10 minutter for å oppnå et cellefritt ekstrakt.

Det rå ekstrakt ble konsentrert 2 ganger og satt på en "Sephadex G-200" (Pharmacia, Uppsala, Sverige) kolonne (137 ml) . Ved en strømningshastighet på 6 ml/time ble proteinene eluert og fraksjoner (9 ml) inneholdende XR-aktivitet ble slått sammen.

Den sammenslåtte fraksjon ble satt på en DEAE-"Sepharose"

(Pharmacia) kolonne (37 ml) ekvilibrert med 0,02 M ammoniumf osf atbuf f er pH 6,0 og eluert med en 250 ml gradient av0-0,5 M NaCl i 0,02 M ammoniumf osf atbuf f er ved en strøm-ningshastighet på 12 ml/min.. Fraksjoner inneholdende XR-aktivitet ble slått sammen (6 ml) og konsentrert til 1 ml. 1 ml av den konsentrerte prøve ble satt på en 1 ml HPLAC-kolonne (cibacron blått F36-A; Perstorp Biolytica, Lund, Sverige) ekvilibrert med 0,02 M ammoniumfosfatbuffer pH 6,0. Eluering av XR ble utført med en 0-2 M NaCl-gradient i ammoniumfosfatbuffer ved en strømningshastighet på 1 ml/min.. Fraksjoner inneholdende XR-aktivitet ble slått sammen (6 ml) og dialysert over natten ved 4°C.

Renhet og molekylvekt ble bestemt med gradient SDS-polyakrylamidgel (T 8,8-21,3%, C 2,6%) elektroforese (Laemmli, 1970) og nativ gradient-polyakrylamidgel (Pharmacia, på forhånd fremstilt gel, 4/30) elektroforese (Pharmacia, vertikalt elektroforesesystem). Lav- og høymolekylvektstan-darder fra Pharmacia ble brukt. Gelfarging ble utført med 0,1% "Coomassie Blue R-250" (Sigma) i 25 % metanol og 10 % eddiksyre. I SDS-PAGE og i nativ PAGE-gel kom XR-fraksjonen etter HPLAC tilsyne som et enkelt bånd (data ikke vist). Spesifikk farging av XR med zymogramteknikken viste at det enkle bånd i den native PAGE-gel var XR (data ikke vist). Molekylvektberegning med SDS-PAGE (se fig. 6) og nativ-PAGE viste en molekylvekt på 38000 ± 1000 for subenhetene og 76000 ± 1000 for det native protein.

Det rensete enzym ble brukt for å fremstille polyklonale antistoff og for å lage en N-terminal aminosyresekvens av enzymet (Marc Bauman ved Dept. of Medical Chemistry, Univ. of Helsinki) SEQ ID NO. 1).

Eksempel 2

Kloning av genet som koder for XR fra Pichia stipitis

l liter av P. stipitis-kultur ble dyrket i xyloseinneholdende medium (se eksempel 1) og innhøstet ved sen log-fase. Innhøstede celler ble omdannet til sfæroplaster med Zymo-lyase, suspendert i 60 ml GuSCN-oppløs ing og RNA ble isolert i henhold til Chirgwin et al. (1979). RNA ble så passert gjennom en oligo(dT) celluloseaff initetskromatogra-fikolonne. Poly(A+)mRNA ble eluert ved å minske ionestyrken av elueringsbufferen. cDNA ble syntetisert fra mRNA ved å bruke cDNA syntesesettet til Amersham og klonet i X gt 11-vektoren ved å bruke Amersham cDNA kloningssettet. Etter 3-4 timers vekst ble plaguene replikaavstøpt på nitrocel-lulosemembraner trukket med IPTG og inkubert over natten. Membranene ble deretter brukt for immunoutvelgelse av transformanter (Young og Davies, 1983) under anvendelse av kaninantiserum mot XR og geiteantikaninantistoffer koblet med alkalisk fosfatase. Positive kloner ble valgt ut fra platene og det innsatte DNA ble amplif ikert med PCR (Giissow og Clackson, 1989) under anvendelse av vektorspesifikke primere. DNA-fragmentene som ble erholdt, ble brukt for restirksjonsenzymanalyse og for ytterligere kloning etter

BatnHI-spaltning i BamHI-spaltet BS+-(Stratagene) vektor. Den lengste cDNA-klon pJHXR20 ble sekvensert ved å bruke den dobbeltkjedete dideoksynukleotidmetode (Zagursky et al., 1986) .

