FI112250B - Menetelmä etanolin tuottamiseksi ja siihen soveltuvat rekombinanttihiivakannat - Google Patents

Description

112250

Menetelmä etanolin tuottamiseksi ja siihen soveltuvat rekombinanttihiivakannat Tämä hakemus on jakamalla erotettu patenttihakemuksesta nro 924461.

5 Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Tämä keksintö koskee erityisesti uusia rekombinanttihiivakantoja, jotka on transformoitu ksyloosireduktaasi- ja/tai ksyli-tolidehydrogenaasi-entsyymien geeneillä. Hiivakanta, joka on transformoitu ksyloosire-duktaasigeenillä, pystyy pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi ja on siten kykenevä tuottamaan ksylitolia in vivo. Jos molemmat näistä geeneistä transformoidaan hiivakantaan, 10 tuloksena oleva kanta kykenee tuottamaan etanolia ksyloosia sisältävään kasvualustaan fermentaation aikana.

Mainitut uudet hiivakannat pystyvät lisäksi ilmentämään kyseiset kaksi entsyymiä.

Ksyloosia esiintyy runsain määrin luonnossa. Se voi muodostaa jopa 40 % lignosellu-loosamateriaalista (Ladisch et ai., 1983). Fermentoimalla ksyloosi voidaan muuttaa etanoliksi, jota voidaan käyttää nestemäisenä polttoaineena tai kemiallisena raaka-aineena.

20 Etanolin tuottamisen kannalta, joka on halpa tuote, on tärkeätä, että raaka-aine voidaan * * fennentoida suoraan niin vähäisellä esikäsittelyllä kuin mahdollista.

• · * ♦ • · , , Luonnollisia ksyloosin käyttäjiä tavataan bakteerien, hiivojen ja sienten joukosta. Kaikis- • · · • » · sa organismeissa ksyloosi muutetaan ksyluloosiksi, joka fosforyloidaan ksyluloosi-5- • · « • * * 25 fosfaatiksi (X5P) ksylulokinaasin avulla. X5P etenee sen jälkeen Embden-Meyerhof- • · · reitille (glykolyysi) pentoosi-fosfaatti-kiertoreitin kautta (shunt).

• * >

» I

. * * . Bakteerit kuten Escherichia mli, Bacillus sp., Streptomyces sp. ja Actinoplanes sp. muut- » · tavat ksyloosin suoraan ksyluloosiksi ksyloosi-isomeraasin (XI) avulla. Siten bakteerit [!!!_ 30 eivät tuota ksylitolia välituotteena, kun ne käyttävät ksyloosia. Ne bakteerit, jotka fer- * · mentoivat ksyloosia etanoliksi, tekevät niin huonoilla saannoilla, koska samalla muodos- • » • t # [ tuu lukuisia sivutuotteita (Skoog ja Hahn-Hägerdal, 1988). Ksyloosia käyttävillä hiivoilla **' kuten Pichia stipitiksellä, Candida shehataella, ja Pachysolen tannophiluksella tämä reak- 2 112250 tio tapahtuu kahdessa vaiheessa: ksyloosi pelkistetään ensiksi ksylitoliksi ksyloosireduk-taasin (XR) avulla, ja ksylitoli hapetetaan ksylitolidehydrogenaasilla (XDH) ksyluloosik-si.

5 Ksyloosia käyttävät hiivat kuten £. stipitis, £. shehatae ja E. tannophilus (Slininger et ai., 1987; Prior et ai, 1989) fermentoivat puhtaita ksyloosiliuoksia korkeilla saannoilla ja hyvillä tuottavuuksilla. Ne eivät kuitenkaan yleensä säily hengissä käsittelemättömästä raaka-aineesta johtuvassa torjuvassa ympäristössä, kuten esimerkiksi sulfiittijäteliemessä tai fluorivedyllä esikäsitellyssä ja happohydrolysoidussa vehnän oljessa (Linden ja Hahn-10 Hägerdal, 1989). Yksi poikkeus, E. tannophilus, tuottaa pääasiassa ksylitolia ja glyserolia vasteena tälle ympäristölle. Sellaisten raaka-aineiden fermentoimiseksi tehokkaasti ksyloosia käyttävien hiivojen avulla, kuten E. stipitiksellä, C. shehataella ja E. tannophilnk-sella, raaka-aineen on läpikäytävä kalliita esikäsittelyjä ioninvaihtohartsien avulla (Clark ja Mackie, 1984) tai höyrystrippauksen avulla (Yu et ai, 1987).

15

Saccharomyces cerevisiae. leivinhiiva, femientoi sulfiittijätelientä tai fluorivedyllä esikä-siteltyä ja happohydrolysoitua vehnän olkea etanoliksi (Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989).

S. cerevisiae ei kykene käyttämään ksyloosia tehokkaasti eikä voi kasvaa ksyloosi ainoa-na hiilenlähteenä. Bakteeriperäisen entsyymin, ksyloosi-isomeraasin, läsnäollessa, joka » » 20 entsyymi muuttaa ksyloosin ksyluloosiksi, S. cerevisiae voi kuitenkin fermentoida sekä puhtaita ksyloosiliuoksia (Hahn-Hägerdal et ai., 1986) että käsittelemättömiä raaka- • · :*.j aineita (Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a,b) etanoliksi, saantojen ja tuottavuuksien olles- ·,! ·’ sa samaa suuruusluokkaa kuin heksoosifermentoinneissa saadut. Samanlaisia tuloksia on • · · V : saatu Schizosaccharomyces pomhella (Lastick et ai, 1989). Sekä S. cerevisiaella että 25 Sch. pomhella on siten toimiva ksylulokinaasientsyymi. On myös havaittu, että S. cere- * # * ·’ .* visiae voi kuluttaa ksyloosia (Batt et ai, 1986; van Zyl et ai, 1989; Senac ja Hahn- '··* Hägerdal, 1990).

Gong (1985) esittää menetelmän etanolin saamiseksi suoraan D-ksyloosista ksyloosia 30 fermentoivien hiivamutanttien avulla. Gongin mukaan valitaan parentaali hiivakanta • : : (esim. Candida sp. tai Saccharomyces cerevisiae), jolla voi alun perin olla kyky käyttää 3 112250 D-ksyloosia, ja tämä parentaali kanta altistetaan sen jälkeen esim. UV-säteilylle mutaation indusoimiseksi. Viitteessä ei kuitenkaan anneta mitään tietoa syystä, miksi saadut mutantit kykenevät käyttämään ksyloosia. Lisäksi, Gong ei siirtänyt uusia koodaavia ja/tai sääteleviä sekvenssejä mainittuihin kantoihin geenitekniikan avulla ksyloosifer-5 mentaation tehostamiseksi.

Luonnolliset ksyloosia hyväksikäyttävät hiivat kuten E. stipitis, Candida sp. ja E. tan-nophihis eivät ole sopivia etanolin eivätkä ksylitolin tuotantoon useasta syystä. Fermen-tointi etanoliksi edellyttää raaka-aineen esikäsittelyä, mikä on kustannusten kannalta lii-10 kaa halvalle lopputuotteelle kuten etanoli. Näiltä lajeilta puuttuu myös GRAS-status. Ksyloosin hyväksikäyttö perustuisi siten sopivimmin leivinhiivan käyttöön, jolla on GRAS-status.