Bekreftelse på kloningen av cDNA av full lengde som koder for XR, ble erholdt ved å sammenligne den N-terminale aminosyresekvens til proteinet med det sekvenserte gen (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2).

Den kromosomale kopi av xrd-genet ble erholdt ved PCR-reaksjon av totalt kromosomalt DNA isolert (Cryer et al.,1979) fra P. stipitis CBS-6054 (Prior et al., 1989) ved å bruke primere som svarer til 5' (GCGGATCCTCTAGAATGCCTTCTAT-TAAGTTGAACTCTGG) og til 3' (TTGGATCCTCTAGATTAGACGAAGATAGGAA-TCTTGTCCC)-enden av det kodende område og som bærer BamHI og Xbal restriksjonsseter. PCR-produktet ble fordøyet med BamHI og klonet i plasmid pMA91 (Mellor et al., 1983) ved Bglll-setet for å erholde plasmid pUA103 (Fig. 1) . DNA-sekvensen av den kromosomale kopi ble sammenlignet med den til cDNA i plasmid pJHXR20, og ble vist å være uten introner.

Eksempel 3

Opprensning av XDH fra Pichia stipitis

Pichia stipitis ble dyrket i xyloseinneholdende medium som beskrevet (eksempel 1) . 30 g våtvekt av cellepasta ble sprengt ved å bruke frysepressing (X-presse) og sentrifugert 1500 g 10 minutter. Det sentrifugerte cellefrie ekstrakt ble konsentrert 3 ganger og 5 ml ble gelfiltrert ved en strømningshastighet på 6 ml/time gjennom en 137 ml"Sepharose 6B"-kolonne ekvilibrert med 0,05 M ammoniumfosf atbuf fer pH 6, 25% glycerol, 1 mM DTT, 1 mM EDTA. Fraksjoner som inneholder XDH-aktivitet målt i henhold til Smiley og Bolen, (1982) ble slått sammen og satt på en 37 ml ionebytterkromatografikolonne (DEAE-sepharose) ekvilibrert med 0,05 M ammoniumfosf atbuf f er pH 6, 25 % glycerol, 1 mM DTT, 1 mM EDTA. XDH-fraksjoner ble eluert med en 250 ml saltgradient på 0 - 0,5 M NaCl ved en strømningshastighet på 12 ml/minutt og slått sammen. Det delvis rensete enzym ble satt på en polyakrylamidgel og blottet på en PVD-membran. Båndet som tilsvarer XDH ble skåret ut og den N-terminale aminosyresekvens ble bestemt direkte fra membranen.

Eksempel 4

Kloning av genet som koder for XDH og ekspresjon i S.

cerevisiae

Det samme X gtll cDNA-bibliotek som erholdt og beskrevet i eksempel 2, ble utsådd og kopiert på nitrocellulosemembran trukket i IPTG og inkubert i 3 timer. Membranene ble så brukt for spesifikk XDH-aktivitet (zymogram)-utvelgelse ved å trekke membranene i 10 ml zymogramoppløsning (0,1 M fosfatbuffer pH 7,0, 1,5 mM NAD, 0,25 mM nitroblått tetra-zolium, 65/im fenazinmetosulfat, 0,4 M xylitol) . Positive kloner (fig. 2) ble fjernet fra platene og det innsatte DNA for to av klonene ble amplifikert med PCR (Gussow og Clackson, 1989) ved bruk av vektorspesifikke primere

(5 ' GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG, 5' -TTGACACCAGACCAACTGGTAATG) .

DNA-fragmentene som ble erholdt var av samme størrelse som ble brukt for restriksjonsenzymanalyse for å undersøke ikke-spaltende og spaltende enzymer og for ytterligere kloning etter BamHI-spaltning i BamHI-spaltet pSP72-vektor (Promega). Plasmidet pJHXDH50 bærer den lengeste cDNA klon (fig. 3).

For å klone den kromosomale kopi av xdh-genet, ble kromosomalt DNA isolert (Cryer et al.,1979) fra P. stipitis stamme CBS-6054 (Prior et al.,1989) og spaltet delvis med Sau 3A. Fragmenter på 35-45 kb i størerelse ble renset ved å fraksjonere det delvis fordøyete DNA i en sukrosegradient (15 % - 40 %) , og fragmentene ble ligert til en p3030 gjærkosmidvektor (Penttilå et al., 1984), spaltet med BamHI. De ligerte molekyler ble pakket i " partikler ved å bruke in vitro pakkesettet til Amersham Ltd. (UK) og transfektert i E. coli HB101 (Maniatis et al., 1982). Rekombinant kosmid-DNA ble isolert fra ca. 15000 sammenslåtte genbankkloner erholdt og transformert i en S. cerevisiae-stamme S150-2B (a, his3-dell, leu2-3, leu2-112, trpl-289, ura3-52, cir<+>, Gal<+>) (Baldari et al., 1987) ved å velge ut for His<+->transformanter på Sc-his-plater. Genbanken ble kopiert på nitrocellulosefiltre, cellene ble ødelagt ved å inkubere filtrene i 5 minutter i kloroform og aktivi-tetsassay'et ble utført som beskrevet ovenfor for X gtll-biblioteket. Flere positive kloner ble erholdt (stammer H494, H495, H496, H497 og VTT-C-91181) , og stammen VTT-C-91181 (fig. 4) ble anvendt for ytterligere studier.

XDH-aktivitet av stammen VTT-C-91181 ble undersøkt i henhold til Smiley og Bolen (1982) og fra fransk presset totaltcellelysat inneholdende 25 % glycerol. DNA fra VTT-C-91181 ble isolert og plasmidet pMW22 reddet ved transformasjon av DNA i E. coli DH50.

S. cerevisiae-stammen VTT-C-91181 som bærer plasmidet pMW22, ble deponert i henhold til Budapestkonvensjonen med tilgangsnummer NCYC 2352 ved the National Collection of Yeast Cultures (NCYC), UK, 29. mars 1991.

Eksempel 5

Ekspresjon av XR i S. cerevisiae.

Genet som koder for XR med de regulatoriske områder til PGK-genet, ble frigitt fra plasmidet pUA103 (eksempel 2) med HindiII og klonet ved HINDIII-setet av den enkelte kopivektor pRS305 (Sikorski og Hieter, 1989) . Det resulterende plasmid pUA107 (fig. 1), hvor det XR-kodende genet var i riktig orientering mot gjær-PGK-promoteren, ble transformert med å bruke LiCl-metoden (Ito et al., 1983), og velge ut for Leu+-transforraanter i S. cerevisiae-stammer S150-2B (se eksempel 4) og GPY55-15BO (leu2-3, leu2-112, ura3-52, trpl-289, his4-519, prbl, cir<+>) og gir de nye rekombinante stammer S. cerevisiae H481, henholdsvis S. cereviae H479. Plasmidet pUA103 transformert i stammene S150-2B og GPY-15B0 resulterte henholdsvis i stammer H477 og H475.