S. cerevisiaen muokkaamiseksi tehokkaaksi ksyloosin käyttäjäksi ksylitolin ja etanolin 15 tuottamista varten, tähän hiivaan tulisi siirtää tehokas entsyymisysteemi ksyloosin muuntamiseksi ksylitoliksi ja ksyluloosiksi. Etanolin tuottamiseksi ksyloosista, XI-geenit E. colista (Sarthy et ai, 1987), B. subtiliksesta ja Actinoplanes missouriensiksestä (Amore et ai., 1989) on kloonattuja transformoitu S. eerevisiaehen. S. cerevisiaessä valmistetulla j v. ΧΙ-proteiinilla oli hyvin alhainen (1/1000 bakteereissa tuotetusta entsyymistä) tai ei yh- • * * 20 tään entsymaattista aktiivisuutta. Joistakin syistä johtuen bakteerientsyymiä ei siis voi * * » · :**: tehdä toimivaksi hiivassa. Toinen mahdollisuus olisi siirtää S. eerevisiaehen XR- ja : ’.: XDH-geenit toisesta hiivasta. E. stipitiksen entsyymien pitäisi olla hyviä ehdokkaita puh- « * ♦ v : taiden ksyloosiliuosten käytön valossa, jota edellä on käsitelty. Voidaan ennustaa, että V · toisen hiivan entsyymit toimisivat paremmin kuin bakteeriperäiset entsyymit, kun niitä 25 ilmennetään hiivassa. Ksylitolia ja etanolia voitaisiin lisäksi tuottaa samalla systeemillä, • » * : .* ja systeemissä yhdistyisivät E. stipitiksen hyvä ksyloosin käyttö S. cerevisiaen inhibi- ’ * · ·' tioresistenssin ja yleisen hyväksyttävyyden kanssa.

Tässä keksinnössä kuvataan ksyloosireduktaasia (XR) ja ksylitolidehydrogenaasia :' ·,. 30 (XDH) koodaavien geenien eristäminen tietyistä hiivoista, joilla on nämä geenit, geenien : ’ : karakterisointi ja geenien siirto ja ilmentäminen Saccharomyces cerevisiaessä.

4 112250 Tämän keksinnön mukaisesti esitetään siten uusia rekombinanttihiivakantoja, jotka ilmentävät ksyloosireduktaasi-ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä.

5 XR-geenillä transformoidut keksinnön mukaiset hiivakannat kykenevät pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi in vivo.

Tässä keksinnössä esitetään edelleen uusia hiivakantoja, jotka on transformoitu kummallakin edellä määritellyllä kahdella geenillä. Näiden geenien yhteisilmentyminen antaa 10 kannalle kyvyn fermentoida ksyloosia etanoliksi puhtaasta ksyloosiliuoksesta tai ksyloo-sia sisältävistä liuoksista, kuten lignoselluloosahydrolysaateista.

Lyhyt kuvaus piirustuksista 15 Kuvio 1 esittää ksyloosireduktaasigeeniä integroituna pMA91 :een ja pRS305:een, jolloin saadaan plasmidit pUA103 ja vastaavasti pUA107.

Kuvio 2 esittää XDH-positiivisen kgtl 1-kloonin aktiivisuusmaljamääritystä • · • ; ‘; 20 Kuvio 3 on kuva xdh-geenin sisältävästä plasmidista pJHXDH50 • * : Kuvio 4 esittää XDH:ta tuottavan S. cerevisiae -yhdistelmäkannan VTT-C-91181 aktii- : visuusmaljamääritystä alkuperäisellä transformointimaljalla (A) ja yksittäisinä tästä

• · I

:,: > transformantista saatuina pesäkkeinä (B).

25 l .· Kuvio 5 esittää ksyloosireduktaasin ekspressiokasettia, jonka vieressä on ribosomaalisia ‘ · · ’ sekvenssejä integroituna BS+:aan, jolloin saadaan vektori pJHXR22.

i i » * · t ·

Kuvio 6 esittää XR:n Westem-analyysiä, kun se on tuotettu S.cerevisiaella seuraavilla 30 plasmideilla, tai P. stipitiksellä. Kaistat: 1 molekyylipainostandardit (LMW, Pharmacia); 2 pRS305; 3 pUA107; 4 tyhjä kaista 5 pMA91; 6 pUA103; 7 puhdistettu XR-entsyymi; 8 5 112250 LMW; 9 Pichia stipitis. Kaistoja 2, 3, 5, 6 ja 9 varten näytteet otettiin French press -solulysaatcista.

Kuvio 7 esittää pUA103:lla ja pUA107:llä transformoitujen S. cerevisiae -kantojen XR-5 aktiivisuutta, käyttäen kofaktorina joko NADH:ta tai NADPH:ta, ja vektorin pRS305 tai pMA91:n sisältävien kontrollikantojen XR-aktiivisuutta

Kuvio 8 esittää ksylitolidehydrogenaasigeeniä integroituna pKB102:een, jolloin saadaan plasmidi pJHXDH60.

10

Ksyloosireduktaasi- (xrd) ja ksylitolidehydrogenaasi (xdh) -geenit, joita käytetään tämän keksinnön mukaisesti, eristetään hiivasta, joka sisältää nämä geenit, esim. Pichia stipi-tiksestä. Myös muita sopivia hiivoja ja muita sieniä, kuten Pachysolen tannophilusta, Klnyveromyces spp., Petromvces alhertensis ja Candida spp. voidaan käyttää.

15 Näillä geeneillä transformoitava hiiva voi olla mikä tahansa hiiva, esim. jokin Saccha-romyces cerevisiae -hiivakanta (esim. DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15Ba, VTT-A-63015, VTT-A-85068, VTT-C-79093), jokin Kluyveromyces sp. tai Schizosaccha-romyces pomhe. Geenien transformointi näihin hiivoihin voidaan saada aikaan esimer-{ :'; 20 kiksi käyttämällä tavanomaisia näille organismeille kuvattuja menetelmiä. On huomatta- *;·; va, että myös Pichia itse voidaan transformoida näillä geeneillä, jotta saataisiin aikaan : ’.: näiden geenien lisääntynyt tai muuttunut ekspressio. Saccharomyces cerevisiae -kannat ‘ · ί ovat edullisia tämän keksinnön tarkoituksiin.

•tl 25 DNA-sekvenssi, joka koodaa XR-entsyymiä, eristetään E. stipitiksestä tavanomaisilla : .· menetelmillä. cDNA-syntetisoidaan mRNA:sta ja kloonataan kgtl 1-vektoriin. Käyttäen ' · · · ‘ inummologista seulontaa XR-spesifisten vasta-aineiden avulla, positiiviset kloonit eriste- tään ja subkloonataan BS+-vektoriin sekvensointia varten. E. stipitiksen XR:ää koodaava geeni voidaan kloonata myös ekspressoimalla S. cerevisiaessa, koska se ei sisällä lain-|' ·,. 30 kaan introneita. Toinen mahdollisuus on käyttää oligonukleotideja, jotka on laadittu ent- : ’ ”: syyniin aminohapposekvenssin perusteella, geenipankin hybridisaatiossa.