Genet som koder for XR ble også integrert i gjærkromosomet i de ribosomale RNA-loci. De ribosomale sekvenser av plasmid pIRL9 ble frigjort med EcoRI, gjort buttendet og klonet ved det buttendete Xbal-sete av BS+ for å erholde vektor pJHR21. Genet som koder for XR, koblet mellom PGK-promoteren og -terminatoren ble frigjort fra vektoren pUA103 som et HindIII-fragment, gjort buttendet og klonet ved det buttendete Xbal-sete i de ribosomale sekvenser av plasmidet pJHR21. Fra dette resulterende plasmid pJHXR22 (fig. 5) ble ekspresjonskassetten, flankert av ribosomale sekvenser, frigjort ved å spalte i de unike restriksjonsseter av BS+-polylinkeren. Dette fragment ble kotransfor-mert i gjær med et autonomt replikerende plasmid som bærer en markør for transformasjon. Trans formant ene som ble erholdt, ble utvalgt for tilstedeværelse av genet som koder for XR ved enzymaktivitetsforsøk som beskrevet ovenfor, og integreringsmønstret ble undersøkt ved Southern analyse. Det autonomt replikerende plasmid ble fjernet fra cellene som bærer XR ekspresjonskassetten ved å dyrke cellene i ikke-selektivt YPD vekstmedium.

Transformantene ble dyrket i minimalt selektivt medium og ekspresjonen av XR ble analysert med Western blotting ved å bruke XR-spesifikt antistoff og den alkaliske fosfatase-metode til Promega (fig. 6) og ved enzymaktivitetsmålinger (Smiley og Bolen, 1982) fra grovekstrakter av gjærceller oppbrutt med fransk presse (fig. 7).

Eksempel 6

Opprenskning av XR fra rekombinant S. cerevisiae

En rekombinant S. cerevisiae-stamme H477 ble dyrket i en 1,5 liters fermentator i et Sc-leu-medium som inneholder 20 g/l glukose. Vekst ble fulgt med turbiditetsmålinger og cellene ble samlet opp ved sen eksponensiell vekstfase ved sentrifugering, vasket og resuspendert i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,0 som inneholder 1,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, til en gjærkonsentrasjon på 100 g tørrvekt/liter. Celler ble ødelagt med 3 passasjer ved 1000 bar gjennom en høytrykks-homogenisator (fransk presse). Homogenatet ble delvis klargjort med 30 minutters sentrifugering ved 15000 g. XR ble renset fra det klargjorte homogenat som beskrevet for P. stipitis i eksempel 1.

Eksempel 7

Fremstilling av xylitol in vitro

En reaksjonsblanding inneholdende 0,33 M xylose, 0,33 M glukose-6-fosfat, 0,67 mM NADPH, 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0), 1 nkat/ml XR-aktivitet av renset XR (eksempel 6) eller fra et fortynnet grovhomogenat av stammen H475, og 1 nkat/ml glukose-6-fosfat-dehydrogenase ble inkubert ved 20°C i 5 timer. Prøver ble fjernet intermitterende og analysert for xylitol under anvendelse av et xylitolsett fra Boehringer. En konstant xylitolproduksjonshastighet som oversteg 0,14 g IT1!"1 ble observert.

Eksempel 8

Ko-ekspresjon av XR og XDH

Plasmidene pUA103 og pUA107 ble transformert i stammen VTT-C-91181 som bærer xdh-genet på plasmidet pMW22. Transformantene ble valgt ut og også senere holdt på Sc-leu-his-plater. Opprettholdelsen av XDH-aktivitet ble bekreftet med et plateaktivitetsassay og XR-aktiviteten med enzymak tivitetsmålinger som beskrevet ovenfor. De to kloner som ble studert ytterligere, og som bærer plasmidene pUA103 og pMW22, ble kalt H492 og H493.

xdh cDNA av full lengde fra plasmidet pJHXDH50 ble klonet ved Hindlll-setet i vektoren pKB102 (Blomqvist et al. 1991) mellom gjær-ADH1-promotoren og -terminatoren. Ekspresjonskassetten ble frigjort med BamHI fra det resulterende plasmid pJHXDH60 (fig. 8) og klonet i den autonomt replikerende gjærvektor p3030 ved BamHI-setet, noe som danner plasmidet pJHXDH70. Det resulterende plasmid ble transformert i stammen H477 som bærer genet som koder for XR (eksempel 5) ved å velge ut transformantene på Sc-leu-his-plater. Ekspresjonen av xdh-genet i S. cerevisiae ble undersøkt med enzymaktivitetsmåling (Smiley og Bolen, 1982) .

Eksempel 9

Fremstilling av xylitol in vivo med rekombinant S. cerevisiae

Gjærstammene H475 og H477 ble dyrket i en 1,5 liters fermentator i et medium inneholdende 10 g/l gjærekstrakt, 20 g/l bakto-pepton og 20 g/l glukose. Dyrkningstempera-turen var 30°C. pHB ble kontrollert mellom 4,5 og 8,0. Omrøringshastighet var 400 rpm og aereringsgraden 0,5 wm. Når glukose ble forbrukt i henhold til analysen av prøvene fra mediet, ble en matning av en oppløsning inneholdende 1 g glukose og 19 g xylose i 100 ml startet ved en hastighet på 0,09 ml/min. Etter 83 timer total dyrkningstid var xylitolkonsentrasjonen i mediet 12,5 g/l som analysert ved HPLC. Således ble over 95% utbytte av xylitol fra xylose matet til kulturen oppnådd. Ved å bruke kont roi ls tammen som bærer vektoren pMA91, ble mindre enn 8 % av xylosen forbrukt i et tilsvarende forsøk.

Eksempel 10

Xylosefermentering med rekombinant S. cerevisiae

S. cerevisiae-stammer H492 og H493 ble dyrket på en rotasjonsryster i Sc-leu-his-medium inneholdende 20 g/l glukose. Rotasjonshastigheten var 200 rpm. Når både glukosen og den 'dannete etanol var forbrukt, ble mediene brukt som inokulum for fermentering på en rotasjonsryster i Sc-leu-his medium inneholdende 20g/l xylose. Rotasjonshastigheten var 90 rpm. Forbruket av xylose og dannelse av etanol og xylitol ble fulgt under fermentering ved å ta prøver og analysere dem med HPLC (Hahn-Hågerdal et al., 1986; Linden og Hahn-Hågerdal, 1989a,b)

Eksempel 11

Fermentering av xyloseholdige råmaterialer med rekombinant S. cerevisiae

S. cerevisiae-stammer H492 og H493 ble dyrket som i eksempel 10 i et ferment er ingsmedium, hvor xylose var erstattet med brukt sulfittvæske. Xylose ble forbrukt til celler, etanol og xylitol.

References

Amore, R., Wilhelm, M. and Hollenberg, CP. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357.

Baldari, C, Murray, J.A.H., Ghiara, P., Cesareni, G., and Galotti, CL. (1987) EMBO J. 6: 229-234.

Barbosa, M.F.S., de Medeira, M.B., de Mancilha, I.M., Schneider, H. and Lee, H. 1988. Screening of yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors which affect xylitol yield in Candida guilliermondii. J. Ind. Microbiol. 3, 241-251.

Batt, CA., Carvallo, S., Easson, D.D., Akedo, M. and Sinskey, AJ. 1986. Metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering 28, 549-553.

Bergmeyer, H.U., Gruber, W. and Gutmann, I. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1323-1330, Verlag Chemie, Weinheim and Academic Press, Inc., New York, London.

Blomqvist, K., Suihko, M.-L., Knowles, J. and Penttila, M. Chromosomal integration and expression of two bacterial a-acctolactate decarboxylase genes in brewer's yeast. Submitted, 1991.

Buckmann, A.F. (1979) German Patent No 28.41.414.

Chiang, C. and Knight, S.G. 1960. Metabolism of D-xylose by moulds. Nature 188, No. 4744, 79-81.

Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. and Rutter, WJ. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.

Clark, T.A. and Mackie, K.L. (1984) J. Chem. Tech. Biotechnol. 34b: 101-110.

Cryer, D.R., Eccleshall, R. and Marmur, J. (1975) Isolation of yeast DNA. Methods Cell Biol. 12: 39-44.

Gong, C-S. (1985). US Pat. 4,511,656.

Giissow, D. and Clackson, T. (1989) Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17: 4000-.

Hahn-Hågerdal, B., Berner, S. and Skoog, K. 1986. Improved ethanol production from xylose with glucose isomerase and Saccharomyces cerevisiae using the respira-tory inhibitor azide. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24, 287-293.

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A. (1983) Trans form at i on of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bact. 153: 163-168.

Kitpreechavanich, V., Nishio, N., Hayashi, M. and Nagai, S. 1985. Rcgencration & retention of NADP(H) for xylitol production in an ionized mcmbrane reactor. Biotechnol. Lett. 7, 657-662.

Kulbe, K.D., Schwab, U. and Gudematsch, W. 1987. Enzyme-catalyzed production of mannitol and gluconic acid. Ann. N.Y. Acad. Sei. 506, 552-568.

Kulbe, K.D., Howaldt, M.W., Schmidt, K., Rothig, T.R. and Shmiel, H. 1989. Rejection and continuous regenreation of native coenzymes NAD(H)/NADP(H) in a charged ultrafilrration membrane enzyme reactor. Poster at the 10th Enzyme En-gineering Conference, Sept. 24-29 1989, Kashikojima, Japan.

Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M. and Tsao, G.T. (1983) Enzyme Microb. Technol. 5: 82-102.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Lastick, S.M., Tucker, M.Y., Beyette, J.R., Noll, G.R. and grohman, K. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 574-579.

Lindén, T. and Hahn-Hågerdal, B. (1989a) Enzyme Microb. Technol. 11: 583-589.

Lindén, T. and Hahn-Hågerdal, B. (1989b) Biotechnol. Techniques 3: 189-192.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, NA., Tuite, M.F., Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T., Kingsman, AJ. and Kingsman, S.M. (1983) Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene 24: 1-14.

Ojamo, H., Ylinen, L. and Linko, M. (1987) Finnish Patent 76377.

Onishi, H. and Suzuki, T. (1966) The production of xylitol, L-arabinitol and ribitol by yeasts. Agr. Biol. Chem. 30: 1139-1144.

Penttilå, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. and Knowles, J.K.C. 1984. Mol. Gen. Genet. 194: 494-499.

Prior, BA-, Kilian, S.G. and du Preez (1989) Process Biochemistry 2: 21-32.

Reslow, M., Adlercreutz, Mattiasson, B. (1988) Eur. J. Biochem. 177: 313-318.

Sarthy, A.V., McConaughy, B.L., Lobo, Z., Sundstrom, JA., Furlong. CE. and Hall. B.D. 1987. Expression of the E. coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 53, 1996-2000.

Senac, T. and Hahn-Hågerdal, B. (1990) Appl. Environ. Microbiol. (in press).

Sikorski, R.S. and Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122: 19-27.

Skoog, K. and Hahn-Hågerdal, B. (1988) Enzyme Microb. Technol. 10: 66-78.

Slininger, P.J., Bolen, O.L. and Kurtzman, CP. (1987) Enzyme Microb. Technol. 9: 5-15.

Smiley, K.L. and Bolen, P.L. (1982) Demonstration of D-xylose reductase and D-xylitol dehydrogenase in Pachysolen tannophilus. Biotechnol. Lett. 4: 607.

Van Zyl, C, Prior, B.A., Kilian, S.G. and Kock, J.L.F. 1989. D-xylose utilization by Saccharomyces cerevisiae. i. Gen. Microbiol. 135, 2791-2798.