6 112250

Plasmidin konstruoimiseksi, joka on sopiva transformoitavaksi hiivaan, XR:ää koodaava geeni kloonataan sopivaan hiivan ekspressiovektoriin, kuten pMA91:een (Mellor et ai., 1983), joka sisältää sopivat hiivan säätelyalueet. Näitä säätelyalueita voidaan saada hii-5 vageeneistä, kuten esimerkiksi PGK1, ADH1, GAL1, GAL10, CUP1, GAP, CYC1 ja PH05. Vaihtoehtoisesti myös XR:ää koodaavaa Pichia-geeniä voidaan käyttää geenin ekspressoimiseksi S. cerevisiaessa. XR:ää koodaava plasmidi, joka sisältää xraf-geenin, kykenee itsenäisesti replikoituinaan transformoituna vastaanottavaan hiivakantaan. XR:ää koodaava geeni voidaan myös kloonata yhtenä kopiona esiintyvään hiiva-10 vektoriin, kuten pRS305:een (Sikorski ja Hietcr, 1989).

XR:ää koodaava geeni voidaan vaihtoehtoisesti liittää myös hiivan kromosomiin, ri-bosomaaliseen RNA-lokukseen. Tätä tarkoitusta varten sopivan plasmidin, esim. plasmidin pIRL9, ribosomaaliset sekvenssit irrotetaan ja kloonataan sopivasti BS+-vektoriin.

15 XR:ää koodaava geeni, kytkettynä sopivien hiivan promoottori-ja terminaattorialueiden väliin, irrotetaan hybridivektorista, joka sisältää geenin ja kloonataan aikaisemmassa vaiheessa saatuun plasmidiin. Ekspressiokasetti, jonka vieressä molemmilla puolilla on ribosomaalisia sekvenssejä, voidaan irrottaa tästä tuloksena olevasta plasmidista. Tämä fragmentti transformoidaan hiivaan yhdessä itsenäisesti replikoituvan plasmidin kanssa, • 20 jossa on sopiva markkeri transformaatiota varten. Plasmidi voidaan jälkeenpäin poistaa •: * : soluista, jotka sisältävät v/rZ-geenin integroituna kromosomiin, viljelemällä soluja ei- • » selektiivisissä olosuhteissa. Tällä tavalla voidaan saada rekombinanttikantoja, joissa ei : ole lainkaan ylimääräistä vierasta DNA:ta, kuten bakteerista peräisin olevia vektorise- :: : kvenssejä. Jos käytetään polyploidista hiivakantaa, kuten VTT-A-63015:a, geeni voidaan 25 integroida myös välttämättömään lokukseen, kuten PGK1- tai TD/37-lokukseen.

'··*' Tässä keksinnössä käytetään spesifistä ksyloosireduktaasigeeniä. xrd-geenin sekvenssi voidaan määrittää sen sisältävistä plasmideista käyttämällä esim. kaksijuosteista dideok-sinukleotidisekvensointimenetelmää (Zagursky et ai., 1986). E. stipitiksen XR:ää koodaa-•' ·,. 30 van xrd-geenin sekvenssi annetaan Sekv. n:o 2:na.

» I

7 112250 Tässä keksinnössä myös valmistetaan spesifisiä hiivavektoreita, jotka sisältävät xrd-geenin. Sellainen vektori on joko itsenäisesti replikoituva useana kopiona tai yhtenä kopiona esiintyvä plasmidi tai vektori, joka pystyy integroitumaan hiivan kromosomiin, kuten edellä on kuvattu.

Eräänä tämän keksinnön kohteena ovat hiivakannat, jotka sisältävät XR:ää koodaavan DNA-sekvenssin ja kykenevät ilmentämään tätä entsyymiä.

Edullisessa suoritusmuodossa „ra%-geenin eristämiseksi E. stipitiksestä kromosomaalinen 10 geenipankki tehdään ensin E. coliin kosmidissa p3030 (Penttilä et ai., 1984) tai jossain muussa hiivavcktorissa, ja rekombinanttiplasmidit eristetään ja transformoidaan hiivaan. xdh-geeni voidaan löytää sen hiivaekspression avulla, mikä voidaan ilmaista aktii-visuusmaljamäärityksellä. Tämän geenin cDNA-kopio voidaan eristää samalla tavalla aktiivisuusmaljamäärityksellä E. coliin tehdystä λgtl l-cDNA:n ekspressiokiijastosta.

15

Vaihtoehtoinen menetelmä xdh-gccmn eristämiseksi E. stipitiksestä on puhdistaa XDH-entsyymi donorihiivasta kromatografisilla menetelmillä ja määrittää sen N-terminaalinen aminohapposekvenssi. Voidaan konstruoida oligonukleotidiseos, joka perustuu saatuun XDH-proteiinin N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin. Tätä oligonukleotidiseosta 20 voidaan sitten käyttää geenipankin hybridisaatiossa tai yhdessä oligo-dT-alukkeen kanssa * i · » •: · · j .«//z-spesifisten sekvenssien monistamiseksi PCR-reaktiolla mRNA-populaatiosta. Tulok- : sena oleva geeni tai cDNA kloonataan BS+-vektoriin tai sen kaltaiseen vektoriin, ja xdh- ' geenin sekvenssi saadaan sitten tavanomaisilla menetelmillä.

25 xdh-geeni voidaan ekspressoida hiivassa kromosomaalisesta kopiosta, joka on kloonattu * » esimerkiksi hiivakosmidiin p3030 (Penttilä et ai., 1984). Tällaiseen hiivaan, joka sisältää « • · * xdh-geenin, voidaan transformoida xrd-gQsmn sisältävä plasmidi.

* » * » Täyspitkä xdh-cUHK voidaan myös kloonata sopivaan ekspressiovektoriin, kuten ·*·,. 30 pMA91:een tai pKB102:een (Blomqvist et ai, 1991) sopivien hiivan säätelyalueiden : ^ ’ ’: väliin, käyttäen edullisesti hiivan PGK1- tai ADH1-promoottoria ja -terminaattoria. Eks- 8 112250 pressiokasetti, joka on liitetty pKB102:een, voidaan irrottaa tuloksena olevasta plasmi-dista ja kloonata itsenäisesti replikoituvaan hiivan useana kopiona esiintyvään vektoriin tai yhtenä kopiona esiintyvään hiivavektoriin, jotka sisältävät sopivan markkerin, esim. URA3:n tai HIS3:n hiivan transformaatiota varten. Nämä tuloksena olevat plasmidit voi-5 daan sitten transformoida sopiviin isäntäkantoihin tai kantoihin, jotka sisältävät geenin, joka koodaa XR:ää.

xdh-geeni voidaan liittää myös hiivan genomiin samalla tavalla kuin edellä on kuvailtu xrd-geenin osalta.

10 Tämän keksinnön kohteena on siten lisäksi menetelmä uusien hiivakantojen konstruoimiseksi, jotka kykenevät ilmentämään ksyloosireduktaasia tai ksylitolidehydrogenaasia tai ilmentämään sekä ksyloosireduktaasia että ksylitolidehydrogenaasia, jossa menetelmässä: 15 (a) ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavat DNA-sekvenssit eristetään sopivasta luovuttajahiivasta tai -sienestä; (b) konstruoidaan jomman kumman mainituista DNA-sekvensseistä sisältävä hiivavektori; ja ·. (e) transformoidaan jompi kumpi tai kumpikin saaduista vektoreista sopivaan ’. 20 hiivaisäntään.

» ,· Esillä olevan keksinnön kohteena on siten menetelmä aktiivisen ksyloosireduktaasin ja : ksylitolidehydrogenaasin ilmentämiseksi rinnakkain hiivakannassa, jossa menetelmässä: : (a) eristetään ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavat DNA- 25 sekvenssit sopivasta luovuttajahiivasta tai -sienestä; (b) konstruoidaan hiivavektoreita, joista kukin sisältää yhden mainituista DNA-sekvensseistä; ;;' (e) transformoidaan saadut vektorit sopivaan isäntään rekombinanttihiivakannan saamiseksi; | (, 30 (d) viljellään mainittua rekombinanttihiivakantaa ksyloosia sisältävässä alustassa; O Ja 9 112250 (e) eristetään ja puhdistetaan alustaan muodostunut etanoli.

Tämän keksinnön mukaiset rekombinanttihiivakannat, jotka yhteisilmentävät ksyloosire-duktaasi- ja ksylitolidehydrogenaasientsyymejä, ovat tehokkaita etanolin tuottajia, fer-5 mentoimalla ksyloosia sisältävän fraktion lignoselluloosahydrolysaateista, kuten metsäteollisuuden sivutuotteista, esim. sulfiittijäteliemestä, tai raaka-aineista, jotka on saatu esikäsittelyllä, ksyloosin saamiseksi käymiskelpoiseksi, käsittelemällä kohonneissa lämpötiloissa kemikaalien kuten rikkidioksidin läsnäollessa tai niiden puuttuessa ja yhdessä happohydrolyysin tai entsymaattisen hydrolyysin kanssa. Ksyloosin kulutus ja tuotteiden 10 muodostus (etanoli, ksylitoli, etikkahappo jne.) analysoidaan esim. HPLC:n avulla (Hahn-Hägerdal et ai., 1986; Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a ja b).

Ksyloosireduktaasin puhdistaminen Pichia stipitiksestä 15 E. stipitistä viljeltiin 1 litran fermentorissa ksyloosia sisältävässä alustassa (0,3 % hiiva-uutetta, 0,3 % mallasuutetta, 0,5 % peptonia, 1,9 % KhbPO^a, 0,3 % (NH^HPO^a, 0,1 % MgSC>4:a ja 5 % ksyloosia, pH 5) ja kerättiin talteen myöhäislogaritmisessa kasvuvai-heessa. 30 g märkäpainoista solumassaa hajotettiin käyttäen jäädytyspuristusta (X-pu-; . , 20 ristin) ja sentrifugoitiin 1500 g, 10 min. ajan soluvapaan uutteen saamiseksi.

« i t I · > · ;' * | Raakauute väkevöitiin kaksinkertaisesti ja pantiin Sephadex G-200 (Pharmacia, Uppsala, • · :*· Ruotsi) -pylvääseen (137 ml). Proteiinit eluoitiin virtausnopeudella 6 ml/h, ja fraktiot (9 : : ml), jotka sisälsivät XR-aktiivisuutta, kerättiin yhteen.

25 ; ’ Yhteenkoottu fraktio pantiin DEAE-Sepharose (Pharmacia) -pylvääseen (37 ml), joka oli *...· tasapainotettu 0,02 M ammoniumfosfaattipuskurilla pH 6,0, ja eluoitiin 250 ml:n gra- ·;· dientilla 0-0,5 M NaCka 0,02 M ammoniumfosfaattipuskurissa virtausnopeudella 12 » « » * ; ml/min. Fraktiot, jotka sisälsivät XR-aktiivisuutta, yhdistettiin (6 ml) ja väkevöitiin 1 30 mkksi. 1 ml väkevöityä näytettä sijoitettiin 1 ml:n HPLAC-kolonniin (cibacrom blue F36-A; Perstorp Biolytica, Lund, Ruotsi), joka oli tasapainotettu 0,02 M ammonium- 10 112250 fosfaattipuskurilla pH 6,0. XR:n eluointi suoritettiin 0-2 M NaCl-gradientilla ammoni-umfosfaatlipuskurissa virtausnopeudella 1 ml/min. XR-aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin (6 ml) ja dialysoitiin yli yön 4°C:ssa.

5 Puhtaus ja molekyylipaino määritettiin SDS-polyakryyliamidigradienttigeeli (T 8,8-21,3 %, C 2,6 %)-elektroforeesilla (Laemmli, 1970) ja natiivilla polyakryyliamidigradientti-geeli (Pharmacia esivalmisteltu geeli, 4/30) -elektroforeesilla (Pharmacian vertikaa-lielektroforeesisysteemi). Pharmacian picnimolekyylipainoisia ja suurimo-lekyylipainoisia standardeja käytettiin. Geelin värjäys suoritettiin 0,1 %:isella Coomassie 10 Blue R-250:llä (Sigma) 25%:isessa metanolissa ja 10%:isessa etikkahapossa. SDS-PAGE-geelissä ja natiivissa PAGE-geelissä XR-fraktio HPLAC:n jälkeen ilmeni yksinkertaisena vyöhykkeenä (tuloksia ei ole esitetty). XR;n spesifinen värjäys zymo-grammitekniikalla osoitti, että natiivin PAGE-geelin yksinkertainen vyöhyke oli XR:ää (tuloksia ei ole esitetty). Molekyylipainon estimointi SDS-PAGE:lla (ks. kuvio 6) ja na-15 tiivilla PAGEdla osoitti molekyylipainoksi 38000 ± 1000 alayksikköjen osalta, ja 76000 ± 1000 natiivin proteiinin osalta.

Puhdistettua entsyymiä käytettiin polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja ent- *,·. syyniin N-terminaalisen aminohapposekvenssin valmistamiseksi (Marc Bauman, Lääke- * 20 tieteellisen kemian laitos, Helsingin Yliopisto) (Sekv. n:o 1).

t t i # * t • · ;' ·, f Esimerkki. 2 • · : ’: Pieli ia stipitiksen XR:ää koodaavan geenin kloonaus * » » 25 1 litra E. stipitis -viljelmää kasvatettiin ksyloosia sisältävässä alustassa (esimerkki 1) ja IV kerättiin talteen myöhäisessä log-vaiheessa. Talteenotetut solut muutettiin sferoplasteiksi

Zymolyasem avulla, suspendoitiin 60 mkaan GuSCN-liuosta, ja RNA eristettiin Chirg-;· winin et ai, (1979) mukaan. RNA ajettiin sen jälkeen oligo(dT)-selluloosa-affi- : ’ ”: niteettikromatografiakolonnin läpi. Poly (A+)(mRNA) eluoitiin alentamalla eluointipus- j*. 30 kurin ionivahvuutta. cDNA:ta syntetisoitiin mRNA:sta käyttäen Amershamin cDNA- synteesipakkausta ja kloonattiin Xgtl 1-vektoriin käyttäen Amershamin cDNA- 11 112250 kloonauspakkausta. 3-4 tunnin kasvatuksen jälkeen, plakit toistomaljattiin nitroselluloo-samembraanille, joka oli kastettu IPTG.hen, ja inkuboitiin yli yön. Membraaneja käytettiin sen jälkeen transformanttien immunologiseen seulontaan (Young ja Davies, 1983) käyttäen kanin antiseerumia XR:ää vastaan ja vuohen anti-kani-vasta-aineita kytkettynä 5 alkaliseen fosfataasiin. Positiiviset kloonit poimittiin maljoilta, ja DNA-insertti monistettiin PCR:n avulla (Gussow ja Clackson, 1989) käyttäen vektorispesifisiä alukkeita. Saatuja DNA-fragmentteja käytettiin restriktioentsyymianalyysiin ja jatkokloonaukseen BamHI-katkaisun jälkeen BamHI-katkaistuun BS+ (Stratagene) -vektoriin. Pisin cDNA-klooni pJHXR20:stä sekvensoitiin käyttäen kaksijuosteista dideoksinukleotidi-10 menetelmää (Zagursky et ai, 1986).