Wandrey, C, Wichmann, R., Leuchtenberger, W., Kula, M.-R. and Biickmann, A.F.

(1981) US Patent No 4.304.858.

Wandrey, C, Wichmann, R., Leuchtenberger, W., Kula, M.-R. and Biickmann, A.F.

(1982) US Patent No 4.326.031.

Yoshitake, J., Shimamura, M. and Imai, T. 1973a. Xylitol production by an Enterobacter species. Agr. Biol. Chem. 37, 2261-2267.

Yoshitake, J., Shimamura, M. and Imai, T., 1973b. Xylitol production by a Corynebacterium species. Agr. Biol. Chem. 37, 2251-2259.

Young, R.A. and Davis, R.W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes: isolation with antibody probes. Science 222: 778-782.

Yu, S., Wayman, M. and Parehk, S.R. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 1144-1150.

Zagursky, RJ., Berman, M.L., Baumeister, K. and Lomax, N. (1986) Rapid and easy sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene Anal. Techn. 2: 89-94.

Deponerte mikroorganismer

De følgende gjærstammer ble deponert i henhold til Buda-pest -konvensjonen ved the National Collection of Yeast Cultures (NCYC), AFRC Institute of Rood Research, Norwich Laboratory, Colney Lane, Norwich, NR47UA, UK

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av xylitol,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter (a) å dyrke i et xylose-inneholdende medium en rekombinant gjærstamme som bærer en DNA-sekvens som koder for xylosereduktaseenzym hvilken DNA-sekvens, når den transformeres inn i nevnte gjærstamme, gir til denne gjærstamme egenskapen å redusere xylose til xylitol; og (b) å gjenvinne xylitolen dannet i mediet, hvor, om ønsket, minst en ytterligere karbonkilde er tilstede i mediet for å øke regenerasjonen av en kofaktor valgt fra NADPH og NADH som er nødvendig for xylose-reduktase-aktivitet, etter hvor, om ønsket, den transformerte gjærstamme er ytterligere transformert med en andre DNA-sekvens som dirigerer ekspresjon hos nevnte gjærstamme av et xylitol-dehydrogenase-enxym, hvor nevnte xylitol-dehydrogenase-enzym gjør regenereringen av en kofaktor som er nødvendig for xylose-reduktase-aktivitet, mulig.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte DNA-sekvens koder for et polypeptid omfattende i hovedsak aminosyresekvensen til SEQ. ID. NO. 2 eller et fragment derav, hvor polypeptidet eller fragmentet oppviser xylose-reduktase-aktivitet .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat nevnte transformerte gjærstamme tilhører arten Saccharomyces cerevisiae, Klyuve-romyces spp., Schizosaccharomyces pombe eller Pichia spp..

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 3,karakterisert vedat nevnte transformerte gjærstamme tilhører arten Saccharomyces cerevisiae.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4,karakterisert vedat nevnte transformerte gjærstamme er Saccharomyces cerevisiae H475 eller H477 som kan dannes ved å transformere henholdsvis Saccharomyces cerevisiae GPY55-15B og S150-2B med plasmid pUA103 som vist i Figur 1.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere karbonkilde er etanol, glukose eller glycerol.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte transformerte gjærstamme er Saccharomyces cerevisiae VTT-C-91181 som bærer plasmidet pMW22 (NCYC nr. 2352) og er ytterligere transformert med plasmid pUA103 som vist i Figur 1.

8. Enzymatisk fremgangsmåte ved fremstilling av xylitol,karakterisert vedat fremgangsmåte omfatter a) å dyrke en rekombinant gjærstamme transformert med en DNA-sekvens som koder for et xylose-reduktase-enzym under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte xylose-reduktase, b) gjenvinne nevnte xylose-reduktase-enzym, c) anvende nevnte xylose-reduktase i en enzymreaktor med et kofaktor-regenererende system, og d) isolere og rense det fremstilte xylitol.