XR:ää koodaavan täyspitkän cDNA:n kloonauksen varmistus saatiin vertailemalla proteiinin N-tenninaalista aminohapposekvenssiä sekvensoituun geeniin (Sekv. n:o 1, Sekv. n:o 2).

15 xrd-gemin kromosomaalinen kopio saatiin E. stipitiksestä CBS-6054 (Prior et ai., 1989) eristetyn kromosomaalisen kokonais-DNA:n PCR-reaktiolla (Cryer et ai, 1979) käyttäen alukkeita, jotka vastaavat koodaavan alueen 5'-päätä (GCGGATCCTCTA-GAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGG) ja 3'-päätä (TTGGATCCTCTAGAT- ; 20 TAGACGAAGATAGGAATCTTGTCCC), ja joissa on BamHI- ja Xbal-restrik- < > 1 Ί tiokohdat. PCR-tuote digestoitiin BamHI:llä ja kloonattiin plasmidiin pMA91 (Mellor et » » ·, 1f ai., 1983) Bglll-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pUA103 (Kuvio 1). Kromosomaalisen •\ · kopion DNA-sekvenssiä verrattiin plasmidin pJHXR20:n cDNA:n vastaavaan, ja havait- I ♦ ', 1 tiin, että se ei sisältänyt introneita.

25 ! > * « 1 1 ♦ I t • I t »

| I

12 112250

Esimerkki 3

Pichia stipitis -hiivaa kasvatettiin ksyloosia sisältävässä alustassa kuten esimerkissä 1 on 5 kuvattu. 30 g märkäpainoista solumassaa hajotettiin käyttäen jäädytyspuristusta (X-puristin) ja sentrifugoitiin 1500 g 10 min. Sentrifugoitu soluvapaa uute väkevöitiin kolminkertaisesti, ja 5 ml geelisuodatettiin virtausnopeudella 6 ml/h 137 ml Sepharose 6B -kolonnin läpi, joka oli tasapainotettu 0,05M ammoniumfosfaattipuskurilla, pH 6, ja sisälsi 25 % glyserolia, 1 mM DTT:tä, 1 mM EDTA:ta. Fraktiot, jotka sisälsivät XDH-10 aktiivisuutta, mitattuna Smileyn ja Bolenin mukaan (1982), koottiin yhteen ja pantiin 37 ml ioninvaihtokromatografiapylvääseen (DEAE-sepharose), joka oli tasapainotettu 0,05 M ammoniumfosfaattipuskurilla, pH 6, ja sisälsi 25 % glyserolia, 1 mM DTT:tä, 1 mM EDTA:ta. XDH-fraktiot eluoitiin 250 mhlla 0-0,5 M NaCl-suolagradienttia virtausnopeudella 12 ml/min. ja koottiin yhteen. Osittain puhdistettu entsyymi ajettiin poly-15 akryyliamidigeelillä ja blotattiin PVD-membraanille. XDH:ta vastaava vyöhyke leikattiin irti, jaN-tcrminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin suoraan membraanista.

Esimerkki 4 j *XDH:ta koodaavan geenin kloonaus ja ekspressio S. cerevisiaessa : 20 •.ti · ',*··; Sama Xgl 11 cDNA-kirjasto kuin saatiin ja on kuvattu esimerkissä 2 maljattiin ja toisto- ; _ ’. i maljattiin nitroselluloosamembraanille, joka oli upotettu IPTG:hen ja inkuboitiin 3 tuntia.

'/· ’ Membraaneja käytettiin sitten spesifisen XDH-aktiivisuuden (zymogrammi) seulomisek-

·' si upottamalla membraanit 10 mhaan zymogrammiliuosta (0,1 M fosfaattipuskuria pH

25 7,0, 1,5 mM NAD:tä, 0,25 mM nitroblue-tetrazoliumia, 65 μΜ fenatsiinimetosulfaattia, 0,4 M ksylitolia). Positiiviset kloonit (Kuvio 2) poimittiin maljoilta ja kahden kloonin insertti-DNA:ta lisättiin PCR:llä Giissow ja Clackson, 1989) käyttäen vektorispesifisiä » alukkeita (5'-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG, 5’- : .*: TTGAC ACC AG ACCAACTGGT AAT G). Saadut DN A-fragmentit olivat samankokoiset * ’·,, 30 ja niitä käytettiin restriktioentsyymianalyysissä ei-leikkaavien ja leikkaavien entsyymien tarkistamiseksi ja kloonauksessa edelleen BamHEllä katkaisun jälkeen BamHEllä kat- • · · 13 112250 kaistuun pSP72-vektoriin (Promega). Plasmidissa pJHXDH50 on pisin cDNA-klooni (Kuvio 3).

xdh-geenin kromosomaalisen kopion kloonaamiseksi kromosomaalinen DNA eristettiin 5 (Cryer et ai, 1979) E. stipitis -kannasta CBS-6054 (Prior et ai, 1989) ja leikattiin osittain Sau3A:lla. 35-45 kb:n kokoiset fragmentit puhdistettiin fraktioimalla osittain katkottu DNA sakkaroosigradientissa (15 % - 40 %), ja fragmentit ligoitiin hiivan p3030 kosmi-divektoriin (Penttilä et ai, 1984), joka oli leikattu BamHkllä. Ligoidut molekyylit pakattiin λ-partikkelcihin käyttäen Amersham Ltd.:n (UK) in vitro -pakkauspakkaustajatrans-10 fektoitiin E. coli HB101:een (Maniatis et ai, 1982). Rekombinanttikosmidi-DNA eristettiin noin 15000:sta saadusta yhdistetystä geenipankkikloonista ja transformoitiin S. cere-visiae -kantaan S150-2B (a, his3-dell, leu2-3, leu2-]12, trpl-289, ura3-52, cir+, Gal+)(Baldari et ai, 1987) selektoimalla His+-transformanttien suhteen Sc-his-maljoilla. Geenipankki toistomaljattiin nitroselluloosasuodattimille, solut hajotettiin inkuboimalla 15 suodattimia 5 minuuttia kloroformissa ja aktiivisuusmääritys suoritettiin kuten yllä on kuvattu kgtl 1-kirjastolle. Saatiin useita positiivisia klooneja (kannat H494, H495, H496, H497 ja VTT-C-91181), ja kantaa VTT-C-91181 (Kuvio 4) käytettiin lisätutkimuksiin.

20 Kannan VTT-C-91181 XDH-aktiivisuus testattiin Smileyn ja Bolenin (1982) menetel- * mällä French-puristimella saadusta kokonaissolulysaatista, joka sisälsi 25 % glyserolia.

·’/-.· DNA VTT-C-91181 :stä eristettiin ja plasmidi pMW22 otettiin eroon transformoimalla •. · DNA E. coii DH5a:aan.

• · 25 S. cerevisiae -kanta VTT-C-91181, joka sisältää plasmidin pMW22, talletettiin Budapes-: ’ tin sopimuksen mukaisesti talletusnumerolla NCYC 2352 National Collection of Yeast ’ *; · ’ cultures (NCYC) -talletuslaitokseen, Iso-Britannia, maaliskuun 29. päivänä, 1991.

i » i * » 14 112250

Esimerkki 5 XR:n ilmentäminen S. cerevisiaessa XR:ää koodaava geeni PGK-geenin säätelyalueilleen irrotettiin plasmidista pUA103 (esi-5 merkki 2) HindNElla ja kloonattiin yhtenä kopiona esiintyvän vektorin pRS305 (Sikorski ja Hieter, 1989) Hindlll-kohtaan. Saatu plasmidi pUA107 (Kuvio 1), jossa XR:ää koodaava geeni oli oikeassa orientaatiossa hiivan PGK-promoottoriin nähden, transformoitiin käyttäen LiCl-menetelmää (Ito et ai., 1983) ja selektoitiin Leu+-transformanttien suhteen, S. cerevisiae -kantoihin, S150-2B (ks. esimerkki 4) ja GPY55-15Ba (leu2-3, 10 leu2-112, ura3-52, trpl-289, his4-519, prbl, cir+), jolloin saatiin uudet rekom- binanttikannat, S. cerevisiae H481 ja vastaavasti S. cerevisiae H479. Kun plasmidi pUA103 transformoitiin kantoihin S150-2B ja GPY55-15Ba, saatiin H477 ja vastaavasti H475.

15 XR:ää koodaava geeni integroitiin myös hiivan kromosomiin ribosomaalisiin RNA-lokuksiin. Plasmidin pIRL9 ribosomaaliset sekvenssit iirotettiin EcoRIillä, tehtiin tasa-päisiksi ja kloonattiin BS+:n tasapäiseen Xbal-kohtaan, jolloin saatiin vektori pJHR21. XR:ää koodaava geeni, kytkettynä PG/Gpromoottorin ja -terminaattorin väliin, irrotettiin ·*; vektorista pUA103 Hindlll-fragmenttina, tehtiin tasapäiseksi ja kloonattiin tasapäiseen : 20 Xbal-kohtaan plasmidin pJHR21 ribosomaalisiin sekvensseihin. Tästä tuloksena olevasta .'··: plasmidista pJHXR22 (kuvio 5) iirotettiin ekspressiokasetti, jonka vieressä molemmilla * t . j puolilla on ribosomaalinen sekvenssi, katkaisemalla BS+-polylinkkerin tunnusomaisissa V ’ restriktiokohdissa. Tämä fragmentti transformoitiin yhdessä itsenäisesti replikoituvan v · plasmidin kanssa, jossa on transformaatioon sopiva markkeri. Saadut transformantit seu- 25 lottiin XR:ää koodaavan geenin läsnäolon suhteen entsyymiaktiivisuuskokeilla, kuten • yllä on kuvattu, ja integraatiomalli tarkistettiin Southern-analyysillä. Itsenäisesti replikoi- ' ; * ’ tuva plasmidi poistettiin soluista, jotka sisälsivät XR-ekspressiokasetin, viljelemällä solu- ,.; * * ja ei-selektiiviscssä YDP-kasvualustassa.

• · 30 Transfomiantteja kasvatettiin selektiivisessä minimaalialustassa, ja XR:n ilmentyminen i " i analysoitiin Westem-blottauksella, käyttäen XR-spesifistä vasta-ainetta ja Promegan 15 112250 alkalinen fosfataasi -menetelmällä (Kuvio 6), ja French-puristimclla rikottujen hiivasolujen raakauutteiden entsyymiaktiivisuusmäärityksillä (Smiley ja Bolen, 1989)(Kuva 7).

Esimerkki 6 5 XR:n ja XDH:n yhteisilmentäminen

Plasmidit pUA103 ja pUA107 transformoitiin kantaan VTT-C-91181, joka sisältää xdh-geenin plasmidissa pMW22. Transformantit selektoitiin Sc-leu-his-maljoilla ja jälkeenpäin pidettiin samoilla maljoilla. XDH-aktiivisuuden säilyminen varmistettiin malja-10 aktiivisuusmäärityksellä ja XR-aktiivisuus entsyymiaktiivisuusmäärityksellä, kuten edellä on kuvattu. Kahdelle edelleen tutkitulle kloonille, jotka sisälsivät plasmidit pUA103 ja pMW22, annettiin nimet H492 ja H493.

Täyspitkä xdh-cDNA plasmidista pJHXDH50 kloonattiin Hindlll-kohdassa vektoriin 15 pKB102 (Blomqvist et ai, 1991) hiivan ADH1-promoottorin ja -terminaattorin väliin. Ekspressiokasetti iirotettiin tuloksena olevasta plasmidista pJHXDH60 (kuvio 8) ja kloonattiin itsenäisesti replikoituvaan hiivavektoriin p3030 BamHI-kohtaan, jolloin syntyi plasmidi pJHXDH70. Tämä tuloksena oleva plasmidi transformoitiin kantaan H477, jotka sisälsi XR:ää koodaavan geenin (esimerkki 5), ja selektoitiin transformantit Sc-leu-I 20 his-maljoilla. xdh-geenin ekspressio S. cerevisiaessa testattiin entsyymiaktii- ': · ί visuusmäärityksellä (Smiley ja Bolen, 1982).

• · * » · « ·

• I

* > • t

I f I

: t * i » *

I I I

• · • · I 4 ( * » • I « 16 112250

Ksyloosifermentaatio S. cerevisiaen avulla

Esimerkissä 6 kuvattuja S. cerevisiae -kantoja H492 ja H493, viljeltiin kiertoravis-5 telijassa Sc-leu-his-alustassa, joka sisälsi 20 g/1 glukoosia. Kiertonopeus oli 200 rpm. Kun sekä glukoosi että muodostunut etanoli oli kulutettu, kasvuliemiä käytettiin siirroksena kiertoravistelijafermentoinnissa Sc-leu-his-alustassa, joka sisälsi 20 g/I ksyloosia. Ksyloosin kulutusta ja etanolin ja ksylitolin muodostusta seurattiin fermentoinnin aikana ottamalla näytteitä, jotka analysoitiin HPLCrn avulla (Hahn-Hägerdal et ai., 1986; 10 Linden ja Hahn-Hägerdal, 1989a, b).

Esimerkki 8

Ksyloosia sisältävien raaka-aineiden fermentointi S. cerevisiaen avulla.

15 S. cerevisiae -kantoja H492 ja H493 viljeltiin kuten esimerkissä 7 on esitetty fermentoin-tialustassa, jossa ksyloosi oli korvattu sulfiittijäteliemellä. Ksyloosi muuttui soluiksi, etanoliksi ja ksylitoliksi.

* * > * # )

I I • I

5 17 112250

Viitejulkaisut

Amore, R., Wilhelm, M. ja Hollenberg, C.P. (1989) Appi. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357.

Baldari, C., Murray, J.A.H., Ghiara, P., Cesareni, G., ja Galotti, C.L. (1987) EMBO J. 6: 229-234.

Batt, C.A., Carvallo, S., Easson, D.D., Akedo, M. ja Sinskey, A.J. 1986. Metabolic path-10 way in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering 28, 549-553.

Bergmeyer, H.U., Gruber, W. ja Gutmann, I. (1974), Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., toim.) 2. painos, voi. 3, ss. 1323-1330, Verlag Chemie, Weinheim ja Academic Press, Inc., New York, London.

15

Blomqvist, K., Suihko, M.-L., Knowles, J. ja Penttilä, M. Chromosomal integration and expression of two bacterial α-acetolactate decarboxylase genes in brewer's yeast. Toim. julkaistavaksi, 1991.

20 Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. ja Rutter, W.J. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.

Clark, T.A. ja Mackie, K.L. (1984) J. Chem. Tech. Biotechnol. 34b: 101-110.

25

Cryer, D.R., Eccleshall, R. ja Marmur, J. (1975) Isolation of yeast DNA. Methods Cell Biol. 12: 39-44.

t'.' Gong, C-S. (1985) US-patentti 4,511,656.

: : : 30

Giissow, D. ja Clackson, T. (1989) Direct clone characterization from plaques and colo-.' : nies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17: 4000-.

V * Hahn-Hägerdal, B., Berner, S. ja Skoog, K. 1986. Improved ethanol production from 35 xylose with glucose isomerase and Saccharomyces cerevisiae using the respiratory inhibitor azide. Appi. Microbiol. Biotechnol. 24, 287-293.

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. ja Kimura, A. (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bact. 153: 163-168.

; -' 40 ,:. Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M. ja Tsao, G.T. (1983) Enzyme Microb. Technol. 5: ::: 82-102.

* » 1 » ; Y Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of : _ “ 45 bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

♦ I

Lastick, S.M., Tucker, M.Y., Beyette, J.R., Noll, G.R. ja Grohman, K. (1989) Appi. Mi- 18 112250 crobiol. Biotechnol. 30: 574-579.

Linden, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1989a) Enzyme Microb. Technol. 11: 583-589.

5 Linden, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1989b) Biotechnol. Techniques 3: 189-192.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. (1982). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

10 Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A.,

Patel, T., Kingsman, A.J. ja Kingsman, S.M. (1983) Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene 24: 1-14.

Penttilä, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. ja Knowles, J.K.C. 1984. Mol. Gen. Ge-15 net. 194:494-499.

Prior, B.A., Kilian, S.G. ja du Preez (1989) Process Biochemistry 2: 21-32.

Sarthy, A.V., McConaughy, B.L., Lobo, Z., Sundström, J.A., Furlong, C.E. ja Hall, B.D.

20 1987. Expression of the E. coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae.

Appi. Environ. Microbiol. 53, 1996-2000.

Senac, T. ja Hahn-Hägerdal, B. (1990) Appi. Environ. Microbiol, (painossa) 25 Sikorski, R.S. ja Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122: 19-27.

' ! Skoog K. ja Hahn-Hägerdal, B. (1988) Enzyme Microb. Technol. 10: 66-78.

:.: : 30 •: ··; Slininger, P.J., Bolen, O.L. ja Kurtzman, C.P. (1987) Enzyme Microb. Technol. 9: 5-15.

• · * » · ’ '·’ Smiley, K.L. ja Bolen, P.L. (1982) Demonstration of D-xylose reductase and D-xylitol dehydrogenase in Pachysolen tannophilus. Biotechnol. Lett. 4: 607.

35

Van Zyl, C., Prior, B.A., Kilian, S.G. ja Kock, J.L.F. 1989. D-xylose utilization by Sac-charomyr.es cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 135, 2791-2798.

Young, R.A. ja Davies, R.W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes: isolation with ‘ · · · ‘ 40 antibody probes. Science 222: 778-782.

*;;; Yu, S., Wayman, M. ja Parehk, S.R. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 1144-1150.

Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. ja Lomax, N. (1986) Rapid and easy se-: *' 45 quencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene : ”: Anal. Techn. 2: 89-94.

19 112250

Talletetut rnik-rn-nrganisrnit

Seuraava hiivakanta on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen Na-5 tional Collection of Yeast Cultures (NCYC), AFRC Institute of Food Research, Norwich Laboratory, Colney Lane, Norwich, NR4 7UA, Iso-Britannia

Kanta Talletusnumero Talletuspäivä 10

Saeeharomyces r.erevisiae NCYC 2352 29.3.1991 VTT-C-91181, jossa on plasmidi pMW22 15

Lisäksi seuraavat hiivakannat talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa.

20 Kanta Talletusnumero Talletuspäivä

Saeeharomyces cerevisiae \ 1. H475 (VTT C-97277) DSM 11546 16.5.1997 ’ 25 Sacc.haromycfis cerevisiae . : H477 (VTT C-97278) DSM 11547 16.5.1997 » · t 1 · t I · lii·» 20 112250 SEKV. N:0 1 5 SEKVENSSITYYPPI: Peptidi SEKVENSSIN PITUUS: 9 aminohappoa TOPOLOGIA: lineaarinen ALKUPERÄINEN LÄHDEORGANISMI: Pichia stipitis CBS-6054 VÄLITÖN KOELÄHDE: proteiinin puhdistus ja N-terminaalisekvensointi 10 YKSITYISKOHDAT: kypsän proteiinin aminohapot 1-9 OMINAISUUDET: ksyloosireduktaasientsyymin (NADPH/NADH) N-terminaalinen peptidi 15

Pro Xaa Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr 1 · 21 112250 SEKV. N:0 2 SEKVENSSITYYPPI: Nukleotidi ja vastaava proteiini 5 SEKVENSSIN PITUUS: 954 emäsparia JUOSTEISUUS: yksijuosteinen TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: cDNA:sta mRNA:han, genomincn DNA ALKUPERÄINEN LÄHDEORGANISMI: Pichia stipitis CBS-6054 10 VÄLITÖN KOELÄHDE: cDNA-kirjasto, PCR-tuote perimän DNA:sta YKSITYISKOHDAT: 1-954 bp, kypsä proteiini OMINAISUUDET: tuotteen ksyloosireduktaasi (NADPH/NADH) -aktiivisuus * » * · 1

* I

• » 22 112250 ATG CCT TCT ATT AAC TTG AAC TOT GGT TAC GAC ATG CCA GCC GTC 45

Met Pro Ser lie Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val 1 5 10 15 GGT TTC GGC TGT TGG AAA GTC GAC GTC GAC ACC TGT TCT GAA CAG 90

Gly Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gin 20 25 30 ATC TAC CGT GCT ATC AAG ACC GGT TAC AGA TTG TTC GAC GGT GCC 135 lie Tyr Arg Ala lie Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly A)a 35 40 45 GAA GAT TAC GCC AAC GAA AAG TTA GTT GGT GCC GGT GTC AAG AAG 180

Glu Asp Tyr Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys 50 55 60 GCC ATT GAC GAA GGT ATC GTC AAG CGT GAA GAC TTG TTC CTT ACC 225

Ala lie Asp Glu Gly lie Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr 05 70 75 TCC AAG TTG TGG AAC AAC TAC CAC CAC CCA GAC AAC GTC GAA AAG 270

Ser Lys Leu Trp Asn Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys 80 85 90 GCC TTG AAC AGA ACC CTT TCT GAC TTG CAA GTT GAC TAC GTT GAC 315

Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ser Asp Leu Gin Val Asp Tyr Val Asp 95 100 105 TTG TTC TTG ATC CAC TTC CCA GTC ACC TTC AAG TTC GTT CCA TTA 3 60

Leu Phe Leu lie His Phe Pro Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu 110 115 120 GAA GAA AAG TAC CCA CCA GGA TTC TAC TGT GGT AAG GGT GAC AAC 4 05

Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn 125 130 1 35 TTC GAC TAC GAA GAT GTT CCA ATT TTA GAG ACC TGG AAG GCT CTT 450

Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro He Leu Glu Thr Trp Lys Ala Leu 140 145 150 GAA AAG TTG GTC AAG GCC GGT AAG ATC AGA TCT ATC GGT GTT TCT 405

Glu Lys Leu Vai Lys Ala Gly Lys Ile Arg Ser He Gly Val Ser 155 160 165 AAC TTC CCA GGT GCT TTG CTC TTG GAC TTG TTG AGA GGT GCT ACC 54 0

Asn Phe r>ro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gly Ala Thr HO 175 180 • I ATC AAG CCA TCT GTC TTG CAA GTT GAA CAC CAC CCA TAC TTG CAA 58 5

He Lys Pro Ser Val Leu Gin Val Glu His His Pro Tyr Leu Gin , 185 190 195 * · * CAA CCA AGA TTG ATC GAA TTC GCT CAA TCC CGT GGT ATT GCT GTC 630 • ·· Gin Pro Arg Leu He Glu Phe Ala Gin Ser Arg Gly He Ala val 200 205 210 ' · ' ,: ACC GCT TAC TCT TCG TTC GGT CCT CAA TCT TTC GTT GAA TTG AAC 67 5 , ,1 Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gin Ser Phe Val Glu Leu Asn ; ; 215 220 225 , , CAA GGT AGA GCT TTG AAC ACT TCT CCA TTG TTC GAG AAC GAA ACT 7 20 : : Gill Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr 230 235 240 ATC AAG GCT ATC GCT GCT AAG CAC CGT AAG TCT CCA GCT CAA GTC 7 65 . . He Lys Ala lie Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gin Val I 245 250 255 TTG TTG AGA TGG TCT TCC CAA AGA GGC ATT GCC ATC ATT CCA AAG 810 ...· Leu Leu Arg Trp Ser Ser Gin Arg Gly He Ala He He Pro Lys 260 265 270 TCC AAC ACT GTC CCA AGA TTG TTC GAA AAC AAG GAC GTC AAC AGC 855

Ser Asn Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser > ’ '' . 275 280 285 TTC GAC TTG GAC GAA CAA GAT TTC GCT GAC ATT GCC AAG TTG GAC 900 " The Asp Leu Asp Glu Gin Asp Phe Ala Asp lie Ala Lys Leu Asp : 1·· 290 295 300 ATC AAC TTG AGA TTC AAC GAC CCA TGG GAC TGG GAC AAG ATT CCT 94 5 lie Asn Lou Arg Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys He Pro 105 310 315 ATC TTC GTC He Phe Val

Claims (11)

112250

1. Menetelmä etanolin tuottamiseksi ilmentämällä aktiivista ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia yhteisesti hiivakannassa, tunnettu siitä, että 5 (a) eristetään sopivasta luovuttajahiivasta tai -sienestä ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavat DNA-sekvenssit, (b) konstruoidaan hiivavektorit, joissa kussakin on yksi mainituista DNA-sekvensseistä, (c) transformoidaan saadut vektorit sopivaan hiivaisäntään, jolloin saadaan 10 rekombinanttihiivakanta, (d) viljellään mainittua rekombinanttihiivakantaa alustassa, joka sallii mainittujen DNA-sekvenssien ilmentymisen, tai ksyloosia sisältävässä alustassa, ja (e) eristetään ja puhdistetaan alustassa muodostunut etanoli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivaisäntä on Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe tai Pichia spp., edullisesti Saccharomyces cerevisiae.

3. Rekombinanttihiivakanta, tunnettu siitä, että se sisältää ksyloosireduktaasia : ; 20 koodaavan DNA-sekvenssin ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavan DNA-sekvenssin, ‘‘: jotka DNA-sekvenssit ovat peräisin hiivasta tai sienestä.

• · * » ’, · ’ 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen rekombinanttihiivakanta, joka on Saccharomyces V · cerevisiae H492 tai H493, jotka kannat on kuvattu selityksen esimerkissä 8. 25

*' 5. Menetelmä uusien rekombinanttihiivakantojen konstruoimiseksi, jotka pystyvät ; · * yhteisilmentämään ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia, tunnettu siitä, että ‘' (a) eristetään ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavat DNA- j ‘. 30 sekvenssit sopivasta luovuttajahiivasta tai -sienestä, 112250 (b) konstruoidaan hiivavektorit, joissa on jompi kumpi mainituista DNA-sekvensseistä, ja (c) transformoidaan saadut vektorit sopivaan hiivaisäntään.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitava isäntä on Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe tai Pichia spp., edullisesti Saccharomyces cerevisiae.

7. Menetelmä uusien rekombinanttihiivakantojen konstruoimiseksi, jotka pystyvät 10 ilmentämään joko ksyloosireduktaasia tai ksylitolidehydrogenaasia, tunnettu siitä, että (a) eristetään ksyloosireduktaasia ja ksylitolidehydrogenaasia koodaavat DNA-sekvenssit sopivasta luovuttajahiivasta tai -sienestä, (b) konstruoidaan hiivavektorit, joissa on jompi kumpi mainituista DNA- 15 sekvensseistä, ja (c) transformoidaan jompi kumpi saaduista vektoreista sopivaan hiivaisäntään.

8. Rekombinanttihiivakanta, joka pystyy ilmentämään ksylitolidehydrogenaasia, • tunnettu siitä, että hiivakantaan on lisäksi siirretty ksyloosireduktaasia koodaava : 20 DNA-sekvenssi, joka on peräisin hiivasta tai sienestä.

* · *,'·· 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rekombinanttihiivakanta, tunnettu siitä, että se on •. ; Saccharomyces cerevisiae H475 tai H477, jotka kannat on kuvattu selityksen V * esimerkissä 5. 25

·' 10. Rekombinanttihiivakanta, joka pystyy ilmentämään ksyloosireduktaasia, tunnettu ; ’ siitä, että hiivakantaan on lisäksi siirretty ksylitolidehydrogenaasia koodaava DNA- .,: ’ sekvenssi, joka on peräisin hiivasta tai sienestä. j ’·· 30

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rekombinanttihiivakanta, tunnettu siitä, että se •,,. · on Saccharomyces cerevisiae VTT-C-91181 (NCYC 2352). 112250